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LemnaTrack HTS—运动轨迹分析

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介绍 表型组学研究中,除了生物(尤其是植物)形态学分析以外,表型特征的动力学变化越来越受到广 大科研工作者的重视,例如动物表型特征及运动轨迹表现研究。然而,基于轨迹运算法则来研究生物运 动轨迹的方法早已被认为是一种标准,但是将其特定用于量化运动轨迹分析的研究则是一个全新的研究 领域。德国LemnaTec公司研发的ScanalyzerHTS和ScanalyzerPL系统采用先进的成像技术,能够清晰观察到 小型生物的运动轨迹变化,尤其对多孔板中的微生物效果更加显著。此外,还可以根据客户的特殊需求, 该成像系统还可以适用于更大型的生物。LemnaTrac软件具有强大的分析功能,能够灵活的对获取的图 像进行分析,并且不依赖于被测生物的大小。本文着重介绍了几个LemnaTrac软件分析生物运动轨迹的 具体实例,并解释了该运动轨迹分析系统的几个基本概念。

人眼与影像式运动轨迹分析比较 人类视觉 相对于人眼对于形状、颜色和大小的识别能力,量化生物体的运动和运动轨迹则困难的多。通常情 况下,利用人眼进行小批量的样品观察,可以获得一些量化的数据,但当进行大量观察时,人的主观性 则势必会极大的影响实验结果,引起误差。对于一些较为复杂的运动形式,例如测定多孔板中微生物的 运动速率,则更难以进行定性和定量分析。因此,在生物的适应性和人眼的限制性双重影响下,使得生 物运动运动轨迹研究异常艰难。 实际上,人眼在观察事物的过程中,首先需要在视力范围内的一个微小平面上进行聚焦,然后才能 定量分析某一特定的运动轨迹,因此,太快或者太慢的运动运动轨迹人眼是很难准确测定和分析的。一 般情况下,人眼最多只能同时聚焦 96 孔板中的恶 4 个孔和极少数目的运动生物,这就使得长期大量的 观察任务几乎是不可能实现的。再者,对于一些突发运动轨迹或者不规则运动,每个样品或处理的观察 次数都是需要考虑的因素,并且需要观察者耗费大量的时间和精力,才能获得相对可靠的数据。大多数 情况下,人眼倾向于比较邻近样品的运动运动轨迹,任何形式的生物运动都很难进行重复测定,这在一 些罕见或者未知的运动形式测定中更是如此,因此准确记录生物的运动轨迹至关重要。

影像式目标定量测定 影像式测定手段作为一种比较新型的技术,能够把数据采集和分析两个过程完全分开,这就使得客 户可以按照预先设定的频率采集图像,而不受到图像存储和分析的影响,之后获取的图像存储于一个大 型服务器中,再利用专业而强大的软件处理图像,便可以对复杂的生物运动进行分析,甚至可以获得整 个生物体质心的运动轨迹。与人眼观察相比,影像式测定方法的观测频率(一个时间单位内的成像次数) 完全可控(几秒或者几分钟),已经可以对太快或者太慢的生物学运动进行测定了。 LemnaTec ScanalyzerHTS和ScanalyzerPL系统的成像单元能够对整个多孔板甚至更大的区域进行成像, 并保证较高的图像分辨率,比如一个 96 孔板中放置了 500 甚至更多个微生物,只要这些微生物在图像 中可见,那么成像系统就可以完成成像。如果微生物体积较小或者行动微小,ScanalyzerHTS系统还可以

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进一步放大其分辨率进行成像(100 倍像素),用户可以在 2-10 张图像中逐像素点比较,从而鉴定和量 化微生物的微弱运动。除此之外,整个生物体的轮廓也可以进行分析(不仅仅是质心),甚至生物体内 的一些运动轨迹(弯曲扭转)同样能够被量化,多孔板空间较小限制生物体运动的问题也不复存在。相 似的,生物体自动运动轨迹分析功能为人眼鉴定生物体运动形式提供了强大的支持,它能够在特定位置 描绘相应的伪色图形,这些图形能够被任意的图形颜色分析功能所分析,最后获得生物体瞬时运动轨迹 模型。这种分析方法不依赖于何种生物类型,适合快速广泛的生物运动测定。

应用实例 蚊子幼虫-成群生物的运动模型 利用一些化学物质或者天然提取药剂抑制蚊子幼虫运动,是一个典型的高通量测定方案。与水蚤测 定相似,蚊子幼虫生态毒理学测试也在 96 孔板中进行。生物体的自动分配会导致多孔板每个孔中生物 体数目的改变,而发育测试会导致生物体的大小明显不同,然后利用成像技术对每个孔中生物体的大小 和数目进行成像,标准化生物体的定量运动。

图 1 放大的原始图像,对 96 孔板中的 12 个孔进行成像,其中包含 8 个对照(1a-1f、2b+2c),4 个处理:2a(表面活性 剂)、2d(5%的乙醇)、2e(50%的乙醇)和 2f(尼古丁)。

该过程中要注意以下几个方面: 1、生物体的运动会随着时间发生改变,因此必须给予对照孔足够的控制以保证其正常的运动水平; 2、由于生物体在有限的空间内会急剧的运动,因此记录其随机位置的改变比跟踪其运动速率更加重要; 3、由于生物体运动较快且无规则,因此观测时间设置为 3s,在此期间拍摄 10 张图像,保证获得足够的 数据进行统计学分析。

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图 2 颜色分类图像,对 96 孔板中的 12 个孔进行分析,其中包含 8 个对照(1a-1f、2b+2c),4 个处理:2a(表面活性剂)、 2d(5%的乙醇)、2e(50%的乙醇)和 2f(尼古丁),颜色编码代表了运动位点和密度。

生物群体在有限的空间内运动,必定会存在交互作用,某个个体的运动会对其它个体有一个刺激作 用。正因为如此,LemnaTec 引入一个附加的数字模型来校正生物体的运动抑制曲线,大量的对照组数据 分析表明,指数模型是比较理想的选择。由于生物体运动轨迹分析快速且不影响生物体本身习性,因此 长期监测其行为变化是完全可行的,并且这对药理学研究具有重要的价值。

图 2 对数运动区域,区别有效和无效的物质浓度水平,活动阈值是通过之前对对照组的显著性测试定义的。

鱼卵分析-不同水平的不规则运动分析 鱼卵测试是一个研究脊椎动物发育效应的高通量测定方案,我们可以获得大量的不同时间点的发育 参数,然而流动参数仍然是一个很大的挑战。一方面,运动形式为肌肉功能和神经发育提供了丰富的信 息;另一方面,鱼卵内胚胎的行为是一系列短而快的活动,接着是几秒钟的静止期。因此,观察频率必 须相对较长,可达 30 秒。 本实例中,每 1 秒成像两次,并计算出不同时间间隔的运动活力,持续观测尼古丁对胚胎活力的影 响(图 4-5) 。图 4 我们可以清楚的看出尼古丁如何促进胚胎的活力,然而在 2 小时培养之后,活力显著 下降至低于培养前水平。 http://www.zealquest.com

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图 4 加入尼古丁前一个鱼胚胎的累积运动次数(t=0min 之前测定)

更详细的动态分析见图 5,加入尼古丁前对照组测定值显示胚胎活动时期为 1-1.5s,平静时期为 3-5s, 加入尼古丁之后的前 10min 没有引起胚胎活动期数目的改变,但是之前活动时期的 2 倍。50min 后,胚 胎活力回复到培养之前水平,但活动时间和频率大大降低。 该示例表明胚胎运动的数据能够进行不同水平的详细分析,主要取决于客户的实验目的。

图 5 鱼胚胎的活动模式,Ref1-3 表示加入尼古丁之前,Nic 表示加入尼古丁之后,其中 Nic1=0min、Nic2=2min、Nic3=5min、 Nic4=9min、Nic5=53min、Nic6=112min、Nic7=262min。

线虫分析-两步成像法 线虫测定是另外一个基于动物模型的高通量测定方案,与遗传学、药理学和毒理学密切相关。在这 个特定的应用方案中,多孔板中的细菌悬浮液以及相对较低的分辨率致使单个线虫很难被观察到。采用 逐像素的分析方法,线虫的运动分析还是可行的,结果如图 6 所示。 采用这种方法分析线虫运动,还可以进一步提高图像分辨率,可以对感兴趣的某一个孔进行二次成 像,这样就可以量化和描述单个线虫的运动轨迹了。

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图 6 LemnaTec 暗视野照明条件下,96 孔板中线虫的低分辨率图像(每板 4 张图/每张图 24 个孔),右边为线虫活动轨迹 颜色分析图像。

图 7 左:原始图像;中:运动线虫分析;右:运动轨迹量化

蚜虫分析 运动轨迹分析并非仅仅局限在水生生物领域,为了鉴定生活的蚜虫,必须找到一种方法来有效鉴定 死亡蚜虫、静止不动的蚜虫(用嘴固定在叶片上)和可生育蚜虫。由于蚜虫在吮吸汁液的时候静止不动, 所以必须采取适当的手段诱导蚜虫在指定时间内运动,针对不同种的蚜虫诱导因素有所不同。其中,一 些种的蚜虫对紫外线比较敏感,还有一些种需要高能红外灯进行热诱导。

图 8 此测试中,采用强紫外线闪光刺激叶片上蚜虫移动(左) ,而自然光下的蚜虫几乎不动,此外还可以选择用强红外照 光对蚜虫进行热诱导。

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由于很多蚜虫善于伪装,因此对图像进行逐像素分析微小颜色的变化,对于进一步鉴定蚜虫的运动 是一个很好的补充。

结论 LemnaTrack运动轨迹分析作为一种强大的分析工具,对于量化和鉴定不同种生物的运动轨迹和生活 习性具有重要意义。

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73-LemnaTrack HTS—行为分析概述  

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