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中原大學 土木工程學系 碩士學位論文

指導教授:游勝傑黃郁慈

探討垃圾滲出水處理廠之厭氧氨氧化菌 族群分布 Investigation of the Distribution of Ammonia-Oxidation

研究生:郭俐櫻

Bacteria in Landfill-leachate Treatment

中華民國九十八年七月

指導教授:黃郁慈 游勝傑 研 究 生:陳秀琇

中華民國一○一年五月


探討垃圾滲出水處理廠之厭氧氨氧化菌族群分布 中文摘要

探討某垃圾處理廠之廢水處理廠,此處理廠所處理之廢水為垃圾滲出 水,操作程序為 SNAD 程序是由序批次式反應器(SBR)衍生出來的,SNAD 程序結合部分硝化、厭氧氨氧化及異營性脫硝三種作用於同一反應系統中, 氨氮與 COD 可同時被去除在同一個反應槽,其廢水富含厭氧氨氧化顆粒。

本研究將樣品分為兩種,一為厭氧氨氧化顆粒(G1、G2、G3);二為混 合厭氧氨氧化顆粒和污泥之混合廢水(M1)。針對真細菌(EB)、氨氮氧化菌 (AOB) 、亞硝酸氧化菌(NOB) 、脫硝菌、總厭氧氨氧化菌(Total Anammox) (TA)、Brocadia anammoxidans(BA)、Kuenenia stuttgartiensis(KS)並利用聚 合酶連鎖反應、相對定量、絕對定量、質體構築…等分子生物技術進行研 究探討。

G1 與 M1 樣品於相對定量結果顯示樣品組成不同導致厭氧氨氧化菌 的含量差異很大。G1 的總厭氧氨氧化菌(TA)為 80%,而 M1 的總厭氧氨 氧化菌(TA)8.6%,兩者差異極大,故檢測厭氧氨氧化樣品時,只需針對顆 粒進行研究,排除污泥帶來的誤差。

進行厭氧氨氧化菌的絕對定量可得到量化的數值,並利用與總厭氧氨 氧化菌(TA)作為百分比分母進行比較,發現 G1、M1、G2 具有共同特性為 Kuenenia stuttgartiensis 在樣品中的含量遠高於 Brocadia anammoxidans。

I


利用 Brod541F 與 Amx820R、 16S-5’與 16S-3’兩對引子進行選殖, 所得結果各別針測出 Brocadia fulgida 與 Kuenenia stuttgartiensis 兩種單一 菌相,其中 16S-5’與 16S-3’所選殖出的 Kuenenia stuttgartiensis 呼應相 對定量的結果,故 16S-5’與 16S-3’較適合作為總厭氧氨氧化菌的選殖

最後利用 11F 與 1512R 作 G3 樣品的 16S rRNA 真細菌分析,發現大 多數為脫硝菌種,卻不包含厭氧氨氧化菌群與硝化菌種,可能原因為厭氧 氨氧化菌群在 16S rRNA 真細菌中所占比例偏低或挑選的菌株數量不足, 故說明要檢測 16S rRNA 真細菌時,需提高挑選菌株的數量。

關鍵詞:厭氧氨氧化、硝化菌、脫硝菌、絕對定量、相對定量、選殖。

II


目錄

中文摘要 ........................................................... I 目錄 ............................................................. III 圖目錄 ............................................................ VI 表目錄 ........................................................... VII 第一章 緒論 ....................................................... 1 1-1

研究動機 ..................................................... 1

1-2

研究目的 ..................................................... 2

1-3

研究架構 ..................................................... 3

第二章 文獻回顧 .................................................... 4 2-1

氮處理程序 ................................................... 4

2-1-1

傳統生物氨氮處理 ......................................... 4

2-1-2

新式生物除氮程序 ......................................... 5 2-1-2-1 2-1-2-2 2-1-2-3 2-1-2-4 2-1-2-5 2-1-2-6

2-1-3 2-2

ANAMMOX 程序 ............................... 5 CANON 程序 ................................... 6 SHARON 程序 .................................. 6 SHARON-ANAMMOX 程序 ...................... 7 OLAND 程序................................... 8 SNAD 程序 ..................................... 9

傳統與新式生物氨氮處理程序之比較 ........................ 10

除氮系菌群之介紹 ............................................ 12

2-2-1

硝化菌種類與特性 ........................................ 12

2-2-2

脫硝菌種類與特性 ........................................ 14

2-3

Anammox 簡介 ............................................... 16

2-3-1

厭氧氨氧化菌之應用 ...................................... 16

2-3-2

Anammox 菌群介紹 ....................................... 17

2-4

分子生物技術分析 ............................................ 22

2-4-1

螢光原位雜交(FISH)技術 .................................. 22

III


2-4-2

聚合酶鏈鎖反應(PCR) ..................................... 22

2-4-3

實時聚合酶鏈鎖反應(Real-time PCR) ........................ 25

第三章 實驗設計與方法 ............................................. 26 3-1

實驗設計 .................................................... 27

3-2

實驗方法 .................................................... 28

3-2-1

樣品來源與保存 .......................................... 28

3-2-2

DNA 萃取 ............................................... 30

3-2-3

聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction,PCR) ............. 32

3-2-3

DNA agarose 膠體電泳 (gel electrophoresis)................... 32

3-2-4

質體構築 (TA-Cloning) .................................... 33

3-2-5

質體純化 ................................................ 36

3-2-6

實時聚合酶連鎖反應(Real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)

............................................................... 37 3-3

實驗分析 .................................................... 39

3-3-1

序列分析 ................................................ 39

3-3-2

系統樹 .................................................. 40

3-4

實驗設備 .................................................... 40

第四章

結果與討論 .............................................. 41

4-1

SNAD 程序之操作情形 ........................................ 41

4-2

分析 SNAD 程序之槽體 ....................................... 46

4-2-1

確認槽體之各菌種存在 .................................... 46

4-2-2

顆粒與污泥樣品所含厭氧氨氧化菌之差異 .................... 48

4-2-3

厭氧氨氧化菌之定量分析 .................................. 52

4-3

質體構築分析 ................................................ 55

4-3-1

針對厭氧氨氧化菌之選殖 .................................. 55

4-3-2

針對 16S rRNA 真細菌之選殖 .............................. 60

4-3-4

探討引子對厭氧氨氧化菌之影響 ............................ 65

IV


第五章

結論與建議 .............................................. 67

5-1

結論 ........................................................ 67

5-2

建議 ........................................................ 69

第六章

參考文獻 ................................................ 70

V


圖目錄

圖 1.1 實驗流程...................................................................................... 3 圖 2.1 硝化作用副產物(N2O)以及脫硝作用中間產物(NO 和 N2O)...... 5 圖 2.2 CSTR 反應器架構 ......................................................................... 7 圖 2.3 Planctomycete 細菌細胞的構造 ............................................... 19 圖 2.4 環狀梯式酯質結構 .................................................................... 19 圖 2.5 根據 16S rRNA 基因繪製厭氧氨氧化菌的系統數 .................. 21 圖 2.6 ANAMMOX 代謝途徑[43] .......................................................... 23 圖 3.1 實驗流程圖................................................................................ 28 圖 3.2 垃圾滲出水處理場的示意圖 [41]............................................ 30 圖 3.3 pGEM® -T Vector Easy Vector 示意圖 ........................................ 34 圖 4.1 2010 年 2 月的顆粒型態 ........................................................... 45 圖 4.2 2011 年 7 月的顆粒型態 ........................................................... 45 圖 4.3 2011 年 3 月的顆粒型態 ........................................................... 45 圖 4.4 2011 年 10 月的顆粒型態 ......................................................... 45 圖 4.5 針對不同引子檢測厭氧氨氧化顆粒 ........................................ 48 圖 4.6 G1 之 AOB、NOB、TA 相對定量 .............................................. 51 圖 4.7 M1 之 AOB、NOB、TA 相對定量 ............................................. 52 圖 4.8 G2 選殖厭氧氨氧化菌的系統樹............................................... 57 圖 4.9 G3 選殖厭氧氨氧化菌的系統樹............................................... 59 圖 4.10

G3 選殖 16S rRNA 真細菌的系統樹 .................................... 64

VI


表目錄

表 2.1 傳統與新式生物氨氮處理程序之比較(一) ..................................... 10 表 2.2 傳統與新式生物氨氮處理程序之比較(二) ..................................... 11 表 2.3 硝化菌的分佈和特徵 ....................................................................... 14 表 2.4 已知脫硝菌的菌種屬名 ................................................................... 16 表 2.5 擴增 planctomycetes 16S rRNA 基因的 PCR 引子列表 .................... 24 表 2.6 擴增 ANAMMOX 菌之功能性基因的 PCR 引子列表 ....................... 24 表 3.1 垃圾滲出水樣品分類表 ................................................................... 29 表 3.2 接合反應的配方配置 ....................................................................... 35 表 4.1 垃圾滲出水的主要參數 ................................................................... 42 表 4.2 不同月份的厭氧氨氧化顆粒型態 .................................................... 44 表 4.3 聚合酶鏈鎖反應的所有引子............................................................ 47 表 4.4 實時聚合酶鏈鎖反應之引子............................................................ 49 表 4.5 G1 之 KS、BA 絕對定量.................................................................... 52 表 4.6 M1 之 KS、BA 絕對定量 ................................................................... 53 表 4.7 G2 之 KS、BA 絕對定量.................................................................... 54 表 4.8 進行選殖反應之引子 ....................................................................... 55 表 4.9 G3 利用 EzTaxon Server 2.1 網站分析之結果 .................................. 62 表 4.10 G2 與 G3 的結果總整理 ................................................................. 66

VII


第一章

緒論

1-1 研究動機 一般傳統厭氧氨氮處理程序,處理程序繁複且需佔用大量的土地體積 與常需額外添加碳源,對於寸土寸金的台灣實在是一種資金與資源的浪費, 若能利用自然界中的 ANAMMOX 菌,直接將氨氮(NH4+)與亞硝酸鹽(NO2-) 轉換成氮氣(N2)逸散置大氣中,是一種不需耗費大量能源與無毒性的處理 程序。

目前在台灣有開發不同的去除含氮污染廢水的處理程序,以減少水中 氨氮,其中利用厭氧氨氧化菌為主的厭氧氨氧化生物處理程序最為節能, 此程序較傳統生物硝化脫硝技術可節省 60%以上的費用,但所採用的厭氧 氨氧化菌生長緩慢不易培養,因此國際上相繼有科學家調查各地的厭氧氨 氧化菌,希望找到新的高除氮效能厭氧氨氧化菌,目前在鑑定出的菌種有 Candidatus

“Brocadia

Anammoxidans”,

Candidatus

“Kuenenia

stuttgartiensis”, Candidatus “Scalindua wagneri,” and Candidatus “Scalindua brodae”, Candidatus “Scalindua sorokinii” 等 , 分 類 於 浮 黴 菌 門 (Plantomycetes),且此三屬微生物 Brocadia, Kuenenia, Scalindua 至今無法 分離培養。

厭氧氨氧化程序負責產生全球海洋 30~70%的氮氣處理,因此在全球 氮循環扮演著重要的角色.至今 ANAMMOX 已被記錄在各種不同的自然 環境,包括:海洋沉積物、淡水和陸地。

1


因此本研究運用分子生物技術分析垃圾滲出水之厭氧氨氧化菌,了解 其菌種之種類與環境之間的關係,比較 ANAMMOX 顆粒與厭氧氨氧化菌 是否有相關性,最後提供厭氧氨氧化程序於實廠之應用。

1-2 研究目的 本研究將善用所具備之分子生物學技術 DNA 純化、基因序列分析比 對與菌種親源鑑定…等,針對台灣特定厭氧氨氧化菌生物反應槽進行採樣 分析,以評估各個反應槽的整體微生物菌相分布,和厭氧氨氧化菌的菌種 鑑定,同時試圖尋找台灣特有本土型的厭氧氨氧化菌種。

總結本計畫的目的如下: 1.

以分子生物學的方法探討反應槽中整體微生物之菌相分佈。

2.

以分子生物學的方法鑑定反應槽中厭氧氨氧化菌之菌種。

3.

以分子生物學的方法分析反應槽中厭氧氨氧化菌之比例變化

4.

試圖尋找台灣特有本土型的厭氧氨氧化菌。

2


1-3 研究架構 本研究的實驗流程,如圖 1.1 所示,民國 99 年 02 月至 100 年 10 月採 取反應槽之污泥樣品,經過 DNA 萃取步驟得到總微生物 DNA。之後針 對 16S rRNA 真細菌、硝化菌、脫硝菌、厭氧氨氧化菌設計引子進行聚合 酵素連鎖反應 (PCR)、實時聚合酵素連鎖反應 (RT-PCR)、質體構築 (TA-Cloning)…等,定序產物的 DNA 序列並進行資訊學的分析,以探討 反應槽中整體微生物菌相分佈。

Trash leachate in Taiwan

The size of granule

DNA Extraction

PCR

TA Cloning (G2、G3) qPCR Phylogenetic tree

Absolute quantification PCR

Relative quantification PCR

Analysis content

圖 1.1 實驗流程

3


第二章 文獻回顧

2-1 氮處理程序

2-1-1 傳統生物氨氮處理 傳統的生物硝化/脫硝法,其所採的就是將高氨氮廢水(通常來自畜牧 糞尿)先經過硝化處理(好氧),將水中 NH4+-N 經氧化程序氧化為亞硝酸根 離子 NO2-再氧化為硝酸根離子 NO3-,然後再經脫硝處理(厭氧),將 NO3離子再度還原為 NO2 →NO →N2 產生最終產物氮氣排放。

傳統生物除氮程序(NBR)是利用細菌的硝化和脫氮能力淨化水質中的 含氮污染物,長時間以來被廣泛應用在廢水處理系統。在硝化過程必須供 應充足的氧氣(大於 0.8mgO2/L)才能進行更有效率的生物硝化程序,也可避 免累積的 NO2-容易轉變而釋出 N2O、NO 氣體產生[29][46],而脫氮過程也 必須注意,若是 C/N 濃度比值小於 3.5,脫氮相關的酶會無法完全表,中 間產物 NO 和 N2O 氣體也會釋出至空氣中[31],因此好氧處理過程需額外 加碳源如甲醇,以獲得較佳的 C/N 比,以協助脫氮程序。

供應系統充足氧氣和碳源,有助於硝化和脫氮作用效率,和避免反應 過程產生導致二次污染的溫室氣體 N2O、NO (圖 2.1) [14][28],但是需要 花費高額的廢水處理費用,除此之外,系統處理後所產生的污泥,必須經 過再處理,也是待解決的問題。

4


圖 2.1、硝化作用副產物(N2O)以及脫硝作用中間產物(NO 和 N2O)

2-1-2 新式生物除氮程序 新式生物除氮程序,包含有 ANAMMOX 程序、CANON 程序、SHARON 程序、SHARON-ANAMMOX 程序、OLAND 程序、SNAD 程序…等。共 同優點為小體積、不須額外添加碳源與氧氣,即可達到高效率的處理氨氮 廢水.

2-1-2-1

ANAMMOX 程序

ANAMMOX 程序是一種可處理高氨氮、低有機物質廢水的程序,而 不是傳統的結合硝化/反硝化過程去除氨氮化合物。ANAMMOX 程序主要 為利用 ANAMMOX 菌,其為 Planctomycete 細菌的一群,以 NO2-做為電 子接受者,將 NH4+和 NO2-轉化而產生 N2,在氨氮的移除上比傳統硝化過 程有更多的優點;例如不需要額外添加碳源、氧氣,也不會有 N2O 和 NO 釋出問題和反應後污泥產生,顯示 ANAMMOX 程序不僅能降低廢水處理 費用,也能避免對環境造成衝擊[34]。

5


2-1-2-2

CANON 程序

CANON (completely autotrophic nitrogen removal over nitrite)程序的反 應過程發生在亞硝酸菌和厭氧氨氧化菌共存的單一反應器內(式 3),適合處 理高氨氮、低溶氧和低有機物質的廢水。Sliekers 等人於 2002 年提出以 SBR (Sequencing Batch Reactor)進行 CANON 程序,首先在厭氧條件下,加入等 量 NH4+和 NO2-以培養厭氧氨氧化菌活性(式 2),待菌體活性呈穩定狀態, 再逐漸加入空氣至 5%以活化亞硝酸菌(式 1),約七周後,在限氧條件下, 系統很穩定的移除氨氮;經過檢測,反應過程並無 NO2 釋出,僅有少量的 N2O 和 NO 氣體(0.05%)產生[8]。

1NH4+ + 1.5O2 → NO2- + 2H++ H2O.................................. (1) 1NH4+ + 1.3NO2- → 1.02N2 + 0.26NO3- + 2H2O........................ (2) (1)+(2):1NH4+ + 0.85O2 → 0.435N2 + 0.13NO3-+1.3H2O +1.4 H2....... (3)

2-1-2-3

SHARON 程序

SHARON (single reactor high activity ammonia removal over nitrite)是一 種短程的生物反應程序,不同於傳統硝化/脫硝過程(NH4+→NO2-→NO3-→ NO2- →N2),SHARON 程序僅使硝化作用進行至第一步驟(NH4+ 氧化為 NO2-),就接著進行脫硝反應,比傳統硝化/脫硝過程少了 NO2-→NO3-途徑。 於 1998 年發表的研究,實驗程序設計在單一連續攪拌槽的反應器 CSTR (continuously stirred tank reactor) (圖 2.2),過程中排放液要間歇性循環供氧, 80 分鐘供給氧氣以進行部分硝化作用(NH4+氧化為 NO2-),40 分鐘進行無 氧脫硝反應(NO2-還原產生 N2 氣體),脫硝過程需要添加甲醇;讓液體停留 反應器時間約 1~1.5 天,過程須控制在高溫(約 30~40oC )、高 pH 值( 8.1 6


~8.4)狀態,以避免硝酸菌生長,使得 NO2-氧化為 NO3-。另外需注意的一 點:SHARON 程序適合處理 NH4+濃度大於 0.5 gN/L 的排放液[40]。

圖 2.2

2-1-2-4

CSTR 反應器架構

SHARON-ANAMMOX 程序

SHARON-ANAMMOX 程序是合併 SHARON 及 ANAMMOX 方式脫 氮,也就是使 SHARON 程序先進行產生 NO2-至一定程度,再將 NH4+和 NO2-提供給厭氧氨氧化菌進行 ANAMMOX 反應。Van Dongen 等人於 2001 年提出實驗證實其可行性,先在 SHARON 反應器內進行部分硝化(約有 50%的 NH4+氧化為 NO2-),再使 NH4+和 NO2-混和排放液流至 ANAMMOX 反應器內,進行厭氧氨氧化脫氮。相較於傳統硝化/脫硝程序, SHARON-ANAMMOX 程序利用約 50%的部份硝化方式,其不用控制 pH 值、鹼液,也減少了約 60 %的供氧量(式 1、2),而後半段 ANAMMOX 程 序因不用額外添加碳源(式 3),而且反應後的污泥量很低,能節省很多污水 處理費用[36]。

7


NH4+ + 0.75O2 → 0.5NO2- + H+ + 0.5H2O + 0.5NH4+……………. (1) NH4+ + 2O2 → NO3- + 2H+ + H2O………………………………... (2) NH4+ + NO2- → N2 + 2H2O………………………………………... (3)

2-1-2-5 OLAND 程序 OLAND (oxygen limited autotrophic nitrification-denitrification)程序是 在限氧條件下,整個硝化和脫硝反應完全由自營菌完成。Bock 等人發現在 環境溶氧不足時,Nitrosomonas eutropha 能夠利用 H2 和 NH4+做為電子供 應者,使 NO2-產生還原反應[4],依此概念 Kuai 等人於 1998 年提出 OLAND 程序,利用 SBR 馴養活性污泥,控制 pH 值 7.0~7.2、溫度約 33℃、限氧 (溶氧 0.1~0.8 mg/L)條件下,高濃度 NH4+進行部份硝化(式 1),然後再使 NO2-還原產生 N2 氣體(式 2) [15]。雖然 OLAND 程序比傳統硝化作用節省 大量供氧,也不用額外添加碳源,但是此過程的氨氮移除效能僅約 15%~ 40%;Windey 等人在 OLAND 程序中逐漸加入 NaCl,直到加入的 NaCl 濃度為 30g/L,結果顯示總氨氮移除效率可達 84% [41]。

1NH4+ + 1.5O2 → NO2- + 2H++ H2O.................................(1) 1NH4+ + NO2- → N2 + 2H2O..............................................(2) (1)+(2):2NH4+ + 1.5O2 → N2 + 2H+ + 3H2O...................(3)

8


2-1-2-6

SNAD 程序

CANON 程序在低溶氧的環境下,具有好氧性及厭氧性的氨氧化細菌 性相互作用。此程序可以有效的降低經濟與能源的需求(比較傳統除氮系 統降低 63%的氧消耗).適合操作在不具有 COD 的高濃度氨氮廢水.但在 CANON 程序中負責部分硝化及厭氧氨氧化的兩種微生物都屬於自營性 菌,需要無機碳作為碳源,若廢水中含有大量的有機碳,則在 CANON 程 序中會造成異營性菌大量生長,且會抑制部分硝化及厭氧氨氧化兩種微生 物的生長。異營性菌生長快速就必須縮短 SRT,對於生長緩慢的微生物來 說,縮短 SRT 會使得生長緩慢的部分硝化及 Anammox 菌被排出反應系 統,故含有高濃度的有機碳的廢水並不適用於 CANON 系統。然而,富含 氨氮的廢水大多具有一定濃度的 COD(例如垃圾掩埋出水之類…)。因此, 有一個新的程序被發展出來,為 SNAD (Simultaneous partial nitrification, anammox and denitrification)程序是由序批次式反應器(SBR)衍生出來的, SNAD 程序結合部分硝化、厭氧氨氧化及異營性脫硝三種作用於同一反應 系統中,氨氮與 COD 可同時被去除在同一個反應槽[6][44]。

9


2-1-3 傳統與新式生物氨氮處理程序之比較 表 2.1 傳統與新式生物氨氮處理程序之比較(一)[46] 傳統硝化/脫硝

ANAMMOX

CANON

SHARON

SHARON-ANAMMOX

OLAND

基質轉換率 (%)

NH4+(100)→NO2 →NO3-→N2(100)

NH4+/NO2-(50/50)→N2/N O3- (90/10)

NH4+(100)→N2 /NO3- (90/10)

NH4+(100)→NO2-(100)→ N2(100)

NH4+(100)→NH4+/NO2(50/50)→N2/NO3- (90/10)

NH4+(100)→N2 /NO3- (90/10)

主要參與細 菌

亞硝酸菌、硝酸 菌、異營脫硝菌

氨氮移除率

操作控制條 件

溫度:25~30℃ pH值:7.0~8.0 溶氧>6.0mg/L 添加鹼液、甲醇

優缺點

厭氧氨氧化菌

亞硝酸菌、 厭氧氨氧化菌

亞硝酸菌、 異營脫硝菌

亞硝酸菌、 厭氧氨氧化菌

亞硝酸菌

90%

90%

90%

90%

84%

分階段使反應 系統呈厭氧和 限氧狀態( 空 氣含氧量<5%)

溫度:30~40℃ pH值:7.9~8.2 溶氧>0.8mg/L 間接供氧、添加鹼液、甲 醇

分為兩部分反應。控制 SHARON部分硝化產生 NO2 ,再NH4 /NO2 提供 ANAMMOX 反應

減少大量供氧

短程硝化效率高,減少25 SHARON-ANAMMOX

溫度:30~43℃ pH值:6.7~8.3 空氣含氧量<5% C/N 比值<0.75

需提供充足氧、甲 不用供氧、鹼液、甲

醇,易有N2O和NO 醇、污泥量極少,節省 量、不用添加 釋出,產生大量污 處理費用,但是菌體繁 甲醇、污泥量 泥,處理費用相對 殖慢,啟動反應時間長 少 高 發展階段

長期廣泛應用於 廢水處理系統

已應用於廢水處理

%供氧量和40%甲醇

實驗室階段

已應用於廢水處理

10

-

+

-

溫度:33℃ pH值:7.0~7.2 溶氧:0.1~0.8mg/L

節省大量供氧、甲醇,

合併反應,不用另外添 但是除氮效能較差 加NO2-,較符合廢水處理 程序 已應用於廢水處理

實驗室階段


表 2.2 傳統與新式生物氨氮處理程序之比較(二)[44]

11


2-2 除氮系菌群之介紹 在高氨氮的廢水中通常含有硝化系細菌,其功能為代謝環境中高氨氮 的廢水,使其能轉換為氮氣散逸到大自然。通常與 ANAMMOX 菌互相影 響存在同一個反應槽中。

2-2-1 硝化菌種類與特性 硝化菌(nitrifying bacteria)都是屬於化學自營的革蘭氏陰性菌,在合適 條件下,世代繁殖時間約為 7~8 小時,其分類上則歸屬於 Nitrobacteraceae 科,而依生理機能之差異可區分為兩類:一為亞硝酸菌(ammonia-oxidizing bacteria),另一群為硝酸菌(nitrite-oxidizing bacteria)。

硝化程序需要兩個步驟,運用兩種不同功能的菌群.第一步驟為氨氮 氧化菌(ammonia-oxidizing bacteria)(AOB)可將 NH3 氧化為 NO2-的亞硝 酸菌,藉由 rRNA 序列的比較,亞硝酸菌被分為兩個單系群(monophyletic groups),其中 Nitrosomonas 、Nitrosospira 、Nitrosolobus 、Nitrosovibrio 四個屬歸為β- 變形菌(beta-proteobacteria) ,其他 Nitrosococcus 屬的菌株 則全部被歸類於 γ- 變形菌(gamma-proteobacteria),Nitrosomonas sp.能與厭 氧氨氧化菌共處於缺氧環境中,亞硝酸菌氧化 NH3 後的產物 NO2-,可提供 給 厭 氧 氨 氧 化 菌 作 為 反 應 的 電 子 受 體 [32] ; 若 為 β - 變 形 菌 (beta-proteobacteria)的單一系群,其最具有象徵性的基因為 ammonium monooxygenase (amoA)。

12


硝化作用第一步驟: NH3 + O2 + 2H+ + 2e- → NH2OH + H2O NH2OH + H2O → NO2- + 5H++ 4e0.5O2 + 2H+ + 2e- → H2O NH3 + 1.5O2 → NO2- + H+ + H2O + 275KJ/molN

負責硝化程序中的第二步驟為亞硝酸氧化菌(nitrite-oxidizing bacteria) (NOB)可將 NO2-氧化為 NO3-的硝酸菌,從化學自營菌中所分離出來的 亞硝酸鹽氧化菌(NOB)屬於以下四個屬:Nitrobacter(α subclass of Proteobacteria),Nitrococcus(γ subclass of Proteobacteria),Nitrospina (δ subclass of Proteobacteria)和 Nitrospira(distinct phylum)。Nitrospira 為絕對好氧自營菌,只能氧化 NO2- ,並喜好低濃度 NO2- 環境;然而在 CANON (completely autotrophic nitrogen removal over nitrite) 程序的低含 氧環境,曾發現 Nitrospira 和厭氧氨氧化菌共存[17].硝化菌在自然界中無 處不在,並已存活在土壤、淡水和污水污泥 [10]。

硝化作用第二步驟: NO2- + H2O → NO3- + 2H++ 2e0.5O2 + 2H+ + 2e- → H2O NO2- + 0.5O2 → NO3-+ 75KJ/mo

硝化作用中,分別進行氨氧化作用及亞硝酸氧化作用的硝酸菌及亞硝 酸菌,其常見於廢水處理程序中的種類及其特性如表 2.3 所示。 13


表 2.3 硝化菌的分佈和特徵[46]

2-2-2 脫硝菌種類與特性 脫硝作用通常在厭氧環境下由厭氧異營菌主導,以有機物質做為碳源 和能量來源,將電子接受者 NO2-或 NO3-還原產生 N2 氣體,在廢水處理過 程,為能使脫硝過程完全,時常需要加入甲醇。

自然界中硝酸鹽氮及亞硝酸鹽氮被微生物還原兩大途徑,一為同化硝 酸還原(Assimilatory),另為異化硝酸還原(Dissimilatory Reduction)。前者為 植物與微生物透過同化硝酸還原酵素作用,將硝酸鹽轉變為亞硝酸鹽後, 14


隨之成為氨,並納入蛋白質及核酸中,其作用活性不受氧之影響。然而脫 硝菌以 NO3-為電子接受者,進行懨氧生長之異化作用,將 NO2-或 NO3還原成 N2O 或 N2,釋回大氣中,稱為脫硝作用,因可重複的將固定氮(fixed nitrogen)釋回大氣中,故於自然界十分重要。

根據研究調查對於已被發現,無論是在土壤、淡水及海水中之脫硝菌 總計約有 130 種。為已知菌種之屬名,如表 2.4 所示 [43]。其中有一半以 上菌種可被清楚歸類,其主要分屬於三大屬:Pseudomonas 屬約有 28 種、 Neisseria 屬約有 13 種及 Bacillus 屬亦約有 12 種;其餘菌種僅有 2 個或 3 個脫硝菌會各自獨立形成一屬。而其分類依據,主要分別根據生長環境中, 有氧或缺氧情況下生存,以及對於硝酸鹽及亞硝酸鹽提供或不提供所造成 氣體產生之有無來分類;除了此些特點分類外,有些微生物會因為某些原 因消失或者僅有血緣關係相似,而判斷不歸類於此些屬。爾後學者之研究 發現 Alcaligenes 、Paracoccus、Pseudomonas 及 Rhodobactor 四個屬,對 於脫硝作用的影響較大[45]。

菌種屬名 Achromobacter Acinetobacter

Kingella Moraxella

Xanthomonas Rhodobacter (舊名為

Cytophaga Desuflovibrio

Neisseria Paracoccus (舊名為

Rhodopseudomonas) Acidovorax** Azoarcus**

Alcaligenes Aquaspirillum

Erythrobacter Flavobacterium

Micrococcus) Propionibacterium Pseudomonas

Kocuria** Marinobacter**

Azospirillum Bacillus Beggiatoa

Gallionella Hallobacterium Halomonas

Rhizobium Thermothrix Thiobacillus

Ochrobactrum** Roseobacter** Thauera**

Aeromonas Agrobacterium

Comamonas Corynebacterium

15


Chromobacterium Clostridium

Hyphomicrobium Janthinobacterium

Thiosphaera Vibrio

表 2.4 已知脫硝菌的菌種屬名[43] 2-3 Anammox 簡介 Anammox 為海洋中自然進行的一種反應,係由海洋中自營性微生物 (厭氧氨氧化菌)於厭氧狀態下利用自然界存在的二氧化碳(CO2)作為碳源, 將氨氮(NH4+)與亞硝酸根離子(NO2-)反應直接轉化生成氮氣(N2)的過程,不 需經由完全硝化為硝酸根離子(NO3-)再進行脫硝反應等步驟。此技術為海 洋中最重要之氮循環作用之一,最多可佔海洋中整體氮循環總量之 50 至 70%。

2-3-1 厭氧氨氧化菌之應用 Anammox 程序在 1995 年被 Mulder 等人發現。此程序可處理含有高 氮氮與低有機物質廢水,被視為一個新的且具有成本效益的方式 [19][22][26]。它被證實在厭氧條件下,自營性氨氧化菌可將亞硝酸鹽轉換 成氮氣釋出。與傳統的生物脫氮處理法相比,它可以減少經營成本,也可 以排除額外添加有機碳和曝氣的問題[23]。在工業應用上,漫長的穩定期、 低生長率與世代交替需 2 週的時間,使得厭氧氨氧化菌應用受到限制[13] [20][21] 。 此 外 , 厭 氧 氨 氧 化 菌 確 定 為 厭 氧 Planctomycete 和 chemolithoautotrophic 的成員,厭氧氨氧化菌是非常困難培養的[1]。

各種反應器的開發和優化,促使厭氧氨氧化菌具有豐富性和運用性, Anammox 程序可作為流化床反應器(fluidized bed reactor),序批次式反應 器 (sequencing batch reactor)(SBR), 旋轉生物接觸器(rotating biological 16


contactor)與氣升式反應器(gas-lift reactor) [1] [2] [12] [21]。反應器的類型是 非常重要的,最好具有高效率保留厭氧氨氧化菌的功能。SBR 法提供幾個 優點,包括高效率的生物保留、混合均勻、可靠性、為長時間的操作。因 此,SBR 法已被證明是一個非常合適應用的厭氧氨氧化系統[37]。近日, 膜生物反應器也得到改善,是理想的應用系統,因為其具有完整的生物保 留性,但膜積垢是一大問題[35]。

上流式厭氧污泥床(upflow anaerobic sludge blanket)(UASB)反應 器,液體上升速度和氣體生產主要是利用液體剪力[18]。已被廣泛研究, 在厭氧生物顆粒。厭氧氨氧化菌生長成形的顆粒,可獲得一個穩定的厭氧 氨氧化菌濃度,UASB 是有利於厭氧氨氧化菌形成顆粒。系統操作在相對 較高的液體上升速度與液體剪力薄弱的情況下,易形成厭氧氨氧化顆粒[3]。 因此,需要一定的水體剪力形成厭氧顆粒。

於 2002 年 , 荷 蘭 Rotterdam 的 廢 水 處 理 廠 Sluisjesdijk 嘗 試 將 ANAMMOX 程序應用於體積為 70m3 廢水處理器。耗時三年,先經過部分 硝化反應器產生 NO2-後,再經由 ANAMMOX 廢水處理器使用的程序才得 以成功穩定運作,每天可以移除氨氮約 700 kg [39]。

2-3-2

Anammox 菌群介紹

氨氮和亞硝酸鹽的氧化以往一直被認為主要是在好氧環境下由硝化 菌所主導。於 1995 年,荷蘭一家酵母製造公司的廢水處理器中,Mulder 發現在厭氧環境下,NH4+和 NO3-消失而有氮氣釋出的現象,進而提出系統 有厭氧氨氧化反應[26];之後 Van de Graaf 等人將 NH4+和 NO2-做為基質, 17


馴養出呈現淡粉紅色的厭氧氨氧化菌團,成功的以流體化床方式啟動微生 物厭氧氨氧化[38]。厭氧氨氧化菌為化學自營的革蘭氏陰性菌,目前尚未 能純化分離,分類上歸屬於 Planctomycete 細菌。

Planctomycete 細菌特徵之一是細胞壁成分為蛋白質,缺乏胜肽聚醣 (peptidoglycan),另一特色是細胞壁內側有兩層膜,細胞壁外側則不具有膜, 內外膜中間含有 RNA 的區域稱為 paryphoplasm,內膜區隔著細胞內部, 含有 DNA 及類似 ribosome 顆粒。另外,厭氧氨氧化菌含有 anammoxosome 構造(圖 2.3),厭氧氨氧化菌的 anammoxosome 構造被單層膜包圍著,此含 雙分子的單層膜是醚鏈和酯鏈混和的酯質,稱為 ladderane lipids,具有特 殊環狀梯式系統 Y、X、X+Y 結構 (圖 2.4) [11],ladderane lipids 具有很高 的不滲透性,可以將所產生具毒性之中間產物能安全保持於膜中,例如 anammoxosome 釋出 N2H2 ,進而阻止其外洩造成細胞之毒害,並能充分 利用其化學能。而 ANAMMOX 經由肼(N2H4)和羥胺(NH2OH)來分解亞硝 酸鹽,反應所釋出的能量 (delta G =–358 kJ/mol) ,可當作厭氧氨氧化的 能量[16]。

1994 年 首 次 證 實 在 流 化 床 廢 水 反 應 器 ( fluidized wastewater bed reactor) ,Planctomycetales 中的厭氧氨氧化菌具有分歧性與高基因多樣性。 ANAMMOX 反應發生在特殊的細胞隔間,稱為 anammoxosome,此處是通 過含有肼(N2H4)及羥胺(NH2OH)的中間體來氧化氨氮,經由此途徑所 消耗的每分子亞硝酸鹽比一般脫硝作用可產生兩倍的的氮氣,且不須添加 外部的還原劑[5]。

18


圖 2.3 Planctomycete 細菌細胞的構造 A:Pirellula marina 和 Isosphaera pallida B:Candidatus “Brocadia anammoxidans” 和 Gemmata obscuriglobus

圖 2.4 環狀梯式酯質結構 19


І:環狀系統 Y,п:環狀系統 X,ш:環狀系統 X+Y 研究指出,氮循環作用中,只有少數環境調查厭氧氨氧化細菌。在缺 氧的黑海 ANAMMOX 負責超過消耗 40%氮固定,在哥斯達黎加的沿海灣 的缺氧水域形成總氮氣 19~35%,大陸架沉積物生產總氮氣 24~67%,河 口沉積物生產總氮氣 1~24%。在全球範圍內,厭氧氨氧化反應可能占海洋 生產氮氣 30%~70%,證實厭氧氨氧化菌在自然界氮的循環中,扮演著很 重要的角色[5] 。

第 一 個 發 現 的 厭 氧 氨 氧 化 細 菌 名 為 Candidatus “ Brocadia

anammoxidans”是第一個從實驗室物理培養分離來的[20]。到目前為止, 只有五種 ANAMMOX 菌屬在廢水處理系統中已被確認(圖 2.5),即 Kuenenia 、 Brocadia 、 Anammoxoglobus 、 Jettenia 和 Scalindua[24]。然 而,只有一個屬(Candidatus Scalindua)似乎是無處不在的存在海洋生態 系統,範圍從北極到熱帶地區[30].Candidatus “Kuenenia stuttgartiensis” 是另一株在實驗室的厭氧生物反應器發現的優勢厭氧菌(約佔 73%)。

Candidatus “Scalindua sorokinii”這株菌被找到的地點在內陸海(Black Sea)深度約 90m 的低含氧區域,Kuypers 等人以 15N 標記追蹤、16S rRNA 基因分析和螢光染色雜交(FISH)等方式鑑定,終於確定自然界的首株厭氧 氨氧化菌,並測得菌體的 ANAMMOX 反應在此區約佔氨氮轉換的 30% 。 與 Candidatus ”Scalindua” 同 屬 的 另 兩 株 新 菌 種 Scalindua brodae 和 Scalindua wagneri,同年在英國 Pitsea 的垃圾滲漏液處理器也被發現。

Candidatus “Anammoxoglobus propionicus”這株厭氧氨氧化菌是 Kartal 等人將廢水處理器的活性污泥加入 NH4+、NO2-、NO3-和丙酸鹽,以 SBR 20


富集化方式培養找到[46]。

圖 2.5 根據 16S rRNA 基因繪製厭氧氨氧化菌的系統數。運用 MEGA 4.0 軟體,1,000 次 bootstrap 分析,序列分支比例尺為 5%

21


2-4 分子生物技術分析

2-4-1 螢光原位雜交(FISH)技術 為了瞭解環境中所存在的 ANAMMOX 細菌種類、分布…等,故需要 利用一些分子生物技術分析方法,最早嘗試的 ANAMMOX 細菌定量方法 為螢光原位雜交(FISH)。FISH 是常用的工具,為培養獨立原位識別環境樣 品中的目標細胞。許多研究都使用 FISH 技術來進行 ANAMMOX 細菌的 定性和定量。根據學者的研究,這項技術已廣泛的對厭氧氨氧化菌使用。

首先,FISH 技術的重點是設計能檢測厭氧氨氧化菌的特異性寡核苷酸 探針(design-specific oligonucleotide probes)。因為不同的探針可針對不同的 微 生 物 群 體 , 特 異 性 螢 光 標 記 的 DNA 寡 核 苷 酸 探 針 (specificity of fluorochrome-labeled DNA oligonucleotide probe)是實踐這項技術的最重要 的因素之一.然而 FISH 是耗時的,且在複雜的生物群集與每細胞 rRNA 含量低時,具有困難性[30]。

2-4-2 聚合酶鏈鎖反應(PCR) 環境樣品中,PCR 擴增具有特定生物標記物引子(biomarkers specific primers)的 DNA 模板,使得所要之 DNA 產物濃度提升.當我們想檢測環 境樣品中,所含的任何菌種,PCR 是首選方法,PCR 可在未知的微生物篩 選任何我們想檢測的 DNA 產物。在 ANAMMOX 情況下,這個方法是最 22


廣泛被使用的,已成功地確定了厭氧氨氧化菌的存在樣品中。除了常用 16S rRNA 基因,厭氧氨氧化菌代謝途徑相關的基因與生物標記物也可通過 PCR 擴增被檢測。廣泛使用的 PCR 引子與其最佳的 PCR 擴增溫度的 ANAMMOX 16S rRNA 基因,如表 2.5 所示。關於功能性基因,基於 ANAMMOX 代謝途徑(圖 2.6)[25],四個核心催化蛋白質是最有可能成為 設計新的 PCR 引子:亞硝酸鹽和硝酸鹽還原酶(NIR),肼水解酶(HH)和肼 脫氫酶(HZO)。目前,HZO,也被稱為羥胺還原酶蛋白(hydroxylamine oxidoreductase-like protein)(HAO),已有大量的公開資料顯示此序列的運用。 可用的 PCR 擴增基因編碼蛋白質,如表 2.6 所示[24]。

圖 2.6

ANAMMOX 代謝途徑[25]

23


表 2.5 擴增 planctomycetes 16S rRNA 基因的 PCR 引子列表[24]

註:a 可運用在擴增 planctomycetes and anammox 細菌的引子 b

可運用在擴增具有較高特異性的 anammox 細菌的引子

c

為 Real-time PCR 所設計的

表 2.6 擴增 ANAMMOX 菌之功能性基因的 PCR 引子列表 [24]

24


2-4-3

實時聚合酶鏈鎖反應(Real-time PCR)

最近引用的 Real-time 聚合酶鏈鎖反應(PCR),其技術對於在生物膜與 河水沉積物的高密度群集硝化細菌具有優化的定量效果。Real-time PCR 的基礎原理為連續監測 PCR 反應的螢光強度,因此,此方法可靠、靈敏、 方便用於生長緩慢與高密度群集的 Anammox 細菌[9]。此外,利用 RT-PCR 技術於功能基因,如 hzo 和 Scalindua-nirS,RT-PCR 技術也可評估厭氧氨 氧化菌的活性。然而,使用定量 PCR 技術於大量的厭氧氨氧化菌結果可能 與 FISH 不一定吻合。這種原因是由於各種 ANAMMOX 物種會有不同的 檢測效率、不同的探針和引子。儘管這種不確定性,定量 PCR 估計厭氧氨 氧化細菌的 RNA 或 DNA 基因,仍然是一個分析厭氧氨氧化菌有效量化和 強大的工具[24]。

25


第三章 實驗設計與方法

厭氧氨氧化(ANAMMOX)程序,此生化程序氧化氨氮轉變成氮氣, 利用亞硝酸鹽作為電子受體,在全球氮循環中扮演重要程序,不久前, ANAMMOX 菌無所不在的分佈在各種環境,改變了我們對全球氮循環的 了解。目前,根據幾組方法可以了解厭氧氨氧化細菌的生理生化特性、細 胞化學組成、16S rRNA 基因和作為選擇性生物標記物的功能基因,其中 包括肼氧化還原酶(hzo)和亞硝酸鹽還原酶基因(nirS)。可利用這些方 法來得到結果,例如:FISH、先進的 RT-PCR 技術和反轉錄mRNA 基因… 等,可幫助我們理解厭氧氨氧化菌在不同的環境中的分佈、多樣性和活 性。

26


3-1 實驗設計 本實驗為研究垃圾滲出水,其含有 ANAMMOX 顆粒之污泥樣品,從民 國 99 年 02 月至 100 年 10 月期間持續送樣品至本研究機構進行研究,經 過萃取步驟得到總微生物之 DNA。針對總細菌、硝化菌、脫硝菌、厭氧氨 氧化菌設計引子,進行聚合酵素連鎖反應(PCR)、實時聚合酶鏈鎖反應 (Real-time PCR)、質體構築 (TA cloning)與定序 DNA 序列並進行資訊學… 等分析,以探討反應槽中整體微生物菌相分布與了解操作環境對 ANAMMOX 顆粒之形成是否有影響。本研究實驗流程圖可參照圖 3.1。

本實驗首先利用 Kit 萃取樣品之 DNA,利用預偵測之引子(primer) 進行 PCR 程序,以初步了解樣品中是否存在本研究所要偵測之菌種,例如: 真細菌(EB)、氨氮氧化菌(AOB)、亞硝酸氧化菌(NOB)、脫硝菌、總 厭氧氨氧化菌(Total Anammox)(TA)、Brocadia anammoxidans(BA) 、 Kuenenia stuttgartiensis(KS)…等;而後續將會針對真細菌(Eubacteria)(EB)與 總厭氧氨氧化菌(TA)進行更深入的研究,利用 TA Cloning 技術來探討樣品 中真細菌或厭氧氨氧化菌的菌相組成與比例。

27


Trash leachate in Taiwan

The size of granule

DNA Extraction

PCR Amplification

qPCR

PCR Fragment purification

Make plasmid for standard curve

TA Cloning (G2、G3)

Absolute quantification PCR

Relative quantification PCR

Ligation Analysis content

Transformation

Blue/White Screening

Sequence 16S rRNA Gene

Phylogenetic tree

圖 3.1 實驗流程圖 3-2 實驗方法

3-2-1 樣品來源與保存 樣品來源為某垃圾處理廠之廢水處理廠,此廢水經由馴養後富含 28


ANAMMOX 顆粒,樣品從取樣當日寄送至本研究機構,其樣品主要分為 兩種,一為 ANAMMOX 顆粒;二為混合 ANAMMOX 顆粒和污泥之混合 廢水,如表 3.1 所示。

本研究所探討的處理廠自 2006 年以來持續地操作處理平均流率為 304 m3/d 的垃圾滲出水。垃圾滲出水處理場的示意圖,如圖 3.2 所示。探討兩 個曝氣池具有同時部分硝化、脫硝和厭氧氨氧化的現象(長:15.6 m、寬:4.1 m、高:3 m)總容積 384 m3 且水力停留時間為 1.26 天。曝氣池的污泥停 留時間保持在 12 和 18 天之間。混合液懸浮固體和混合液揮發性懸浮固 體的濃度分別為 2110 與 1505 mg/L。 此曝氣池裝設細管狀的氣泡擴散配 備 , 幫 助 DO 濃 度 維 持 在 大 約 0.3 mg/L , 此 濃 度 的 溶 氧 量 能 促 進 ANAMMOX 菌群與脫硝作用共存。而 pH 值大約在 7.4,在研究過程中, 受到環境的影響水體溫度在 30~33◦C 之間。[41]

樣品寄送至本研究機構時,隨即存放至 4℃作保存.於兩日內進行 DNA 之萃取,剩餘之樣品,經由 10000xg 離心去除水分保留底泥部分,將其分 裝於 2ml 的保存管內,放入-80℃做長時間保存,所分裝之樣品解凍一次後, 便不在重複使用,避免其細胞因收縮膨脹導致細胞破裂或不新鮮。本實驗 分析的樣品為 2010 年 02 月至 2011 年 10 月,期間間接式的送樣至本機構 進行實廠操作厭氧氨氧化菌之相關性的研究。

表 3.1 垃圾滲出水樣品分類表 日期

樣品型態

2010/02/03

紅色顆粒

29


2010/07/06

紅色顆粒 & 污泥

2011/03/01

紅色顆粒

2011/10/24

紅色顆粒 (擔體)

圖 3.2 垃圾滲出水處理場的示意圖 [41] 3-2-2

DNA 萃取

了解污泥中 16S rRNA 細菌存在,必須萃取其 genomic DNA 作進一 步的研究,本實驗運用 SoilMasterTM DNA Extraction Kit (epicentre 公司)進 行污泥樣品的 DNA 萃取。 30


操作步驟: A 部分(預備) 1.

添加 550μl 的 Inhibitor Removal Resin 到 Spin Column 中,離心 2000xg 1 分鐘。

2.

排除過濾液並保留原來的 Spin Column,將其放置在相同收集管.

3.

再添加 550μl 的 Inhibitor Removal Resin 到步驟二的 Spin Column 中,離心 2000xg 2 分鐘。

4.

將 Spin Column 移至新的 1.5ml 的收集管。

B 部分(細胞裂解) 1.

放入 100mg 的污泥樣品至 1.5ml 的收集管。

2.

添加 250μl 的 Soil DNA Extraction Buffer 和 2μl 的 Proteinase K;柔和 的震盪混合。

3.

放置收集管在 37℃中搖晃 10 分鐘或震盪 2 分鐘可增加 DNA 產量。 注意:震盪可能會使 DNA 斷裂。

4.

添加 50μl 的 Soil Lysis Buffer 並柔和的震盪混合。

5.

在 65℃培養 10 分鐘,離心 1000xg 2 分鐘.轉移 180μl 的上層液至新 的收集管。

6.

添加 60μl 的 Protein Precipitation Reagent,利用上下反轉收集管,使其 混和。

7.

在冰上培養 8 分鐘.用最大速離心 8 分鐘。

8.

吸取 100~150μl 的上層液,直接轉移至先前準備的 Spin Column(from A 部分)。

9.

離心 2000xg 2 分鐘,使液體通過 1.5ml 的收集管,排除 Spin Column。

10. 添加 6μl 的 DNA Precipitation Solution,柔和的震盪混合,在室溫下 31


培養 5 分鐘。 11. 用最大速離心 5 分鐘,小心移除上層液,留下底部的沉澱物。 12. 利用 500μl 的 Pellet Wash Solution 沖洗沉澱顆粒.反覆反轉混和後, 用最大速離心 3 分鐘.小心的移除上層液。重複步驟 12。 13. 添加 50μ的 TE Buffer 使沉澱物回溶於液體。 14. 此液體即為 DNA 萃取液.將其冰於-20℃冰箱保存。

3-2-3 聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction,PCR) 此程序使用之 PCR 酵素為 2X Taq PCR MasterMix(Genomics 生技公 司),首先於無菌微量離心管內加入 12.5μl 的 2X MasterMix,1μl 的 primer (forward、reverse)濃度各為 10μM 與總量小於 1μl 的 DNA Template, 最後添加滅菌水補足至 25μl,使其液體混合均勻後,放入聚合酶連鎖反應 機器。

反應程式為先預熱 94℃ 5 分鐘,再進行 35 個週期反應;每個週期 為 94℃ 30 秒變性反應 (denature),50℃~ 60℃ 30 秒黏合反應 (anneal), 72℃ 1 分鐘合成反應 (extend),35 個週期完後,再進行 72℃ 5 分鐘使合 成反應完全,最後會設定 4℃作為降溫保存 PCR 產物,即可得到欲增幅的 DNA 產物。 3-2-3

DNA agarose 膠體電泳 (gel electrophoresis)

DNA 含有磷酸根 (phosphate group),在中性及鹼性環境下會帶負電 荷,故在電場中會往正極移動。agarose 於高溫下 (高於 60℃)會融解,而 在室溫時則會凝固成為膠體 (gel),膠體內有許多孔隙,孔隙的大小 (pore 32


size)決定於 agarose 的濃度,濃度愈高則孔隙愈小。在電場中,不同大小 的 DNA 片段,在 agarose 膠體的孔隙內往正極移動,DNA 體積愈大者, 移動時所受的阻力愈大,使其移動較慢;而 DNA 體積較小者,則移動較 快。因此藉由 agarose 膠體電泳的過程,即可將大小不同的 DNA 分開。

配置膠體為利用 agarose 與 1X TAE Buffer 混和,放入微波爐加熱直 至混合液冒泡沸騰,沸騰後將其取出搖晃均勻,再放入微波爐沸騰,此步 驟重複 3 次,直到 agarose 完全溶解.將液態 agarose 加入 SafeView DNA Stain 幫助 DNA 在後續照紫外燈時能顯色,最後將其倒入製作膠體的模 板即完成.本實驗以配置 1~2%的 DNA agarose 膠體來進行電泳實驗。

3-2-4 質體構築 (TA-Cloning) 本次分析以微生物普遍存在且保守性高的 16S rRNA 基因序列作為族 群分析的依據。第一步為片段增幅(Amplification),利用聚合酶鏈鎖反 應(PCR) 快速擴增基因片段,而 DNA 聚合酶會隨機地將產物 3’尾端加 “A”,可直接搭配 pGEM-T Vector System (Promega 公司)[45]進行選殖; 第二步為片段純化(Fragment purification) ,將擴增基因片段進行跑膠,經 由切膠體純化來移除影響接合反應的抑制物及單核苷酸雜質,純化完成後, 除了淨化目標片段外,更進一步達到濃縮的目的,有助於提高後續選殖珠 的數量及成功率。 第三步為接合作用(Ligation),DNA 的黏合以 T4 DNA ligase 進行, 反應需要 ATP (adenosinetriphosphate)作為能量,可將兩段 DNA 分子間 5' 磷酸根與 3' 氫氧根重新形成 phosphodiester 鍵結。接入子 (Insert) DNA 濃度相對高於載體 (Vector) DNA 濃度較有利於 ligation,當接入子 33


與載體 DNA 兩端有相同的限制酶切位時,需確定黏合後的方向性和是否有 重覆多個接入子的送入載體。如在接入子與載體 DNA 兩端設計不同的限制 酶切位,可避免相同限制酶切位的載體自己黏接且不需確定送入 DNA 片段 的方向性。一般而言,黏合端 (cohesive ends or sticky ends)會比鈍 端 (blunt ends)黏合效率較高。在做鈍端 (blunt ends)黏合時,可加入 十分之一的 50% PEG4000 溶液來幫助提升 DNA 黏合效率。

將帶有 3’尾端“A”的 PCR 片段產物,直接與 pGEM® -T Vector (圖 3.3) 的尾端“T”作黏合,並利用 T4 接合酶將 DNA 的 3’-OH 端及 5’-PO4 端形成磷酸雙脂鍵 (Phosphodiester bond) 。添加接合反應的配方(表 3.2) 後,放置 4℃反應 16 小時接合效果最佳,接合反應即可完成。

圖 3.3 pGEM® -T Vector Easy Vector 示意圖。5’端的合成酶為 T7 RNA 聚 合酶;3’端則為 SP6 聚合酶,此載體具有許多限制酶切位[45] 34


表 3.2 接合反應的配方配置 Reagent

Standard Reaction

2X Rapid Ligation Buffer

5μl

pGEM-T Easy Vector (50ng)

1μl

PCR product

3μl

T4 DNA Ligase (3μg/μl)

1μl

Add nuclease-free water to

10μl

第四步為轉殖反應 (Transformation),使用 JM109 Competent Cells ( >108 CFU/μg) 與 ligation mixture 混合,利用熱衝擊法是利用細胞表面破 損的特性,搭配 42℃的樂衝擊 (Heat shock) ,讓質體可以順利進入細胞中, 完成轉殖反應。

轉殖步驟如下: 1.

將 competent cells 從-70℃取出,於冰上緩慢解凍 5 分鐘。

2.

取 100μl 的 competent cells 與 10μl 的 ligation mixture 輕柔混和,並 於冰上反應 20 分鐘。

3.

置入 42℃水浴槽作 heat-shock 反應 45-50 秒後,迅速將 mixture 置於 冰上兩分鐘。

4.

加入 900μl 的 LB 培養液 (無抗生素) 後,於 37℃ 培養箱搖晃 (150-200 rpm) 培養一小時 30 分鐘。 35


5.

欲增加菌落數量,可取步驟 4 培養過的菌液,以 1000 g 離心 10 分鐘, 再以 100μl 塗盤。

6.

取 增 殖 培 養 後 的 菌 液 100μl

(視情形可增加體積)塗於

LB/ampicillin/IPTG/X-gal 培養皿上。 7.

於 37℃ 培養箱培養 16~18 小時。隔天觀察即可。

第 五 步 為 藍 白 篩 選 (B/W Screening) , 將 轉 殖 的 菌 液 塗 抹 於 含 有 Ampicillin (終濃度 100μg/ml) 、IPTG (終濃度 0.5Mm)及 X-Gal (終濃度 50 μg/ml) 的培養皿上,未選殖的細菌會生成大量的 β-galactosidase,產生藍 菌;反之,則產生白色菌落,也就是我們的標的菌落。

第六步為定序 (Sequencing),將白色菌落挑起,送予生技公司進行 後續步驟,先隔夜培養適當體積 (1~3ml) 的菌液,抽取大量質體 DNA 後, 選擇適當限制酶 (例如 Eco R1) 切嵌入片段,然後跑交確認其位置即可. pGEM®-T easy vector 上帶有 Sp6/T7/M13 Primer binding site,可供定 序使用.本實驗使用 T7 primer 作為判別目標片段是否確實嵌入.

3-2-5

質體純化

製作質體純化步驟如下 1.

挑出的單一菌落培養於含抗生素的 LB 中以 37℃ 200 rpm 震盪培養 12 小時。

2.

利用 12,800 rpm 離心 5 分鐘後倒除上清液。

3.

加入 100 μl 的溶液 I (50 mM glucose、25 mM Tris-Cl pH 8.0、10 Mm EDTA pH 8.0)並震盪使菌懸浮於溶液中。 36


4.

加入 200 μl 的溶液 II(0.2 N NaOH 1% SDS)並輕輕的混合均勻。

5.

加入 150 μl 的溶液 III(3 M potassium、5 M acetate)將其輕輕混合均 勻。

6.

以 12,800 rpm 離心 6 分鐘,取 400 μl 上清液並加入等體積室溫下的 異丙醇用力震盪.

7.

以 12,800 rpm 離心 5 分鐘即可得到質體 DNA 的沉澱,接著去除上清 液加入 200 μl 70%的酒精輕輕混合均勻以去除鹽類。

8.

以 12,800 rpm 離心 5 分鐘,離心完後去除上清液。

9.

於 DNA 乾燥後加入 20μl 的無菌水溶 DNA 即可。

3-2-6 實時聚合酶連鎖反應(Real-time polymerase chain reaction, RT-PCR) 一般 PCR 反應只能擴增 DNA 增加其含量,經由跑膠達到初步的了解 是否有此菌種存在,卻不能知道其菌種的確切含量為多少,但經由實時聚 合酶連鎖反應(RT- PCR)可了解菌種實際的濃度。

實時聚合酶連鎖反應(RT- PCR)為利用酵素 SsoFast

TM

EvaGreen®

(BIO-RAD 公司)或 SYBR Green (KAPA 公司) 在雙股 DNA 時會被激發 螢光,故在 PCR 的合成反應 (extend) 時,酵素會與 DNA 鍵結並激發螢光, 經由 RT- PCR 儀器偵測可得到 Ct 值.首先來看 Real-time PCR 中的重要參 數 Ct 值(Ct value),閾值(threshold),和基線(baseline)。一般來講, 37


第 3-15 個循環的螢光值就是基線,是由測量的偶然誤差引起的。通常閾值 是基線標準偏差的 10 倍,但在實際操作中也可以手動調節,位於指數期 就可以。Ct 值就是螢光值達到閾值時候的 PCR 循環次數,所以是一個沒 有單位的參數,但可代表在第幾次循環時,DNA 開始大量複製,故 Ct 值 越小,DNA 濃度越高;反之,則 DNA 濃度越低。

實時聚合酶連鎖反應(RT- PCR)可以分絕對定量和相對定量。絕對定量 是用一系列已知濃度的標準品製作標準曲線,該標準品是純化的質體 DNA. 最佳標準曲線的斜率(Slope) 為 -3.6 ~ -3.1 (最佳參數為 -3.4 )、效率 (efficiency)為 90% ~ 110% (最佳參數為 100% )、R2 為 ≧ 0.98。在 相同的條件下,測得目標基因的螢光信號量與標準曲線進行比較,從而得 到目標基因的量。

絕對定量之計算方式,當 Y= -3.432X+34.638; R2=0.995 時,符合範圍 標準,所以可進行數據分析: 如果未知樣品的

Ct=25

代入方程式:

25=-3.432X+34.638

所以:

X=2.8

Quantity = 10^2.8

相對定量為比較 Ct 法,將各個偵測基因的 CT 值減去 Actin 的 CT 值, 得到ΔCT (公式 1) 值,套入公式 2△Ct,即可得到各個樣本偵測基因的相對 表現量。

38


△Ct = (Ct reference gene– Ct sample gene)

(公式 1)

RT- PCR 反應程式為預先加熱 95℃ 30 秒,再進行 39 個週期反應; 每個週期為 95℃ 5 秒變性反應 (denature),50℃~ 65℃ 5 秒黏合反應 (anneal),39 個週期完後,再添加熔解曲線 (melting curve) 步驟,從 65 ℃ 每 5 秒增加 0.5℃ 升溫到 95℃ 為止,添加此步驟可為幫助後續分析, 了解樣品是否受污染或有引子互黏 (primer dimer) …等,完成 RT- PCR 反 應後,可得到 Ct 值.Ct 值可轉換成濃度(ng/μl),經由數據換算,濃度 可轉換為拷貝數(copy number) (公式 2) 。另外,根據文獻指出,平均一個 真細菌細胞有 3.6 單位的拷貝數,但一個厭氧氨氧化細菌卻只有 1 單位的 拷貝數[46]。

DNA(copy number) 6.02 × 10 23 (copy/mol)× DNA amount(g) = DNA length(dp) × 660(g/mol/ dp)

(公式 2)

3-3 實驗分析

3-3-1 序列分析 本研究利用引子放大菌株之 16S rDNA ,並利用藍白篩選技術所得到 的白色菌落,送至波仕特生物科技公司進行 DNA 序列定序。再將定序結 果 產 生 之 序 列 , 進 一 步 將 資 料 傳 送 至 NCBI (National Center for Biotechnology Information )網站,該網站綜合了 GenBank、EMBL、DDBJ 與 PDB 資料庫。應用 NCBI 中 blastn 程式將定序所得核苷酸序列與資料庫 中 DNA 資料進行比對,以得到相似度較高之菌種 ; 另外,應用 EzTaxon Server 2.1 網站進行序列分析,將從 NCBI 比對出的未定義菌種(unculture 39


Bacteria),加以分析出已知菌種名。

3-3-2 系統樹 本實驗使用 MEGA version 5.05 軟體來建構出系統樹 (Phylogenetic trees)。首先將已定序之序列與七大 ANAMMOX 菌群 ( Anammoxoglobus propionicus 、 Brocadia anammoxidans 、 Brocadia fulgida 、 Kuenenia stuttgartiensis、Scalindua brodae、Scalindua sorokinii、Scalindua wagneri ) 進行 Alignment 排列,將資料匯入 Phylogeny 系統,利用 Bootstrap 方法 將 DNA 分成 1000 個片段進行比對分析,最後繪製成系統樹.

3-4 實驗設備

1.

高壓滅菌釜 ( TOMUN,TM-327 )

2.

直立式-20℃冷凍櫃 ( L.M.I ,FFU-21M7HW,美國製 )

3.

離心機 ( BECKMAN COULTER,美國製 )

4.

離心機 ( HSIANGTAI,CN-2600,台灣製 )

5.

恆溫水槽 ( Lab Companion,BW-10G )

6.

聚合酶連鎖反應機器 ( CORBETT RESEARCH,C100306,澳洲製 )

7.

聚合酶連鎖反應機器 ( BioRad,MyCycler,美國製 )

8.

DNA 電泳設備 ( BioRad PowerPac BasicTM,041BR16414,美國製 ) 40


9.

實時聚合酶連鎖反應機器( MiniOpticon Real-Time PCR System, BIO-RAD,新加坡製)

10. 實時聚合酶連鎖反應機器( Applied Biosystems,ABI 7300 Real-Time PCR System,美國製) 11. UV 燈箱 ( PANTECH,UVBOX 8100,台灣製 ) 12. 影像系統 ( AlphaDigiDocTM ) 13. 震盪恆溫培養箱 ( FIRSTEK,S306R ) 14. -86 度低溫冷凍櫃 ( SANYO MDF-U33V )

第四章

結果與討論

4-1 SNAD 程序之操作情形 依照垃圾滲出水處理廠提供的每個程序/操作單元廢水參數,可參照表 4.1。發現 NO2--N 濃度含量低,主要是因為厭氧氨氧化菌利用 NH4+-N 為 電子供應者,NO2--N 作為電子接受者;硝酸菌則利用 NO2-將其轉變為 NO3-, NO2--N 不斷的被厭氧氨氧化菌和硝酸菌消耗。

從進流至放流 COD 去除 155 mg/L,而脫硝反應每去除 1 mg 的 41


NO3--N 會消耗 3.7 mg 的 COD,故經由脫硝反應消耗 42 mg 的 NO3--N, 相當於消耗 42 mg 的 NH4+-N。處理廠共處理了 508 mg/L 的 NH4+-N,脫硝 反應所消耗的 NH4+-N 只佔總處理 NH4+-N 的 8%,剩餘的 92%並非完全 經由傳統程序硝化、脫硝反應處理,而是由另一種厭氧氨氧化程序加入, 使其 NH4+-N 處理得以提高。

此垃圾滲出水處理廠採用 SNAD 程序,槽體含有硝化菌、脫硝菌、厭 氧氨氧化菌相互作用所得到的成果,使得 NH4+-N 的去除率高達 80%,故 此垃圾滲出水處理廠具有良好處理氨氮的成效。

表 4.1 垃圾滲出水的主要參數

42


Influent to aeration tank

Effluent from aeration tank

Removal rate

(mg/L)

(mg/L)

(%)

pH

7.9

7.3

-

TS

2610 ± 22

1970 ± 31

24.5

VS

554 ± 27

448 ± 81

19.1

COD

554 ± 97

399 ± 59

30

BOD

57 ± 1

9 ± 1

84.2

NO2--N

Not detectable

6 ± 1

-

NO3--N

3 ± 1

23 ± 12

-

NH4+-N

634 ± 143

126 ± 57

80.1

PO43--P

4 ± 1

2 ± 1

50

Parameter

依照不同月份寄送之樣品,所形成的厭氧氨氧化顆粒會受到當時環境 的影響,而有不同的狀態,故所採用的處理方式有所不同,如表 4.2 所示。 於 2011 年 3 月之後,此垃圾滲出水處理廠,研發新的方式培養厭氧氨氧 化顆粒,採用黑色擔體讓厭氧氨氧化顆粒能附著於上生長,此方式乃是發 現厭氧氨氧化顆粒喜附著於粗糙表面上,通常馴養厭氧氨氧化菌的廢水處 理場其水泥表面容易附著厭氧氨氧化顆粒,故以此方式進行後續操作培 養。

於 2010 年 7 月開始研究,第一個樣品為 2010 年 2 月的 G1,此樣品 被存放於 4℃ 直至當年 7 月重新萃取 DNA 並利用實時聚合酶鏈鎖反應分 析,G1 來源為曝氣池的底泥,底泥為厭氧氨氧化顆粒與槽體污泥混合組成, 利用滅菌水將其稀釋至可清楚分辨出紅色顆粒之程度,利用肉眼將紅色顆 粒一一挑出,故產生 G1(圖 4.1)樣品,樣品經由測量儀器檢測顆粒的平均 大小,G1 的顆粒平均直徑為 0.80±0.24mm。 43


而 M1(圖 4.2)由於顆粒細小且污泥含量多不易將顆粒從污泥中分離出, 所以採取混合物進行實驗,而 M1 的顆粒平均直徑為 0.66±0.23 mm,顏色 為紅色且顆粒結實。G2(圖 4.3)的處理程序如同 G1 將顆粒與污泥分離,顆 粒平均直徑為 1.10±0.32 mm,顏色為紅色且顆粒結實。

於 2011 年 10 月,處理廠研發擔體,可直接讓厭氧氨氧化菌附著於上, 方便取樣與研究;G3 為擔體上的紅色顆粒,而所培養的 G3 (圖 4.4)為本研 究期間生長最佳的樣品,顆粒平均直徑為 1.65±1.16 mm,顏色為鮮紅色, 型態結實且具有膨脹感。

表 4.2 不同月份的厭氧氨氧化顆粒型態 日期

樣品型態

顆粒平均直徑

代表符號

2010/02/03

紅色顆粒

0.80±0.24mm

G1

2010/07/06

紅色顆粒 & 污泥

0.66±0.23 mm

M1

2011/03/01

紅色顆粒

1.10±0.32 mm

G2

2011/10/24

紅色顆粒 (擔體)

1.65±1.16 mm

G3

M 代表厭氧氨氧化顆粒與污泥混合(Mix)。 G 代表附著於擔體上的厭氧氨氧化顆粒(Granule)。

44


圖 4.1、2010 年 2 月的顆粒型態

圖 4.2、2011 年 7 月的顆粒型態

圖 4.3、2011 年 3 月的顆粒型態

圖 4.4、2011 年 10 月的顆粒型態

45


4-2 分析 SNAD 程序之槽體

4-2-1 確認槽體之各菌種存在 垃圾滲出水污泥送達實驗室後,隨即利用 SoilMasterTM DNA Extraction Kit (epicentre 公司)進行 DNA 萃取,本實驗設計多對引子 (primer) 針對 高氨氮廢水中常出現之菌種,例如真細菌(11F_1512R)、亞硝酸鹽菌 (CTO & amoA)、 硝酸鹽菌 (NSR & Nitro)、脫硝菌 (nirS & cnorB)、厭氧氨氧化 菌 (AnnirS & KS & BA)。最佳 PCR annealing 溫度,溫度範圍從 51℃至 60℃,如表 4.3 所示。以 PCR 反應增殖基因序列,利用電泳分析確認 PCR 片 段 大 小 , 此 片 段 大 小 分 別 為 1.5kb (11F , 1512R) 、 465bp (CTO189fA/B+CTO189fC,CTO654r) 、 491bp (amoA-1F,amoA-2R) 、 151bp (NSR-1113f,NSR-1264r) 、 225bp (Nitro-1198f,Nitro-1423r) 、 890bp (nirS-1F , nirS-6R) 、 389bp (cnorB-2F , cnorB-6R) 、 442bp (AnnirS379F,AnnirS821R) 、 121bp (KS-qF3, KS-qR3) 、 277bp (BA-qF, BA-qR)。

本研究將樣品針對 ANAMMOX 紅色顆粒,進行 PCR 反應增殖基因 序列之產物跑膠,如圖 4.5 所示。在相同濃度下,所欲偵測的真細菌、亞 硝酸鹽菌、 硝酸鹽菌、脫硝菌、厭氧氨氧化菌都於膠體上顯示亮帶,代 表樣品內含有欲偵測之菌種,而其中以 TA 與 KS 顯示的亮帶最為明顯, 可初步評估樣品內總厭氧氨氧化菌與 Kuenenia stuttgartiensis 的存在占優 勢。

46


於 此 處 理 場 中 , Candidatus Kuenenia stuttgartiensis 的 含 量 大 於 Candidatus Brocadia anammoxidans,針對此兩種菌種作研究只要是因為 Kuenenia stuttgartiensis 與 Brocadia anammoxidans 是人為污染嚴重區域出 現的優勢菌種。而 AnnirS 設計為針對所有含有 nirS 基因的厭氧氨氧化菌, 除了 Scalindua 的 nirS 基因不可偵測於此引子中,故此 AnnirS 引子包含 大多數的厭氧氨氧化菌,可做為厭氧氨氧化菌存在的依據。

表 4.3 聚合酶鏈鎖反應的所有引子 Target

Primer

Most bacteria

AOB

NOB

Denitrifier

Most Anammox

Sequence(5’→3’)

11F

GTTTGATCCTGGCTCAG

1512R

GGYTACCTTGTTACGACTT

CTO189fA/B

GGAGRAAAGCAGGGGATCG

CTO189fC

GGAGGAAAGTAGGGGATCG

CTO654r

CTAGCYTTGTAGTTTCAAACGC

amoA-1F

GGGGTTTCTACTGGTGGT

amoA-2R

CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC

Nitro-1198f

ACCCCTAGCAAATCTCAAAAAACCG

Nitro-1423r

CTTCACCCCAGTCGCTGACC

NSR-1113f

CCTGCTTTCAGTTGCTACCG

NSR-1264r

GTTTGCAGCGCTTTGTACCG

nirS-1F

CCTAYTGGCCGCCRCART

nirS-6R

CGT TGAACTTRCCGGT

cnorB-2F

GACAAGNNNTACTGGTGGT

cnorB-6R

GAANCCCCANACNCCNGC

AnnirS379F

TCTATCGTTGCATCGCATTT

AnnirS821R

GGATGGGTCTTGATAAACA

Reference

Annealing temp (°C) 57

Amann et al., 1995

57

Kowalchuk 1997

et

al.,

53

Rotthauwe 1997

et

al.,

58

Knapp and Graham, 2007

60

Dionisi et al., 2002

51

Braker et al., 1998

51

Braker et al., 2003

51

Li et al., 2011a

K= G or T; R= A or G; S= G or C; Y= C or T; N= A, C, G orT AOB: ammonia-oxidizing bacteria; NOB: nitrate oxidizing bacteria; KS: Candidatus Kuenenia stuttgartiensis; BA: Candidatus Brocadia anammoxidans 47


圖 4.5 針對不同引子檢測厭氧氨氧化顆粒

4-2-2 顆粒與污泥樣品所含厭氧氨氧化菌之差異 本實驗向中原大學生物科技學系借用 ABI7300 Real-Time PCR System 進行實驗,利用此儀器進行相對定量與絕對定量之實驗。

本研究以 G1 和 M1 兩種樣品各別作為代表厭氧氨氧化菌顆粒的樣品 與富含污泥與顆粒的混合樣品。利用相對定量分析樣品中 16S 真細菌 (eubacteria)(EB) 、氨氮氧化菌(ammonia-oxidizing bacteria)(AOB)、亞硝 酸 氧 化 菌 (nitrite-oxidizing bacteria) ( NOB ) 、 總 厭 氧 氨 氧 化 菌 ( Total 48


anammox) (TA) ,如表 4.4 所示。以 EB 做為控制組,其他菌種作為對照 組,經由與控制組的比較換算成百分比,可去除實驗的誤差並得到結果。

表 4.4 實時聚合酶鏈鎖反應之引子 Target

EB AOB NOB

TA

Primer

Sequence(5’→3’)

BACT1369F

CGGTGAATACGTTCYCGG

PROK1492R

GGWTACCTTGTTACGACTT

amoA-1F

GGGGTTTCTACTGGTGGT

amoA-2R

CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC

NSR-1113f

CCTGCTTTCAGTTGCTACCG

NSR-1264r

GTTTGCAGCGCTTTGTACCG

Amx809F

GCCGTAAACGATGGGCACT

Amx1066R

AACGTCTCACGACACGAGCTG

Annealing temp (°C)

Reference

54

Suzuki et al., 2000

53

Rotthauwe et al., 1997

60

Dionisi et al., 2002

58

Tsushima et al., 2007a

G1 經由前處理將厭氧氨氧化顆粒從污泥中分離出,經由 RT-PCR 儀 器的相對定量程式分析,以 16S 真細菌(EB)作為控制組,讓硝化菌(AOB、 NOB)、總厭氧氨氧化菌(TA)比較各占 7.5%、9.0%、80%,如圖 4.6 所示。 根據結果可判斷 G1 的總厭氧氨氧化菌(TA)占 16S 真細菌(EB)的比例有 80 %含量極高,其餘的氨氮氧化菌與亞硝酸氧化菌含量很低,所以單純研究 厭氧氨氧化顆粒可得到高含量的厭氧氨氧化菌種,而其餘的硝化菌種,可 能為挑取厭氧氨氧化顆粒時,不甚參雜進入樣品的污泥。未研究的菌種占 3.5%,可能為脫硝菌、共生菌(Rubrivivax sp.)或其他常存在於廢水系統的 菌種…等。

M1 樣品以 16S 真細菌(EB)作為百分比的分母,氨氮氧化菌(AOB)、 49


亞硝酸氧化菌(NOB)、總厭氧氨氧化菌(TA)比較各占 1.1%、81.9%、8.6 %,如圖 4.7 所示。發現 M1 樣品內部所含總厭氧氨氧化菌的比例不高, 造成此結果的原因可能為紅色顆粒與污泥混合,其污泥成分占大宗。而又 以亞硝酸氧化菌(NOB)占有 81.9%,可說明此次樣品厭氧氨氧化反應並 未良好,因為大多數的 NO2--N 被亞硝酸氧化菌利用轉換為 NO3--N,使的 厭氧氨氧化菌沒有足夠的 NO2--N 可利用,可能為顆粒偏小的原因之一。

根據上述結果作初步的探討,發現總厭氧氨氧化菌(TA)所占的比例與 樣品處理有關,若樣品為乾淨的厭氧氨氧化顆粒則厭氧氨氧化菌含量就會 明顯的偏高; 反之,若污泥含量多,則以硝化細菌群為優勢。因此,本實 驗著重於研究厭氧氨氧化菌,故後續實驗將以紅色顆粒作為研究之對象, 盡量排除污泥干擾性。

50


EB (%) AOB 7.5%

未知 3.5%

NOB 9.0%

TA 80.0%

圖 4.6 G1 之 AOB、NOB、TA 相對定量

EB (%) TA 8.6%

未知 8.4%

AOB 1.1%

NOB 81.9%

51


圖 4.7 M1 之 AOB、NOB、TA 相對定量

4-2-3 厭氧氨氧化菌之定量分析 針對厭氧氨氧化菌作細部的了解與分析,使用絕對定量分析 G1、M1、 G2 樣品的原因為可以得到實際的含量,分析項目包含總厭氧氨氧化菌 ( Total anammox) (TA) 、 Kuenenia stuttgartiensis (KS) 、 Brocadia anammoxidans (BA)。絕對定量需製作標準曲線作為數據判斷之依據,可推 算出原始含量並換算出拷貝數(copy number)與細胞數(cell number)。利用標 準曲線將 CT 值換算成細胞數(cell number),本章節將以細胞數探討各菌種 存在之變化,所有樣品定量為 3ng 進行 RT-PCR 實驗。

G1 的標準曲線斜率為-3.17,截距為 8.60,R2 為 0.97 ,經由 CT 值所 換算出的細胞數(cell number),如表 4.5 所示。將總厭氧氨氧化菌(TA)的細 胞 數 作 為 百 分 比 的 分 母 與 Kuenenia stuttgartiensis (KS) 、 Brocadia anammoxidans (BA) 的細胞數做比較,獲得結果為在總厭氧氨氧化菌中 Kuenenia stuttgartiensis 占 89.4%,而 Brocadia anammoxidans 大約佔有 6.7 %,可以說整個厭氧氨氧化顆粒幾乎為 KS 與 BA 所組成的。

表 4.5

G1 之 KS、BA 絕對定量

2010/02/03 (G1)

TA

KS

BA

CT value

16.94

18.61

22.17

Copy number per ng

2.17*105

1.94*105

1.46*104

Cell number per mg

2.17*108

1.94*108

1.46*107

52


/TA ratio (%)

100

89.4

6.7

M1 的標準曲線斜率為-3.17,截距為 8.60,R2 為 0.97 , Kuenenia stuttgartiensis (KS)、Brocadia anammoxidans (BA)換算為百分比,如表 4.6 所示。分別各占 25.6%與 0.2%,說明 M1 樣品的厭氧氨氧化菌 Kuenenia stuttgartiensis 存在遠高於 Brocadia anammoxidans,但此兩種菌種只佔有總 厭氧氨氧化菌的 25.83%,尚有 74.2%為未知的厭氧氨氧化菌種。

表 4.6

M1 之 KS、BA 絕對定量

2010/07/06 (M1)

TA

KS

BA

CT value

18.36

31.25

37.72

Copy number per ng

7.8*104

2*107

1.82*105

Cell number per mg

7.8*107

2*107

1.82*105

/TA ratio (%)

100

25.6

0.2

G2 的標準曲線斜率為-3.16,截距為 6.47,R2 為 0.98 , Kuenenia stuttgartiensis (KS)、Brocadia anammoxidans (BA)與總厭氧氨氧化菌 (TA) 的比值,如表 4.7 所示。Kuenenia stuttgartiensis 為 38.7%、Brocadia anammoxidans 為 0.7%,G2 樣品的趨勢如同 M1,厭氧氨氧化菌 Kuenenia stuttgartiensis 高於 Brocadia anammoxidans,但 G2 樣品中所含的 Kuenenia stuttgartiensis 與 Brocadia anammoxidans 仍有限,尚有 60.6%的未知厭氧氨 氧化菌種可以探討。 53


表 4.7

G2 之 KS、BA 絕對定量

2011/03/01 (G2)

TA

KS

BA

CT value

16.72

19.53

25.06

Copy number per ng

5.3*104

2.05*104

3.66*102

Cell number per mg

5.3*107

2.05*107

3.66*105

/TA ratio (%)

100

38.7

0.7

54


4-3 質體構築分析 經由利用絕對定量分析所得結果,發現除了 G1 含有大量的 Kuenenia stuttgartiensis 與 Brocadia anammoxidans 以外,其餘的 M1、G2 尚有許多 未知的厭氧氨氧化菌種存在,為了更進一步的了解厭氧氨氧化菌群有哪些, 故將使用 G2 與 G3 樣品進行質體構築(TA Cloning)分析。

4-3-1 針對厭氧氨氧化菌之選殖 主要研究樣品為 G2 與 G3,G2 所使用的引子為 Brod 541F 與 Amx 820R; 而 G3 所使用的引子為 16S-5’與 16S-3’,如表 4.8 所示。本研究所探討之垃 圾滲出水處理場其受環境變化不大,故將其設定為穩定狀態,厭氧氨氧化 菌群不受影響,故採用不同時間點之 G2、G 3 樣品,探討何種引子較利於 於選殖出豐富的厭氧氨氧化菌族群。

表 4.8 進行選殖反應之引子 primer name

Sequence(5’→3’)

reference

Brod541F

GAGCACGTAGGTGGGTTTGT

Penton et al., 2006

Amx820R

AAAACCCCTCTACTTAGTGCCC

Schmid et al., 2000

16S-5’

TGGCGGCGTGGTTTAGGC

Fujii et al., 2002

16S-3’

GGTTACCTTGTTACGACT

Fujii et al., 2002

55


G2 以 Brod 541F 與 Amx 820R 進行選殖,以幫助了解厭氧氨氧化顆粒 的菌相分佈,利用 MEGA 5.05 進行序列 alignment,其中另外添加七種已 知厭氧氨氧化菌 ( Candidatus Anammoxoglobus propionicus、Candidatus Brocadia anammoxidans、Candidatus Brocadia fulgida、Candidatus Kuenenia stuttgartiensis、Candidatus Scalindua brodae、Candidatus Scalindua sorokinii、 Candidatus Scalindua wagneri ) 進行比對建立系統樹,藉此得知厭氧氨氧 化顆粒選殖出的菌種,最為類似何種厭氧氨氧化菌。

此次引用 Brod 541F 與 Amx 820R 作為 G2 的引子,所得系統樹如圖 4.8 所示。本次研究挑選 48 株菌株,成功定序 40 株菌株,經多重序列排 比整理後,共可分為 3 大族群,其中 38 個序列經由 NCBI 比對為 Uncultured planctomycete clone AMX46 16S ribosomal RNA gene (以 clone 31 為代表), 此菌株與已知的 Candidatus Brocadia fulgida 16S ribosomal RNA gene 最為 類似;另外,也分析出 2 個差異較大的序列,分別為 Uncultured bacterium clone p2 16S ribosomal RNA gene(以 clone 48 為代表) 與 Uncultured planctomycete clone ST_3 16S ribosomal RNA gene(以 clone 08 為代表),經 由系統樹發現此兩菌株 clone 48 和 clone 08 也是與 Candidatus Brocadia fulgida 16S ribosomal RNA gene 最為類似。

將上敘 3 大類菌群與 Candidatus Brocadia fulgid 進行比較,以尋找其 序列的差異度,第一族群以 clone 31 為代表,與 Candidatus Brocadia fulgid 的差異度為 2.2%;第二族群以 clone 48 為代表,與 Candidatus Brocadia fulgid 的差異度為 2.2%;第三族群以 clone 08 為代表,與 Candidatus 56


Brocadia fulgid 的差異度為 4%。

經由上述結果,可得知於 G2 樣品中,以 Candidatus Brocadia fulgida 為優勢菌種(95%),經由選殖的菌株與 Candidatus Brocadia fulgida 的差異 度皆小於 4%。

圖 4.8 G2 選殖厭氧氨氧化菌的系統樹

此次進行 G3 樣品的選殖,使用的引子改為 16S-5’與 16S-3’,改變 的主要原因為此引子可偵測大部分的厭氧氨氧化菌。

57


本次挑選 25 株菌株,定序成功 23 株菌株,經重複 aligment 排比分 析後,共分為 4 大族群,其中有 20 個序列大致相同(以 clone 02 為代表), 與 Anaerobic ammonium-oxidizing planctomycete KOLL2a 最為相似;另外, clone 07 序列與 Kuenenia stuttgartiensis genome fragment KUST_E 最為相似, 此兩類序列經由系統樹顯示,可得知與 Candidatus Kuenenia stuttgartiensis 最為相似。

此外,出現偏離厭氧氨氧化菌的選殖菌株,分別為 clone 21 和 23,深 入分析 clone 23 發現其並非為一個完整的序列,其序列片段長度只有 586 bp,為完整序列的 39% (586/1497),但利用 MEGA 5.05 將 586 bp 進行 alignment 序列分析,可得到 clone 23 與 Anaerobic ammonium-oxidizing planctomycete KOLL2a 最相似,而 clone 23 與 Kuenenia stuttgartiensis 的相 異度只有 1.4%。其中 clone 21 經由 NCBI 分析為 Uncultured Unclassified bacterium 16S rRNA gene from clone QEDV1BE10 ,並非屬於厭氧氨氧化 菌群

將上敘 4 大類菌種與 Candidatus Kuenenia stuttgartiensis 進行比較,以 尋 找 其 序 列 的 差 異 度 , 第 一 族 群 以 clone 02 為 代 表 , 與 Kuenenia stuttgartiensis 的差異度為 1%,第二族群以 clone 07 為代表,與 Kuenenia stuttgartiensis 的差異度為 3%,第三族群以 clone 21 為代表,與 Kuenenia stuttgartiensis 的差異度為 21%,第四族群以 clone 23 號為代表,與 Kuenenia stuttgartiensis 的差異度為 1%(8/586)。

經 由 上 述 結 果 , 可 得 知 於 G3 樣 品 中 , 以 Candidatus Kuenenia stuttgartiensis 為優勢菌種(91%),此次研究發現序列編號 21 號菌種與厭氧 58


氨氧化菌群差異最大,值得進一步深入探討,所得系統樹如圖 4.9 所示。

圖 4.9 G3 選殖厭氧氨氧化菌的系統樹

59


4-3-2 針對 16S rRNA 真細菌之選殖 為了瞭解厭氧氨氧化菌以外的菌群,運用 11F 與 1512R 偵測 G3 樣品 中的 16S 真細菌,本次樣品分析除了將序列資料傳送至 NCBI (National Center for Biotechnology Information ) 網 站 進 行 比 對 以 外 , 也 會 應 用 EzTaxon Server 2.1 網站進行未定義菌種(unculture Bacteria)的序列分析, 但利用 EzTaxon Server 2.1 網站分析之結果,與原始序列之相似度介於 99~84%之間,如表 4.9 所示。

本次研究挑選 29 株菌落來進行後續分析,分析結果,如圖 4.10 所示。 經由 NCBI 網站分析發現 29 株菌落大約都為 Uncultured Bacteria,其中又 為 Uncultured sludge bacterium clone ASB79 16S ribosomal RNA gene (以 sequence 01 為代表)重覆比例為 24%(7/29)較高,此種菌為 sludge bacterium 與目前生存活環境相符;另外,使用 EzTaxon Server 2.1 網站分析為 Denitratisoma oestradiolicum AcBE2-1(T),此菌種為脫硝菌種。

而 NCBI 網站分析出 Uncultured bacterium clone Dok59 16S ribosomal RNA gene (以 sequence 08 為代表),重覆比例為 10%(3/29);於 EzTaxon Server 2.1 網站顯示結果為 Azoarcus tolulyticus Tol-4(T) ; 另外,發現 sequence 17 為 Azospira restricta SUA2(T)與 Azoarcus tolulyticus Tol-4(T) 60


菌種相近。而 Denitratisoma oestradiolicum AcBE2-1(T)、Azoarcus tolulyticus Tol-4(T) 、Azospira restricta SUA2(T)此三菌種的共同為 Rhodocyclaceae 科 且為脫硝菌種。

NCBI 比對結果得知 sequence 03 的為 Bacteroidetes bacterium 是擬桿菌 門(Bacteroidetes)包括三大類細菌,即擬桿菌綱、黃桿菌綱、鞘脂桿菌綱。 而 sequence 13 與 sequence 22 為 beta proteobacterium 門是多屬於化學自營 性細菌,除氮系細菌也為其中一部分,但經由 EzTaxon Server 2.1 網站分 析 sequence 13 與 sequence 22 並非屬於除氮系細菌;而所有選殖的菌株為 厭氧菌。

61


表 4.9 G3 利用 EzTaxon Server 2.1 網站分析之結果 相似度 (%)

除氮菌

Rhodocyclaceae Denitratisoma oestradiolicum AcBE2-1(T)

95.5

脫硝菌

SEQUENCE 02

Rhodocyclaceae Denitratisoma oestradiolicum AcBE2-1(T)

95.5

脫硝菌

SEQUENCE 03

Marinilabiaceae Alkaliflexus imshenetskii Z-7010(T)

83.9

SEQUENCE 04

Rhodocyclaceae Denitratisoma oestradiolicum AcBE2-1(T)

95.4

脫硝菌

SEQUENCE 05

Rhodocyclaceae Denitratisoma oestradiolicum AcBE2-1(T)

95.4

脫硝菌

SEQUENCE 06

Rikenellaceae Alistipes shahii WAL 8301(T)

88.9

SEQUENCE 07

Proteocatella sphenisci PPP2(T)

99.0

SEQUENCE 08

Rhodocyclaceae Azoarcus tolulyticus Tol-4(T)

92.1

脫硝菌

SEQUENCE 09

Rhodocyclaceae Denitratisoma oestradiolicum AcBE2-1(T)

95.4

脫硝菌

SEQUENCE 10

Spirochaeta stenostrepta DSM 2028(T)

91.6

SEQUENCE 11

Thermoanaerobacteraceae Thermanaeromonas toyohensis ToBE(T)

86.8

SEQUENCE 12

Cryomorphaceae Crocinitomix catalasitica IFO 15977(T)

87.8

SEQUENCE 13

Xanthomonadaceae Lysobacter bugurensis ZLD-29(T)

92.4

SEQUENCE 14

Rhodocyclaceae Denitratisoma oestradiolicum AcBE2-1(T)

95.5

SEQUENCE 16

Clostridiales Anaerovorax odorimutans NorPut(T)

93.0

SEQUENCE 17

Rhodocyclaceae Azospira restricta SUA2(T)

86.6

脫硝菌

SEQUENCE 18

Rhodocyclaceae Azoarcus tolulyticus Tol-4(T)

91.9

脫硝菌

SEQUENCE 19

Clostridiales Proteocatella sphenisci PPP2(T)

85.9

脫硝菌

SEQUENCE 20

Rhodocyclaceae Sulfuritalea hydrogenivorans sk43H(T)

88.3

SEQUENCE 21

Rhodocyclaceae Sulfuritalea hydrogenivorans sk43H(T)

95.6

SEQUENCE 22

Burkholderiaceae Cupriavidus gilardii CIP 105966(T)

89.7

SEQUENCE 23

Clostridiales Anaerovorax odorimutans NorPut(T)

92.9

SEQUENCE 24

Spirochaeta stenostrepta DSM 2028(T)

89.8

序列

菌種名

SEQUENCE 01

62

脫硝菌


SEQUENCE 25

Caldilineaceae Caldilinea aerophila STL-6-O1(T)

86.2

SEQUENCE 26

Cryomorphaceae Owenweeksia hongkongensis UST20020801(T)

87.6

SEQUENCE 27

Acidobacteriaceae Edaphobacter modestus Jbg-1(T)

84.5

SEQUENCE 28

Rhodocyclaceae Azoarcus tolulyticus Tol-4(T)

92.1

SEQUENCE 29

Rhodocyclaceae Propionivibrio limicola GolChi1(T)

91.1

SEQUENCE 30

Saprospiraceae Haliscomenobacter hydrossis DSM 1100(T)

91.6

63

脫硝菌


Anammox 菌群

圖 4.10

G3 選殖 16S rRNA 真細菌的系統樹 64


4-3-4 探討引子對厭氧氨氧化菌之影響 總結 G2 與 G3 的結果,如表 4.10 所示。G2 與 G3 經由選殖程序出來 的結果不相同,導致此結果的原因為所選用的引子不同。G2 使用的 Brod541F 與 Amx820R 可偵測厭氧氨氧化菌,但主要針對 Scalindua 菌屬, 鎖定的氧氨氧化菌群範圍較小,結果偵測出 G2 的菌相非常單一化為 Brocadia fulgida。

後期改用 16S-5’與 16S-3’此序列片段大約為 1.5kb,希望能獲得更 豐富的厭氧氨氧化菌群,選殖分析後發現大致為 Kuenenia stuttgartiensis, 雖然沒有菌相豐富化的情形,但與絕對定量之結果相呼應,依據 G1、M1、 G2 樣品的絕對定量可發現 Kuenenia stuttgartiensis 存在高於 Brocadia anammoxidans,故 16S-5’與 16S-3’較適合作為檢測厭氧氨氧化菌的引 子。

利用 11F 與 1512R 作 16S rRNA 真細菌之研究分析 29 顆菌株,利用 MEGA 5.05 軟體繪出系統樹,選殖出的 G3 序列並不包含厭氧氨氧化菌群 與硝化菌種,可能原因為厭氧氨氧化菌群在 16S rRNA 真細菌中所占比例 偏低或挑選菌株數量不足。目前已發現之脫硝菌總計約有 130 種,比例大 於硝化菌,故於 G3 樣品中的菌種大多數為脫硝菌種。但依據水質資料顯 示,NH4+-N 去除量大約為 500mg/L,而硝化菌至少參與 250mg/L 的 NH4+-N 去除量且根據絕對定量結果說明 AOB 與 NOB 存在於樣品中,故硝化菌不 存在為不合理的,造成此原因的結果為所挑選的菌株數量不足。

65


日期

樣品

定序成

菌種類別

(Primer)

功/挑選 菌數

(菌數)

2011/03 天外天 40/48 紅色顆粒 (Brod 541F、

23/25

相異度 (%) (1) 2.2%

Uncultured planctomycete clone ST_3 16S ribosomal RNA gene (1/40)

1. Brocadia fulgida 2. Brocadia fulgida 3. Brocadia fulgida

Anaerobic ammonium-oxidizing

1. Kuenenia

(1) 1%

1.

Uncultured planctomycete clone AMX46 16S ribosomal RNA gene (38/40)

2.

Uncultured bacterium clone p2 16S ribosomal RNA gene (1/40)

3.

1.

Amx 820R)

2011/10 天外天

菌種

表 4.10 G2 與 G3 的結果總整理

66

(2) 2.2% (3) 4%


紅色顆粒 (16S-5’、

planctomycete KOLL2a 16S ribosomal RNA gene (21/23)

16S-3’)

2.

Kuenenia stuttgartiensis genome fragment KUST_E (1/23)

3.

Unclassified bacterium 16S rRNA gene from clone QEDV1BE10 (1/23)

4.

Partial of Anaerobic ammonium-oxidizing

stuttgartiensis 2. Kuenenia stuttgartiensis 3. Unculture Bacteria 4. Kuenenia stuttgartiensis

planctomycete KOLL2a 16S ribosomal RNA gene (1/23)

2011/10 天外天 29/30 紅色顆粒 (11F、1512R)

1.

Denitratisoma (7/29

2.

Azoarcus tolulyticus Tol-4(T) (3/29)

3.

Azospira restricta SUA2(T) (1/29)

第五章

oestradiolicum

AcBE2-1(T)

1.

脫硝菌

2.

脫硝菌

3.

脫硝菌

結論與建議

5-1 結論 本實驗研究某垃圾滲出水處理廠利用 SNAD 程序培養出的厭氧氨氧 化水樣,主要以厭氧氨氧化顆粒為主要研究對象。觀測此處理廠於 2 年之 間的厭氧氨氧化變化,獲得下列結論。

67

(2) 3% (3) 21% (4) 1%


1.

不同月份之厭氧氨氧化顆粒的大小有所不同,其顆粒大小與四季 變化沒有直接的關係,而其中以 G3 樣品的型態為最大。

2.

於 G1 與 M1 樣品作相對定量,發現樣品組成不同導致厭氧氨氧化 菌的含量差異很大。G1 為經由人為挑選的厭氧氨氧化顆粒,而 M1 為污泥與厭氧氨氧化顆粒的混合物,依照相對定量顯示 G1 的 總厭氧氨氧化菌(TA)為 80%相較於未經處理的 M1 樣品為 8.6%, 總厭氧氨氧化菌明顯高於很多,故由此得知檢測厭氧氨氧化樣品 時,只需針對顆粒進行研究,排除污泥帶來的誤差。

3.

針對厭氧氨氧化菌作絕對定量可得到量化的數值,並研究於人為 污 染 區 域 常 出 現 的 Kuenenia stuttgartiensis 與

Brocadia

anammoxidans,利用與總厭氧氨氧化菌(TA)作為百分比分母進行 比較,發現 G1、M1、G2 的共同特性為 Kuenenia stuttgartiensis 的存在遠高於 Brocadia anammoxidans。

4.

由於垃圾滲出水處理場的溫度大約在 30~33℃,而 pH 值大約在 7.4 左右, 總厭氧氨 氧 化 菌 相 並 不 會 有 太 大 的 改 變 , 故 使 用 Brod541F 與 Amx820R 作為偵測 G2 樣品的引子,發現只可檢測出 單一菌相為 Brocadia fulgida。故後續改用片段較長(1497bp)可偵 測出大部分厭氧氨氧化菌的 16S-5’與 16S-3’引子作選殖,其結 果也大致為單一菌相 Kuenenia stuttgartiensis,只有一株菌不包含 於厭氧氨氧化菌群。

5.

依據 G1、M1、G2 樣品的絕對定量可發現 Kuenenia stuttgartiensis 68


存在高於 Brocadia anammoxidans,故 16S-5’與 16S-3’較適合作 為檢測厭氧氨氧化菌的引子。

6.

利用 11F 與 1512R 作 G3 樣品的 16S rRNA 真細菌分析,發現大 多數為脫硝菌種, 不包含厭氧氨氧化菌與硝化菌,依據水質分析 與相對定量結果,其結果不合理,可能原因為選殖數量不足。

5-2 建議

1.

本研究於對於 G1、M1、G2、G3 樣品為個別利用不同的分子生物技術 作研究探討,倘若每個樣品都有做相對定量、絕對定量、TA-Clonig… 等分子生物技術,便可更清楚探討樣品之間是否有相關性。

69


2.

由於本實驗所使用於針對厭氧氨氧化菌選殖反應的引子為 Brod541F_Amx820R、16S-5’_ 16S-3’兩種,所顯示出的菌相都非常 單一化,若能找到包含所有厭氧氨氧化菌的引子,表現出樣品中菌相 的豐富性亦佳。

3.

實驗中使用相對定量與絕對定量主要是針對菌種的 genomic DNA 分 析,若後續實驗可針對厭氧氨氧化菌中的功能性基因(HAO、HZO…等) 最研究,即可更深入的探討厭氧氨氧化菌。

第六章

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