Issuu on Google+

液质联用(LCMS)原理简析

1.质谱法 质谱分析是先将物质离子化,按离子的质荷比分离,然后测量各 种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。质谱的样品一般 要汽化,再离子化。不纯的样品要用色谱和质谱联用仪,是通过色谱 进样。即色谱分离,质谱是色谱的检测器。离子在电场和磁场的综合 作用下,按照其质量数 m 和电荷数 Z 的比值(m/z,质荷比)大小依次 排列成谱被记录下来,以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标,离 子质荷比为横坐标所作的条状图就是我们常见的质谱图。

2.质谱仪 质谱仪由以下几部分组成 数据及供电系统 ┏━━━━┳━━━━━╋━━━━━━┓ 进样系统

离子源

质量分析器

检测接收器

┗━━━━━╋━━━━━━┛ 真空系统

质谱仪一般由进样系统、离子源、分析器、检测器组成。还包括 真空系统、电气系统和数据处理系统等辅助设备。 (1)离子源:使样品产生离子的装置叫离子源。液质的离子源有 ESI, APCI,APPI,统称大气压电离(API)源,实验室常用液质的离子源为 ESI 源。


电喷雾(ESI)的特点 „ 通常小分子得到[M+H]+ ]+,[M+Na]+ 或[M-H]-单电荷离子,生 物大分子产生多电荷离子。 „ 电喷雾电离是最软的电离技术,通常只产生分子离子峰,因此 可直接测定混合物,并可测定热不稳定的极性化合物;其易形 成多电荷离子的特性可分析蛋白质和 DNA 等生物大分子;通过 调节离子源电压控制离子的碎裂(源内 CID)得到化合物的部 分结构。

(2)质量分析器: 由它将离子源产生的离子按 m/z 分开。离子通过 分析器后,按不同质荷比(M/Z)分开,将相同的 M/Z 离子聚焦在一起, 组成质谱。 质量分析器有:磁场和电场、四极杆、离子阱、飞行时间质谱、 傅立叶变换离子回旋共振等。实验室目前液质的质量分析器类型:三 重四极杆(QqQ) : 离子源→第一分析器→碰撞室→第二分析器→接收器 MS1 Q1

MS2 q2

Q3

„ QqQ 仪器可以方便的改变离子的动能,因此扫描速度快,体积 小,常作为台式进入常规实验室,缺点是质量范围及分辨率有 限,不能进行高分辨测定,只能做到单位质量分辨。 „ 在液质联机中使用的碎片化手段,能量都是以碰撞的形式输送


给分子离子,这个能量足以使得处在能量亚稳态分子中的某些 化学键断裂并使一些特定的分子发生结构重排。

(3)碰撞诱导解离 CID 质谱: QqQ 检测器中的碰撞反应在 CID 中进行。选择一定质量的离子作 为母体离子,进入碰撞室,室内充有靶子反应气体(本实验室选择高 纯氦) ,发生离子—分子碰撞反应,从而产生‘子离子’,再经 MS2 的 分 析 器 及 接 受 器 得 到 子 离 子 质 谱 , 一 般 称 做 CID (collision-induced dissociation)谱。

(4)检测器:离子检测器由收集器和放大器组成。打在收集器上的 正离子流产生与离子流丰度成正比的信号。

(5)真空系统:质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须在高真 空状态下工作,以减少本底的干扰,避免发生不必要的离子-分子反 应。所以质谱反应属于单分子分解反应。利用这个特点,我们用液质 联用的软电离方式可以得到化合物的准分子离子,从而得到分子量。 由机械真空泵(前极低真空泵),扩散泵或分子泵(高真空泵)组成真空 机组,抽取离子源和分析器部分的真空。只有在足够高的真空下,离 子才能从离子源到达接收器,真空度不够则灵敏度低。实验时要注意 观察质谱的真空度状态,如有异常,及时向相关老师汇报。


3. 质谱仪的联用技术 质谱仪可以与其他仪器联用,如气相色谱-质谱联用(GC/MS)、 高效液相色谱-质谱联用(HPLC/MS) ;也可以质谱-质谱联用(MS-MS)。 (1) GC/MS、HPLC/MS 仪: 基于色谱和质谱的仪器灵敏度相当,加之使分离效果好的色谱成 为质谱的进样器,而速度快、分离好、应用广的质谱仪作为色谱的鉴 定器,使它们成为目前最好的用于分析微量的有机混合物的仪器。

(2)液质联用与气质联用的区别: „ 气质联用仪(GC-MS)是最早商品化的联用仪器,适宜分析小分 子、易挥发、热稳定、能气化的化合物;用电子轰击方式(EI) 得到的谱图,可与标准谱库对比。 „ 液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问题:不挥发性化合 物分析测定;极性化合物的分析测定;热不稳定化合物的分析 测定;大分子量化合物(包括蛋白、多肽、多聚物等)的分析 测定;一般没有商品化的谱库可对比查询,只能自己建库或自 己解析谱图。 所以目前液质联用在环境领域主要应用于有标准 物质参照情况下的定性分析。

(3)MS-MS: 质谱-质谱法是 70 年代后期迅猛发展起来的。这种方法是指用 质 谱 作 质 量 分 离 的 质 谱 技 术 (mass separetion-mass spectra


characterization)。 它可以研究母离子和子离子的关系,让大的离 子进一步裂解,获得裂解过程及离子组成的信息。它有几种称呼,如 质谱-质谱法(MS-MS 或 MS/MS),串联质谱,二维质谱法,序贯质谱。 本实验室的质谱检测器为三重四极杆检测器,属于 MS/MS 型质谱检测 器。

(4)有机质谱局限性: „ 异构体,立体化学方面区分能力差。 „ 重复性稍差,要严格控制操作条件。所以不能象低场 NMR,IR 等自己动手,须专人操作。 „ 有离子源产生的记忆效应,污染等问题。 „ 价格昂贵,分析成本高,操作复杂。

4. 质谱仪性能指标 (1)质量范围:即仪器测量质量数的范围。 (2)分辨率:即表示仪器分开两个相邻质量离子的能力,通常用 R 表 示,实验室内的 TSQ Quantum 分别率为 0.7。 (3)质量测量精度:离子质量测定的精度,一般对质量几百的离子, 测量误差应<0.003 质量单位。

5.基本术语 (1)质谱图:质谱图一般都采用“条图”,或称为棒状图。在图中横轴


表示质荷比(m/z,因为 Z 接近于 1,故实际上 m/z 多为离子的质量) 。 纵轴则表示峰的相对强度(RA,相对丰度)。 (2)质荷比: 离子质量(以相对原子量单位计)与它所带电荷(以电子 电量为单位计)的比值,写作 m/Z。 (3)峰: 质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰。 (4)离子丰度: 检测器检测到的离子信号强度。峰越高表示形成的离 子越多,也就是说,谱线的强度是与离子的多少成正比的。 (5)基准峰:在质谱图中,指定质荷比范围内强度最大的离子峰称作 基峰,其离子峰的峰高作为 100%,而以对它的百分比来表示其他离子 峰的强度。 (6)总离子流图:在选定的质量范围内,所有离子强度的总和对时间或 扫描次数所作的图,也称 TIC 图. (7)质量色谱图:指定某一质量(或质荷比)的离子其强度对时间所作 的图。利用质量色谱图来确定特征离子,在复杂混合物分析及痕量分 析时是 LC/MS 测定中最有用的方式。当样品浓度很低时 LC/MS 的 TIC 上往往看不到峰,此时,根据得到的分子量信息,输入 M+1 或 M+23 等数值,观察提取离子的质量色谱图,检验直接进样得到的信息是否 在 LC/MS 上都能反映出来,确定 LC 条件是否合适,以后进行 SRM 等 其他扫描方式的测定时可作为参考。


100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

2.0

3.0

4.0

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

6. 影响离子丰度的主要因素: 峰的强度反映出该碎片离子的多少,峰强表示该种离子多,峰弱 表示该种离子少。 影响离子丰度的主要因素:1.键的相对强度:2.产物离子的稳定 性:这是影响产物离子丰度的最重要因素。3.原子或基团相对的空 间排列(空间效应):空间因素影响竞争性的单分子反应途径,也影 响产物的稳定性。4. Stevenson 规则:5.最大烷基的丢失等。

7.质谱中离子的类型 质谱中的离子有多种类型,最基本的有: (1)分子离子


指与分子存在简单关系的离子,通过它可以确定分子量。液质中 最常见的准分子离子峰是[M+H]+ 或[M-H]-。 在 ESI 中, 有时会生成质量大于分子量的离子如 M+1, M+23, M+39, M+18......称准分子离子,表示为:[M+H]+,[M+Na]+等。 分子离子有时又叫母离子,是一切碎片离子的母离子,即一切碎 片离子是通过分子离子再进一步裂解得到的。写质谱裂解反应要从分 子离子写起。

(2)碎片离子: „ 准分子离子经过一级或多级裂解生成的产物离子。 „ 碎片峰的种类、数目及其丰度则与分子结构、仪器类型、分析 条件等因素有关,数目多表示该分子较容易断裂,丰度高的碎片 峰表示该离子较稳定,也表示分子比较容易断裂生成该离子。

(3)多电荷离子: 指带有 2 个或更多电荷的离子,常见于蛋白质或多肽等离子.有 机质谱中,单电荷离子是绝大多数,只有那些不容易碎裂的基团或分 子结构-如共轭体系结构-才会形成多电荷离子。它的存在说明样品是 较稳定的。

(4)同位素离子 由元素的重同位素构成的离子称为同位素离子.


各种元素的同位素,基本上按照其在自然界的丰度比出现在质谱 中,这对于利用质谱确定化合物及碎片的元素组成有很大方便, 还可 利用稳定同位素合成标记化合物,如:氘等标记化合物,再用质谱法检 出这些化合物,在质谱图外貌上无变化,只是质量数的位移,从而说明 化合物结构,反应历程等。

8.扫描模式的选择 (1)正负离子模式: 一般的商品仪器中,ESI 和 APCI 接口都有正负离子测定模式可供 选择。一般不要选择两种模式同时进行。 正、负离子模式建议根据文献选择。 选择的一般原则为: „ 正离子模式:适合于碱性样品,可用乙酸或甲酸对样品加以酸 化。样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式。 „ 负离子模式:适合于酸性样品,可用氨水或三乙胺对样品进行 碱化。样品中含有较多的强伏电性基团,如含氯、含溴和多个 羟基时可尝试使用负离子模式。

(2) 全扫描方式(Q1 扫描) 全扫描数据采集可以得到化合物的准分子离子,从而可判断出化 合物的分子量,用于鉴别是否有未知物,并确认一些判断不清的化合 物,如合成化合物的质量及结构。


(3)母离子扫描 母离子分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物,尽管它们的母 离子的质量可以不同,但在分裂过程中会生成共同的子离子,这种扫 描功能在药物代谢研究中十分重要。 LC-MS 中常见的本底离子 „ m/z 50-150, 溶剂离子,[(H2O)nH+

,n= 3-112]

„ m/z 102, H+乙腈 +乙酸, C4H7NO2H+,102.0549 „ m/z149, 管路中邻苯二甲酸酯的酸酐, C8H4O3H+,149.0233 „ m/z 288, 2mm 离心管的产生的特征离子 „ m/z 279, 管路中邻苯二甲酸二丁酯 C16H22O4H+, 279.1591 „ m/z 316, 2mm 离心管的产生的特征离子 „ m/z 384, 瓶的光稳定剂产生的离子 „ m/z391, 管路中邻苯二甲酸二辛酯, C24H38O4H+, 391.2843 „ m/z413, 邻苯二甲酸二辛酯+钠, C24H38O4Na+, 413.2668 „ m/z 538, 乙酸+氧 +铁(喷雾管), Fe3O(O2CCH3)6, 537.8793

(3)选择离子扫描(SRM 模式) 也称为子离子扫描( MS/MS ),用于结构判断(得到化合物的二 级谱图即碎片离子)和选择离子对作多种反应监测(SRM)。通过 Q1 选 择目标物质的母离子,在 Q2 发生碰撞反应,Q3 对目标物质丰度最大 的子离子进行扫描。


子离子质谱图已知只有一种质量通过 MS1(Q1),因此也已知所 有碎片离子都是由我们所选定的母离子所产生的,所以我们更相信由 MS/MS 产生的谱图的纯度。相对其它扫描模式,SRM 模式对于目标物 质最为灵敏,干扰也最低,一般用于定量分析。

Precursor ion fixed

Fragmentation (CID)

Product ion fixed

9.其它事项 (1)流动相的选择 „ 常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及 一些易挥发盐的缓冲液,如甲酸铵、乙酸铵等,还可以加入易 挥发酸碱如甲酸、乙酸和氨水等调节 pH 值。 „ LC/MS 接口避免进入不挥发的缓冲液,避免含磷和氯的缓冲


液,含钠和钾的成分必须<0.5mmol/l。(盐分太高会抑制离子 源的信号和堵塞喷雾针及污染仪器)含甲酸(或乙酸)<1%。 含三氟乙酸≤0.2%。含三乙胺<0.5%。含醋酸铵<2-5mmol/l。 „ 送样前一定要摸好 LC 条件,能够基本分离,缓冲体系符合 MS 要求。

(2)流量和色谱柱的选择 „ 不加热 ESI 的最佳流速是 1—50ul/min,应用 4.6 mm 内径 LC 柱时要求柱后分流,目前大多采用 l—2.1 mm 内径的微柱,TIS 源最高允许 lml/min,建议使用 200—400ul/min „ APCI 的最佳流速~lml/min,常规的直径 4.6mm 柱最合适。 „ 为了提高分析效率,常采用< 100 mm 的短柱(此时 UV 图上并 不能获得完全分离,由于质谱定量分析时使用 MRM 的功能,所 以不要求各组分没有完全分离) 。这对于大批量定量分析可以节 省大量的时间。

(3)辅助气体流量和温度的选择 „ 雾化气(sheath gas)对流出液形成喷雾有影响,辅助气(Aux gas)影响喷雾去溶剂效果,碰撞气影响二级质谱的产生。 „ 操作中温度的选择一般情况下选择温度高于分析物的沸点 20 ℃ 左右即可。对热不稳定性化合物,要选用更低的温度以避免 显著的分解。


„ 选用温度和气体流量大小时还要考虑流动相的组成,有机溶剂 比例高时可采用适当低的温度和流量小一点的。

(4)样品的预处理: 从保护仪器角度出发,防止固体小颗粒堵塞进样管道和喷嘴,防 止污染仪器,降低分析背景,排除对分析结果的干扰。 要求获得最佳的分析结果,从 ESI 电离的过程分析:ESI 电荷是 在液滴的表面,样品与杂质在液滴表面存在竞争,不挥发物(如磷酸 盐等)防碍带电液滴表面挥发,大量杂质防碍带电样品离子进入气相 状态,增加电荷中和的可能。


液质联用(LCMS)原理简析