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LemnaTec Scanalyzer3D—热成像方法

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介绍 随着技术的进步以及对植物表型组学认识的不断深入,使我们对整个植物生长发育过程的理解和测 定手段有了更新的看法。尤其是先进、无损伤的成像技术,配以特定的植物传感器和适宜数据分析模型, 对于我们描述和量化植物表型性状信息,甚至是一些较为复杂的性状(如抗性),提供了一条有效的途 径,这必将大大推动作物遗传育种工作的发展。 为了更好的了解植物表型、基因型以及环境之间的关系,首先必须明确一个概念,那就是“一个表 现型”实际上是一个非常复杂的功能网络,需要有大量的量化的参数加以描述,这其中除了包括遗传背 景以外,还包含了所有的形态学指标和生长模型,以及植物对短期或者长期环境条件的特殊反应,比如 营养缺乏、灌溉、病虫害、极端温度以及干旱等等。因此,想要获得准确可靠的实验数据,就必须在严 格控制的环境条件下种植大量的植株,并且间隔一定的时间要对每一个单株进行综合的、无损伤的测定, 同时为了区分每个因素所引起的特定表型,还必须采用合适的数据模型分析数据。本文着重介绍了利用 LemnaTec Scanalyzer3D系统进行热成像,在实验设计、测定过程及模型选择上所要主要的一些内容。

热成像的特殊动力学 植物热成像与可见光、荧光、近红外等其它成像类型有很大不同,因为没有其它电磁波辐射与环境 条件如此相关,同时,植物叶片温度较其它受气孔开关影响的参数来说,变化更为迅速。植物热成像的 结果取决于内外两方面的因素,因此成像方法起到了决定性作用。 气孔关闭的植物显示的温度实际上就是周围环境的温度,会随着外界环境的变化而变化(一天内的 温度变化会超过 10℃) 。但是,由于太阳辐射的缘故,直接暴露在太阳下的植物叶片会显示出比环境温 度更高的温度(10℃甚至更高)。此时,比较薄的一些植物组织会在几秒钟或者几分钟内改变温度以适 应环境温度的改变,而对于一些较厚的组织(如茎秆),由于其较强的耐热性,适应时间相对较长。 气孔打开的植物由于水分蒸腾作用,叶片温度下降相对较快,此时叶片温度实际上是环境温度和水 分蒸发温度下降共同作用的结果。然而,植物气孔的水分蒸发量又取决于其他的环境因子,如空气相对 湿度、风速等等,这无论对大田还是温室都会产生非常重大的影响。综上可知,叶片温度实际上是几个 因素共同作用的结果,其中有些因素可以加以控制,而一些因素则必须通过合适的统计学手段以及成像 方法进行标准化,进一步降低实验误差。

热成像—短暂的物理现象 任何时候进行热成像,我们都会获得一个经过校正的颜色编码图像,它所反映的是一个绝对温度, 要么是植株或叶片上的某个点,要么是背景,类似于不同接触式温度计测定的温度。实际上,用任何成 像系统测定样品辐射都有一个明显的差异,那就是它不仅仅受温度的影响,还受到材料属性的影响,材 料属性决定发射率,通常情况下,水和木头的发射率在 0.9 左右,而光亮的铝板只有 0.1。材料属性的差 异会导致不同的发射率(导致热图像颜色改变),即使被测物本身拥有完全相同的温度。物理背景是热 辐射测定的另外一个因素,它有利于集中相对差异。因此,我们不能把物理温度测定作为植物成像的结 果。

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影响因子控制 由于植物生长依赖于太阳光,因此绝对控制温室中的环境条件是不可能的,但是通过 LemnaTec 自 动传送系统的随机分布功能,能够有效的平衡空气相对湿度和风速等因素。值得注意的是,进入成像单 元之前,所有的被测单株都必须处在相同的环境条件下。因此,处于同一排的所有植物单株,其所处的 环境条件要么被严格控制,要么保证整个温室条件一致。除此之外,将成像区域与温室培养区域隔开, 传送系统将植物逐盆从温室运至成像区域进行成像是消除环境误差的最佳途径。

图 1 降低光照强度(从日光到弱光)后,香蕉树的温度动力学变化(300s 时间)。黄色的增加意味着由于蒸腾作用减弱 导致植物温度上升,绿色的树干热容量相对较好,温度变化较慢。

LemnaTec 热成像概念 热成像比较容易受到环境条件的影响,比如温室中金属零件的反光等等。出于这个原因,LemnaTec 所有成像过程均在一个完全封闭的暗室中进行,这样可以有效地降低实验误差。为了避免暗室辐射对植 物的干扰,它保持当前环境温度不变。因此,与外界环境温度相近的植物部分很难与背景区分开来,但 是通过可见光图像和红外图像进行匹配,就能够很好的解决这个问题了。采用这种方法,植物的热像轮 廓便能够轻易的与任何背景进行区分了。

相对差异的重要性 以上提到的方法保证我们通过热成像能够获得重复性的结果,但由于固有因素(相对湿度和风速) 对于环境绝对温度的影响并不能被完全消除,只能被降低到一个很小的范围。因此,叶片温度的绝对值 并没有太大意义。与此相反,相对值则显得更加重要,成像反映小的差异,并不是在很大精度条件下测 定绝对温度。

各种相对差异提供的信息

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一般方法 如上所述,测量单株叶片温度的绝对值并没有太大意义,因为叶片温度是一个综合的参数,受多个 环境因子的影响。出于这个原因,获得大量的数据、统计学分析以及分析模型的选择都是必须的。以下 章节将重点介绍该过程中的一些主要问题。

平均温度 VS 温度分布 叶片平均温度的计算看起来要比平均颜色的计算更简单,但存在的主要问题比较相似:如何在保持 合理的实验结果情况下平均温度和颜色?平均过程中会丢失多少信息?理论上,在单株数目满足正态分 布假设条件基础上,为平均值赋予意义。这里所说的热成像,植物的不同部分由于不同的原因显示不同 的温度,这些不同可能来自于不同的适应性、不同的蒸腾速率、不同的热容性等等,大多数影响影子与 植物表型建成密切相关,最终产生不同的模型。基于这个原因,平均化的基本假设(无论是正态分布, 还是假设植株间自身相似)都是不成立的。与颜色分类方法相似,LemnaTec 强烈建议采用一套温度级别, 对每一个单株的温度分布进行量化。

植物间差异 如果大量植物叶片温度分布表现正常,那么对一系列成像植物进行“移动平均数”计算是有意义的, 在此基础上, “异常点”就比较有意思了。获得的数据经过 LemnaBase 软件进行统计学分析,便可以知 道这些异常点与动力学曲线之间的距离,或者异常点与平均值之间的偏差,这些是在任何一个试验中都 要回答的问题。

图 2 一系列植物“移动平均数”模型,包含了“异常点” 。很明显,植物的顺序起到决定性作用,而并非是绝对值。

与对照植物的偏差 在很多试验中,对照单株也会被放置到每一条传送带上,用于标准化其它所有被测单株的温度值。

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只有真实的数据,通过不同的手段进行分析,才能反映出大量详细的信息,但可能存在较大的差异,比 如物种间或者温室特定环境条件等等。

植物材料差异 植物由于蒸腾速率发生改变,导致其温度变化比较显著,而随植物一起传送的培养盆和传送车则不 会发生这种变化,它们会根据环境辐射条件进行调整,从而保持某一特定温度值,这主要取决于它们的 颜色、朝向和材质。在波动的环境条件下,根据自身的热容量不同,它们表面的温度变化会比植物慢的 多。此外,还要考虑到发射率的问题(之前提到的),尤其是当没有聚焦到相对差异的时候。 关于传送带上的植物、培养盆以及传送车的不同部分可以被用于对照,对被测植物温度进行标准化。 比较有意思的是培养盆(高热容量)、蓝色盘(低热容量)和黑色柱子(推测为中间热容量)的变化。 任何情况下,红外摄像头所测定的都不是表面温度,而是与表面温度、材料表面属性相关的热辐射放射。 高通量条件下,通过红外成像获得数据/表型参数是一个新的领域,已经远远超过了在一张图像上研究两 个植物单株相同点不同叶片温度的方法。

结论 高科技的成像设备、发达的传感器技术、广泛的实验方案、合理的数据模型、先进的统计学手段的 有机结合,构成了高通量研究植物表型组学的基础。实践证明,采用成像的手段研究植物表型是有效的, 即使对于像热成像这种高度动态过程。高通量热成像是一个相对新型的研究领域,尤其适用于在波动环 境条件下研究植物温度的动力学变化,并不是简单的对所感兴趣的植株进行拍照。LemnaTec Scanalyzer3D 成像技术及自动传送系统必定会极大的推动热成像领域的发展,使之更好的为植物表型组学研究服务。

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