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普通生物實驗 共筆

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單元一:顯微鏡使用及原理介紹 一、

實驗原理

顯微鏡是傳統動物學及植物學實驗室中必備的工具,使用顯微鏡前後有幾點需要 注意: A. 載物台是否有降至最低。 B. 最低倍物鏡(4X)對準光圈,在光鏡上。 C. 鏡頭是否有汙損。 D. 拿顯微鏡的時候一手扶鏡臂;另一手扶著底座。 顯微鏡的歷史十分久遠,1610 年時伽利略利用顯微鏡觀察生物;1665 年虎克利 用顯微鏡看到植物細胞的細胞壁,命名為細胞(Cell);1667 年雷文霍克利用顯 微鏡發現細菌。目前在實驗室中使用的顯微鏡可以分為以下幾種: ◎光學顯微鏡(Optical Microscope):光學顯微鏡利用透鏡組來放大物體,可分 為複式顯微鏡及解剖顯微鏡。 ◎電子顯微鏡(Electron Microscope):穿透式電子顯微鏡(transmission electron microscope)使人看到細胞和胞器(organelles)內部的組織結構; 掃描探針顯微鏡(Scanning probe microscopy, SPM) :可提供細胞與生物表面 之影像。 根據顯微鏡的特性及染色的技術,我們可以得到以下幾種影像: (a)Brightfield(Unstained specimen) 讓光線直接穿過樣本,除非樣本本身有色素,否則影像的對比很弱。 (b)Brightfield(Unstained specimen) 利用各種染色來增加對比,不過大部分的染色程序將降細胞固定。 (c)Phase-Contrast 經由增擴樣本內容之密度差異而增強物染色細胞的對比,尤可以用來檢視不 含色素的細胞。 (d)Differential Interference Contrast (Nomarsk) 類似相位差(Phase-Contrast)顯微鏡,使用光學改良式設計來強調密度的差 異。 (e)Fluorescence 可顯現分子在細胞中的位置,螢光物質會吸收較短波長的光而發射出較長波 長的可見光,有些細胞中即具有可發螢光的物質,但更常的是人們將螢光物 質黏附至我們所感興趣的分子上。 (f)Confocal 利用雷射及特殊視覺進行「光學切片」 ,唯有焦點之狹窄深處內部會顯現黑色, 而非模糊,這種顯微鏡亦使用螢光染色的樣本。 在了解顯微鏡的工作原理之前,我們先了解幾個解析度,人眼在明視距離為 25cm 時,僅可分辨相距約 0.1-0.2mm 的物體,意即當兩物體相距不到 0.2mm 時,人眼 為將之視同一物體,光學顯微鏡的解析度約 0.2μm,電子顯微鏡的解析度則為 0.2nm。


1. 接目鏡(Ocular Lenses or Eyepieces):位於鏡筒的頂端,進一步放大物體 的像,一般放大倍率為 10X,在目鏡內有測微器及指針,有些接目鏡上裝有 調節輪,可因應個人焦距而改變。 2. 景深(Depth of field):是指在一個聚焦平面,視野清晰範圍內可觀察到檢 體影像的厚度。 3. 接物鏡:鎖於物鏡轉盤上,一般來說有 4X,10X,40X,100X(油鏡)四種鏡頭, 每一隻物鏡上有固定的放大倍率(Magnification, Ex: 40X)、數值光圈 (Numerical Aperture, Ex: 0.65),數值光圈表示物鏡捕捉光線的能力,數 值愈高捕捉光顯能力越強,解像力越佳、工作距離(Working Distance, Ex: 0.6mm),工作距離代表成像時物鏡與標本之距離,與放大倍率及景深成反比, 有些鏡頭上還有蓋玻片容許最大厚度(40X 時為 0.17mm)。 4. 機械筒長(Mechanical Length):指從物鏡至接目鏡的光徑長度。

二、

實驗結果與討論

◎實驗一:影像的方向與標本玻片觀察 從本實驗中可以發現在玻片中央寫的 pqbd 字母在顯微鏡下影像仍為 pqbd,這是 複式顯微鏡影像的特性:上下相反,左右相反。另外觀察鴨拓草下表皮細胞標本 中可以發現帶有葉綠體的保衛細胞及不具葉綠體的表皮細胞;經過亞甲藍染色後 的人類口腔黏膜細胞外觀呈不規則狀,細胞內有明顯藍色的細胞核。

鴨拓草下表皮細胞(左)人類口腔黏膜細胞(右) ◎實驗二:物鏡視野的觀察 從本實驗中可以發現使用放大倍率越高的物鏡所得到的視野越小。


◎實驗三:影像的對比 藉由調整光圈(Condenser Iris Diaphragm)的大小觀察樣本的對比,當顯微鏡觀 察暗的樣本時,利用光圈調整對比,光圈慢慢縮小,樣本影像對比將減少,反之 亦然。 ◎實驗四:不同放大倍率的物鏡有不同的景深 將黃、藍、紅三根絲線在玻片上交叉後,在顯微鏡下觀察,並轉動細調節輪制看 清楚為止,觀察樣本影像顏色之變化。

單元二:水中生物觀察 一、

實驗原理

在了解顯微鏡的使用後,將顯微鏡拿來觀察水中小生物,水中小生物通常可分為 原生動物及藻類,也有可能是節肢動物。 ◎原生動物: 原生動物細胞上具有鞭毛(flagella),如眼蟲、腎形蟲等。 原生動物具有偽足:如變形蟲、蕈頂蟲等。 原生動物細胞表面具有纖毛(cilia),如纖毛蟲、草履蟲、鐘形蟲等

眼蟲(左)、變形蟲(中)、草履蟲(右) ◎藻類: 藍綠藻類生物如葛米仙藻、顫藻、念珠藻、藍鼓藻等。 綠藻類生物有單細胞及多細胞群體兩種型態,如團藻、鼓藻、盤星藻、水綿、四 聯原藻、新月藻、實球藻等。 黃金藻類生物如矽藻等。

顫藻(左)、新月藻(中)、矽藻(右) ◎無脊椎動物:輪蟲、瓢體蟲、線蟲、水蚤、孑孓、水蠆等。

水蚤(左)、輪蟲(中)、線蟲(右)


單元三:蛋膜的滲透作用分析 一、

實驗原理

細胞膜為一脂雙層的結構,細胞膜上面嵌有通道蛋白,可讓細胞所需的物質通過, 物質通過細胞膜的方式有:擴散作用,如氧氣、二氧化碳等氣體分子;水擴散通 過細胞膜的方式特別稱為滲透作用;有些物質可以不耗能藉由膜上的通道或是攜 帶蛋白進入細胞,如離子通道;而有些物質需藉由耗能方式進入細胞,稱為主動 運輸,如鈉鉀幫浦。 擴散作用是一種物質從高濃度往低濃度移動的現象,可以從自由移動的液體及氣 體中發現這樣的現象,外力可以加快擴散的速率,溫度、擴散表面積、介質及分 子質量皆會影響擴散的速率,而溶質的濃度則決定擴散的方向。滲透壓(Osmotic Pressure),滲透作用對半透膜所造成的壓力,溶液濃度越高,滲透壓越高;溶 液濃度越低,滲透壓越低,水分子淨移動方向:滲透壓低→滲透壓高,擴散作用 最著名的例子即為”一家烤肉萬家香”。 動物細胞的滲透作用,當動物細胞處於高張的環境下,細胞內的水分子會滲透至 胞外,造成細胞萎縮;等張環境下,進出細胞的水分子數量達成平衡,細胞維持 正常形狀;在低張環境下進入細胞的水分子較多,造成細胞膨脹甚至破裂。若將 植物細胞放入不同滲透壓的環境中,在高張環境下會有細胞膜與細胞壁分開的現 象;在低張環境中,植物細胞因有細胞壁的關係,細胞並不會破裂。

動物細胞在低張(左)等張(中)高張(右)環境下的狀態

二、

實驗步驟與結果

細胞膜是一種半透膜,在滲透作用進行時具有選擇性,可以讓溶液中的部分物質 通過膜到膜的另一邊,本次使用的半透膜有兩種:蛋膜(將雞蛋內容物取出後, 將雞蛋泡於醋酸溶液中約一天即可小心的將蛋殼與蛋膜分離)及賽璐珞材質 (Cellulose)的人工差異透析膜。 ◎實驗一:滲透作用 取透析膜袋數個,內裝入蒸餾水及不同濃度的蔗糖溶液,稱重紀錄之,之後放入 蒸餾水中 30 分鐘後取出再次稱重。實驗發現裝有蒸餾水的透析袋重量幾乎不變, 裝有蔗糖溶液的透析袋,袋內蔗糖溶液的莫耳濃度與袋外相差越多,重量變化百 分比越高,水分子易從低張溶液往高張溶液擴散。 ◎實驗二:半透膜的選擇作用 在試管 A 中倒入碘液後以半透膜封口,再置入裝有澱粉液的燒杯中;另一試管 B 倒入澱粉液後以半透膜封口,再置入裝有碘液的燒杯中,靜置後發現試管 A 管口 外部出現藍黑色錯合物;試管 B 管口內部亦出現藍黑色錯合物。


三、

實驗討論

◎為何要計算重量改變百分比,而不是簡單的重量改變: 每段透析袋長度不同,棉線長也不同,故重量不一,所裝的 10mL 容易因濃度不 同,重量也不一,故在比較實驗數據時,使用重量改變百分比會比使用重量改變 更能顯現實驗結果。 ◎滲透壓實驗的設計: 1.將 0.6M 蔗糖溶液置於試管中,管口 以透析膜封住後倒放於裝有蒸餾水 的燒杯中,靜置 30 分鐘後,觀察試 管內水面高低。 2.取A,B兩試管,分別加入 15mL (A) NH 4 OH和 (B)phenol red 水溶液 以透析膜封口後,將試管A倒放置於 置裝有phenol red 水溶液的燒杯中; 將試管B倒放置於置裝有NH 4 OH的燒 杯中,靜置 10 分鐘觀察兩試管顏色。

單元四:酵素活性分析 一、

實驗原理

鎖鑰模型(Lock and Key Model)是 1890 年由 Fisher 提出,他認為酵素的特異校 表現於酵素與受質之間的結構互補特性;而 Koshland 的誘導配合模型 (Induced-fit Model)則認為當受質與酵素結合時活化位會發生構型的改變以配 合受質的結構。 ◎輔酶(Coenzyme):亦與酵素活化位結合,可提供反應基團,如維生素 B 群、 葉酸 (Folicacid)、生物素 (Biotin)。

◎輔因子(Cofactor):許多金屬離子,如Zn2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, Cu2+以離子鍵的方 式與酵素結合,許多酵素若失去了輔因子就會失去催化的能力,此狀況下的酵素


成為酶原(Apoenzyme),而具有完整活性的酵素則稱為全酶(Holoenzyme)。 ◎輔基(Prosthetic Group):有些酵素可與此類分子緊密結合,除非酵素被破壞, 否則此類分子很難與酵素分開,輔基亦提供一個強力的反應基團,吸引基質快速 參加反應。

二、

實驗步驟與結果

◎實驗一:Catecholase 的影響 Catechol,一種多酚,當受到 Catecholase(淡黃)的催化後可以氧化為醌類 Benzoquinone(深棕),將馬鈴薯抽出物(內含 Catecholase)與 Catechol 及水混 合後,放在室溫 5 分鐘後觀察顏色;實驗發現當酵素及受質皆存在下,溶液變色; 而控制組中,缺少酵素或受質的試管皆不變色。 ◎實驗二:受質的特異性 Hydroxyquinone 為 Catechol 的異構物,與兩試管分別加入 Hydroxyquinone 及 Catechol 後加入酵素及水反應五分鐘。實驗發現酵素具有受質特異性,只會與 Catechol 反應,使溶液變色。 ◎實驗三:溫度的影響 將酵素、水、Catechol 的混和液分別放在不同的溫度中五分鐘後觀察顏色變化, 實驗結果發現在 37℃下酵素反應速率最快。 ◎實驗四:pH 的影響 將酵素、水、Catechol 及特定 p H 的緩衝液混和,反應五分鐘後觀察顏色變化, 實驗結果發現在 pH=10 下酵素反應速率最快。

三、

實驗討論

◎說明控制組及實驗組的意義: 控制組:在實驗一中,mix 2 及 3 各抽換了一個變因,控制組的設計能維持實驗 的準確性 ( Negative Control)。 實驗組:改變單一變因,觀察不同組實驗結果。 ◎為何在切開水果(如蘋果)表面放上檸檬汁可以延緩水果的氧化(變棕色): 從實驗中可發現 catecholase 在酸性環境下會失去活性,而檸檬汁的 pH 值偏酸, 故在切開的蘋果上放上檸檬汁能延緩水果表面的氧化。

單元五:食品中營養成分的分析 一、

實驗原理

◎醣類(Carbohydrates):醣類(CH 2 O) n 為構成生物體的主要成分之一,亦是人體 主要的能量來源,根據單元體數的不同,可以分為單醣,如葡萄糖、半乳糖及果 糖等;雙醣,如蔗糖、麥芽糖等;及多醣,如纖維素及澱粉等。而單醣可以因分 子結構的不同,分為醛醣(Aldose)及酮醣(Ketose),酮醣可以利用半縮醛方式轉 換為醛醣,醛基具有還原性,因此這些醣被稱為還原醣(Reducing Sugar),還原 醣可以與本氏液(藍色)反應經加熱後根據醣類含量呈現綠、黃、橙、紅四色錯合 物,澱粉則可以與碘液(黃褐色)中的碘分子形成藍黑色錯合物。 本氏液成分:CuSO 4 、Sodium Citrate、Na 2 CO 3 ◎脂質(Lipid): 脂質是由甘油與脂肪酸脫水縮合而成的物質,天然的脂肪酸多含有偶數個碳,若 脂肪酸碳鍊間皆為單鍵成為飽和脂肪酸;碳鍊中含有雙鍵則稱為不飽和脂肪酸, 動物性脂肪中除了魚肝油外多含有胞和性脂肪酸、在室溫下為固體;植物性脂肪 除了椰子油外多含有不飽和脂肪酸,在室溫下為液體。蘇丹四號(一種暗紅色染


料) 可以溶於脂質並使脂質呈鮮紅色。 ◎蛋白質(Proteins): 蛋白質主要是由C,H,O,N,S等元素組成,分子量約一萬 至百萬不等,蛋白質是由胺基酸組成,每一個胺基酸 均有胺基跟羧基,在多肽鍊中,胺基與羧基形成胜肽 鍵,雙脲試劑(Biuret reagent,淡藍色)中的銅離子可 以與肽鍵形成藍紫色錯合物。雙脲試劑中的鹼提供鹼 性環境;CuSO 4 則提供銅離子做錯合。 雙脲試劑成分:NaOH、CuSO 4 ◎維生素 C(Vitamin C): 維生素 C 為水溶性,缺少時會得壞血病,它廣泛存在於蔬果中,具有強烈還原性, 利用 2,6dichlorophenol indophenol(DCPIP),使其被還原後由藍色變成無色。

單元六:植物細胞內色素體與晶體的觀察 一、

實驗原理

◎質體(Plastid),是一種植物特有膜狀胞器, 在未分化前稱為原質體(Proplastid),葉綠體的 前驅胞器稱為黃質體(Etioplast),黃質體照光 後分化為葉綠體(Chloroplast),若質體中的葉 綠素消失,同時含有類胡蘿蔔素及葉黃素等色素 則稱為雜色體(Chromoplast),而白色體 (Leucoplast)可以根據其內含物的不同分為澱 粉體(Amyloplast)、造油體(Elaioplast)及蛋白 體(Proteinplast),白色體通常存在於植物體不 見光的部分,具有儲存功能,當白色體照光後即 變為葉綠體。 ◎澱粉粒(Starch Grain)存在於光合作用細胞及儲存養分的細胞中,如馬鈴薯的 塊莖、甘藷的塊根中,每種植物的澱粉粒形狀不一,且有紋理,可以藉由澱粉粒 大小及形狀的不同分辨植物。 ◎結晶(Crystal)是植物細胞生活的廢物,結晶體形狀不一,有針狀、簇狀、多 面體等,草酸鈣結晶是由草酸與鈣鹽形成,碳酸鈣結晶是指在細胞壁的特殊瘤狀 突起上聚集了大量碳酸鈣形成葡萄穗狀晶體,如鐘乳體。

由左而右:鐘乳體、多面體結晶、針狀結晶、簇狀結晶


單元九:DNA模型的探討與製作 一、

實驗原理

1. 2. 3. 4.

去氧核醣核酸(DNA)是由核苷酸所組成。 核苷酸由鹼基、去氧核醣及磷酸根所組成 鹼基連接於五碳醣的 1 號碳位置;磷酸根連接於五碳醣的 5 號碳位置。 兩個核苷酸之間,3 號碳上的-OH 與五號碳上的磷酸根形成磷酸二酯鍵 (Phosphodiester bond),如此接下去形成長鍊。 5. DNA 長鏈具有方向性,分別為 5’-P 及 3’-OH。 6. 在 DNA 鹼基配對時,腺嘌呤(Adenine,A)與胸腺嘧啶(Thymine,T)之間以兩個 氫鍵鍵結;胞嘧啶(Cytosine,C)與鳥糞嘌呤(Guanine,G)之間以三個氫鍵配 對。 7. 本次製作的 DNA 模型為右旋的,這種 DNA 成為 B DNA,存在於正常的環境中, 另外還有 A 及 Z DNA,B DNA 每一扭曲單位約 10 bp (Base Pair),長度約 0.34nm, 半徑約 1.0nm,兩個鹼基之間距離為 0.34nm,因此扭曲而非對稱,雙股螺旋 表面會有 Major Groove 及 Minor Groove,這樣的結構對於蛋白質與 DNA 之 間的交互作用很重要。

鹼基配對(左)DNA 雙股螺旋(右)

單元十:有絲分裂標準玻片觀察 一、

實驗原理

細胞週期由以下幾個時期所組成:G1,S,G2,M,在兩個前期(G1 及 G2)中,細胞持 續生長,在 S 期中,細胞則進行 DNA 複製,並在 M 期進行細胞分裂(Mitosis,有 絲分裂),一些高度分化的細胞,如神經細胞會停於 G0 期,在細胞週期中有三個 檢查點(Checkpoint),分別位於 G1,G2 及 M,細胞會產生週期素(Cyclin)並累積 其濃度,並與細胞中的週期素相關激酶(Cdk,Cyclin-dependent Kinase )結合成 MPF(Maturation Promoting Fator)複合體, 當 MPF 累積到一定的量即可通過檢查點, MPF 會磷酸化許多控制細胞周期的蛋白質, MPF 作用後一段時間,周期素會被降解, 周期素相關激酶則回到細胞中。


◎G2 間期(G2 of Interphase):中心體及染色體均已複製。 ◎前期(Prophase):核仁消失,染色質濃縮為姊妹染色二分體,兩個中心體間產 生微管構成的紡錘絲 ◎前中期(Prometaphase):核膜消失,染色分體間產生著絲點(Kinetochore), 由中心體發射出的微管接到著絲點。

◎中期 (Metaphse):為有絲分裂最長的一期,染色二分體排在細胞中央,每個 染色二分體著絲點上均有來自細胞兩端中心體的紡錘絲。 後期(Anaphase):為有絲分裂最短的一期,姊妹染色體分離並往細胞兩及移動。 末期(Telophase):兩個子細胞形成,核仁及核膜出現,染色體變為染色質,之 後進行胞質分裂(Cytokinesis)。

植物的細胞分裂


單元十一:減數分裂標準玻片觀察 一、

實驗原理

◎前期 1:染色體濃縮,同源染色體發生聯會(Synapsis)及互換,中心體往兩極 移動並發射出紡錘絲。 ◎中期 1:染色四分體排在細胞中央,每個著絲點上均有來自細胞兩端中心體的 紡錘絲。 ◎後期 1:同源染色體分離,並往細胞兩極移動。 ◎末期 1 及胞質分裂:2 個子細胞形成,染色體為單套。

◎前期 2:紡錘絲形成。


◎中期 2:姊妹染色二分體排在細胞中央。 ◎後期 2:姊妹染色分體分離 ◎末期 2 及胞質分裂:共形成四個子細胞,均具不同的基因組合。

a.細絲期(Leptotene):染色體聚縮。 b.偶線期(Zygotene):發生聯會(Synapsis)。 c.雙絲期(Pachytene):染色體互換。 d.粗絲期(Diplotene):部分物種在此時期有大量 RNA 生成。 e.終變期(Diakinesis):染色體聚縮完全形狀變得十分粗短,進行DNA修補工作, 準備進入分裂。

水仙雄蕊花藥切片


單元十二:人類染色體鑑定 一、

實驗原理

真核細胞的染色體結構包含 DNA、RNA 及蛋白質(組織蛋白及非組織蛋白),組織 蛋白(Histone)含有大量帶正電的胺基酸:精胺酸(Arginine)及離胺酸(Lysine), 有 H1,H2a,H2b,H3,H4 五種,他們的序列非常保守,組織蛋白具有穩定染色體結 構及促進 DNA 纏繞的功能;非組織蛋白結構差異性大且有組織專一性,參與 DNA 複製、轉錄與修復等生理活動。 染色體的中節(Centromere)為細胞分裂時染色體與紡錘絲結合的地方,具有重複 的 DNA 序列;端粒(Telomere)位於染色體的末端,可以保護染色體不被壞,端粒 具有重複的 5’-TTAGGG 序列,端粒會隨著分裂而變短,若細胞中具有端粒酶 (Telomerase),細胞可以節由端粒酶將特定序列加至染色體尾端,分化程度越高 的細胞端粒酶活性越低;癌細胞具有端粒酶,因此可以不斷分裂。 DNA 與 H2a,H2b,H3,H4 四種組蛋白纏繞形成核小體(Nucleosome),核小體再與 H1 及 linker DNA 連接形成染色絲次單元,多個染色絲次單元再經過纏繞、螺旋、 摺疊等步驟變成染色體。

二、

實驗器材與步驟

在細胞分裂中期加入秋水仙素使細胞週期停止,將染色體經過物理及化學處理後 染色並拍照,所得的染色體圖譜稱為 Karyotyping。染色後的 23 對染色體呈現 出不同的條紋,根據染色體中節的位置可以將之分為: Metacentic:中節上方的染色體稱為 p arm;下方稱為 q arm,若 p 及 q arm 長 度相當稱為 Metacentric。 Submetacentric:若 p arm 比 q arm 短,則稱為 Submetacentric。 Acrocentric:若中節上方為衛星 DNA,此類型稱為 Acrocentric。 綜合染色體的條紋及中節位置可將之分為 7 組,: A:染色體第 1 至 3 對,第 1 對染色體是 23 對染色體中最長的一對。 B:染色體第 4 及第 5 對,為 Submetacentric。 C:第 6 到第 12 對染色體及 X 染色體,Submetacentric。 D:第 13,14,15 對染色體,Acrocentric。


E:第 16,17,18 對染色體。 F:第 19 及 20 對,Metacentric。 G:第 21 及 22 對染色體及 Y 染色體,第 21 對染色體是最短的一對。 衛星染色體(Satellite Chromosome):有衛星區的染色體,每種生物至少有一對, 人類有 5 對(Group D, Chromosome 21,Chromosome 22),內有製造 rRNA 的 DNA。

利用條紋技術檢測人類染色體的缺失,如錯位,缺失等,以下介紹四種條紋技術: ◎C band:代表基本異染色質(constitutive heterochromatin),染色較深的條 紋是基本異染色質部份,出現在中心節附近及染色體的尖端,可用來鑑定哺乳動 物的 Y 染色體,因為 Y 染色體整條都是異染色質。 ◎G band:G 代表用金沙染料染色((Giemsa staining),先經鹼性鹽溶液及酵素 處理,再用 GiemsaGiemsa 染色,條紋型代表染色區的排列,醫院常用 G-band 來 檢查人類遺傳疾病,將每一條染色體分為短臂、長臂,每一臂依條紋出現位置, 再分隔為不同區。 ◎Q band:Q 代表螢光染料 Quinacrine mustard,染色體先用 quinacrine 染色 後,於螢光顯微鏡下(UV),出現螢光條紋,背景是暗的。 ◎R band:R 代表與 G band 相反,G band 染色深的部位,在 R band 是淺的。 通常是用高溫,低 pH 處理,為真染色質區,R band 沒有 G band 清晰,較少用 來鑑定染色體,助於研究染色體的結構,尤其是染色體的尖端部位染得很清楚, 可用來鑑定染色體是否發生端點缺失(terminal deletion) 。


單元十三:微量吸管的使用與原理 一、

實驗原理

◎精密度(Accuracy):當多次重複測量時,不同測量值彼此間偏差量的大小。如 果多次測量時,此間結果皆很接近,則稱為精密度較高。 ◎準確度(Precision):準確度的定義是測量值與真值(或公認值)的偏差程度, 統計上以變異係數(Coefficient of Variation,CV%)表示。公認值通常指使用 已知較準確且精密度高的實驗儀器,在優良訓練的實驗人員重複操作下,所得出 精密度相當高的實驗結果。但實驗時不見得有所謂公認值存在。

◎微量吸管(Pipet)是實驗室中用來吸取以微升(Microliter,μL,λ)為單位的 工具,在使用時應選擇適當範圍的 pipet 使用,如 P1000 的適用範圍為 1000-200 λ;P200 的適用範圍為 200-20λ。 ◎在調整刻度時應由低旋轉至高值,須先超越所欲設定值至少三分之一轉後,再 反轉至設定值;由高旋轉至低值,則直接轉至設定值即可。請勿將體積調整圈 轉 到超過最低或最高的使用範圍。 ◎吸取溶液時,尖端請先套上微量吸管頭(tip),將按鈕壓至第一段, 儘可能保 持微量吸管垂直,將微量吸管頭尖端浸入溶液,再緩慢釋放按鈕。釋放按鈕不可 太快,以免溶液衝入吸管柱內而腐蝕活塞。微量吸管頭尖端浸入溶液的程度隨吸 取的體積及使用型號而定,

◎釋放溶液時,將微量吸管頭與容器壁接觸,慢慢壓下按鈕至第一段,停一兩秒 再壓至第二段,把溶液完全壓出。 ◎使用微量吸管時,勿將吸頭置入容液中;切勿用火烤;若吸取過酸或鹼,應將 微量吸管拆開以蒸餾水清洗;P5000 必須使用濾頭;若將液體吸入吸頭中,應拆 開並清洗;吸取黏度高溶液應將吸管頭出口剪大:應定期校正微量吸管的準確 度。


單元十四:PCR聚合酶連鎖反應 一、

實驗原理

◎聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction)利用耐高溫的DNA聚合酶Taq來 複製特定的DNA片段,除了模板及Tag外,兩種DNA Primer及四種dNTP也是PCR反 應的原料,PCR反應利用三種溫度的循環約 30-35 次而達成,首先在 94℃使兩股 分開,在降溫至 50-60℃使引子黏附至模板DNA上,之後在 72-74℃環境下讓Tag 進行DNA複製。進行n個循環之後,此PCR反應會產生 2n-2個欲複製的片段。在PCR 反應中,所使用模板的量及鎂離子的量均會影響PCR的品質,鎂離子會與聚合酶 及引子形成複合體,太少無法進行PCR反應,大多則造成雜訊。 ◎Primer 在設計上有其限制,長度約 17-30 個核苷酸,G 及 C 的比例約 50%, 應避免連續重複特定核苷酸,Primer 要避免有二級結構的產生,PCR 所需要的兩 個引子應設計互相不能互補。引子最佳的 Annealing 溫度為 Tm 溫度減五度,Tm 為 DNA 分子 50%的鹼基對間的氫鍵被破壞的溫度,算法為 Tm=(A+T)×2+(G+C)×4。 ◎本實驗結果應只有具有所有原料的試管會進行 PCR 反應,缺乏任一個引子及任 一種 dNTP 或模板皆無法進行 PCR,加入錯誤的引子可能造成複製的片段錯誤。

二、

實驗結果與討論

相信大家看共筆看到這邊應該已經很累了,那就讓我們聽一下歌吧!除了 PCR 之歌以外,生技大廠 BioRad 其實還有另一首有關 PCR 的歌叫做 GTCA Song,現在 就放鬆一下聽聽歌吧! PCR Song:http://www.youtube.com/watch?v=x5yPkxCLads GTCA Song:http://www.youtube.com/watch?v=CQEaX3MiDow&NR=1


單元十五:DNA電泳 一、

實驗原理

電泳(Electrophoresis)為在系統中加入強大電場使生物巨分子(DNA,RNA,蛋白 質)因為分子量及帶電量的不同而在膠體中產生不同距離的運動,影響移動性的 因素包括大小、形狀、帶電量、等電點(Isoelectric Point)及具有極性與否, DNA 帶有磷酸根,在中性或鹼性環境下帶負電,在電場下往正極跑,由瓊脂醣 (Agarose)構成的膠體呈網狀,DNA 在電場上的移動因而受阻,分子量越大的阻 力愈大,因此 DNA 分子移動的距離與分子量成反比,另外,濃度越高的膠體網狀 結構越緻密,當樣本分子量較小時可以使用濃度較高的膠體進行電泳,反之亦 然。

二、

實驗器材與步驟

◎實驗一:電泳膠體製作 將瓊脂醣與緩衝液於錐形瓶中混和,於微波爐中分段加熱以免突沸,將加熱的瓊 脂醣稍微冷卻後倒入模型中,再插入齒梳,待冷卻後使用。 ◎實驗二:跑電泳 將膠體至於電泳槽中,加入緩衝液 TAE 並蓋過膠體,並注意電場方向,將 DNA 樣品與兩種染劑(淺藍、深藍)及甘油(幫助樣本沉降)混合並 loading 進膠體中, 以 110V 的電壓進行電泳 45 分鐘。 ◎實驗三:膠體呈色 跑完電泳的膠片置於含有 EtBr(Ethidium Bromine)的染色盒中 10 分鐘後,再利 用 UV 燈觀察於電泳膠片上的 DNA 條帶。EtBr 會與 DNA 雙股螺旋的 Minor Groove 結合,當照射到 UV 後會發出螢光。

單元十六:發酵作用 一、

實驗原理

細胞產生能量的方式有無氧呼吸及有氧呼吸,有氧呼 吸即一般所說的呼吸作用(Respiration),分為糖解 作用、檸檬酸循環及電子傳遞鍊等步驟;無氧呼吸可 以根據最終代謝產物的不同分為酒精發酵、乳酸發酵 及醋酸發酵等。 糖解作用總共產生 2 個 ATP、2 個丙酮酸及 2 個 NADPH, 丙酮酸在酒精發酵中將被還原為乙醇並產生 2 個二氧 化碳,同時也消耗了糖解作用產生的 NADPH,整個無 氧呼吸共產生了 2 個 ATP。

二、

實驗步驟及結果

◎在本實驗中使用蔗糖、澱粉及葡萄糖作為發酵的原料,在其中一組發酵管中除 了澱粉外還加入澱粉酶(Amylase),澱粉酶可以將澱粉分解為小分子醣類。將醣 類酵母菌混合液加入發酵管中,並保持發酵管頂端為無氧狀態,根據時間紀錄發 酵管頂端細菌產生二氧化碳的體積,實驗後發現以蔗糖為發酵原料的發酵管產生 最多二氧化碳,單純只有澱粉的發酵管中的酵母菌不行發酵作用。 ◎將氫氧化鈉滴入發酵管口後大拇指壓住管口,搖晃發酵管可以發現二氧化碳與 氫氧化納反應產生碳酸鈉沉澱,造成大拇指有被吸住的感覺(PV=nRT)。


單元十七:細菌轉型 一、

實驗原理

基因轉殖(Gene Cloning),即將一特定片段放入載體(Vector)中,再將質體放入 特定細胞去複製,複製出來的細胞均具有特定的 DNA 片段,我們稱之為 Clone。 特定片段來源可能來自於 PCR 產物,或是使用特定限制酶切割的 DNA 片段,一個 良好的載體有以下幾點條件須符合: 1. 小而環形。 2. 具有複製起點(Ori) 3. 具有抗抗生素基因 4. 具有多限制酶切位,且對於特定限制酶在整個質體中只有一個切位。 除了質體外,噬菌體或病毒也被人拿來當載體,進行基因轉殖最重要的除了載體 外,還有限制酶,限制酶可以辨認 DNA 上面的特定回文序列,如 EcoRI: 5’G↓AATTC,限制酶的命名範例如 HindIII 限制酶,源自於 Haemophilus influenzae,d 為細菌株名,III 為發現順序。

大腸桿菌若要拿來當勝任細胞(Comptent)必須要經過物理及化學的處理,最常使 用的化學方法為將細胞與CaCl 2 作用,改變細胞表面的通透性,之後再將DNA與勝 任細胞混合,並利用熱休克(Heat-Shock)的方式將DNA送入細菌完成轉型作用, 電穿孔(Electroporation)可以增加轉型作用(Transformation)的成功率。

二、

實驗步驟與結果

將欲轉型進勝任細胞的載體與勝任細胞在試管中混和,置於碎冰上 30 分鐘,放 入 42℃水浴中一分鐘,再放回碎冰上 5 分鐘後加入 LB(Luria-Bertani Broth) 液態培養基,至於 37℃培養箱 45 分鐘後將菌液塗至含有 Ampicillin 的 LB Plate 上。將 LB Plate 放於 37℃培養箱中 16-18 小時後即可得到經過選汰後具有載體 的大腸桿菌。而轉型失敗的勝任細胞則因為沒有抗抗生素基因於含有抗生素的培 養基上死亡。


單元十八:質體DNA抽取 一、

實驗原理

質體(Plasmid),獨立於細菌染色體的環形 DNA 分子,長度約 1000 至 200000 個 鹼基對,可以自行複製不受細菌染色體控制,質體上可能帶有抗抗生素的基因, 可以在細菌族群間傳遞,可以做為基因轉殖的載體。

二、

實驗步驟與結果

目前純化小量質體的方法有兩種:快速沸騰法及鹼性溶解法,在本實驗中使用鹼 性溶解法: 將離心過後的大腸桿菌沉澱物回溶於 GTE 溶液中;再加入鹼性溶解液,鹼性溶解 液中具有 SDS(十二甲烷基磺酸鈉,清潔劑的成分)可以溶解細菌細胞壁,而氫氧 化納則可以破壞 DNA 分子內的氫鍵使質體從超螺旋(Supercoiled)狀態變為直鏈 狀;加入醋酸鉀(Potassium Acetate)使細菌的染色體 DNA 析出形成沉澱;離心 後取入上清液至另一試管,在上清液中加入異丙醇(Isopropanol)使質體沉澱, 之後以乙醇清洗質體沉澱,清洗後將質體沉澱加入 TE 緩衝液並保存。

附錄:96 年普生實驗考答案 CDACD\CBDAD\BABAD\CDACC\EBDAB\BDDCA\CDADC\CDBDE\ACBCD\BDAEA

編後語 呼!總共約一萬字的普通生物實驗共筆終於做完了,可見我的廢話有多少,這本 共筆整理了這學期做的 16 個實驗,至於實驗八「基因體資訊」實驗,劉玉凡先 生表示將在下學期上,生命科學是一門實驗的科學,許多生物學家在實驗室中度 過青壯年,在短短的兩節課時間好好地做一個實驗的確稍嫌短暫,但不可否認的 是在這一學期中我們在生物實驗課做了不少實驗,也學到了不少?僅獻上這本共 筆,希望能幫助大家好好回味一下這學期的實驗,最後祝大家聖誕及新年快樂, 最重要的是「心之谷」順利進行,大家都 Hi-Pass! 行憲紀念日×聖誕節 10.12.25 亥時 偉峰


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