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Síndrome del seno cavernoso asociado a parálisis facial y síndrome vestibular periférico en un cruce de pequinés (Sinus cavernosum syndrome associated to facial paralysis and vestibular syndrome in a pekinese cross-bred dog). Hernández Guerra, Angel M Dpto. Medicina y Cirugía Animal. Facultad de Ciencias Experimentales y de la Salud Universidad Cardenal Herrera-CEU Edificio Seminario, s/n. 46113 Moncada. Valencia Tel 0034961369000 (extensión 1150); Fax: +34961365272 Email: angelhdez@uch.ceu.es

RECVET: 2008, Vol. III, Nº 4 Recibido 22.01.08 / Referencia 040801_RECVET / Aceptado: 03.03.08 / Publicado: 01.04.08 Este artículo está disponible en http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408.html concretamente http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040801.pdf Revista Electrónica de Clínica Veterinaria RECVET® está editada por Veterinaria Organización® Se autoriza la difusión y reenvío siempre que enlace con Veterinaria.org® http://www.veterinaria.org y con RECVET®-http://www.veterinaria.org/revistas/recvet

RESUMEN Se presenta un perro cruce de pequinés de siete años de edad, con signos de oftalmoplejía, atrofia de los músculos masticatorios, ladeo de cabeza y parálisis facial de lado izquierdo. Esto signos eran compatibles con síndrome del seno cavernoso, síndrome vestibular y parálisis facial. La tomografía axial computerizada con contraste intravenoso reveló una masa que se extendía desde la bulla timpánica del mismo lado hasta el espacio retrobulbar que afectaba a los nervios craneales, III; IV, V, VI, VII y VIII. La masa acabó resultando un carcinoma indiferenciado y debido al grave pronóstico, el perro fue eutanasiado. Palabras clave: Seno Cavernoso | Síndrome Vestibular | Parálisis facial |Tomografía Axial computerizada.

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ABSTRACT A seven-year old Pekinese cross-bred dog was presented with signs of ophthalmoplegia, head tilt, facial paralysis and masticatory muscle atrophy on the left side. These neurological deficits were compatible with cavernous sinus syndrome. Computed tomography images of the cavernous sinus and the optical fissure revealed a mass extending from the left tympanic bulla to the retrobulbar space. This extension of the mass affected the normal function of the cranial nerves III; IV, V, VI, VII and VIII. Histopathological diagnosis revealed an undifferentiated carcinoma. The dog was euthanized due to the poor prognosis Keywords: Computerized Axial Tomography | Facial Paralysis | Sinus cavernosus | Vestibular Syndrome |

1.

INTRODUCCIÓN

El Síndrome del Seno Cavernoso se produce en caso de afección de dos o más de los nervios craneales que atraviesan dicho Seno ( Nervios craneales III, IV, VI y las dos primeras ramas del V). Está normalmente producido por una masa que comprime estos nervios a su paso por él. Es un síndrome poco común y, especialmente en perros, suele presentar un pronóstico grave por la inaccesibilidad de la zona y debido a una etiología casi siempre neoplásica. Por su parte, el síndrome vestibular se produce por afección del sistema vestibular. Este síndrome se puede diferenciar clínicamente en periférico en caso de afectar al nervio vestíbulo coclear y/o al laberinto de hueso petroso o central si afecta a los centros vestibulares del tallo encefálico y/o cerebelo. 2. HISTORIA CLÍNICA Y ANAMNESIS Se presenta un perro macho, cruce de pequinés, de 7 años de edad, al Hospital Clínico Veterinario de la Universidad Cardenal Herrera-CEU remitido por una historia de atrofia progresiva de los músculos masticatorios del lado izquierdo de un año duración. A los tres meses se acompañó de pérdida de visión y ladeo de la cabeza hacia el mismo lado. Desde hacía quince días presentaba ligera dificultad en la prensión de alimentos. Se le trató de forma empírica con vitamina B y antibióticos. 3. EXAMEN FÍSICO En un primer examen a distancia, el animal presentaba una marcada atrofia de los músculos masticatorios del lado izquierdo de la cabeza, endoftalmia, ptosis palpebral del ojo ipsilateral y ladeo de cabeza hacia el mismo lado y una evidente sequedad de mucosas en el ollar izquierdo (fig 1). En un examen a corta distancia se apreciaba la presencia de abundante Síndrome del seno cavernoso asociado a parálisis facial y síndrome vestibular periférico en un cruce de pequinés http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040801.pdf

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tejido de granulación en la córnea del ojo del mismo lado compatible con una úlcera corneal crónica. El resto del examen físico no presentó ninguna alteración relevante. En el examen neurológico, la respuesta de amenaza y los reflejos corneal y palpebral del lado izquierdo estaban ausentes. El reflejo pupilar indirecto del ojo izquierdo era normal, no pudiéndose estimar el reflejo pupilar directo de ese mismo ojo debido al citado tejido de granulación corneal presente. El nistagmo post-rotatorio (reflejo óculo vestibular) era normal en ojo derecho y ausente en el izquierdo, que no presentaba movimiento alguno. Si se variaba la postura se podía apreciar cierto nistagmo horizontal en el ojo derecho (nistagmo posicional). El lado derecho de la cabeza no presentaba ninguna otra anormalidad aparte del ya mencionado nistagmo posicional. El test de Schirmmer en el ojo derecho era normal y en el izquierdo era de 3 mm/min (valores normales 10-15 mm/min). Esta disminución de la producción de la fase acuosa de la lágrima unido a la sequedad de las mucosas del ollar del lado izquierdo era compatible con una queratoconjuntivitis seca do origen neurogénico, producida por un déficit de estímulo parasimpático a las glándulas lacrimales. El resto del examen neurológico era normal, incluyendo el estado mental, propiocepción y reflejos espinales de las cuatro extremidades. Los resultados del examen neurológico eran compatibles con déficit de los pares craneales III, IV, V, VI, VII y VIII del lado izquierdo. 4. PRUEBAS COMPLEMENTARIAS Se realizó un estudio radiológico completo de la cabeza que incluía vistas laterales, dorsoventrales y oblicuas, que no halló ningún hallazgo relevante. Ante esta ausencia de hallazgos se optó por realizar, bajo anestesia general, una Tomografía Axial Computerizada (TAC). El examen tomográfico mostró en la vista precontraste en ventana ósea una erosión de la cortical del hueso basiesfenoides a la altura del agujero oval (figura Síndrome del seno cavernoso asociado a parálisis facial y síndrome vestibular periférico en un cruce de pequinés http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040801.pdf

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2). En la vista post-contraste se observa un zona de toma de contraste que se extiende medial a la rama vertical de la mandíbula desde la porción rostral de la bulla timpánica hasta la fisura orbitaria (figura 3). Además de estos hallazgos, se observó una bulla timpánica con contenido líquido, compatible con una otitis media.

Seguidamente se tomó una biopsia quirúrgica mediante un abordaje desde el espacio retrobulbar. En informe anatomopatológico identificó la muestra como una miositis piogranulomatosa, aunque no se identificó agente causal alguno (cuerpo extraño, hongo, o parásito). Se decidió, dada la ausencia de agente causal identificado, comenzar un tratamiento empírico a base de antibiótico de amplio espectro: (AmoxicilinaSíndrome del seno cavernoso asociado a parálisis facial y síndrome vestibular periférico en un cruce de pequinés http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040801.pdf

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ácido clavulanico, Synulox® 8,75mg/kg 12 horas) y antiinflamatorio (Carprofeno, Rimadil®, 2 mg/kg 12 h). En cualquier caso se emitió un pronóstico reservado ante la ausencia de identificación del agente causal y la imposibilidad de descartar un origen neoplásico. Tras un periodo de mejora parcial, a los tres meses se observo un crecimiento de una masa caudal al último molar del maxilar izquierdo. Una biopsia de la zona identificó la masa como un carcinoma indiferenciado, con un pronóstico grave. Ante este pronóstico, los dueños optaron por la eutanasia del animal, no permitiendo estudio post-mortem. 5. DISCUSIÓN El Síndrome del Seno cavernoso (SSC) está caracterizado por la disfunción de más de uno de los nervios que atraviesan el seno cavernoso (pares craneales III, IV, VI y las dos primeras ramas del V). Este seno es un canal venoso bilateral situado entre la duramadre y el basiesfenoides inmediatamente caudal a la órbita ocular que juega un papel clave en el drenaje venoso de la órbita y el encéfalo. Los senos derecho e izquierdo se ubican a ambos lados en el suelo de la fosa craneal media del basiesfenoides y se extienden desde la fisura óptica al canal petrooccipital. Ambos senos cavernosos están conectados medialmente a la altura de la silla turca, donde se sitúa la glándula pituitaria (Evans,1993). Esta área está atravesada por las fibras óculosimpáticas y motoras de los nervio craneales oculomotor (III), troclear (IV), abducente (VI) así como por dos ramas del nervio trigémino (V): las porciones maxilar y oftálmicauna lesión en el seno cavernoso afectará con mucha probabilidad a alguno de estos nervios dando lugar a dicho síndrome (CSS). Al continuar estos nervios cranealmente es imposible clínicamente determinar si la lesión se sitúa en este seno o en la fisura orbital(Scagliotti, 2000). En este caso, la tomografía axial localizó la masa extracranealmente después de la salida del la cavidad craneal de los nervios craneales III, IV, las ramas oftálmica y maxilar del V y de los nervios oculovestibular (VIII) y facial (VII). El Síndrome del Seno cavernoso es un síndrome raramente diagnosticado en medicina humana, y ha sido descrito en pocas ocasiones en veterinaria (Fransson et al., 2000; Lewis et al., 1984; Valentine et al., 1988; Theisen et al., 1996; Rossmeisl et al., 2005; Hernández-Guerra et al, 2007). En perro este síndrome esta normalmente causado por una masa de origen neoplásico (Theisen et al., 1996). Otra causa descrita de síndrome del seno cavernoso en perro, es el aneurisma de origen traumático (Fransson et al., 2000). Los signos clínicos más frecuentes asociados al síndrome del seno cavernoso son oftalmoplejía, oftalmoparesis, midriasis, ausencia de reflejos pupilares, déficit en la sensación ocular y alteración del reflejo retractor del globo ocular (Theisen et al., 1996). Existe controversia respecto a añadir la rama mandibular del nervio trigémino a este síndrome (Theisen et al., 1996). En este caso, el perro mostró además de los signos típicos, signos compatibles con un síndrome vestibular y parálisis facial. Estos signos podrían ser debidos no solo a la masa sino a la otitis media que reflejaba el Síndrome del seno cavernoso asociado a parálisis facial y síndrome vestibular periférico en un cruce de pequinés http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040801.pdf

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TAC (Hernández Guerra, 2006); Además de esto signos el perro presentaba atrofia de la musculatura masticatoria, muy probablemente debido a una lesión de la rama mandibular del nervio trigémino. Hasta ahora todos los casos descritos en perro, excepto el del aneurisma traumático, han tenido un origen neoplásico. En el gato, en cambio, la mayoría (4/6) de los casos descritos han sido de origen infecciosos/inflamatorio (Theisen et al., 1996). 6. REFERENCIAS 1. Evans, H.E., 1993. Veins. In: Miller’s Anatomy of the Dog, third ed. WB Saunders Co., Philadelphia, PA, pp. 710–711. 2. Fransson, B., Kippenes, H., Silver, G.E., Gavin, P.R., 2000. Magnetic resonance diagnosis: cavernous sinus syndrome in a dog. Veterinary Radiology and Ultrasound Vol 6, 536–538. 3. Hernandez-Guerra AM, Lopez-Murcia MM, Planells A, Corpa JM, Liste F. Computed tomographic diagnosis of unilateral cavernous sinus syndrome caused by a chondrosarcoma in a dog: A case report. Veterinary Journal. Nº174 (2007) 206-208. 4. Hernández Guerra Angel M Otitis interna. Exploración neurológica y diagnóstico por imagen. Consulta difusión veterinaria. Mayo 2006: nº 130. 5. Lewis, G.R., Blanchard, G.L., Trapp, A.L., 1984. Ophthalmoplegia caused by thyroid adenocarcinoma invasion of the cavernous sinus in the dog. Journal of the American Animal Hospital Association vol 20, 805–812. 6. Rossmeisl, J.H., Higgins, M.A., Inzana, K.D., Herring, I.P., Grant, D.C., 2005. Bilateral cavernous syndrome in dogs: 6 cases (1999–2004). Journal of the American Veterinary Medical Association. Vol 7, 1105– 1111. 7. Scagliotti, R.H., 2000. Comparative neuro-opthtalmology. In: Gelatt, Kirk (Ed.), Veterinary Ophthalmology, third ed. Lippincot Williams & Wilkins, Philadelphia, USA, pp. 307–1400. 8.Theisen SK, Podell M, Schneider T, Wilkie DA, Fenner WR A retrospective study of cavernous sinus syndrome in 4 dogs and 8 cats.. J Vet Intern Med. 1996 Mar-Apr; 10(2):65-71. Erratum in: J Vet Intern Med 1996 May-Jun;10(3):197.

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Alopecia (hiposomatotropismo – Dermatosis sensible a GH) - Alopecia X (Hyposomatotropism- Dermatosis sentive to GH) Simón C., Claudio. Dr. MV. Diplomado Medicina Pequeños animales Universidad De Chile. Pasantía en Dermatología Universidad de Sao Paulo Brasil. Clínica Veterinaria Full Animals. Santiago Chile clausimon@fullanimals.cl

RECVET: 2008, Vol. III, Nº 4 Recibido 26.11.07 / Referencia 040802_RECVET / Aceptado: 03.03.08 / Publicado: 01.04.08 Este artículo está disponible en http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408.html concretamente http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040802.pdf Revista Electrónica de Clínica Veterinaria RECVET® está editada por Veterinaria Organización® Se autoriza la difusión y reenvío siempre que enlace con Veterinaria.org® http://www.veterinaria.org y con RECVET®-http://www.veterinaria.org/revistas/recvet

RESUMEN La alopecia X probablemente incluye varias entidades patológicas no diferenciables en la actualidad como hiposomatotropismo, síndrome lanoso, hipogonadismo en los machos enteros, pseudoenfermedad de Cushing, al igual que se incluían hasta hace unos años los pacientes con síndrome similar a la hiperplasia adrenal congénita. Después de descartar estas patologías se debe realizar un diagnostico de exclusión a lo cual se debe añadir un ensayo terapéutico. Es una patología poco común y de causa múltiple, lo que la hace fácil de confundir con otras patologías dermatológicas, o sistémicas que cursan con signos dermatológicos. Por esto es muy importante descartar afecciones endocrinológicas de las glándulas adrenales e hipotiroidismo. Palabras clave: alopecia X l dermatosis sensible a GH l hipogonadismo de machos enteros l hiposomatrotopismo l síndrome lanoso

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ABSTRACT Alopecia X includes several pathological probabilities not distinguishable at present as hyposomatotropism, wool syndrome, hypogonadism in entire males, pseudocushing's disease, as well as be included until a few years ago patients with syndrome similar to congenital adrenal hyperplasia. After discarding these pathologies is due to make a diagnosis of exclusion which must make a therapeutic trial. Alopecia X is a rare disease with multiple causes, which makes it easy to confuse with other dermatological diseases, or systemic diseases that occur with dermatological signs. Therefore it is very important to rule out endocrine disorders of the adrenal glands and hypothyroidism. Keywords: alopecia x l dermatosis sensitive to GH l hypogonadism in entire males l wool syndrome

1. ANTECEDENTES DEL PACIENTE Canino macho de 10 años de edad de raza poodle toy, color negro, llamado Nico, el cual registra un peso de 3 Kg. Vive con sus dueños solo, en una casa, no tiene contacto con otros perros pero tiene acceso al jardín. Se encuentra con vacunas y desparasitaciones al día. El motivo de la consulta fue la presencia de hipotricosis marcada con hiperpigmentación en la zona del dorso. Este cuadro lo presenta hace 2 meses. La dueña le realiza baños con Asuntol jabón para controlar las garrapatas cada 20 días. El examen clínico fue realizado en la clínica veterinaria “full animals” 2. EXAMEN FÍSICO Al examen físico inicial, el paciente presentó temperatura corporal de 39 º C, mucosas rosadas, tiempo de llenado capilar de 1.5 segundos, normodipsia, normotenso, normohidratado. La frecuencia cardiaca y respiratoria se encontraba dentro de los parámetros normales, como dato anexo presenta Halitosis y Alopecia (hiposomatotropismo – Dermatosis sensible a GH) http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040802.pdf

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periodontitis. Los exámenes bioquímicos fueron normales. Al examen dermatológico se observó una alopecia difusa del manto, la piel se encontraba delgada e hipotónica. Hiperpigmentación generalizada con adelgazamiento de la piel a nivel abdominal. Además se observaron folículos pilosos de diferentes tamaños y contextura. Dentro de los prediagnósticos establecidos se sospecharon de hipotiroidismo, hiperadrenocorticotrismo, demodicosis, dermatofitosis, tumor de células de sértoli y displasia folicular.

3. EXÁMENES COMPLEMENTARIOS Se procedió a realizar exámenes directos del pelo, hemograma y perfil bioquímico, además de pruebas de Tetrayodotironina (T4) y Hormona Tiroidoestimulante (TSH); testosterona y progesterona; prueba de estimulación con ACTH (Synacthen), como prueba complementaria se realizó tricograma y biopsia de piel. Los estudios hematológicos arrojaron la presencia de una leve neutrofilia (84 cel/µ) e incremento marcado de la Fosfatasa Alcalina (185 U/L). Los resultados de los exámenes de hormonas tiroideas no mostraron alteraciones marcadas, los valores de progesterona y testosterona se Alopecia (hiposomatotropismo – Dermatosis sensible a GH) http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040802.pdf

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presentaron dentro de los rangos normales al igual que el test de estimulación con ACTH. El resultado de la biopsia de piel reveló que presenta la epidermis muy adelgazada con hiperqueratosis ortoqueratósica leve y marcada queratosis intrafolicular. Marcado edema en dermis con atrofia de folículos pilosos y glándulas anexas. Proliferación de haces de fibras colágenas, con edema interfascicular. Como conclusión de la biopsia presenta una dermatosis atrófica con hiperqueratosis ortoqueratósica leve y edema dérmico compatible con dermatopatia de base hormonal. El examen directo de pelo fue negativo. El resultado del Tricograma evidenció algunos pelos con agregados de melamina (macromelanosomas) a nivel del bulbo y tallo piloso y gran cantidad de pelo en fase telógena. 4. DISCUSIÓN El hiposomatotrofismo también se presenta de manera adquirida, y generalmente afecta a perros adultos jóvenes. Es también conocido como dermatosis sensible a la hormona del crecimiento” y “dermatosis sensible a la castración”, “síndrome lanoso”, “Hipogonadismo en los machos enteros”, “pseudoenfermedad de cushing” (Medleau, 2007). Es un proceso mal conocido. Scott y col. (1997) diferencian dos patologías. A la primera la denominan “hiposomatotropismo del perro adulto”, “dermatosis sensible a la hormona del crecimiento” o “pseudoCushing”. A la segunda la denominan “hipogonadismo en machos enteros”, aunque la mayor parte de los perros tienen unos testículos normales a la palpación y actúan como perfectos sementales, siendo raro encontrar cambios anatomopatológicos a nivel gonadal, no teniendo por qué haber modificaciones en los niveles sanguíneos de las hormonas sexuales. Como no se puede diferenciar con exactitud frente a cual patología nos encontramos es conveniente agrupar todo dentro del concepto de “alopecia X”, que probablemente incluye varias entidades patológicas no diferenciables en la actualidad, al igual que se incluían hasta hace unos años los pacientes con síndrome similar a la hiperplasia adrenal congénita. 5. PRUEBAS DIAGNÓSTICAS La exploración clínica, las características de la historia, los raspados cutáneos y las muestras con cinta adhesiva, así como el examen histopatológico de las muestras de biopsia, permitirán reducir mucho el diagnóstico diferencial de las endocrinopatías. Muy importante descartar afecciones endocrinológicas de las glándulas adrenales e hipotiroidismo, por ende se deben realizar pruebas de cortisol y exámenes de TSH Y T4. Después de descartar estas patologías se debe realizar un diagnostico de exclusión a lo cual se debe realizar un ensayo terapéutico (Scott y Miller, 1997). Alopecia (hiposomatotropismo – Dermatosis sensible a GH) http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040802.pdf

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6. TRATAMIENTO Dentro de las opciones del tratamiento médico se encuentran: uso de Melatonina oral en dosis única diaria de 1 mg/Kg administrado en torno a las 9:00 pm. Esta droga ha sido utilizada en muchas dermatosis y alopecias. Además, la aplicación tópica de melatonina inhibe el desarrollo de eritemas por radiación solar. En lo que respecta al crecimiento del pelo, el modo de acción de la melatonina aún se desconoce, pero se cree que podría deberse a una inducción de la fase anágena. Según un estudio realizado en cabras, se asoció el crecimiento de la fibra de pelo en la primavera avanzada con una supresión de los niveles en la concentración normal de prolactina en el plasma (Scott y Miller, 1997). En perros, la melatonina ha sido utilizada para el tratamiento de la alopecia estacional de los flancos cuyo origen es desconocido obteniéndose resultados alentadores, ya que 9 perros que habían sufrido de tres o más episodios en años anteriores, cuando recibieron melatonina 2 meses antes de un nuevo episodio no presentando ninguno de ellos extensas áreas de alopecia en comparación con los años anteriores. La melatonina también ha funcionado en las alopecias con patrón de distribución y otras displasias foliculares, observándose que el pelo vuelve a crecer tras mes y medio desde el inicio del tratamiento, siendo máximo el crecimiento a los 3-4 meses del comienzo. Las dosis utilizadas en este último caso han sido 1 a 3 implantes subcutáneos de 12 mg. de melatonina por perro o 5 mg. de melatonina oral cada 24 horas por 30 días. Debido a la corta vida de la melatonina, en caso de administrarse vía oral, tal vez sería preferible una dosis total de 5 a 6 mg. cada 8 horas. Otra opción de tratamiento el la castración y el uso de Mitotane lo cual hasta el día de hoy es un tema en discusión (Vallerino, 1991). Se puede adicionar el uso de minerales, ya que el pelo se compone de un 80 a un 85% de queratina que es rica en azufre. El resto de los elementos químicos que intervienen en la formación de un pelo sano son hierro, zinc, calcio, magnesio y yodo. Se puede utilizar a la vez ácidos grasos omega 3-6, los cuales los perros son incapaces de sintetizar. Es por esto que son considerados esenciales y deben ser aportados en forma externa mediante suplementos o junto con los alimentos (Rejas, 1999). Los ácidos grasos omega 3 competirían con el ácido araquidónico por los sitios de síntesis en las vías de la ciclooxigenasa y de la lipooxigenasa. Se ha sugerido que no sólo el ácido graso omega 3 es importante para suprimir el metabolismo del ácido araquidónico, sino que también la relación entre los omega 3 y omega 6 es importante, ya que determinaría la proporción relativa de metabolitos pro-inflamatorios y menos inflamatorios producidos (Rejas, 1999). Otro tratamiento considerado un poco empírico en nuestro país es la utilización de hormona del crecimiento (somatotropina bovina, porcina, o sintética) (0,11 Ul/kg; somatotropina bovina en mg x 1,8 = UI) administradas 3 veces por semana durante 6 semanas vía subcutánea (Andrews, 1996). A lo cual según estudios en otros países la utilización de este producto transcurridas 4-6 semanas es evidente un nuevo Alopecia (hiposomatotropismo – Dermatosis sensible a GH) 5 http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040802.pdf


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crecimiento del pelo y generalmente se mantiene el pelaje durante 2-3 años siendo necesario nuevo tratamiento después de ese periodo. El tratamiento es muy caro y una posible complicación del tratamiento con la hormona del crecimiento es la diabetes mellitus. Debido a esto, habrá que analizar el azúcar en sangre cada semana durante el tratamiento. Si aparece diabetes mellitus, suele resolverse por sí misma cuando se interrumpe el tratamiento con la hormona del crecimiento. Además, hay que tener cuidado con el uso de este tratamiento ya que hay que recordar que el exceso de secreción de GH puede producir acromegalia, por ello, lo mas importante es realizar una adecuada presentación del caso y realizar pruebas endocrinológicas de descarte (Scott y Miller, 2002). El tratamiento realizado en la clínica consistió en la castración del paciente mas la administración diaria de una dosis oral de Melatonina de 1mg/Kg junto a la suplementación de Zn, Se, Mg y Omega 3-6 a lo cual en la actualidad la presentación de la enfermedad ha tenido un retroceso. Foto tomada con dos semanas de tratamiento 7. BIBLIOGRAFÍA 1. 2. 3. 4.

SCOTT D., MILLER W., GRIFFIN C., MULLER G., KIRK R., 1997. Dermatología en Pequeños Animales. Quinta Edición, Editorial InterMédica. 4-44, 110. SISSON Y GROSSMAN, 1994. Anatomía de los animales domésticos. Salvat Editores. 1953. ROJAS L., JUAN, 1999. Actualización: otras novedades en Terapéutica Dermatológica. Revista MEVEPA Vol. 13 Nº2, pág 20-26. VALLERINO, JESSICA, 1991. El Gran libro del Husky Siberiano. Editorial de Vecchi. 93-94,114-117.

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Linfadenitis caseosa II: Diagnóstico, control y aspectos epizootiológicos (Caseous lymphadenitis II: Brief review of diagnostic, control and epidemiological aspects) Ruiz L., Jerónimo R.*1; Barrera Valle, Maritza2; Frias, Maria Teresa2 1-Universidad de Granma. Carretera de Manzanillo Km 17½. Peralejo Bayamo Granma Cuba. CP: 85100 2-Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria. Carretera deTapaste y 8 vias. Apdo. #10. San Jose de las Lajas. Habana. *Email: jrrl@udg.co.cu

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RESUMEN La linfadenitis caseosa o pseudotuberculosis ovina es una enfermedad infectocontagiosa, de curso crónico, causada por Corynebacterium pseudotuberculosis, el cual ataca principalmente a las especies ovina y caprina, provocando alteraciones de los ganglios linfáticos del animal y en otras partes de la economía animal. Este agente también afecta a otras especies como equinos, bovinos, llama, alpaca, camellos, dromedarios, ciervos y más raramente a otras especies incluido el hombre donde ya se han reportado múltiples casos. Esta enfermedad provoca cuantiosas pérdidas en la industria ovina mundial las que no son correctamente evaluadas por diversas razones. El trabajo aborda un análisis de los principales trabajos sobre la reproducción experimental, el diagnóstico, con énfasis en la Prueba de ELISA y varios aspectos importantes de su epidemiología incluyendo los métodos actuales de control. Aunque sabemos que es imposible abarcar todas las investigaciones realizadas en este campo consideramos que esta revisión puede ser de gran ayuda para Linfadenitis caseosa II: Diagnóstico, control y aspectos epizootiológicos http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040803.pdf

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orientarse en las principales directrices que han seguido las investigaciones en esta enfermedad hasta la actualidad y es ese el ánimo que inspiró a su realización. Palabras clave: linfadenitis caseosa, pseudotuberculosis, ELISA, diagnóstico, control

Corynebacterium

ABSTRACT Caseous lymphadenitis or Pseudotuberculosis of sheep is a infected disease of chronic course, caused by Corynebacterium pseudotuberculosis, which affect principally to sheep and goats, producing alterations of lymphatic nodes and other parts of animal body. Many species was affects by this agents, such as equine, bovine, alpaca, llama, camel, dromedary, deer and rarely other species included the human, of whom some reports was made. This disease produces many losses to the sheep industry in the world, though it not correctly valued for many reason. This work analyze the principals reports about the experimental reproduction, the diagnostic, with emphasis in ELISA Test, and many important aspects of the epidemiology, included the actual methods of control. We know is impossible include all the investigations make in this field but we considered this review may be a good help to orientate in the principal lines following by the researchers in this disease until the actuality and this is the intention, that inspire it to be realization Key words: caseous lymphadenitis, Corynebacterium pseudotuberculosis, ELISA, diagnostics, control

REPRODUCCION EXPERIMENTAL DE LA ENFERMEDAD. La reproducción experimental de enfermedades, es, desde hace tiempo, un método insustituible para comprender los mecanismos, tanto de la instauración de la enfermedad, como de las vías por las que el organismo las combate, a la vez que resulta el campo de prueba imprescindible para los métodos de diagnóstico y tratamiento. La linfadenitis caseosa no es una excepción y, desde que se comenzó a investigar en la enfermedad y hasta el presente, se han buscado algunas alternativas como son los animales de laboratorio (ratones, curieles), los que han sido usados para estos trabajos [15, 24, 51, 68]. Sin embargo, animales diana a la enfermedad como los ovinos y caprinos, constituyen los más importantes modelos escogidos por los investigadores por las numerosas ventajas y la correcta reproducción de las

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manifestaciones clínicas y las lesiones que se presentan en la linfadenitis caseosa de campo. En los primeros intentos de reproducir la enfermedad en dichas especies, por la inoculación de cultivos del microorganismo, se produjeron resultados diferentes a la infección natural. Si la dosis era alta se producían cuadros clínicos anormales y en dosis pequeñas no se reproducía con regularidad la enfermedad. En las últimas décadas se han probado varias formas de reproducir la linfadenitis caseosa. Por ejemplo, Costa-Filho y col., partiendo de la suposición de que la infección por Corynebacterium pseudotuberculosis en caprinos en una región seca en el norte de Brasil era causada por heridas en la piel producidas por los cactus existentes en los pastizales, reprodujo la enfermedad escarificando y perforando con espinas, la piel de 14 cabras y colocando sobre el área lesionada, pus de los abscesos causados por el microorganismo. Esto conllevó a que al cabo de tres meses se comenzaron a presentar abscesos en los puntos de inoculación y posteriormente, a nivel de los ganglios y vasos linfáticos, inclusive con lesiones a nivel de órganos internos [30]. Más adelante Cameron debido a la necesidad de un modelo experimental para probar vacunas, usó por primera vez, la vía endovenosa, obteniendo abscesos múltiples a nivel pulmonar [24]. Nagy, tratando de explorar las vías de infección, inoculó cultivo de Corynebacterium pseudotuberculosis por las vías, vaginal, prepucial, oral, intratraqueal, subcutánea y por cortes en la piel, esta última resultó la más efectiva de todas [68]. Husband y Watson [49] y Burell [18] desarrollaron un modelo experimental de infección por Corynebacterium pseudotuberculosis por vía intralinfática a través del vaso linfático aferente del ganglio poplíteo, esto le permitió reproducir la enfermedad con cierta regularidad. Otro de los trabajos que hicieron de estas especies un modelo experimental fue el de Ashfaq y Campbell quienes lo utilizaron para investigar las fuentes, vías y tiempo de eliminación de Corynebacterium pseudotuberculosis. Estos autores empleando 1 x 106 UFC inocularon 14 animales por las vías intramucosal, subcutánea e intradérmica, logrando la reproducción del cuadro clínico con alteraciones de los ganglios cervicales, mandibulares, sublinguales e ilíacos, e internamente a nivel del ganglio mediastínico, con microabscesos en el pulmón de un solo animal. También afirmaron que el período de incubación oscilaba de 41 a 147 días. [5] Cuatro años más tarde, Brogden y col. utilizaron la vía endovenosa a nivel de la yugular con dosis diferentes (3.2 x 10 3, 10 4, 105, 10 6), para reproducir la enfermedad. Ello produjo cuadros atípicos en los cuales un animal murió a los nueve días y el período de incubación fue de 28 días Linfadenitis caseosa II: Diagnóstico, control y aspectos epizootiológicos http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040803.pdf

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obteniéndose a nivel pulmonar gran cantidad de abscesos, que en algunos casos, sobrepasaron el centenar. [12]. En 1988 Langeneger y Langeneger, teniendo en cuenta que en la naturaleza difícilmente los animales se infecten con cantidades de gérmenes como las que se usaban por los trabajos anteriores, realizó la inoculación de 26 caprinos por vía intradérmica de inóculos que contenían cantidades muy pequeñas de Corynebacterium pseudotuberculosis lavados (tres grupos con 5,20,100 UFC). Ellos obtuvieron cuadros clínicos que en algunos casos se parecían a los que se producían en la infección natural, pero que en otros eran demasiado leves o no reproducían la enfermedad. En el trabajo la necropsia, no arrojó lesiones internas y la bacteriología dio negativa en 19 de los 26 animales. [59] En ese mismo año, Pépin y col. utilizaron la inoculación subcutánea de varias dosis del microorganismo a nivel de la cara externa de la oreja de ovejas adultas, como método de reproducir la enfermedad obteniendo muy buenos resultados al alcanzar una adecuada reproducción de la clínica y las lesiones por una vía fácil y segura. Los autores recomendaron las dosis de 108 UFC, como la mejor para lograr los objetivos [73]. Desde entonces varios investigadores han usado estas experiencias para reproducir la enfermedad con el fin de estudiar aspectos de la misma que aun permanecen oscuros, para investigar el efecto de fármacos o vacunas o para estandarizar medios diagnósticos [82]. Un ejemplo de ello fue que este mismo autor en 1991 reprodujo nuevamente la enfermedad pero esta vez en corderos por la misma vía y usando las dosis de 1.1 x 108 y 1.5 x 108 con lo cual obtuvo también muy buenos resultados, aunque como el objetivo del trabajo era medir la diseminación bacteriana durante la fase aguda de la enfermedad, los animales no permanecieron largos períodos de tiempo, que les permitiera desarrollar la forma crónica, sino que fueron sacrificados escalonadamente hasta el día 28 post-inoculación. [74]. Ya en 1992 Alonso y col., con el objeto de estudiar el efecto de la enfermedad sobre la reproducción realizaron la infección experimental de 12 ovejas por el método descrito por Burell [18], en dosis de 2 x 106 obteniendo períodos de incubación entre 25 y 140 días, en dependencia del período de gestación en el que se realizó la inoculación. [1] También la enfermedad ha sido reproducida en otros animales diana como son las Alpacas en la cuales Braga realizó una reproducción experimental para demostrar la susceptibilidad de la especie ante el C. pseudotuberculosis por lo que fueron inoculadas con una dosis de 1,1 x 106 UFC por vía intradermica en el flanco hallando un cuadro patológico que se caracterizaba por fiebre, leucocitocis, variaciones en los valores de hematocrito y hemoglobina, formación de abscesos en el punto de inoculación y nódulo linfatico renal principalmente, con formación de granulomas y/o una linfadenitis supurativa crónica. [11] Linfadenitis caseosa II: Diagnóstico, control y aspectos epizootiológicos http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040803.pdf

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Recientemente este mismo investigador profundizo sus estudios sobre los efectos de la enfermedad en esa especie, realizando una nueva reproducción experimental en esa especie hallando además de los síntomas descritos, lesiones a nivel del pulmón y no halló diferencias desde el punto de vista patogénico entre los aislamientos de llama y alpaca. [12]. DIAGNOSTICO Además de los diagnósticos clínico, anatomopatológico y bacteriológico, que son los más conocidos, existe una gran variedad de métodos de diagnóstico inmunológicos para la linfadenitis caseosa, entre ellos, algunos determinan el estado de la inmunidad mediada por células y otros el de la inmunidad humoral. En el caso de los métodos de diagnóstico que miden la inmunidad mediada por células, el primer intento fue hecho por Cesari, el cual al inocular 0,2 mL de un cultivo filtrado de Corynebacterium pseudotuberculosis en cobayos anteriormente infectados por el mismo microorganismo, provocó una reacción de hipersensibilidad local semejante a la reacción alérgica de la tuberculina en cobayos con tuberculosis y la designó como Preisznocardina y sugiriendo que la prueba alérgica podía ser usado para el diagnóstico de la enfermedad en carneros. [29] Al año siguiente Cassamagnaghi, basándose en el trabajo de Cesari, elaboró la Preisznocardina, filtrando un cultivo del microorganismo en un filtro de Chamberland L3 y la empleó en un primer experimento de 25 ovinos de los cuales 14 fueron experimentalmente infectados, y en otro experimento con 80 ovinos de un rebaño naturalmente afectado. En ambos casos reportó alentadores resultados. [28] Por otra parte Carne, trató de obtener un alergeno (pseudotuberculina) siguiendo la técnica de elaboración de Koch, con lo que obtuvo una baja especificidad en un rebaño de 50 ovejas adultas. Luego de este resultado, dicho, autor empleó el método usado por Cassamagnaghi, pero no mejoró los resultados Esto lo condujo a concluir que la respuesta inmunitaria era deficiente y que la prueba alérgica para el diagnostico de la linfadenitis caseosa no era adecuado. [26] En 1934, Train elaboró un alergeno denominado también preisznocardina para el diagnóstico de la linfangitis ulcerativa en equinos; más tarde dicha técnica fue empleada por Cameron y McOmie para compararla con la prueba de seroglutinación pero los resultados fueron muy variables y no pudieron ser correlacionados con la reacción de aglutinación, aparte de que la Prueba alérgica resultó negativa en dos ovejas con lesiones en los ganglios externos. [25, 93] En Egipto, Farid y Mahmuud utilizaron una sensitina elaborada por ellos que provocó reacciones de hasta 16 mm de diferencia en animales enfermos, Linfadenitis caseosa II: Diagnóstico, control y aspectos epizootiológicos 5

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mientras los animales procedentes de rebaños negativos no presentaron reacción. [43] En 1973, Costa y col prepararón una sensitina a partir de una suspensión bacteriana fenolizada y probó su eficacia en 5 cabras portadoras de la enfermedad y en 10 animales sanos. [32] Renshaw y col. ensayaron un alergeno obtenido por sonicación de las bacterias lavadas de Corynebacterium pseudotuberculosis, testándolo en 26 ovejas con el síndrome de la oveja flaca de donde se obtuvo que solo el 55,5 % de los que tenían abscesos internos revelaron reacciones alérgicas. [81] Finalmente Langenegger y col. elaboraron un producto que denominaron linfadenina, consistente en una proteína soluble contenida en el sobrenadante del cultivo lavado del microorganismo. Esta se obtuvo por precipitación con el ácido tricloracético y fue empleada primero en cobayos y luego en 40 caprinos infectados naturalmente y en 22 sanos. Se obtuvieron resultados calificados como buenos por los autores del trabajo. [59] Con relación a las pruebas diagnósticas que determinan la actividad de la inmunidad humoral, debemos decir que Carne trató de elaborar una prueba cutánea similar al Test de Schick usado en humanos para la detección de Corynebacterium diphtheriae; dicho examen consistía en inyectar pequeñas cantidades de toxina diftérica intradérmicamente y si existían anticuerpos contra la toxina, su efecto es neutralizado inmediatamente y no hay reacción, pero si faltan, hay enrojecimiento visible por varios días. En el caso de la aplicación de este, por Carne, Corynebacterium pseudotuberculosis en 100 ovejas enfermas provocó reacciones irregulares, independientes de la toxina, por lo cual no fue eficaz. [27] En ese mismo año, Cameron y McOmie emplearon una prueba de aglutinación con resultados poco alentadores, Sin embargo más adelante Award empleó una cepa del microorganismo con menor grado de aglutinación con la cual alcanzó mejores resultados. [8, 23] En 1964, Doty y col. usaron otra variante de un examen cutáneo, al utilizar una mezcla a partes iguales del suero del animal problema y diferentes diluciones de la toxina, incubando esa mezcla 1 hora a 37º C y luego la inyectan intradérmicamente a la piel rasurada de un conejo, usando como control una mezcla de la toxina con el suero de un animal sano. Si el suero neutraliza la toxina, no se observa reacción en el conejo y dicho suero seria positivo; si por el contrario, el suero no neutraliza la toxina, entonces se apreciará una reacción igual al control en un tiempo aproximado de 48 h. Estos autores, aunque no lo consideraban una prueba diagnóstica acabada, le veían varias ventajas, pero en realidad este método tampoco se extendió, entre otras cosas, porque en la respuesta inmunológica del conejo podían influir elementos independientes de la mezcla inoculada, por ejemplo en el caso de que el conejo tuviera título de anticuerpos. [38] Linfadenitis caseosa II: Diagnóstico, control y aspectos epizootiológicos 6

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A pesar de esto, dicho trabajo sentó las bases para la realización de futuras pruebas diagnósticas al establecer la identidad de la toxina de todos los aislamientos y, por tanto que el suero de todo animal afectado contendrá antitoxina que podrá ser medida por métodos serológicos. Zaki utilizando la propiedad de la exotoxina de inhibir la lisis de los eritrocitos por la beta hemolisina de un estafilococo, desarrolló con éxito una prueba que consistía en incubar el suero problema con cantidades definidas de exotoxina de Corynebacterium pseudotuberculosis, eritrocitos bovinos y por último la hemolisina del estafilococo. Cuando el suero problema no tenía anticuerpos contra la exotoxina, esta ocupa todos los sitios activos en la membrana del eritrocito, evitando que la betahemolisina realice su efecto hemolítico. En esta prueba la hemólisis estaba en relación con la positividad del suero a testar. Esta prueba recibió el nombre de Inhibición de la Beta-hemolisina (I.B.H.) y fue avalado por un pesquisaje de 200 ovinos y caprinos, con una sensibilidad de 92 % y una especificidad del 96 %. Además ha sido usada por varios autores para compararla con otros métodos de diagnóstico. [96] Otra de las propiedades de la exotoxina, la de provocar la lisis de los eritrocitos al actuar en sinergia con la toxina de Rhodococcus equi, fue utilizada por Knight para la detección de Corynebacterium pseudotuberculosis en equinos. Esta prueba fue denominada como Inhibición de la Hemólisis Sinérgica (I.H.S.). En este caso, el suero del animal mezclado con buffer salino formalinizado y con la toxina de Corynebacterium pseudotuberculosis (fosfolipasa D), se aplicó por medio de unos discos de papel adsorbente a una placa de Petri que contenía agar sangre preparado con una mezcla de eritrocitos bovinos lavados y previamente sensibilizados con la toxina de Rhodococcus equi (fosfolipasa C), esto se incubó a 37º C durante toda la noche. Si en el suero del animal problema no había anticuerpos contra la toxina, esta en sinergia con la fosfolipasa C, provocaba un halo de hemólisis alrededor del disco, que era proporcional a la dilución empleada por lo que permitía titular la toxina. [55] Esta técnica fue empleada más adelante por Brown y col. en la detección de la infección experimental de la linfadenitis caseosa obteniendo que todos los animales que presentaron lesiones al sacrificio, resultaran seropositivos a los 23 días post-inoculación mientras que los que no se infectaron fueran seronegativos en todo el experimento [16]. Estos mismos autores en 1986 realizaron un nuevo experimento con cabras y ovejas sanas, afectadas de forma natural con Corynebacterium pseudotuberculosis, obteniendo que el 98 % de las cabras y el 96 % de los carneros que presentaron abscesos resultaron seropositivos. Sin embargo, en los animales sin abscesos el 28 % de las cabras y el 10 % de las ovejas resultaron seropositivas. Por ello concluyeron que o la prueba carecía de suficiente especificidad o esos títulos eran el reflejo de una infección sin abscesos claramente visibles [17].

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En 1989 Eguen y col. al utilizar la I.H.S. como prueba de la actividad de la exotoxina, introdujeron modificaciones que facilitan su ejecución y la hacen más reproducible, tales como el uso del Agar purificado, buffer fosfato salino, eritrocitos en sol. Alsever y horadar pocillos en lugar de discos de papel. [42] Con relación a otros tipos de diagnóstico serológico, Burell utilizó la propiedad de la exotoxina de tener actividad hemolítica sobre los eritrocitos de carnero cuando reacciona a un pH por debajo de 6 y tener actividad de hemoaglutinación cuando reacciona a un pH más alto, y basado en eso, al año siguiente elaboró una técnica que denominó Inhibición de la Hemólisis [20, 21]. Por estos métodos era difícil obtener una adecuada repetibilidad, ya que depende mucho de las condiciones en que se obtiene el cultivo y la toxina, además en diluciones altas el suero no es capaz de evitar que el pH se acidifique, por lo que pueden obtenerse falsos negativos [18]. También Burell utilizó otra prueba basada en las reacciones de precipitación en gel, (ensayo de doble inmunodifusión) el cual puede ser aplicado en un pesquisaje de la enfermedad, pero no da información sobre el título de la toxina. [22] Menzies y Muckle emplearon un ensayo de microaglutinación directa adaptando un sistema de microplaca para Pasteurella hemolítica y un tubo del test de aglutinación de Corynebacterium pseudotuberculosis. Esta prueba presentó diferencias entre los resultados de la especificidad y sensibilidad en carneros y cabras y presentó un pobre valor predictivo para los positivos por lo cual sus autores no lo recomiendan para su uso en un programa de erradicación [66]. Por último Prodhan y col. han desarrollado un ensayo inmunoenzimático de Dot - Blot, el cual fue comparado con la IHS en cabras infectadas de forma natural con Corynebacterium pseudotuberculosis. [78] A pesar de estos avances otros autores insisten en métodos tradicionales como es el test de neutralización de la fosfolipasa usado por Skalka y col., con el cual examinaron tanto sueros humanos para diagnosticar la infección espontánea por el Arcanobacterim haemoliticum como a sueros ovinos y caprinos para diagnosticar la infección por Corynebacterium pseudotuberculosis , confirmando lo planteado por Cuevas y Songer sobre la similitud entre las características de la fosfolipasa D de ambas bacterias. [34, 87] Más adelante Prescotty col utilizaron un ensayo de Interferon-Gamma que emplea sangre completa, como base para el diagnóstico de la afección por Corynebacterium pseudotuberculosis en ovejas. Estos autores reportan como una de la ventajas del ensayo que las vacunaciones repetidas con las vacunas comerciales de bacterina-toxoide que se utilizan habitualmente no interfieren en el diagnóstico de la enfermedad por lo cual consideran que la respuesta de Interferón-Gamma ante antígenos de Corynebacterium Linfadenitis caseosa II: Diagnóstico, control y aspectos epizootiológicos 8

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pseudotuberculosis usando sangre completa y no suero es una oferta prometedora para su uso en pruebas diagnósticas para la erradicación de la CL en ovejas [77]. A pesar de estos trabajos hasta el presente los autores siguen usando los métodos serológicos para el diagnóstico de esta enfermedad en rebaños ovinos y caprinos [63]. APLICACION DEL TEST DE ELISA EN EL DIAGNOSTICO. En el caso de las técnicas inmunoenzimáticas el primer reporte de la aplicación de la prueba de ELISA la realizó Shen y col., los cuales estandarizaron un ELISA indirecto para detectar anticuerpos contra un antígeno de la pared celular de Corynebacterium pseudotuberculosis obtenido por la tripsinización de la bacteria. [86] Más adelante, Maki y col. utilizaron cinco preparaciones celulares antigénicas, que fueron: una suspensión de células íntegras, una suspensión de células completas dispersadas y rotas por sonicación, células tratadas por extracción con éter dietílico, células tratadas por extracción con éter dietílico y entonces rotas por sonicación y finalmente el extracto lipídico. También empleó como antígeno la exotoxina obtenida a partir del sobrenadante del cultivo. Con estos seis antígenos, probaron un ELISA indirecto para cada uno de ellos y los compararon con la I.B.H.. Los resultados obtenidos por el autor revelan que las preparaciones celulares antigénicas no son eficaces, pero, sin embargo, la exotoxina exhibió muy buenos resultados detectando títulos de anticuerpos de 30 a 60 días después de la inoculación experimental. Esto fue superior a la I.B.H., que detectó los títulos entre 60 y 90 días post inoculación. Todo ello los llevó a considerar dicho ELISA como una útil herramienta para el diagnóstico. [62] Dos años después, Sutherland y col. compararon nuevamente un ELISA para detectar anticuerpos contra la pared celular, con otro para detectar anticuerpos antitoxina y obtuvieron que el primero detectaba más carneros con linfadenitis caseosa que el segundo y que ambos unidos detectaban el 92 % de las lesiones en pulmón, aunque en el trabajo se aborda el alto porcentaje de falsos positivos especulándose acerca de las posibles causas de este problema. Estos autores recomiendan el ELISA para detectar anticuerpos contra la pared celular como una vía útil para pesquisajes a gran escala de rebaños vacunados con toxoides en lugares donde esta presente la infección con linfadenitis caseosa. [90] En Polonia Kaba y col. notificaron el desarrollo de un ELISA que utiliza un extracto de la célula completa de C. pseudotuberculosis como fase sólida del ensayo y usando un Wester blot como comparación. [53] A pesar de esto, la mayoría de los autores reportan el uso de un ELISA que emplea como antígeno la toxina de Corynebacterium pseudotuberculosis, tal es el caso de Chikamatsu y col., los cuales compararon un ELISA indirecto con la inmunodifusión en 1186 sueros procedentes de rebaños aparentemente sanos de la región de Hokkaido en Japón, obteniendo una mayor sensibilidad con el ELISA que con la Linfadenitis caseosa II: Diagnóstico, control y aspectos epizootiológicos 9

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inmunodifusión, aunque encontraron reacciones inespecíficas ocasionales en el ELISA. Los autores de ese trabajo se inclinan hacia el uso de la inmunodifusión como método practico para detectar la enfermedad en el campo, aunque reportan el hallazgo de falsos negativos por inmunodifusión (4 animales de 16 investigados) lo cual explican, porque las cantidades de anticuerpos en dichos animales no era suficiente para detectarlo por dicha técnica, por lo que debía resolverse ese problema. [35] Sin embargo, en ese mismo año Kuria y Holtad, comparando el ELISA antitoxina con la inhibición de la hemólisis, hallaron una alta correlación entre las dos pruebas y recomienda el uso del ELISA para los pesquisajes masivos de la infección por Corynebacterium pseudotuberculosis ante todo por la facilidad de dicha técnica para su ejecución y la gran capacidad de trabajo que alcanza. [56] Estas bondades de la técnica, también se evidencian en los trabajos de Laak y Schreuder y Laak y col. En el primero los autores exponen el desarrollo y uso de un ELISA en un programa de erradicación de la enfermedad en Holanda, donde se testaron miles de muestras de suero. Dichos autores afirman la utilidad de la técnica y reportan que lograron la certificación de rebaños libres de la enfermedad. [57, 58]. En el 1992, dichos autores reportaron la creación de un ELISA de doble anticuerpo tipo sandwich, para la detección de anticuerpos antitoxina, así como de la inmunotransferencia (inmunoblot) para el control de la linfadenitis caseosa. En este caso se recubrió la placa con inmunoglobulinas antitoxina de Corynebacterium pseudotuberculosis obtenida en conejo y luego se aplica un crudo de la toxina, continuando con el suero problema, el conjugado y el sustrato. Con este sistema realizaron 38165 determinaciones en carneros, y reportaron un 100 % de sensibilidad y un 99 % de especificidad. En dicho trabajo los resultados del ELISA fueron confirmados por la inmunotransferencia, y se recomendó que este debiera ser usado como prueba confirmatoria de los casos positivos y el ELISA, como prueba diagnóstica en los programas de erradicación de la linfadenitis caseosa ovina [58]. Estos resultados fueron confirmados por Schreuder y col. quienes lograron la erradicación de la linfadenitis caseosa en dos grandes rebaños en el sur y el este de Holanda, en los cuales la enfermedad era endémica, mediante un programa de erradicación en el cual la herramienta principal era el uso del ELISA de doble anticuerpo propuesto por Laak y col. Se observó el decrecimiento de los títulos de ELISA a partir de 1988, no reportándose casos, ni clínicos ni serológicos desde septiembre de 1989. [84] Por otra parte, Menzies y col. reportaron una nueva variante de ELISA, que empleaba como antígeno para una prueba de ELISA indirecto la toxina de Corynebacterium pseudotuberculosis obtenida por vía recombinante por la expresión del gen que la codifica, en Echerichia coli según los trabajos de Songer y col. así como un conjugado anti IgG de carnero con Linfadenitis caseosa II: Diagnóstico, control y aspectos epizootiológicos 10

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fosfatasa alcalina, obteniendo buenos resultados (sensibilidad 86,3 % y especificidad 82,1 % para un punto de corte de 0.080), pero inferiores a los reportados por Laak y col., aunque en su trabajo cuestionan algunos aspectos de los trabajos de estos últimos investigadores tales como el uso de un solo control positivo y la complicada naturaleza del ELISA de doble anticuerpo, considerando que son elementos que conspiran contra su comercialización. El trabajo utiliza un método basado en una curva receptor operador, lo cual le permite definir la eficacia de la prueba a diferentes puntos de corte y por tanto posibilita ajustar el incremento de la sensibilidad o de la especificidad de la prueba, en dependencia de los objetivos de su uso. Los autores concluyen que su ELISA tiene un valor comercial que ayudaría al control y erradicación de la enfermedad. [67, 88] Actualmente la prueba de ELISA ha sido usada también para el diagnóstico de Corynebacterium pseudotuberculosis en otras especies de rumiantes. Braga y col. realizaron un ELISA indirecto usando un antígeno de pared celular en alpacas en el Perú, para este trabajo utilizó proteína A con peroxidasa como conjugado y se obtuvo una sensibilidad de un 89 %. Los investigadores concluyeron que el ELISA era una buena alternativa para el diagnostico de la infección en alpacas. [10] Ruiz y col estandarizaron un Elisa indirecto utilizando como antígeno la toxina de Corynebacterium pseudotuberculosis (fosfolipasa D) y usando un conjugado anti IgG bovina con peroxidasa con lo cual obtuvo una sensibilidad y especificidad de 96,6% y 94,6% respectivamente, Esto fue probado por la comparación con el “Estado verdadero” (unión del aislamiento, la anatomopatología y la clínica) en un trabajo en condiciones controladas que incluyó la reproducción experimental de la enfermedad. [82] También en ese año en Holanda se publicó un artículo que compara cuatro tipos de ELISA para el diagnóstico de la Linfadenitis caseosa entre ellas un ELISA Sandwich de doble anticuerpo que alcanzó una especificidad de 98% para cabras y de un 99% para ovejas y hace recomendaciones para el programa de erradicación y control de Holanda. [36] PERDIDAS ECONOMICAS. Las pérdidas económicas de la linfadenitis caseosa son variadas, pero a veces mal evaluadas, por el hecho de que no provoca una alta mortalidad y no provoca síntomas clínicos aparatosos. Según Burell los daños provocados por la enfermedad se pueden resumir en nacimientos de crías débiles, disminución de la eficiencia reproductiva, de la producción láctea y de la ganancia de peso, provocando emaciación progresiva, varios años más tarde, tanto Batey como Sutherlan y col. afirmaron que Corynebacterium pseudotuberculosis es el responsable de la mayoría del decomiso de carne de carnero en mataderos de Australia, estos últimos autores citando a Wroth y Suiter, en 1977 plantea que la Linfadenitis caseosa II: Diagnóstico, control y aspectos epizootiológicos 11

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linfadenitis caseosa produjo pérdidas estimadas en 2 millones de dólares para la industria ovina en el oeste de Australia. [9, 21, 90] En Québec Canadá Arsenault y col en un trabajo realizado en canales de carneros sacrificados hallaron una prevalencia de Linfadenitis caseosa (CL) de un 21% mucho mayor que otras enfermedades como paratuberculosis, plantearon además que el riesgo de rechazo o decomiso de las canales está asociado con la región del cuerpo y el número de abscesos estando la mayor prevalencia de la CL en la cavidad torácica. [4] Más adelante resulta de interés lo planteado por Tadich y col. el que refiere que en el Boletín de Vigilancia Epidemiológica en 1996 se indica que el número de animales decomisados por LC fue de un 1% de un total de 563.193 ovinos beneficiados, registrándose decomisos solo en los mataderos de la Región de Magallanes mientras que al año siguiente 1997 se faenaron 642.028 ovinos en el país y de estos el total de decomisos por causas infecciosas y parasitarias fue de 63.138, siendo la LC la tercera causa en importancia, correspondiéndole un 14,3% del total de decomisos [92] En la esfera de de la reproducción Alonso y col. resumieron, que conduce a una posible transmisión vertical, así como, a desórdenes reproductivos tales como abortos, mortalidad neonatal y reducción de la tasa de crecimiento para los corderos. Además de esto la necesidad de atención veterinaria, el consumo de medicamentos el decomiso de carnes afectadas, los sacrificios sanitarios para su control, los problemas con la venta de leche de cabra y la devaluación de las pieles y lana son aspectos que a nivel internacional se valoran como daños. [1] Finalmente, el hecho de afectar otras especies como bovinos y equinos e incluso eventualmente al hombre, aumenta su nocividad, dándole una connotación epidemiológica que incrementa su importancia. VIAS DE TRANSMISIÓN Las vías de transmisión de la linfadenitis caseosa constituyen un aspecto que por su importancia ha sido abordado por diferentes autores. Muchos coinciden en afirmar que la primera vía son las heridas de esquileo. [5, 18, 45, 69, 70, 85]. Según Nagy esta transmisión ocurre cuando las cuchillas contaminadas con pus depositan microorganismos sobre las nuevas heridas de esquileo favoreciendo una puerta de entrada al microorganismo. [69] Este mismo autor realizó una inoculación experimental de 330 ovejas por 6 rutas diferentes (subcutánea, vaginal, intratraqueal, oral prepucial y heridas de esquileo). Cada una constituyó un grupo y obtuvo que el 46.5 % de los abscesos producidos se obtuvieran en las heridas de esquileo, afirmando por tanto, que ellas eran la principal vía de infección de la enfermedad. [69]

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Esta afirmación ha sido confirmada por Sherikawa y col. los cuales obtuvieron un incremento de la seropositividad mediante el ELISA durante dos años en ovejas de uno y dos años de edad, relacionado directamente con el esquileo de los animales. Ellos sugirieron el tratamiento inmediato de dichas heridas, como vía de impedir la diseminación. [85], A pesar de estas evidencias las heridas de esquileo no son la única fuente de infección Nair y Robertson demostraron la posibilidad de contaminación a través del baño, realizando una infección experimental de este con un caldo de cultivo en proporción 1:2000 y pasando por él, a ovejas de dos semanas de esquiladas con lo que obtuvo lesiones en 3 de 12 ovejas tratadas. [70] Esto ha sido confirmado por Jubb y col. los que han planteado que el microorganismo puede penetrar a través de la piel intacta en animales acabados de esquilar sobre todo a causa de su inmersión en baños contaminados. Estos mismos autores consideran las heridas de castración, corte de cola y corte de ombligo como de menor importancia y también consideran que ocasionalmente puede ser adquirida por ingestión o por inhalación, en este último caso produciendo abscesos en pulmones [52]. Sin embargo en este sentido Paton y col. realizaron un trabajo donde determinaron que distanciando el esquilado de las ovejas del baño de los animales en 8 semanas no se disminuye el riesgo de contraer la linfadenitis caseosa y observaron que ovejas bañadas inmediatamente después del esquilado desarrollaron mayores concentraciones de anticuerpos a C. pseudotuberculosis que ovejas en las que el baño ocurió entre 2 y 8 semanas después del esquilado. [73] En el caso de las cabras, así como carneros que no son de lana o que no se esquilan, las principales vías de transmisión son muy variadas, Nagy en el trabajo al cual hemos hecho referencia obtuvo un 21,5 % de abscesos por vía subcutánea, 16 % por vía vaginal, 12,5 % por vía intratraqueal y 3 % por vía oral, Ashfaq y Campbell lograron reproducir las lesiones de la enfermedad usando simultáneamente las vías intradérmica, submucosal y subcutánea, mientras, más adelante, Brodgen y col. obtuvieron en una infección experimental por vía endovenosa gran número de abscesos a nivel pulmonar. [6, 13, 69] En 2003 Paton y col. identificaron un grupo de factores que afectan la incidencia de la LC, entre ellos plantean el esquilado de las oveja usando una máquina de esquilar que esparce una solución insecticida al unísono del esquileo incrementa en 5 veces el riesgo de contraer L, lo cual se explica por la capacidad del microorganismo para difundirse a través de las gotas de agua. También plantea que estabular a las ovejas bajo techo por una hora o más después del esquileo incrementa el riesgo de incidencia de LC en 3 veces [73] El papel de los artrópodos como vectores también ha sido estudiado, descartándose la posibilidad de que sea una vía importante de diseminación Linfadenitis caseosa II: Diagnóstico, control y aspectos epizootiológicos 13

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ya que no se encontró correlación entre la severidad de la infección de garrapatas y la prevalencia de la enfermedad, sin embargo Yeruham y col consideran a la mosca domestica como un factor importante para la transmisión de la mastitis por Corynebacterium pseudotuberculosis en bovinos por lo que la población de este vector, podría considerarse otro factor de riesgo. [69, 95] En Cuba como no se esquilea a las ovejas, la vía de infección fundamental está en las heridas por alambres de púas de la cercas, los pinchazos para azuzar al ganado y las lesiones de la piel en general, Álvarez y col. sugieren las lesiones podales, la vía digestiva y los parásitos gastrointestinales, aunque Jubb y col. descartan esa posibilidad. [2, 52] Por su parte, Mena encontró una alta incidencia de la enfermedad en unidades ovinas de Guantánamo en las que existía gran cantidad de Marabú relacionando los pinchazos por esta planta con la alta incidencia encontrada. [65] FUENTES DE INFECCION Las principales fuentes de infección son los animales enfermos, materiales purulentos, el pus de los abscesos, el estiércol contaminado, el agua contaminada de los bañaderos, incluso la tierra, así como los alimentos y el agua de bebida contaminada. Brown y Olander sugieren la transmisión a través del aire debido a que existe una alta prevalencia de lesiones pulmonares y torácicas en animales con la forma visceral de la linfadenitis caseosa. [18] En un pesquisaje de 4000 ovejas adultas escogidas en el oeste de los Estados Unidos se calculó que el 25 % de todos los animales tenían abscesos en los pulmones o en los nódulos linfáticos toráxicos, así como que eran la mayoría de los abscesos internos encontrados [89]. Por otro lado, Hein y Cargill en Australia, al analizar 274 casos de la enfermedad en cabras salvajes encontraron que el 29 % tenía abscesos en los nódulos linfáticos mediastínicos, bronquiales y/o en pulmones. Estos 79 animales representaban el 80 % de los nódulos linfáticos internos encontrados. [47] Según Brown y Olander, la contaminación ambiental constituye un aspecto de importancia en la ocurrencia de la linfadenitis caseosa, ya que esta es una enfermedad de naturaleza enzoótica, en la cual las más altas prevalencias se presentan en áreas donde está bien establecida [18]. Varios autores han referido que la introducción de un animal con abscesos en un rebaño libre provoca una alta incidencia de abscesos en el rebaño 2 o 3 años más tarde. [5, 94]. Agustine y Richard consideran que tomando en cuenta que la concentración de gérmenes viables en un material purulento varia entre 1 x 10 6 a 5 x 10 7, la ruptura de un solo absceso es suficiente para la contaminación del ambiente. [7] Linfadenitis caseosa II: Diagnóstico, control y aspectos epizootiológicos 14

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La capacidad del microorganismo de sobrevivir en la tierra y en los fómites, asegura la continua presencia del mismo. MÉTODOS DE CONTROL Y/O ERRADICACION. El control y la erradicación de la linfadenitis caseosa han sido y es, una de las constantes preocupaciones de los investigadores que abordan esa temática sin embargo este objetivo tiene algunas dificultades. Con relación al tratamiento directo del animal enfermo Ashfaq y Campbell señalaron que en zonas endémicas la enfermedad era casi imposible de erradicar debido entre otras causas, a que los antibióticos son incapaces de penetrar a través de la cápsula de los abscesos; esto unido a la variabilidad en la sensibilidad de diferentes cepas del microorganismo a diferentes tipos de antimicrobianos, ha provocado que los intentos de un tratamiento medicamentosos de la enfermedad hayan resultado infructuosos [6, 37, 97],. También las dificultades se sustentan por la comprobada supervivencia del microorganismo en determinados fómites, a los cuales ya hemos hecho referencia, lo que provoca que otros tratamientos como el vaciamiento de los abscesos en los animales infectados tenga el inconveniente de la disposición del material caseoso y la posibilidad de que el animal siga expulsando gérmenes y por tanto el peligro de acelerar la diseminación de la enfermedad. [7, 54] También la existencia de una forma visceral de esta patología complica el tratamiento clínico de la enfermedad [52, 65, 81]. Es por esto que la lucha y control de esta patología se ha establecido, en zonas donde la prevalencia es baja, mediante programas de erradicación basados en el diagnóstico serológico de los animales, el control estricto de los focos, las medidas epizootiológicas y sanitarias apropiadas y el sacrificio de los animales afectados [58, 66] con lo que se han alcanzado muy buenos resultados en Holanda [84]. Por otro lado en zonas donde la prevalencia es alta, se emplea la vacunación como método fundamental de control y erradicación, siendo, además, el método más usado y uno de los campos donde más se investiga dentro de la linfadenitis caseosa. Ya en 1972 Cameron utilizó una suspensión de Corynebacterium pseudotuberculosis inactivada por formalina y se la aplicaron a ovejas Merino las cuales fueron inoculadas con un cultivo de este mismo microorganismo por vía endovenosa. Ellos consiguieron que la vacunación protegiera contra la muerte aguda o subaguda, pero no prevenía o alteraba el desarrollo de los abscesos. Esto sugirió que el uso de vacunas vivas estimulaba la inmunidad mediada por células. [25] Algo después, Nair y col. investigaron el efecto protector del toxoide, mediante el uso de la exotoxina cruda concentrada y formalinizada, en 24 ovejas. Una vez vacunadas, estas fueron inoculadas mediante la aplicación Linfadenitis caseosa II: Diagnóstico, control y aspectos epizootiológicos 15

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de material purulento en heridas cutáneas frescas. Esto tuvo como resultado que dos de las ovejas del grupo control murieron con anemia hemolítica, mientras el resto de los animales del experimento fueron sacrificados 15 días después de la inoculación, con lo que se apreció que los controles tenían abscesos múltiples, mientras que de los inoculados solo tres tenían lesiones. Ellos concluyeron que la respuesta inmune a la exotoxina juega un importante papel en la resistencia del animal ante la enfermedad. [71] Más adelante, Brodgen y col compararon la protección obtenida a partir de la inmunización con células completas Corynebacterium pseudotuberculosis y de fragmentos de pared celular en corderos de cinco semanas de edad privados del consumo de calostro, los cuales fueron luego inoculados por vía endovenosa con cultivos puros del microorganismo y finalmente sacrificados al mes de ser inoculados, contándose los abscesos y triturándose el hígado y el pulmón los que fueron homogenizados y sembrados para hacer el conteo de colonias. [13] Este experimento arrojó que los corderos vacunados presentaban una significativa disminución de los abscesos así como de los gérmenes en los cultivos a partir de los macerados de órganos en los corderos vacunados y además, que los animales que recibieron la vacunación con pared celular tenían menos lesiones que los otros vacunados con la célula completa. En ese mismo año, Anderson y Nairn desarrollaron comercialmente un toxoide para ser usado en carneros en Australia e inocularon a cabras de Angora vacunadas, mediante el frotado de la piel lesionada con caldo de cultivo. [3] Este trabajo tuvo como resultado que al ser sacrificadas tres meses después de la inoculación, solo tres de las 20 cabras tuvieron abscesos, lo cual resultó significativamente mejor que los controles, en los cuales de 10, todos desarrollaron la enfermedad. Esto confirmaba que el toxoide daba alguna protección a la exposición con Corynebacterium pseudotuberculosis. Estos mismos autores investigaron el poder protectivo del toxoide en corderos de una semana de nacidos y hallaron que solo un cordero de ocho que fueron vacunados y luego inoculados, desarrolló abscesos, mientras que en los controles, de ocho inoculados, siete desarrollaron abscesos, a pesar de que aún la inmunidad pasiva natural estaba alta. [3] El uso de adyuvantes para la inmunidad fue inicialmente investigado en ratones por Brogden y col. usando cuatro adyuvantes (BCG, muramil dipéptido, cord factor y C. parvoum. Este trabajo arrojó que ninguno de ellos era capaz de inducir resistencia a la infección por Corynebacterium pseudotuberculosis ni modular la respuesta en animales no vacunados, sin embargo eran capaces de incrementar la respuesta protectiva de algunas dosis de preparados vacunales de célula completa en dichos ratones. [14] Brown y col. estudiaron nuevamente el efecto del toxoide pero esta vez con adyuvante incompleto de Freund para lo cual utilizaron 15 cabras en tres grupos (dos vacunados y uno control) y los inoculó a las siete semanas Linfadenitis caseosa II: Diagnóstico, control y aspectos epizootiológicos 16

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midiendo la respuesta humoral mediante el EHS y la celular por una prueba cutánea, encontrando diferencias significativas en el número de animales con abscesos y en la cantidad de abscesos entre vacunados y control. Estos autores concluyen que los anticuerpos antitoxina deben limitar la difusión y diseminación del microorganismo en el período inicial de su multiplicación, sobre todo hasta dos semanas después de la infección. [17] Un año más tarde LeaMaster y col. emplearon una bacterina inactivada con formalina y adyuvada con hidróxido de aluminio en corderos, hallando que en los dos grupos de animales vacunados la media de producción de abscesos por cordero fue de 7 y 4 respectivamente mientras en el grupo no vacunado fue de 32 abscesos por cordero. Por ello consideraron que la vacuna proveía de protección inmunológica contra la inoculación con Corynebacterium pseudotuberculosis y aunque no afectaba el tamaño de los abscesos, si afectaba la virulencia del microorganismo. [61] En 1990 Brogden y sus colaboradores, emplearon nuevamente el muramil dipeptido (MDP) como adyuvante de vacunas de células integras de Corynebacterium pseudotuberculosis, pero esta vez en corderos, además de ratones, así como en varias dosis, lo cual arrojó que en los corderos la combinación de 10 mg de células completas con 1 mg de MDP inducía inmunidad sin el inconveniente de abscesos estériles en el punto de inoculación, aunque consideraron que debe comprobarse el resultado en grandes masas de animales susceptibles. [15]. En el año 1990 Real y León utilizaron el BCG (bacilo de Calmette y Guerin) por su probada actividad frente al M. bovis en la inmunoprofilaxis de la infección por Corynebacterium pseudotuberculosis, pero sus resultados no fueron satisfactorios, por lo que después de seis años de estudios consideraron que el método no se puede recomendar para el control de la Linfadenitis caseosa. [80] Al año siguiente, se publicó la realización de un ensayo de campo sobre la vacunación de rebaños de ovejas y cabras con una vacuna realizada por Brogden y col. y que abarcó tres años de observaciones, con todas las dificultades y desventajas que todo ensayo de campo presenta. Este dio como resultado que la vacuna brindaba un grado de protección estadísticamente significativa en el caso de los carneros, pero en cabras tenía una tendencia a proteger que no llegaba a ser significativa, concluyendo que brinda una buena protección contra el desarrollo de la linfadenitis caseosa en carneros y que podría jugar un importante papel en el control de esta enfermedad. [13] Este ensayo tiene la ventaja de que sus conclusiones son más extrapolables a las condiciones de campo que con una inoculación experimental. Un importante experimento, relacionado con el efecto de la inmunidad pasiva natural, sobre la vacunación en los corderos, fue hecho por Patón y col. en 1991. En este trabajo se dividieron las madres de acuerdo a su tasa de anticuerpos antitoxina contra la linfadenitis caseosa y se controlaron los Linfadenitis caseosa II: Diagnóstico, control y aspectos epizootiológicos 17

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corderos vacunándolos a diferentes períodos entre 0 y 18 semanas después del parto inoculándolos entre 18 y 24 semanas con pus de los abscesos y sacrificándolos finalmente a los cuatro meses de la infección artificial. Esta investigación arrojó que cuando la prevalencia de la linfadenitis caseosa en las ovejas es alta, no se obtiene una buena protección contra la enfermedad si se vacuna los corderos antes de las 12 semanas de nacido, especialmente si la primera dosis se recibe con menos de tres semanas. Por ello se cual recomiendan la vacunación en dichos rebaños a partir de 12 semanas de edad [72]. En ese mismo año Eggleton y col., en tres trabajos sucesivos publicados sobre el tema de la vacunación obtuvieron que el uso de células de Corynebacterium pseudotuberculosis, unidas a un toxoide, no incrementaba la potencia protectiva de este. Tampoco hallaron incremento de la protección por la adición de antígenos de cinco especies de Clostridium, con la adición de selenio de sodio como adyuvante. Sin embargo, en todos los casos se obtuvo buenos niveles de protección con el toxoide empleado por sí solo y se encontró una correlación positiva entre la cantidad de toxoide de Corynebacterium pseudotuberculosis y el grado de protección alcanzado. También lograron que el toxoide purificado por métodos cromatográficos, indujera la mayor protección lo cual sugiere que la antitoxina es el mayor factor de protección. [39, 40,41] La aplicación de la biología molecular y la ingeniería genética a la producción de vacunas contra la LC se produce a partir de los trabajos de Hodgson y col. en el que mediante la delección del gen de la fosfolipasa D, del genoma de Corynebacterium pseudotuberculosis, logrando una variante del microorganismo donde la virulencia se reducía en gran medida y que denominaron Toxminus y con el cual probaron la inoculación de carneros, con distintas dosis, en comparación con inoculaciones de cepas de campo de Corynebacterium pseudotuberculosis y luego retaron todos los grupos con dosis mayores de la misma cepa de campo. Este trabajo obtuvo como resultado que el Toxminus estimula fuertemente la respuesta humoral y celular, así como, que la infección con este microorganismo se resuelve en el sitio de inoculación en pocas semanas y que la bacteria Toxminus no pudo ser cultivada a partir de los tejidos en la necropsia de ninguno de los animales inoculados de la 8va a la 18va semana. Todo esto llevó a los autores a sugerir que la fosfolipasa D contribuye a la supervivencia de Corynebacterium pseudotuberculosis dentro de su hospedero. También se plantea que la persistencia del microorganismo durante las primeras semanas estimula el sistema inmune, lo cual sería un importante atributo para una vacuna viva o para utilizarla como vehículo de entrega de los antígenos al organismo animal. [48] Sin embargo esta vacuna tenía la desventaja de provocar abscesos indeseables en el punto de inoculación esto motivó al autor a utilizar la vacuna viva atenuada con C. pseudotuberculosis toxminus por vía oral, tanto solo como unido al gen modificado que producía la toxina PLD alterada genéticamente sin embargo aunque se reportaba como un posible vehículo Linfadenitis caseosa II: Diagnóstico, control y aspectos epizootiológicos 18

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de administración de vacunas los resultados aun no eran alentadores. [49] Solo un año después el mismo grupo de trabajo dio a conocer sitios específicos del gen que codifican para la toxina PLD que al ser alterados producían la inactivación de la toxina secretada por el C. pseudotuberculosis [91]. Estos esfuerzos fructificaron en una patente a favor de Anthony Radford y Adrian Hodgson en 1997 dirigida hacia la creación de la vacuna con el Corynebacterium pseudotuberculosis mutante [79]. En 1998 Pionlkowoski y Shivvers. evaluaron una vacuna comercial caseous D-T para la prevención de la inducción de abscesos por Corynebacterium pseudotuberculosis, logrando una disminución del número de abscesos. [76] En el 2003 investigadores peruanos han publicado un trabajo destinado a probar la eficacia de una vacuna elaborada a partir de precipitado proteico de C. pseudotuberculosis conteniendo la exotoxina, en animales de laboratorio (ratones albinos) observando disminución de los efectos tóxicos del C. pseudotuberculosis, con disminución del número y tamaño de abscesos de los animales vacunados (40% afectado) comparado con las lesiones severas y generalizadas encontradas en los animales del grupo control (95% afectado) demostrándose al C. pseudotuberculosis como agente causal de la infección por medio de la técnica de PCR mediante la banda de DNA de 815 bp en los animales que presentaban abscesos. [64] Más recientemente Fontaine y col. después de crear un modelo experimental de la enfermedad en ovejas usando cepas virulentas del Reino Unido y luego las retaron con varios preparados vacunales entre ellos un recombinante deribado de la fosfolipasa D procedente de un aislamiento virulento, una bacteria muerta con formalina y una bacteria modificada con un recombinante de fosfolipasa D , observando que conferian una protección estadísticamente significativa contra la infección, así como, parece restringir la diseminación desde el sitio de inoculación. La vacuna fue comparada con una vacuna comercial que no tiene licencia en el Reino Unido y concluyen que sus resultados proporcionanuna información pertinente para el desarrollo de una estrategia de vacunación efectiva contra la linfadenitis caseosa. [44] Pero no solamente la vacunación es el método de elección de los investigadores sino que actualmente se considera que este es un problema que debe ser abordado desde muchos puntos de vista por ejemplo Cubero y col. plantean una serie de estratégias evaluadas por diferentes autores, que se pueden emplear para el control de la linfadenitis caseosa entre ellas destaca las campañas de saneamiento consistentes en, detectar los animales infectados, eliminar todo animal positivo al diagnóstico, presente o no síntomas, vacunación de los efectivos en riesgo y medidas generales de higiene. [33] Linfadenitis caseosa II: Diagnóstico, control y aspectos epizootiológicos 19

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Nota: Ver la primera parte de esta monografía, Linfadenitis Caseosa I: Aspectos históricos, etiológicos y clínicos, en RECVET: 2007, Vol. II, Nº 8 http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n080807.html concretamente en http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n080807/080707.pdf

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Diferentes biotipos de Corynebacterium pseudotuberculosis están involucrados en la Linfadenitis Caseosa Cutánea y Visceral - Biotypes different of Corynebacterium pseudotuberculosis are involved in the Cutaneous and Visceral Caseous Lymphadenitis Barrientos Padilla Juan Sebastián: 2Laboratorio de Patología , Programa de MVZ. Km 2.5 carretera Cuautitlan Teoloyucan, San Sebastian Xhala, Cuautitlan Izc. Edo. de México, México.| Cortés De Arcipreste Norhan: Facultad de Estudios Superiores Cuautitlan Universidad Nacional Autónoma de México, 1Unidad de Investigación Multidisciplinaria en Salud Animal | Tórtora Pérez Jorge Luis: Facultad de Estudios Superiores Cuautitlan Universidad Nacional Autónoma de México, 1Unidad de Investigación Multidisciplinaria en Salud Animal | Alba Hurtado Fernando: Facultad de Estudios Superiores Cuautitlan Universidad Nacional Autónoma de México, 1 Unidad de Investigación Multidisciplinaria en Salud Animal, | Del Río García Juan Carlos: 2Laboratorio de Patología , Programa de MVZ. Km 2.5 carretera Cuautitlan Teoloyucan, San Sebastian Xhala, Cuautitlan Izc. Edo. de México, México.|Valdivia Anda Guillermo: Facultad de Estudios Superiores Cuautitlan Universidad Nacional Autónoma de México, 1Unidad de Investigación Multidisciplinaria en Salud Animal | Autor responsable y para sobretiros: Dr. Guillermo Valdivia Anda, Ciprés N° 53, Fracc. Los Morales Cuautitlan Estado de México, CP54800, Teléfono 0445554020661, E mail: valdivag@servidor.unam.mx El trabajo contiene resultados parciales de la tesis de maestría del primer autor (Maestría en Producción y Salud Animal). El trabajo fue realizado con apoyo del Programa de Cátedras de Investigación IN 214 (FESC) “Mecanismos de Patogenicidad Microbianos”, del Proyecto PAPIIT IN21005-3 y PAPIME EN 208304 (UNAM)

RECVET: 2008, Vol. III, Nº 4 Recibido 22.01.08 / Referencia provisional: R030907 /Referencia definitiva 040804_RECVET / Aceptado: 08.03.08 / Publicado: 01.04.08 Este artículo está disponible en http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408.html concretamente http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040804.pdf Revista Electrónica de Clínica Veterinaria RECVET® está editada por Veterinaria Organización® Se autoriza la difusión y reenvío siempre que enlace con Veterinaria.org® http://www.veterinaria.org y con RECVET®-http://www.veterinaria.org/revistas/recvet

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RESUMEN La linfadenitis caseosa de las cabras y borregos es causada por Corynebacterium pseudotuberculosis, existen dos presentaciones clínicas: Cutánea y visceral. El objetivo del presente trabajo fue determinar si existen diferencias fenotípicas entre las cepas de Corynebacterium involucradas en las dos presentaciones clínicas en ovinos. Las muestras se obtuvieron de rebaños en el Estado de México, México en explotaciones en donde los borregos presentaron problemas de lesiones en linfonodos externos, así como de órganos y linfonodos de animales sacrificados en el rastro. Los aislamientos de C. pseudotuberculosis se agruparon con base a los resultados de las pruebas bioquímicas, al órgano de procedencia, tipo de presentación clínica y los diferentes biotipos encontrados. Se realizó una prueba de hipótesis para dos proporciones de grupos independientes. En los casos de presentación cutánea, la mayoría de los aislamientos no utilizó la glucosa (81%) ni la galactosa (82%), pero para la maltosa, la mayoría fueron positivos (63%), para los aislamientos de la presentación visceral, los resultados fueron inversos, la mayoría fueron positivos a la glucosa (83.7%) y la galactosa (75.5%) y con la maltosa se comportaron de manera similar. Las diferencias observadas en la fermentación de azúcares, son sugestivas de mecanismos de mutación, adaptación y regulación genética de la bacteria, en diferentes ambientes oxidativos o de disponibilidad de sustratos. PALABRAS CLAVE: Linfadenitis caseosa | ovinos y caprinos | cutánea y visceral | biotipos, Corynebacterium pseudotuberculosis

ABSTRACT The caseous lymphadenitis of the goats and lambs is caused by Corynebacterium pseudotuberculosis, two clinical presentations exist: Cutaneous and visceral. The objective of the present work was to determine if phenotype differences exist among the strains of Corynebacterium involved in the two clinical presentations in sheep. The samples were obtained of farm in the State of Mexico where the lambs presented problems of lesions in external lymph nodes, and of organs and lymph nodes of animals at slaugher. The C. pseudotuberculosis was grouped with base to the results of the biochemical tests, to the origin organ, type of clinical presentation and the different biotypes formed, later were carried out a hypothesis test for two proportions of independent groups. In the cases of cutaneous presentation, most didn't use the Diferentes biotipos de Corynebacterium pseudotuberculosis están involucrados en la Linfadenitis Caseosa Cutánea y Visceral http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040804.pdf

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glucose (81%) neither the galactose (82%), but for the maltose, most was positive (63%), for the isolations of the visceral presentation, the results were inverse, most went positive to the glucose (83.7%), the galactose (75.5%) and with the maltose they behaved in a similar way. The differences observed in the sugars fermentation are suggestive of mutation mechanisms, adaptation and genetic regulation of the bacteria, in different oxidative ambient or of substrate readiness. WORDS KEY: Caseous lymphadenitis | sheep and goat |cutaneous and visceral | biotypes | Corynebacterium pseudotuberculosis

INTRODUCCIÓN La linfadenitis caseosa (LC) de cabras y borregos es una enfermedad crónica causada por Corynebacterium pseudotuberculosis, caracterizada por supuración e inflamación necrotizante de uno o más linfonodos. La enfermedad está presente en muchas partes del mundo, especialmente en las áreas de cría de pequeños rumiantes y es un problema que causa pérdidas económicas importantes en la producción (Walker J y col, 1991, Pépin y col, 1997, Zaitoun y col, 1994, Asfaq M.K. 1980, Burrel D.H.1981, Holstand G. 1986). En la enfermedad se observan abscesos en linfonodos externos y emaciación como se ha comprobado en animales con LC clínica, en donde se aisló C. pseudotuberculosis en borregos de 2 años de edad en 98.3% de los casos. En el 93% de los borregos emaciados sacrificados se demostró C. pseudotuberculosis a partir de órganos internos, (Literak I. y col. 1994, Paton N.W. y col. 1994). El género Corynebacterium es un grupo heterogéneo de bacterias cuyas especies comparten características similares, son referidas como bastones, Gram positivos, redondeados, inmóviles, no esporulados, que contienen irregularmente gránulos metacromáticos, su tamaño es de 1-3 µm de largo y de 0.5-0.6 µm de ancho. En el frotis con tinción de Gram las bacterias presentan arreglos angulares o de empalizada con características de reja o letras chinas. En base a las caracteristicas de la pared celular, las corinebacterias son agrupadas con las micobacterias, nocardias y rodococos, en el grupo “CMRN”, los cuatro géneros tienen paredes celulares ricas en componentes lipídicos complejos, el más conocido es un ácido graso, comúnmente llamado ácido micólico, el cual es considerado como el factor más importante en la virulencia de Mycobacterium tuberculosis y ha sido bien estudiado en este género. Los lípidos de la pared celular constituyen el 11.3% del peso total de la célula bacteriana, su naturaleza hidrofóbica es la causa del crecimiento de C. pseudotuberculosis en una película en caldo de cultivo (Literak I. y col. 1994, Paton N.W. y col. 1994, Sayed A.M. y col. 1995, Goodfellow M. y col. 1981, Jawetz L.D. y col. 1982), es un anaerobio facultativo que crece relativamente lento en agar sangre, produciendo colonias blancoDiferentes biotipos de Corynebacterium pseudotuberculosis están involucrados en la Linfadenitis Caseosa Cutánea y Visceral http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040804.pdf

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amarillentas, resecas, opacas, planas, a las 24 a 48 horas las colonias están rodeadas por una zona de β hemólisis (Jawetz L.D. y col. 1982). Para la identificación del género y especie se realizan bioquímicas (Cowan 1979, Bergey y col 1994).

pruebas

Barakat y col., 1984 , han descrito dos biotipos de C. pseudotuberculosis en base a su habilidad para reducir nitratos, con diferente distribución por especie, cepas nitrato positivas en bovinos y equinos y nitrato negativas en ovinos y caprinos. Analizando fragmentos de restricción, se encontraron diferencias genéticas entre estos dos grupos, así mismo, se buscaron relaciones genéticas y fenotípicas de C. pseudotuberculosis con C. ulcerans, Actynomices pyogenes y Rhodococcus equi pero no se encontraron patrones comunes entre ellos (Cowan S.T. 1979). Un factor que se considera importante en la patogenicidad de C. pseudotuberculosis, es la producción de una poderosa exotoxina, la fosfolipasa D (FLD), que es capaz de inhibir la hemólisis por la β-lisina de Staphylococcus aureus, una esfingomielinasa, por ocupación competitiva del sitio de reconocimiento sobre la membrana del eritrocito, esta propiedad ha sido utilizada en la prueba de la inhibición de la betahemolisina (AHÍ), para la detección de anticuerpos contra la exotoxina; la hemólisis sinérgica ocurre cuando la FLD del C. pseudotuberculosis actúa en conjunto con ciertos tipos de fosfolipasa C, como la exotoxina de Rhodococcus equi produciendo la degradación de esfingomielina a ceramida lo que da como resultado la desorganización de la membrana y causan lisis celular, esta hemólisis sinérgica por las dos exotoxinas, es útil en la identificación y constituye la base de la prueba de la inhibición de la hemólisis (PIH), que puede ser usada para detectar anticuerpos contra la exotoxina de C. pseudotuberculosis (Ioneda T y col. 1979, Cowan S.T. 1979). En las ovejas la contaminación por las heridas durante trasquila es la de mayor importancia. (Zaitoun y col, 1994, Sayed A.M. y col. 1995, Bergey y col, 1994). Experimentalmente se aplicó exudado purulento en heridas frescas de trasquila que resultaron en un absceso en 26 de 30 borregos tratados, la infección también se indujo colocando caldo de cultivo en la piel recién trasquilada en donde 7 de 21 borregos desarrollaron abscesos en linfonodos superficiales, también se produce la infección por la aplicación de baños de inmersión, posteriores a la trasquila. Probablemente la infección es favorecida si la piel tiene heridas que no se ven a simple vista (Zaitoun y col, 1994). Se han probado numerosas rutas de infección experimental en borregos, incluyendo intradérmica, intratraqueal, subcutánea, intravenosa e intravaginal y cada uno de estos métodos produce abscesos en linfonodos locales. La administración intravenosa da como resultado la formación de Diferentes biotipos de Corynebacterium pseudotuberculosis están involucrados en la Linfadenitis Caseosa Cutánea y Visceral http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040804.pdf

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abscesos viscerales, la mayoría de ellos en los pulmones y en los linfonodos torácicos (Barakat A.A.y col, 1984, Pépin M. y col. 1988, Adrian L.M. 1994) .Otros autores sugieren que los traumatismos de la mucosa bucal son un medio de entrada para el organismo, la inoculación subgingival dio como resultado la infección de las cabras, y determinó abscesos en linfonodos regionales en todos los animales; así mismo, la inoculación intradérmica produjo abscesos en la cavidad torácica, así como en linfonodos locales en todos los animales, en la infección experimental pueden pasar varios meses antes de formarse abscesos en los linfonodos (Nairn M.E. y col. 1982,Paton M. y col. 1996,Nairn M.E. y col. 1977,Ellis J.A. y col, 1991,Carne H.R. y col. 1978). En borregos y cabras con la forma visceral de LC, hay una alta presencia de lesiones pulmonares y torácicas, indicando la posible transmisión aérea (Zaitoun y col, 1994, Brown C.C. y col, 1985). La patogenia de la LC en borregos y cabras no está bien definida, pero dos factores parecen jugar un papel esencial en el desarrollo de la enfermedad, el primero, la alta cantidad de lípidos en la pared de C. pseudotuberculosis que permite que el microorganismo resista la digestión por las enzimas de los macrófagos, persista como un parásito intracelular facultativo y se involucre en la formación de abscesos y segundo, la capacidad de producir toxinas citotóxicas que causan necrosis. En macrófagos mantenidos in vitro, que fueron infectados con C. pseudotuberculosis, la multiplicación bacteriana intracelular comenzó inmediatamente, formando varias generaciones en las siguientes cinco horas, los macrófagos infectados fueron degenerando cuando el número de microorganismos alcanzó 30 a 40 por célula, las bacterias libres fueron subsecuentemente fagocitadas por nuevas células. A la multiplicación por progresión geométrica, siguió la rápida muerte de los macrófagos y el incremento de bacterias en el medio; esta habilidad de C. pseudotuberculosis de resistir la digestión por fagocitos, se considera de gran importancia en la formación de los abscesos (Sayed A.M. y col. 1995). Los organismos pueden proliferar localmente y viajar dentro de los macrófagos hacia el linfonodo, los macrófagos mueren y se lisan, los organismos son fagocitados por otros macrófagos que repiten el ciclo, para eventualmente producir un absceso en el lugar (Zaitoun y col, 1994, Sayed A.M. y col. 1995, Brown C.C. y col, 1985b). Ocurren pequeñas variaciones en las cantidades de exotoxina producida por diferentes cepas, con evidencia de que la producción de exotoxina afecta la virulencia; en 25 aislamientos de C. pseudotuberculosis se encontró una correlación significativa entre la producción de exotoxina y la severidad de la enfermedad subaguda (abscesos) en ratones y en borregos, los extractos con el más alto nivel de producción de toxina fueron los que determinaron más abscesos (Ioneda T y col. 1979).

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En Australia se reportaron 10 casos de linfadenitis caseosa en humanos de 1985 a 1992, nueve de los cuales fueron relacionados con personas que trabajan en contacto directo con borregos y el caso de una mujer de 53 años de edad, habitante urbana, de la cual no se estableció el mecanismo de infección. Todos los pacientes infectados fueron de diferente sexo y edad, así como la localización de los linfonodos infectados fue variable, los pacientes recibieron tratamiento con antimicrobianos después de drenar la lesión o escindir el linfonodo. Entre los años de 1966 a 1986 se reportaron 12 casos de linfadenitis caseosa en humanos, en las mismas condiciones que los presentados en Australia, pero en otros países: Panamá, Francia, E.U.A. y Nueva Zelanda. (Brown C.C. y col, 1985). OBJETIVOS El objetivo del presente trabajo fue determinar si existen diferencias fenotípicas entre las cepas de Corynebacterium involucradas en las dos presentaciones clínicas de linfadenitis caseosa en ovinos. MATERIAL Y METODOS Las muestras se obtuvieron de rebaños en el Estado de México, México; se seleccionaron borregos que presentaron lesiones en linfonodos explorables, utilizando una punción con aguja y jeringa estériles, otras muestras fueron obtenidas de recolectar órganos y linfonodos de animales sacrificados en el rastro de Tlalnepantla Estado de México. Con base en datos de frecuencia de aislamiento obtenidos por Barrientos y col. en 1996 y que fueron del 10.6% (Barrientos y col, 1996), se realizó, mediante el programa Statistic, el cálculo del tamaño de la muestra. Se inspeccionó una población aproximada de 1500 cabezas de ganado y para fines probabilísticos se trató de igualar el número de muestras de origen cutáneo y visceral. El tamaño de la muestra mínima calculada fue de n=189 por lo que se obtuvieron 241 muestras de linfonodos y vísceras con lesiones sugestivas a LC. Para las muestras de linfonodos que se obtuvieron de ranchos, se realizó la inspección o palpación de los linfonódulos explorables submaxilares, parotideos, prescapulares y prefemorales con aumento de tamaño. Se procedió al aislamiento y la identificación bacteriana en el laboratorio de Investigación Multidisciplinaria en Salud Animal (UIMSA) de la FESC, UNAM, cada muestra se trabajó en condiciones de esterilidad y se sembraron en agar nutritivo, agar MacConkey, agar sangre al 10% y agar sangre al 10% más telurito de potasio; incubándolas a 37° C de 24-48 h en presencia de oxígeno, A las colonias desarrolladas se les realizaron: Tinción de Gram, prueba de oxidasa, catalasa y fermentación de glucosa en medio base de CTA. A los aislamientos sospechosos de pertenecer al género Corynebacterium se les realizó además, prueba de Voges Proskauer Diferentes biotipos de Corynebacterium pseudotuberculosis están involucrados en la Linfadenitis Caseosa Cutánea y Visceral http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040804.pdf

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y producción de ácido sulfhídrico en medio base de TSI, para diferenciar de otros géneros como Listeria spp y Kurthia spp (Cowan S.T. 1979, Bergey y col, 1994, Manual de prácticas, 1997). De cada caso se seleccionaron 5 colonias sospechosas. Una vez identificado el género se realizaron las siguientes pruebas para identificar la especie de acuerdo a los métodos descritos en Cowan S.T. 1979, Bergey y col, 1994 y Manual de prácticas, 1997. Tinción de Albert para gránulos metacromáticos, fermentación de galactosa y maltosa, hidrólisis de la arginina ey utilización de urea. Los aislamientos de C. pseudotuberculosis se resembraron en agar sangre para proceder a su conservación utilizando refrigeración, congelación a 20° y -80° C, así como en nitrógeno líquido. A una cepa de cada caso se le realizó la caracterización fenotípica con base al comportamiento metabólico de los aislamientos de C. pseudotuberculosis provenientes de las diferentes presentaciones clínicas. A los diferentes aislamientos se les realizaron, por triplicado, las siguientes pruebas de caracterización bioquímica de acuerdo a los métodos bacteriológicos convencionales (Cowan S.T. 1979, Bergey y col, 1994, Manual de prácticas, 1997). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Almidón Celobiosa Glucosa Dulcitol Fructuosa Galactosa Inositol Lactosa Maltosa Manitol Manosa

12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Rafinosa Salicina Trehalosa Xilosa Prueba de Urea Hidrólisis de la Arginina Prueba de Catalasa Prueba de Oxidasa Voges – Proskauer TSI (H2S)

Los aislamientos de C. pseudotuberculosis se agruparon con base a los resultados de las pruebas bioquímicas, de acuerdo al órgano de procedencia, tipo de presentación clínica y los diferentes biotipos formados como resultado de la utilización de carbohidratos en los que se observó variabilidad. Se estandarizó la prueba de inhibición de la beta-hemolisina para determinar la producción de toxina producida por los diferentes aislamientos de C. pseudotuberculosis de manera cuantitativa (Jawetz E. 1998, Valdivia A.G. 1992), para tal fin, se prepararon eritrocitos de carnero al 1%. Se extrajeron 5 ml de sangre con anticoagulante, se tomó 1 ml y se diluyó con 4 ml de solución salina fisiológica al 85% centrifugándose a 950 Diferentes biotipos de Corynebacterium pseudotuberculosis están involucrados en la 7

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g, durante 10 minutos y el sobrenadante se eliminó por decantación; este proceso se realizó por triplicado. Una vez lavados, se tomó 0.1 ml del paquete globular y se diluyó en 0.9 ml de solución salina fisiológica. Se cultivó la cepa de Staphylococcus aureus Cowan 1 en medio de BHI a 37° C durante 24 horas, se centrifugó a 3,900 g, a 6° C, durante 15 minutos, se obtuvo el sobrenadante y se mantuvo congelado a -10 ° C hasta su uso. Se realizaron diluciones dobles de la hemolisina (sobrenadante) en microplacas de 96 pozos, con un volumen final de 100 µl, se agregaron 100 µl de eritrocitos de carnero al 1%, se agitaron y dejaron en incubación durante 24 h a 37 ° C. Posteriormente se realizó la lectura de las microplacas en un Multiskan Ascent V1.22, a 405 nm (Jawetz E. 1998,Valdivia A.G. 1992). Se seleccionaron 15 aislamientos de cada una de las dos presentaciones, se obtuvieron cultivos en medio de caldo Brucella más suero al 10%, , se centrifugaron a 3,900g a 6° C durante 15 min. , se obtuvo el sobrenadante (FLD) y se trabajó la prueba en microplaca para la cuantificación de la toxina (Jawetz E. 1998,Valdivia A.G. 1992). Se realizaron diluciones dobles del sobrenadante (FLD) en las microplacas de 96 pozos, a un volumen final de 100 µl, se agregaron 100 µl de glóbulos rojos de carnero al 1%, se incubaron las placas durante 30 minutos a 37° C, se adicionaron 100 µl de la hemolisina de la cepa Staphylococcus aureus Cowan 1 previamente titulada, se incubó 30 min. a temperatura ambiente y posteriormente 18 h a 4° C. Se incluyeron como testigos: Un pozo con solo eritrocitos en solución salina fisiológica, otro con eritrocitos más el sobrenadante (FLD) y uno con eritrocitos y hemolisina (blanco). Se realizo la lectura de las microplacas en un Multiskan Ascent V1.22, a 405 nm. Con las absorciones y los porcentajes se realizó una curva contra dilución del sobrenadante (Jawetz E. 1998,Valdivia A.G. 1992). Electroforesis. Para la separación analítica de las proteínas, se utilizó PAGE-SDS por el método de Laemmli, las diferentes proteínas en el gel se separan en función de sus pesos moleculares (Valdivia A.G. y col 1999, Biorad, 1999, Laemmli W.K. 1970). Se tomaron aleatoriamente 8 aislamientos de cada grupo (4 cutáneas y 4 viscerales), se obtuvo de cada uno un cultivo en caldo Brucella más suero al 10%, se centrifugaron a 3,900 g a 6°C durante 15 min., se retiró el sobrenadante y el sedimento se restituyó en 5 ml de solución salina fisiológica al 85% y se sonicó a 45-90 herts por 60 segundos en 5 ciclos, con la finalidad de destruir los cuerpos bacterianos y liberar las proteínas somáticas. Diferentes biotipos de Corynebacterium pseudotuberculosis están involucrados en la Linfadenitis Caseosa Cutánea y Visceral http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040804.pdf

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Las soluciones sonicadas se centrifugaron a 5,000g a 6° C durante 15 min, posteriormente se les retiró el sobrenadante y se usó para determinar la cantidad total de proteinas por el método de Bradford y se calculó el volumen necesario a utilizar en el corrimiento electroforético (Valdivia A.G. y col 1999, Biorad, 1999, Laemmli W.K. 1970,100), utilizando 50 µg de proteínas de cada muestra que se mezclaron con 200 µl de buffer de lisis (4ml de agua destilada, 1ml de Tris – HCI al 0.5M y a un pH de 6.8, 0.8 ml de glicerol, 1.6 ml de dodecilsulfato de sodio al 10%, 4ml de 2bmercaptoetanol y 0.2 ml de azul de bromofenol al 0.5%) y se sometieron a baño maría durante 1 minuto. Se preparó el gel de PAGE-SDS al 12.5% adicionando a cada carril 10 µl de la muestra y se realizó el corrimiento, en un canal se depositó la solución con los marcadores de peso molecular. El corrimiento se realizó a 80 volts la primera hora y 120 volts en la segunda, en el buffer de corrimiento (Valdivia A.G. y col 1999,Biorad, 1999,Laemmli W.K. 1970). De cada muestra se realizaron dos geles, uno para ser teñido con nitrato de plata y otro para realizar la inmunotransferencia. Una vez finalizado el tiempo de corrida, uno de los geles se fijó con una solución de metanol al 10%, y ácido acético al 0.5% por media hora, posteriormente el gel se sumergió en una solución de nitrato de plata 0.011 M en agitación constante y en oscuridad, se realizaron tres lavados de un minuto con agua desionizada y se sumergió el gel en una solución reveladora en agitación constante hasta que desapareció el precipitado sobre el gel, cuando aparecieron las bandas y el gel comenzó a oscurecerse, se sacó de la solución de revelado y se fijó con metanol al 10% y ácido acético 0.5% (Valdivia A.G. y col 1999). El peso molecular de las bandas fue estimado con el programa Syngene, comparándolo con el estándar de proteínas de peso molecular conocido. Después de separar las proteínas por PAGE-SDS, fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa por electrotransferencia a 80 volts, y 400 mA durante una hora (Laemmli W.K. 1970, Karumieet P. 1996). La membrana de nitrocelulosa fue tratada por 24 horas, con leche descremada al 5% con la finalidad de bloquearla, se lavó la membrana en tres ocasiones con PBS-Tween 20 por 15 minutos y se procedió a cortarla en tiras de aproximadamente 5 milímetros de ancho, las cuales fueron depositadas en placas con canales, a los que se les adicionaron 7 mililitros de suero hiperinmune obtenido en conejo previamente y adicionado de PBS+Tween 20+leche descremada al 5% y se incubó en agitación durante dos horas a 37° C o toda la noche a 4°C (Laemmli W.K. 1970, Karumieet P. 1996). A continuación las tiras se lavaron en tres ocasiones con PBS+Tween 20 durante 15 minutos y finalmente se incubaron con proteína A conjugada con peroxidasa a una dilución de 1:2000, en agitación por dos horas, a 37° Diferentes biotipos de Corynebacterium pseudotuberculosis están involucrados en la Linfadenitis Caseosa Cutánea y Visceral http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040804.pdf

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C o toda la noche a 4° C (Laemmli W.K. 1970, Karumieet P. 1996). Para el revelado de la membrana se utilizó Diaminobenzidina (DAB) al 0.05%, 20 µg de DAB en 40 mililitros de ácido fosfórico 50 mM a pH 7.4, agitándose por 40 minutos y finalmente se filtró. A esta solución se agregó lentamente 1.2 mililitros de solución NiCo (15 mg de NICI3 y 15 mg de CoCl2) y 400 µl de H2O2. Una vez que se prepararon estas soluciones se agregaron a las tiras en agitación y la reacción se terminó al obtener la intensidad deseada de las bandas (Laemmli W.K. 1970,Karumieet P. 1996). RESULTADOS En las pruebas bioquímicas se encontraron algunas diferencias en relación a lo mencionado por Bergey y colaboradores en 1994 para los azúcares maltosa, glucosa, galactosa y gránulos metacromáticos (cuadro 1). Cuadro 1. Resultados de las pruebas bioquímicas para los aislamientos de C. pseudotuberculosis PRUEBA

POSITIVO %

CATALASA

253

100 0

0

Bergey 1994 +

ALMIDÓN

253

100 0

0

+

FRUCTUOSA

253

100 0

0

+

MANOSA

253

100 0

0

+

UREA

253

100 0

0

+

ARGININA

253

100 0

0

+

MALTOSA

194

77 59

23

+

GLUCOSA

143

57 110

43

+

GALACTOSA

130

51 123

49

+

T. ALBERT

132

52 121

48

+

OXIDASA

0

0

253

100

-

VP

0

0

253

100

-

H2S

0

0

253

100

-

CELOBIOSA

0

0

253

100

N/D1

DULCITOL

0

0

253

100

N/D1

INOSITOL

0

0

253

100

N/D1

LACTOSA

0

0

253

100

-

MANITOL

0

0

253

100

-

RAFINOSA

0

0

253

100

-

SALICINA

0

0

253

100

-

TREHALOSA

0

0

253

100

(-)2

NEGATIVO %

et.

Diferentes biotipos de Corynebacterium pseudotuberculosis están involucrados en la Linfadenitis Caseosa Cutánea y Visceral http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040804.pdf

al.

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XILOSA 1 2

0

0

253

100

-

No se encontraron datos de evaluación de estos carbohidratos. Ocasionalmente cepas positivas.

Se estableció la relación entre la utilización de los tres carbohidratos variables con la forma de LC, de aislamientos de C. pseudotuberculosis y el órgano de procedencia (cuadro 2). Cuadro 2. Relación de las pruebas bioquímicas variables de C. pseudotuberculosis con el órgano de procedencia Cutánea Carbohidratos Glucosa Galactosa Maltosa Visceral Carbohidratos Glucosa

Parotideo No.-(%) Positivo 6 (10%) Negativo 56 (90%) Positivo 5 ( 8%) Negativo 57 (92%) Positivo 38 (61%) Negativo 24 (39%) Resultado

Resultado Positivo

Positivo

Positivo

1 (3%)

73 (75%) 28 (82%)

Negativo 25 (25%) Maltosa

Otros No.-(%) 5 (100%) 0 5 (100%) 0 5 (100%) 0

Parotideo Submandibular Otros No.-(%) No.-(%) No.-(%) 15 75 (76%) 33 (97%) (100%)

Negativo 23 (24%) Galactosa

Submandibular No.-(%) 9 (23%) 30 (77%) 9 (23%) 30 (77%) 24 (62%) 15 (38%)

6 (18%)

79 (81%) 33 (97%)

Negativo 19 (19%)

1

(3%)

0 10 (67%) 5 (33%) 15 (100%) 0

Total No.-(%) 20 (19%) 86 (81%) 19 (18%) 87 (82%) 67 (63%) 39 (37%) Total No.-(%) 123 (83.7%) 24 (16.3%) 111 (75.5%) 36 (24.5%) 127 (86.4%) 20 (13.6%)

Se realizó una prueba de hipótesis para dos proporciones de grupos independientes (p<0.05), utilizando el programa estadístico Microstat, los asteriscos en la tabla indican diferencias significativas (cuadro 3). Con base en los resultados de la utilización de los diferentes carbohidratos los aislamientos se agruparon en diferentes biotipos, mostrándose los datos del número de los aislamientos y sus frecuencias en el cuadro 4. Considerando la frecuencia elevada de ciertos biotipos, se procedió a separarlos por el tipo de presentación clínica (cuadro 5) Diferentes biotipos de Corynebacterium pseudotuberculosis están involucrados en la Linfadenitis Caseosa Cutánea y Visceral http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040804.pdf

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Cuadro 3. Análisis estadístico de la presentación cutánea y visceral, con los tres carbohidratos variables. Carbohidratos Resultado Cutánea Glucosa Positivo 20 (19%) Negativo 86 (81%) Galactosa Positivo 19 (18%) Negativo 87 (82%) Maltosa Positivo 67 (63%) Negativo 39 (37%)

Visceral 123 (83.7%) 24 (16.3%) 111 (75.5%) 36 (24.5%) 127 (86.4%) 20 (13.6%)

P<0.05 0.0001* 0.0001* 0.0037* 0.0002* 0.057 -0.57

Se realizó una prueba de hipótesis para dos proporciones de grupos independientes (p<0.05), utilizando el programa estadístico Microstat. * Diferencias estadísticas significativas.

Cuadro 4. Frecuencias de los diferentes biotipos. Biotipo GLU + GAL + MAL + GLU – GAL – MAL – GLU – GAL – MAL + GLU + GAL – MAL + GLU – GAL + MAL + GLU + GAL + MAL – GLU + GAL – MAL – GLU – GAL + MAL – Total:

Cantidad de cepas 123 56 49 17 5 2 1 0 253

Frecuencia (%) 48.62 22.13 19.37 6.72 1.98 0.79 0.40 0.00 100

Cuadro 5. Diferentes biotipos y sus frecuencias en la presentación cutánea y visceral.

Biotipo* Glu +, Gal+ , Mal+ Glu – Gal – , Mal – Glu – , Gal – , Mal + Glu + Gal – , Mal + Glu – , Gal + , Mal + Glu + , Gal + Mal – Glu + Gal – , Mal – Glu – , Gal + , Mal – Total:

Presentación Total de Presentación Visceral cepas Cutánea (%) (%) 123 14 (11.4) 109 (89) 56 38 (67.8) 18 (32) 49 48 (98.0) 1 (2) 17 0 (0) 17 (100) 5 5 (100.0) 0 (0) 2 0 (0) 2 (100) 1 1 (100.0) 0 (0) 0 0 0 253

* Glu.- Glucosa, Gal.- galactosa, Mal.- maltosa El signo positivo indica la utilización del carbohidrato en cuestión.

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En el cuadro 6 se muestran los resultados de la titulación de la fosfolipasa D, mediante la inhibición de la hemólisis de la beta lisina producida por el S. aureus Cowan 1. Cuadro 6. Cantidad de Fosfolipasa D en algunos de los aislamientos de Corynebacterium pseudotuberculosis realizados.

Cutánea Aislamiento identificación 12 16 26 45 47 61 92 102 112 118 120 129 133 149 189

UFLD* 3,200 1,600 1,600 1,600 1,600 3,200 1,600 1,600 1,600 1,600 1,600 1,600 1,600 1,600 1,600

Visceral Aislamiento identificación 1 8 22 43 58 66 88 110 156 162 175 188 200 206 212

UFLD 1,600 1,600 1,600 1,600 1,600 1,600 800 1,600 1,600 800 1,600 1,600 1,600 1,600 800

* Una unidad de fosfolipasa D (UFLD) se define como, el inverso de la dilución de FLD que bloquea 2 UH de la hemolisina del S. aureus Cowan 1 (70)

En la figura 3 se muestran los geles del corrimiento electroforético tanto para los aislamientos de la presentación cutánea como para la presentación visceral, los cuales fueron analizados por medio del programa Syngene para la obtención de los pesos moleculares. No se observaron diferencias en las proteínas fraccionadas en los 17 aislamientos evaluados, se separaron 8 proteínas de pesos: 69.62, 57.91, 53.26, 47.78, 35.97, 33.84, 31.96 y 23.46 kDa respectivamente.. El suero hiperinmune obtenido en conejo con la cepa de C. pseudotuberculosis proveniente del CENID-INIFAP se utilizó para desafiar a los diferentes biotipos de cada presentación en la inmunotransferencia, como lo muestra la figura 6. En las 6 muestras ensayadas y en la muestra proporcionada por el CENIDINIFAP, el suero de conejo reconoció a la proteína fraccionada de mayor peso molecular 69.62 kDa. Diferentes biotipos de Corynebacterium pseudotuberculosis están involucrados en la Linfadenitis Caseosa Cutánea y Visceral http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040804.pdf

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Glucosa

Galactosa

Lactosa

Glucosa + lactosa

Fosfoenol transferasa de glucosa

Sacarosa

Glucosa

Fructosa Manosa

Sacarosa

Glucosa + Fructosa Fosfoenoltransferasa específica de fructosa y manosa Fosfoenol transferasa de glucosa Figura 1.- Representación esquemática de las probables vías de introducción de carbohidratos en Corynebacterium Tomado y modificado de Kiefer P. y col 2004, Barrett E. y col 2004, Molenaar D. y col, 2000.

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GALACTOSA FRUCTOSA

GLUCOSA Pentosa 5 P Glucosa 6 P Eritrosa Fructosa 6 P Pseudo Heptulosa Vía de las Pentosas

Fructosa 1P Fructosa 1,6 diP

ACETATO Gliceraldehido 3P Acetil CoA PE Piruvato

Isocitrato

Malato / Oxalacetato

2-oxoglutarato Succinato Ciclo de Krebs

Figura 2.- RUTAS METABOLICAS EN Corynebacterium spp Tomado y modificado de Kiefer P. y col 2004, Barrett E. y col 2004, Molenaar D. y col, 2000. Diferentes biotipos de Corynebacterium pseudotuberculosis están involucrados en la Linfadenitis Caseosa Cutánea y Visceral http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040804.pdf

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69.62

Ref.

1

1 c

1 v

2 c

2 v

3 c

3 v

c = presentación cutánea. V= presentación visceral 1.- Glu+, Gal+, Mal+ 2.- Glu+, Gal+, Mal- 3.- Glu-, Gal-, MalFigura 3. Inmunotransferencia de algunos de los aislamientos de C.pseudotuberculosis.

Se realizaron curvas de crecimiento, en dos medios de cultivo, en el caldo Todd-Hewitt se presentó crecimiento irregular entre los aislamientos probados, no así en caldo brucella, en donde el crecimiento fue más uniforme. Las velocidades de crecimiento fueron muy parecidas dentro de los medios. C. pseudotuberculosis mostró una velocidad de crecimiento, calculada de m = 5.7583 y no presentó fase de latencia, probablemente porque se utilizó el mismo medio de cultivo para el preinóculo, por lo tanto las bacterias no sufrieron de condiciones desfavorables y se adaptaron rápidamente. La curva muestra desde un inicio, una fase de crecimiento exponencial con una duración de 12 h aproximadamente. Posterior a las 12 horas, se puede asumir que la bacteria entra en una fase estacionaria, en la cual la tasa de crecimiento es decreciente o de cero, en esta fase se encontró la mayor cantidad de bacterias en el medio (Jawetz E. 1998). DISCUSION Durante las últimas dos décadas se han modificado e incluido nuevas especies dentro del género Corynebacterium, por ejemplo la descrita de un aislamiento en perros en donde se usó análisis genético y fenotípico para caracterizarlas, (Collins M.D. y col. 1999). Como resultado de la caracterización metabólica de los aislamientos de C. pseudotuberculosis, se encontró que de las 22 pruebas realizadas, en cuatro, los resultados fueron diferentes a lo señalado por Bergey y col. en 1994. Estas pruebas fueron, la utilización de los carbohidratos maltosa, glucosa, galactosa y la tinción de Albert para gránulos metacromáticos (cuadro 1). En la utilización de los carbohidratos celobiosa, dulcitol e inositol, no se encontraron datos de su evaluación y el total de las cepas Diferentes biotipos de Corynebacterium pseudotuberculosis están involucrados en la Linfadenitis Caseosa Cutánea y Visceral http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040804.pdf

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trabajadas (253) dieron un resultado negativo. Así mismo, en la utilización de trehalosa la bacteria se reporta como ocasionalmente positiva (13) y en este trabajo el total de los aislamientos fueron negativos (cuadro 1). Las bacterias del género Corynebacterium pueden utilizar carbohidratos y ácidos orgánicos como fuente de carbono; de este modo la glucosa y el acetato también pueden ser empleados para la síntesis de aminoácidos. El acetato es convertido a Acetil CoA la que a su vez produce aminoácidos y energía, la ruta es apoyada por el ciclo del glioxilato como una ruta anaplerotica. El acetato es convertido a acetil fosfato mediante la enzima acetatocinasa (AK), este compuesto es convertido a Acetil CoA mediante la fosfotransacetilasa (PTA). Por otro lado la Isocitratoliasa (ICL) cataliza la conversión del isocitrato a succinato y glioxilato el que a su vez se convierte a malato por su condensación con Acetil Coa, el paso es catalizado por la malato sintetasa (MS). Los genes aceA, aceB, ack y pta que codifican para la ICL, MS, AK y PTA, respectivamente, son regulados a nivel transcripcional por la presencia de acetato en el medio de cultivo (Gerstmeir R. y col, 2004) En base a los resultados de las pruebas bioquímicas de comportamiento metabólico variable, se agruparon los aislamientos, de acuerdo a la presentación y al órgano de procedencia. En los aislamientos de casos de presentación cutánea, la mayoría no utilizó glucosa 81% (86:101) y galactosa 82% (87:106) pero para la maltosa se observó un porcentaje ligeramente mayor de positivos 63% (67:106) (cuadro 3). Para los aislamientos de la presentación visceral, los resultados fueron inversos, la mayoría fueron positivos a la glucosa 83.7% (123:147) y la galactosa 75.5% (111:147)y con la maltosa 86.4% (127:147) se comportaron de manera similar a las de la presentación cutánea (cuadro 3). A diferencia de lo encontrado en el presente trabajo, algunos estudios realizados por medio de campos pulsados, indican que las cepas aisladas de ovinos tanto de la presentación visceral como cutánea, son iguales genéticamente y bioquímicamente, (Connor K.M. y col, 2000).; pero coinciden parcialmente con Collins M.D. y col quienes en 1999 reportan a C. pseudotuberculosis positivo a glucosa, maltosa y variable a fructosa, sin embargo no mencionan en cual presentación, visceral o cutánea establecen su estudio Por otro lado, se agruparon los aislamientos de C. pseudotuberculosis en los diferentes biotipos posibles, en base a los tres carbohidratos encontrados como variables (cuadro 4) y se encontró que el biotipo Glu+Gal+Mal+ fue el de mayor frecuencia (48.62 %), correspondiendo a lo que sería una cepa clásica de C. pseudotuberculosis, no así, los biotipos, Glu-Gal-Mal- (22.13 %) y Glu-Gal-Mal+ (19.37 %), en donde la diferencia la hace la utilización de la maltosa. Cuando se compararon los diferentes biotipos, entre las dos presentaciones se encontró que el biotipo clásico de Glu+Gal+Mal+ se encuentra con mayor frecuencia en la presentación visceral, por otra parte los biotipos Glu-GalDiferentes biotipos de Corynebacterium pseudotuberculosis están involucrados en la Linfadenitis Caseosa Cutánea y Visceral http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040804.pdf

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Mal-, Glu-Gal-Mal+ tuvieron una frecuencia mayor en la presentación cutánea. El análisis estadístico, con la prueba de hipótesis para dos proporciones de grupos independientes, comparando los aislamientos de presentación cutánea contra las viscerales, en relación a la positividad o negatividad para cada uno de los tres carbohidratos, indicó que existieron diferencias significativas entre las dos presentaciones para glucosa y galactosa (p<0.05), pero no para maltosa (cuadro 3). Estos resultados pueden ser interpretados como una posible selección de diferentes biotipos del microorganismo influidos por el medio ambiente tisular en el que se encuentra la bacteria, proceso que estaría relacionado con los factores auxiliares de virulencia diferenciales para las dos presentaciones, siendo necesario evaluar si se trata de variantes genéticas asociadas a procesos de mutación y selección bacteriana o a diferentes especies. En virtud de que la mayoría de los estudios de las rutas metabólicas en el género Corynebacterium han sido realizados principalmente en C glutamicum, de que tiene dos enzimas para el metabolismo del malato a oxaloacetato estando ambas asociadas a la membrana y al parecer están conservadas en varias bacterias, incluyendo gram positivas y negativas. Molenaar D y col, 2000, utilizaremos los datos al respecto para tratar de establecer las diferencias bioquímicas encontradas en el presente trabajo. C. glutamicum no utiliza lactosa ni galactosa, pero utiliza la sucrosa y la glucosa para introducirlas al ciclo de Krebs y a partir del intermediario oxaloacetato derivar para la producción de aminoácidos como la lisina, treonina, metionina e isocitrato, se han introducido genes de E. coli para la utilización de la lactosa del medio de cultivo en C. glutamicum y de esta manera logra producir aminoácidos (Barrett E. y col, 2004), sus resultados sugieren que el problema de la utilización de lactosa y galactosa es el ingreso de los compuestos a la bacteria y no las rutas metabólicas capaces de degradarlos. Extrapolando estas observaciones a los resultados encontrados en el presente, es posible que C. pseudotuberculosis galactosa negativo tenga un problema de permeabilidad específico de este carbohidrato ya que todas las cepas fueron lactosa negativo al igual que C. glutamicum. Las observaciones y conclusión al respecto, son reforzadas por el hecho de que el 100% de las cepas de C. pseudotuberculosis analizadas en nuestro trabajo, utilizaron la fructuosa, pero existieron diferencias en la utilización de la glucosa y si consideramos que Kiefer P. y col. 2004 demostraron que C. glutamicum emplea más la ruta de las pentosas por crecimiento sobre glucosa que por crecimiento sobre fructosa, por lo que Corynebacterium es capaz de metabolizar ambos carbohidratos. De la misma manera, si analizamos la Fig 2. , las cepas Gluc - , tienen pocas probabilidades de contener una mutación en la ruta metabólica de la glucosa, debido a que Diferentes biotipos de Corynebacterium pseudotuberculosis están involucrados en la Linfadenitis Caseosa Cutánea y Visceral http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040804.pdf

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tiene dos caminos, uno de los cuales es compartido por el metabolismo de la fructosa. Por otro lado, estudios que se han realizado en el género Corynebacterium indican que la glucosa entra a la célula a través de la fosfoenol transferasa y la maltosa entra por medio de una fosfoenol transferasa específica, asociada fuertemente a la fructosa. (Kiefer P.y col 2004). Nuestros resultados sugieren que en este caso también pudieran estar involucradas mutaciones en las fosfoenol transferasas específicas para la glucosa ya que todas las cepas fueron positivas a la utilización de fructosa y manosa. En la Fig. 1 se muestran las vías de entrada a la célula y en la Fig. 2 las posibles rutas metabólicas de los carbohidratos encontrados como diferenciales en el presente estudio (Tomadas y modificadas de Kiefer P. y col 2004, Barrett E. y col 2004, Molenaar D. y col, 2000). Por otro lado, y realizando un análisis y correlación de nuestros resultados con los datos encontrados en la bibliografía, sugerimos que la alteración metabólica que puede explicar los resultados encontrados está a nivel de las permeasas (Fosfoenoltransferasa específica de fructosa y manosa y de la Fosfoenol transferasa de la glucosa ) debido a que sería muy difícil que una ruta central como la glicólisis estuviera alterada además de que el uso de la glucosa tiene una ruta alterna por la vía de las pentosas. (fig. 1 y 2) Para poder explicar los resultados diferentes a los antes mencionados en cuanto a los biotipos relacionados con la presentación, es importante considerar que de los animales inspeccionados en campo, solo se muestrearon lesiones cutáneas y no fue posible determinar si presentaban lesiones viscerales, por otro lado, los animales inspeccionados en el rastro, no fue posible determinar si además de presentar lesiones viscerales, también presentaban lesiones cutáneas, por la metodología de matanza en el rastro en donde los matanceros eliminaban los linfonodos subcutáneos previo a la evisceración, sitio en donde se tomaron las muestras. Se estandarizó determinar la aislamientos de resultados no (p<0.05)

la prueba de inhibición de la beta-hemolisina para producción de toxina producida por los diferentes C. pseudotuberculosis de manera cuantitativa (33), los mostraron diferencias estadísticamente significativas

Los patrones de separación de proteínas en geles resultaron idénticos para los aislamientos estudiados, independientemente de la forma de presentación de la enfermedad (cutánea o visceral) o del biotipo considerado figura 5. Se utilizó el suero hiperinmune del conejo inoculado con el aislamiento del CENID-INIFAP, contra los tres diferentes biotipos y las dos presentaciones clínicas, en todos los casos el suero reconoció la misma proteína de 69.62 kDa de PM. La proteína de 69.2 kDa reconocida por los anticuerpos del conejo, coincide por otra parte, con una de las seis Diferentes biotipos de Corynebacterium pseudotuberculosis están involucrados en la Linfadenitis Caseosa Cutánea y Visceral http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040804.pdf

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proteínas que en el trabajo de Ellis J.A. y col, 1991 fueron reconocidas en la inmunotransferencia, empleando sueros de ovinos infectados naturalmente, que seguramente montan una respuesta más compleja, que la que se podía esperar con la aplicación de la bacteria inactivada al conejo, como se hizo en este ensayo. Los resultados de producción de toxina, caracterización proteica e inmunotransferencia, indican que no existieron diferencias relevantes entre los aislamientos estudiados de C. pseudotuberculosis que pudieran influir su diferente comportamiento patogénico en las dos presentaciones clásicas de la enfermedad. Sin embargo, las diferencias observadas en la fermentación de azúcares, son sugestivas de mecanismos de adaptación y regulación génica de la bacteria, en diferentes ambientes oxidativos y de disponibilidad de sustrato. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES El biotipo clásico de Corynebacterium pseudotuberculosis Glu+Gal+Mal+ se encontró con mayor frecuencia en la presentación visceral y los biotipos Glu-Gal-Mal- , Glu-Gal-Mal+ tuvieron una frecuencia mayor en la presentación cutánea. Existieron diferencias significativas entre las dos presentaciones para la fermentación de la glucosa y galactosa (p<0.05), pero no para la maltosa. La producción de fosfolipasa D y las proteínas inmunodominantes de la membrana o pared celular no tuvieron diferencia estadísticamente significativa para las cepas de C. pseudotuberculosis que pudieran influir en su comportamiento patogénico diferente en las dos presentaciones clásicas de la enfermedad. Es necesario realizar estudios de los sitios específicos de alteración metabólica entre las rutas de glucosa y galactosa para establecer su posible papel en la expresión de los factores auxiliares de virulencia de Corynebacterium pseudotuberculosis, especialmente aquellos diferentes a la toxina fosfolipasa D. Los estudios deberán enfocarse a la regulación de la actividad intracelular de la bacteria dentro de los macrófagos. BIBLIOGRAFIA

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Patologías de la reproducción en bovinos de la raza Maronesa (Reproductive diseases in Maronesa cattle) Simões, João: CECAV/HVUTAD/DCV, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Apartado 5000-801, Vila Real, Portugal, NickName: jsimoes | Mascarenhas, Ramiro: Estação Zootécnica Nacional - Instituto Nacional dos Recursos Biológicos, 2005-048 Vale de Santarém, Portugal | Teixeira, Fátima: Médica Veterinaria en ejercicio liberal, 5370 Mirandela, Portugal | Santos, Cristiana: HVUTAD/DCV, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Apartado 5000-801, Vila Real, Portugal | Madureira, Mário: Sorgal - Soc. de Óleos e Rações, S.A.; Médico Veterinario en ejercicio liberal, 5000 Vila Real, Portugal. Autor a quien dirigir la correspondencia: João Simões. Tel.: +351259350000; Fax: +351259350480. Email: jsimoes@utad.pt

RECVET: 2008, Vol. III, Nº 4 Recibido 22.01.08 / Referencia provisional R030907 / Referencia definitiva 040805es_RECVET / Aceptado: 15.03.08 / Publicado: 01.04.08 Este artículo está disponible en http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408.html concretamente http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040805es.pdf Revista Electrónica de Clínica Veterinaria RECVET® está editada por Veterinaria Organización® Se autoriza la difusión y reenvío siempre que enlace con Veterinaria.org® http://www.veterinaria.org y con RECVET®-http://www.veterinaria.org/revistas/recvet

Resumen El ganado Maronés constituye una raza autóctona, de aptitud cárnica, explotada en el interior norte de Portugal, con un efectivo bovino adulto de pequeña dimensión. Fueron descritos e ilustrados 5 casos clínicos de distintas patologías, algunas de las cuales raras, que afectan a la fertilidad individual y/o a la gestación de hembras de raza Maronesa y cuyas causas no están completamente esclarecidas: hidralantóides, prolapso vaginal de tercer grado, distocia por Shistosoma reflexus y degeneración quística del ovario (quistes foliculares y luteínicos). Un mejor conocimiento de la etiopatogenia de estas patologías es fundamental para su abordaje clínico y prevención, en ésta y otras razas de bovinos. Palabras clave: Razas autóctonas | Bovinos | Maronesa | Reproducción | Patologías | Hidralantoides | Prolapso vaginal | Shistosoma reflexus | Degeneración quística del ovario

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Abstract Maronesa cattle are a Portuguese indigenous beef breed. This small population is located in mountain regions of north-west Portugal. Five clinical cases of distinct reproductive pathologies with unclear etiology, affecting the individual fertility and/or gestation of females, were reported in this breed. Some of these illustrated diseases are rare. Hydrallantois, vaginal prolapse (3rd degree), fetal dystocia due to Schistosoma reflexus and cystic ovarian disease (Follicular and luteinised ovarian cysts) were described. A deep knowledge of etiopathogeny is necessary to provide a more precise clinical approach and prevention of these diseases. Keywords: Local breeds | Cattle | Maronesa | Reproduction | Pathologies | Hydrallantois | vaginal prolapse | Schistosoma reflexus | cystic ovarian disease

INTRODUCCIÓN Los bovinos de la raza Maronesa son explotados, principalmente por agricultores, en el interior norte de Portugal. Su origen se sitúa en las regiones agrestes de la sierras del Marão, Alvão y Padrela, a las cuales se encuentran adaptadas. Esta raza autóctona Portuguesa, usada en el pasado como fuerza motriz, tiene como principal finalidad la producción de terneras de 7 a 8 meses de edad (en el momento del destete) para un sacrificio con denominación de origen protegido (DOP). El sistema de producción depende de las condiciones edafoclimáticas y del régimen de propiedad de los terrenos, aunque se destaquen el régimen de pastoreo cuando las condiciones ambientales lo permiten, y el de semiestabulación, sin ninguna suplementación de alimento concentrado (ocasionalmente harina de maíz). En 2003, se encontraban inscritas en el respectivo libro genealógico 5982 vacas adultas provenientes de 1931 productores, representando un encabezamiento medio de 3,1 vacas por criador, aunque con una amplitud entre 1,1 y 7,0 (Alves y Teixeira, 2006). No obstante, se observó en los últimos anos la aparición de explotaciones de dimensiones más significativas, del orden de decenas de animales. Existe un esfuerzo en apoyar esta raza, amenazada de extinción, con sistemas de ayudas a la producción y también por selección genética de los machos (Santos, 2006) asociada a una mayor expansión de la inseminación artificial.

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A nivel reproductivo, las hembras de esta raza (49,3% alcanzan el 10º parto) fueran descritas por Alves y Teixeira (2006) como teniendo una edad al primero parto de 828 ± 114 días, un índice de fertilidad cerca de 86% y un intervalo entre partos de 384 ± 53 días para el cual contribuye un intervalo parto-concepción de 101 ± 32 días, influenciado por un anestro de lactación de 90 ± 30 días. Estos autores mencionan, además, que las vacas de esta raza presentan una elevada facilidad de parto debido al registro de bajo porcentaje (5,3%) de partos asistidos. De hecho, no abundan en la literatura descripciones de alteraciones reproductivas, en esta raza de aptitud cárnica. Sin embargo, han sido observadas por nosotros distintas patologías de esta índole, algunas de las cuales consideradas raras también en bovinos de otras razas, con aparición en diferentes fases del ciclo reproductivo. El presente trabajo tiene por objetivo la descripción de 4 patologías distintas de origen reproductivo y de etiopatogenia no completamente aclarada, con impacto en la fertilidad individual y/o en la gestación de vacas de raza Maronesa. Una de las afecciones observadas fue la degeneración quística del ovario (quistes foliculares y luteínicos) y las restantes fueron alteraciones de gestación (hidralantóides, prolapso vaginal de tercer grado y distocia por Shistosoma reflexus). DESCRIPCIÓN DE LOS CASOS CLÍNICOS Los casos seleccionados fueron abordados por nosotros en el ámbito de la clínica ambulatoria, por solicitud de los productores. Caso nº 1- Hidralantoides Fue llevada a consulta una vaca multípara (3 partos), con 6 años de edad, gestante de 8 meses. El principal motivo de la consulta fue una pérdida gradual de apetito durante el último mes y anorexia total en los 2 días anteriores a la llamada. Los dueños observaron una distensión abdominal progresiva en los 2 últimos meses. Figura 1. Silueta abdominal con distensión bilateral, en forma de tonel, característica del hidralantoides en bovino.

A la inspección, era evidente la distensión bilateral del abdomen (Fig. 1). Las mucosas tenían coloración rosácea normal. La temperatura rectal era normal (38,2 oC) y se observó ausencia de movimientos Patologías de la reproducción en bovinos de la raza Maronesa http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040805es.pdf

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ruminales, una frecuencia cardíaca de 96 latidos por minuto y ligera disnea. La palpación transrectal permitió la identificación del útero gestante, ocupando parte significativa de la cavidad abdominal. La pared del útero se encuentra extremamente tensa dificultando la palpación de los placentomas. Por el examen clínico, se diagnosticó una hidropesía (hidralantoides). Como tratamiento, fue efectuada una cesárea con abordaje por la fosa paralumbar izquierda con bloqueo paravertebral de las ramas ventrales y dorsales de los nervios localizados entre T13 y L3, con aplicación de aproximadamente 20 ml de lidocaína al 2% en cada nervio (técnica de Farquarson). Figura 2. Extracción de fluido claro proveniente de la cavidad abdominal.

Se retiró, de forma progresiva, una cantidad anormal de líquidos fetales (Fig. 2) principalmente de la cavidad alantóide. En un primer momento, antes de la incisión de cerca de 30 cm de la pared uterina, se intentó realizar una descompresión lenta con un trocar, para prevenir una eventual descompensación hidrodinámica brusca conduciendo a un posible shock hipovolémico. Se extrajo, del cuerno uterino derecho, un feto muerto con anasarca (Fig. 3). El feto presentaba edema subcutáneo generalizado (señal de Godé positivo), así como infiltración en los principales órganos internos, aunque sin otras alteraciones macroscópicas visibles. La inexistencia de señales de momificación, maceración o enfisema fetal, así como su tamaño, fueron indicios de una muerte bastante reciente.

Figura 3. Anasarca fetal. Para el cierre de la Patologías de la reproducción en bovinos de la raza Maronesa http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040805es.pdf

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pared uterina, se utilizó una sutura continua de reinversión con hilo reabsorbible (catgut nº 3). El peritoneo y los músculos abdominales fueron suturados en 3 planos, a través de una sutura continua simple (catgut nº 3), aplicándose ocasionalmente un punto de sutura ancorada, este último para garantizar la tensión del hilo y consecuentemente la correcta aposición de los bordes musculares. Para evitar espacios vacios entre los planos, 2 o 3 puntos ocasionales englobarán también una porción muscular del plano anterior. Fue usada una sutura continua ancorada, con seda nº 2, en la piel. Para evitar infecciones, fue administrado cerca de 40 ml de una asociación antibiótica compuesta por penicilina (200.000 UI/ml) y estreptomicina (250 mg/ml) en la cavidad intrauterina e intraabdominal antes del cierre de la cirugía. La terapia post-operatoria consistió en la administración de 25 ml (IM, SID) de asociación antibiótica de penicilina y estreptomicina, y 10 ml (IM, SID) de un analgésico no esteroideo (flunixin meglumina a 50 mg/ml), durante 5 días. Se observó una rápida recuperación de la vaca durante el período postoperatorio. Después de 15 días, el animal se encontraba normal al examen clínico. Caso nº 2- Prolapso vaginal de tercer grado Fue observada la presencia de una masa prolapsada en la región perineal en una vaca primípara con edad superior a los 3 años. Esta hembra se encontraba en la fase final de la gestación, con el parto previsto para la semana siguiente. Después de la limpieza y antisepsia con povidona yodada se identificó la pared vaginal invertida. No se observaron, en la inspección y palpación, lesiones traumáticas significativas de la mucosa. El orificio del cérvix fue observado junto a la comisura vulvar dorsal (Fig. 4), confirmándose el diagnóstico de Prolapso vaginal de tercer grado (prolapso cervical). No fue observado el tapón mucoso, probablemente debido a su disolución o pérdida. El tratamiento consistió en la reducción manual de la masa prolapsada, utilizando anestesia epidural baja (caudal) por administración en el espacio epidural, entre Co1 e Co2, de 8 ml de lidocaína al 2%. El potencial de recidiva fue prevenido mediante la aplicación de 4 alfileres obstétricos en la base del esfínter vulvar. Patologías de la reproducción en bovinos de la raza Maronesa http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040805es.pdf

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La antibioterapia fue efectuada con 25 ml (IM, SID) de amoxicilina (150 mg/ml) durante 5 días, para prevenir complicaciones eventuales, como septicemias e infecciones intrauterinas, conduciendo a la muerte fetal, debido al desaparecimiento del tapón mucoso. Figura 4. Prolapso cervical (prolapso vaginal de tercer grado). Los pliegues cervicales exteriores se encuentran bien evidentes junto a la comisura vulvar dorsal. Se observan algunas ulceraciones de la mucosa, provocadas por traumatismos de la pared vaginal expuesta. Fueron dadas instrucciones al propietario del animal de retirar los alfileres un día antes de la fecha prevista para el parto normal. No fueron observadas recidivas de prolapso vaginal y el animal volvió a reproducirse normalmente. Caso nº 3- Distocia de origen fetal por monstruo celosomiano Una vaca multípara, con edad superior a 7 años, se encontraba con dificultades en su 5º parto, hacia más de 12 horas. Después de la palpación vaginal, fueron exteriorizadas parte de las vísceras fetales de un monstruo simple (celosomiano) y se identificó una distocia de origen fetal, por presentación visceral de un Schistosoma reflexus (Fig. 5). La clasificación de este monstruo fue efectuada por la reconstrucción de las partes retiradas por fetotomia. Figura 5. Vísceras de un Schistosoma reflexus, la cuales se encontraban en el canal del parto, antes de su exteriorización manual.

Después de la aplicación de la anestesia epidural baja (10 ml de lidocaína 2%), se procedió a la remoción de las vísceras fetales. A través de la fetotomia percutánea de las extremidades y del abdomen, se retiró, por partes, la totalidad del feto.

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Fueron administrados 25 ml (IM, SID) de una asociación de penicilina (200.000 UI/ml) y estreptomicina (250 mg/ml) y 10 ml (IM, SID) de flunixin meglumina (50 mg/ml) durante 4 días. No se verificó cualquier secuela visible en los días inmediatos a la resolución del parto distócico. Casos nº 4 y nº 5- Degeneración quística del ovario En el primer caso, una vaca multípara con 15 años de edad y 4 meses después del último parto presentaba como motivo de consulta señales de ninfomanía, con vocalización y temperamento más agresivo de lo normal. Mediante palpación transrectal, se le detectó un quiste en el ovario derecho y 2 en el izquierdo, y se elaboró un diagnóstico presuntivo de quistes foliculares. Fue efectuado un examen ecográfico 10 días después de la primera palpación para establecer un diagnóstico definitivo (Fig.6).

Figura 6. Dos sonogramas obtenidos a partir de cada ovario con, por lo menos, un quiste folicular. No se observa la presencia de tejido luteínico en las paredes de los quistes. Las barras laterales representan una distancia de 10 mm entre si.

Fue entonces, efectuado un tratamiento único con 20 µg de acetato de burselina (GnRH) seguido, 10 días más tarde, de la aplicación de 500 µg de cloprostenol, ambos por vía intramuscular. El comportamiento de la vaca, incluyendo su temperamento, se alteró 4 días después de la administración de burselina, observándose el celo 3 días después de la administración de la prostaglandina. El animal fue beneficiado en el siguiente celo, y 60 días más tarde, fue efectuado un diagnóstico positivo de gestación por palpación transrectal. En el segundo caso, fue observada una vaca con 8 partos (13 años de edad), cuyo motivo de consulta fue la ausencia de celos desde el último parto normal, ocurrido hacia cerca de 3 meses. Mediante palpación transrectal, se identificó el ovario derecho, de conformación oval, con más de 50 mm de eje mayor, y del cual sobresalía una estructura de gran dimensión, superior a 25 mm, con una superficie de textura esponjosa/rugosa, El ovario izquierdo se presentaba normal, Patologías de la reproducción en bovinos de la raza Maronesa 7 http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040805es.pdf


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con folículos de pequeño tamaño. Fue diagnosticada la presencia de un presunto quiste luteínico. El diagnóstico definitivo fue efectuado 10 días más tarde, a través del examen ecográfico (Fig. 7), antes de la aplicación de cualquier tratamiento.

Figura 7. Sonograma del ovario derecho en plano sagital. Se observa un quiste cuya pared se encuentra impregnada con tejido luteínico (textura granular hipoecogénica) de espesura variable y con un diámetro mayor superior a 40 mm. Las barras laterales representan una distancia de 10 mm entre si.

Fue entonces administrado vía IM, un análogo sintético de la prostaglandina (25 mg de dinoprost), observándose señales de estro 3 días después del tratamiento. La vaca fue beneficiada en el siguiente celo y el diagnóstico positivo de gestación fue efectuado cerca de 60 días después de la monta. DISCUSIÓN La raza Maronesa no parece diferenciarse de otras razas bovinas de aptitud cárnica, en lo que se refiere a la evolución de alteraciones de la gestación y del tracto reproductivo, antes y después del tratamiento, como demuestran estos casos clínicos. Hidropesías Las hidropesías son caracterizadas, en bovinos, por la acumulación de grandes cantidades de fluido (hasta 200 litros) en la cavidad alantoide (hidralantoides) o en la cavidad amniótica (hidramnios). El hidralantoides ocurre en el 90% de las situaciones de hidropesía (1 en cada 7500 gestaciones; Sloss y Dufty, 1980) formándose en la fase final de la gestación con una evolución generalmente inferior a un mes. La extrema distensión de la pared uterina impide la palpación transrectal de los placentomas y del feto dificultando su detección. Esta situación puede originar por compresión, en estadio avanzado, dificultades de deglución y locomoción de las vacas o incluso rotura del tendón prepúbico. Patologías de la reproducción en bovinos de la raza Maronesa http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040805es.pdf

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La causa está relacionada con una disfunción placentaria, una vez que surge asociada a un menor número de placentomas y alteraciones de las vellosidades placentarias (Drost, 2007). También fue observada una mayor prevalencia en gestaciones ocurridas por transferencia de embriones fertilizados in vitro (Hasler y col., 1995). Las retenciones placentarias después de la inducción del parto y las metritis son complicaciones frecuentes. Los hidramnios se desenvuelven durante la segunda mitad de la gestación con una acumulación progresiva de fluidos viscosos y con presencia de meconio. La silueta de la vaca adquiere una conformación de pera. La causa está relacionada a alteraciones congénitas o genéticas fetales como disfagia y agenesia o disgenesia renal (Drost, 2007). Aunque el feto sea inviable, el pronóstico relativo a la fertilidad de la madre es favorable. Prolapsos vaginales Los prolapsos vaginales ocurren principalmente en las 2 últimas semanas de la gestación, cuando se inicia el relajamiento de las estructuras perivaginales. El aumento del contenido plasmático de estrógenos observados por esta altura, el alto número de partos, la excesiva deposición perineal de grasa, factores mecánicos (aumento de presión intraabdominal por los fetos grandes; declives de terrenos montañosos) y heredabilidad, son factores que predisponen a esta afección. Los prolapsos son clasificados en 4 grados (Hooper y col., 1999): primer grado – inversión de una pequeña porción de la pared vaginal solamente cuando la vaca se encuentra acostada; segundo grado – la protusión de la pared vaginal se mantiene igual cuando la vaca está de pie (el cérvix se mantiene sellado); tercer grado – ocurre inversión de la pared de la vagina y del cérvix (prolapso cervical) pudiendo estar afectada la vejiga y; cuarto grado – presencia de lesiones necróticas en la pared vaginal y cérvix expuestos. La inflamación y el edema ocurren debido a traumas de la mucosa y a la congestión venosa pasiva. El tratamiento pasa por la aplicación de suturas de retención. Generalmente son utilizadas la sutura de Bühner y suturas de colchonero en U horizontales (Simões y Quaresma, 2001) o incluso la aplicación de alfileres (sutura metálica) o varilla (método de Flessa) con cuidado de monitorizar eventuales infecciones locales y eliminar la sutura antes del parto, principalmente, si es previsible que ocurra en los días siguientes. Alternativamente, y en los casos donde persista el tenesmo, puede realizarse la corrección quirúrgica a través de cervicopexia (técnica de Patologías de la reproducción en bovinos de la raza Maronesa http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040805es.pdf

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Winkler) o vaginopexia (método de Minchev modificado) (Hooper y col., 1999). El pronóstico depende de la gravedad de las lesiones y fácilmente el prolapso puede presentarse en el parto posterior (Drost, 2007). Schistosoma reflexus El Schistosoma reflexus es un desorden congénito raro y fatal que ocurre principalmente en rumiantes, caracterizado primariamente por inversión de la columna vertebral, eventración de las vísceras debido a la fisura abdominal y anquilosis de los miembros (Laughton y col., 2005). Encontramos descritos en la literatura, relatos de la ocurrencia de esta malformación en bovinos (Khan y col., 2005), porcinos (Reyes Avila y col., 2006), caprinos (Bedford, 1967), ovinos (Dennis and Meyer, 1965), dromedarios (Elias, 1991), asninos y equinos (Dubbin y col., 1990), y también en gatos (Kawata y Tiba, 1961). Aunque de etiología desconocida, su origen genético ha sido sugerido (Laughton y col., 2005). La cesárea es una de las formas más frecuentes de resolver este tipo de distocia fetal, siendo la fetotomia una alternativa viable (Herr, 1979), principalmente cuando existe facilidad de la eliminación previa de las vísceras, como son los casos de presentación visceral. Degeneración quística del ovario La degeneración quística de los ovarios, o quistes ováricos, es caracterizada por la aparición de folículos anovulatorios con más de 25 mm, generalmente con ausencia de cuerpo lúteo, y con persistencia superior a los 10 días (Gaverick, 1997). Pueden desaparecer espontáneamente y son considerados patológicos cuando aumentan el intervalo entre partos (López-Gatius y col., 2002). Su luteinización puede ocurrir (quistes luteínicos) o no (quistes foliculares), originando un comportamiento de anestro patológico o de ninfomanía, respectivamente. Uno de los modelos más aceptados para justificar su aparición, es la disminución de la sensibilidad del hipotálamo al estradiol, debido a bajos niveles de progesterona, originando un crecimiento prolongado del folículo dominante con dimensiones superiores a 25 mm (Wiltbank y col., 2002). En un estudio realizado en explotaciones de bovinos lecheros de raza Holstein-Frisona en el interior norte de Portugal, se observó que la degeneración quística de los ovarios correspondía al 30% (1/4 fueron quistes luteínicos) de 102 afecciones reproductivas diagnosticadas en el Patologías de la reproducción en bovinos de la raza Maronesa 10 http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040805es.pdf


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post-parto, en un universo de 682 animales examinados y que, después del tratamiento adecuado, el diagnóstico de gestación fue positivo en más del 90% de los casos (Santos y col., 2007). Sería interesante estudiar la incidencia de esta patología en la raza Maronesa, porque es sabido que está relacionada con los niveles de producción lechera (Crane y col., 2006b). Los tratamientos clásicos con prostaglandinas para provocar la luteolisis de la pared de los quistes luteínicos espontáneos o por un protocolo constituido por administración de GnRH, o su análogo sintético, para promover la luteinización de la pared seguido de prostagandina 12 días después, en los casos de quistes foliculares, son tratamientos efectivos. También el uso de progestágenos (PRID; CIDR) durante 10 - 12 días es una alternativa eficaz, principalmente en los tratamientos de quistes foliculares (Arthur, 1996; Crane y col., 2006a). CONCLUSIÓN Fueron descritas algunas alteraciones reproductivas con importancia en la fertilidad individual del ganado de carne Maronés. Su baja incidencia, en ésta como en otras razas, asociada a una etiopatogenia mal esclarecida puede ocasionar algunas dificultades para su abordaje clínico por los veterinarios asistentes de las explotaciones. Una investigación más profunda para determinar las causas de estas afecciones podría contribuir para mejorar su diagnóstico, tratamiento, pronóstico y, sobretodo, su prevención. El tratamiento adecuado, cuando es hecho a tiempo, no pone en riesgo la fertilidad de las hembras, pero se traduce siempre en un alargamiento del ciclo reproductivo que, asociado al coste de los tratamientos, constituye una pérdida económica significativa para el criador. AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen a los alumnos de veterinaria del programa Erasmus por revisar la lingüística española del presente trabajo.

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Patologias da reprodução em bovinos da raça Maronesa (Reproductive diseases in Maronesa cattle) Simões, João: CECAV/HVUTAD/DCV, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Apartado 5000-801, Vila Real, Portugal, NickName: jsimoes | Mascarenhas, Ramiro: Estação Zootécnica Nacional - Instituto Nacional dos Recursos Biológicos, 2005-048 Vale de Santarém, Portugal | Teixeira, Fátima: Médica Veterinária em regime Liberal, 5370 Mirandela, Portugal | Santos, Cristiana: HVUTAD/DCV, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Apartado 5000-801, Vila Real, Portugal | Madureira, Mário: Sorgal - Soc. de Óleos e Rações, S.A.; Médico Veterinário em regime Liberal, 5000 Vila Real, Portugal. Autor a quem dirigir a correspondência: João Simões. Email: jsimoes@utad.pt

RECVET: 2008, Vol. III, Nº 4 Recibido 22.01.08 / Referencia provisional R030907 / Referencia definitiva 040805po_RECVET / Aceptado: 15.03.08 / Publicado: 01.04.08 Este artículo está disponible en http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408.html concretamente http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040805po.pdf Revista Electrónica de Clínica Veterinaria RECVET® está editada por Veterinaria Organización® Se autoriza la difusión y reenvío siempre que enlace con Veterinaria.org® http://www.veterinaria.org y con RECVET®-http://www.veterinaria.org/revistas/recvet

Resumo A raça bovina Maronesa é uma raça autóctone, de aptidão carne, explorada no interior norte de Portugal, com um efectivo adulto de pequena dimensão. Foram descritos e ilustrados 5 casos clínicos de distintas patologias, algumas das quais raras, que afectaram a fertilidade individual e/ou a gestação de fêmeas desta raça e cujas causas não estão completamente esclarecidas: Hidroalantóide, prolapso vaginal de 3º grau, distócia por Schistosoma reflexus e degenerescência quística do ovário (quistos foliculares e luteínicos). Um melhor conhecimento da etiopatogenia destas patologias é fundamental para a sua abordagem clínica e prevenção, nesta e noutras raças de bovinos. Palavras Chave: Raças autóctones | Bovinos | Maronesa | Reprodução | Patologias | Hidroalantóide | Prolapso vaginal | Schistosoma reflexus | Degenerescência quística do ovário

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Abstract Maronesa cattle are a Portuguese indigenous beef breed. This small population is located in mountain regions of north-west Portugal. Five clinical cases of distinct reproductive pathologies with unclear etiology, affecting the individual fertility and/or gestation of females, were reported in this breed. Some of these illustrated diseases are rare. Hydrallantois, vaginal prolapse (3rd degree), fetal dystocia due to Schistosoma reflexus and cystic ovarian disease (Follicular and luteinised ovarian cysts) were described. A deep knowledge of etiopathogeny is necessary to provide a more precise clinical approach and prevention of these diseases. Keywords: Local breeds | Cattle | Maronesa | Reproduction | Pathologies | Hydrallantois | vaginal prolapse | Schistosoma reflexus | cystic ovarian disease

INTRODUÇÃO Os bovinos da raça Maronesa são explorados, principalmente por agricultores, no interior norte de Portugal. O seu solar situa-se nas regiões agrestes das serras do Marão, Alvão e Padrela, às quais se encontram adaptados. Esta raça autóctone Portuguesa, usada no passado como força de tracção, tem como principal finalidade a produção de vitelas com 7 a 8 meses (por altura do desmame) para abate com denominação de origem protegida (DOP). O sistema de produção depende das condições edafoclimáticas e regime de propriedade dos terrenos, embora se destaquem o regime de pastoreio, quando as condições ambientais o permitem, e o de semiestabulação, sem qualquer suplementação de alimento concentrado (ocasionalmente farinha de milho). Em 2003, encontravam-se inscritas no respectivo livro genealógico 5982 vacas adultas provenientes de 1931 produtores, representando um encabeçamento médio de 3,1 vacas por criador, embora com uma amplitude entre 1,1 e 7,0 (Alves e Teixeira, 2006), observando-se nos últimos anos o aparecimento de explorações de dimensões mais significativas, na ordem das dezenas de animais. Existe um esforço em apoiar esta raça, ameaçada de extinção, através de ajudas à produção e ainda da selecção genética criteriosa dos machos (Santos, 2006) associada a uma maior expansão da inseminação artificial. Patologias da reprodução em bovinos da raça Maronesa http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040805po.pdf

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A nível reprodutivo, as fêmeas desta raça (49,3% atingem o 10º parto) foram descritas por Alves e Teixeira (2006) como tendo uma idade ao 1º parto de 828 ± 114 dias, um índice de fertilidade de cerca de 86,6% e um intervalo entre partos de 384 ± 53 dias para o qual contribui um intervalo parto-concepção de 101 ± 32 dias influenciado por um anestro de lactação de 92 ± 30 dias. Estes autores referem, ainda, que as vacas Maronesas apresentam uma elevada facilidade de parto devido ao registo de baixa percentagem (5,3%) de partos assistidos. De facto, não abundam na literatura descrições de alterações reprodutivas nesta raça de aptidão de carne. No entanto, tem sido por nós observadas distintas patologias desta índole, algumas da quais consideradas raras mesmo em bovinos de outras raças, com ocorrência em diferentes fases do ciclo reprodutivo. Este trabalho teve como objectivo a descrição de 4 patologias distintas, de origem reprodutiva e etiopatogenia não completamente esclarecida, com impacto na fertilidade individual e/ou na gestação de vacas da raça Maronesa. Uma delas corresponde a degenerescência quística do ovário (quistos foliculares e luteínicos) e as restantes a alterações da gestação (Hidroalantóide, prolapso vaginal de 3º grau e distócia por Schistosoma reflexus). DESCRIÇÃO DOS CASOS CLÍNICOS Os casos seleccionados foram por nós abordados no âmbito de clínica ambulatória, por solicitação de produtores de bovinos da raça Maronesa. Caso n.º 1 – Hidroalantóide Foi apresentada à consulta uma vaca multípara (3 partos), com 6 anos de idade, gestante de 8 meses. O principal motivo da consulta foi uma perda gradual de apetite durante o último mês e anorexia total nos 2 dias anteriores à chamada. Os donos observaram um abaulamento abdominal progressivo nos últimos 2 meses. Figura 1. Silhueta abdominal com abaulamento bilateral, em forma de tonel, característico de hidroalantóide em bovinos.

À inspecção, era evidente o abaulamento bilateral do abdómen (Fig. 1). As mucosas tinham coloração rosácea normal. A temperatura rectal era normal (38,2ºC) e Patologias da reprodução em bovinos da raça Maronesa http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040805po.pdf

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observou-se ausência de movimentos ruminais, uma frequência cardíaca de 96 bpm e ligeira dispneia. A palpação transrectal permitiu a identificação do útero gestante, ocupando parte significativa da cavidade abdominal. A parede do útero encontrava-se extremamente tensa dificultando a palpação dos placentomas. Pelo exame clínico, diagnosticou-se uma hidropisia (hidroalantóide). Como tratamento, foi efectuada uma cesariana com abordagem pela fossa paralombar esquerda após bloqueio paravertebral dos ramos ventrais e dorsais dos nervos localizados entre T13 e L3, com aplicação de aproximadamente 20 ml de lidocaína a 2% em cada nervo (técnica de Farquarson). Retirou-se, de forma progressiva, uma quantidade anormal de líquidos fetais (Fig. 2), principalmente da cavidade alantóide. Numa primeira instância, antes da incisão de cerca de 30 cm da parede uterina, tentou-se realizar uma descompressão lenta com um trocarter, de forma a prevenir uma eventual descompensação hidrodinâmica brusca conduzindo a um possível shock hipovolémico. Figura 2. Extracção de fluido límpido proveniente da cavidade alantóide.

Extraiu-se, do corno uterino direito, um feto morto com anasarca (Fig. 3). O feto apresentava edema subcutâneo generalizado (sinal de Godé positivo), assim como infiltração nos principais órgãos internos, embora sem outras alterações macroscópicas visíveis. A inexistência de sinais de mumificação, maceração ou enfisema fetal indiciou uma morte bastante recente.

Figura 3. Anasarca fet

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Para fechamento da parede uterina, utilizou-se uma sutura contínua invertida com fio reabsorvível (catgut nº 3). O peritoneu e músculos abdominais foram suturados em 3 camadas, através de uma sutura contínua simples (catgut nº 3), aplicando-se ocasionalmente um ponto de sutura ancorada, este último para garantir a tensão do fio e consequentemente a correcta aposição dos bordos musculares. Para evitar espaços vazios entre camadas, 2 ou 3 pontos ocasionais englobaram também uma porção muscular da camada anterior. Foi usada uma sutura contínua ancorada, com seda nº 2, na pele. De forma a evitar infecções, foi repartido cerca de 40 ml de associação antibiótica de penicilina (200.000 UI/ml) e estreptomicina (250 mg/ml) na cavidade intrauterina e intrabdominal antes do respectivo fechamento. A terapia pós-operatória consistiu na administração de 25 ml (IM, SID) de associação antibiótica de penicilina e estreptomicina e 10 ml (IM, SID) de um analgésico não esteróide (flunixim meglumine a 50 mg/ml), durante 5 dias. Observou-se uma rápida recuperação da vaca durante o período pósoperatório. Após 15 dias, o animal encontrava-se normal ao exame clínico. Caso n.º 2 – Prolapso vaginal de 3º grau Foi observada a presença de uma massa prolapsada na região perineal numa vaca primípara com idade superior a 3 anos. Esta fêmea encontrava-se em fase final de gestação, com parto previsto na semana seguinte. Figura 4. Prolapso cervical (prolapso vaginal de 3º grau). As pregas cervicais exteriores encontram-se bem evidentes junto à comissura vulvar dorsal. Observam-se algumas ulcerações da mucosa, provocadas por traumatismos da parede vaginal exposta.

Após limpeza e anti-sepsia com solução de iodopolividona, identificou-se a parede vaginal invertida. Não se observaram, à inspecção e palpação, lesões traumáticas significativas da mucosa. O orifício da cérvix foi observado junto à comissura vulvar dorsal (Fig. 4), confirmando-se o diagnóstico de prolapso vaginal de 3º grau (prolapso cervical). Não foi observado o tampão mucoso, provavelmente devido à sua dissolução ou perda. Patologias da reprodução em bovinos da raça Maronesa http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040805po.pdf

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O tratamento consistiu na redução manual da massa prolapsada, sob anestesia epidural baixa (caudal) por administração no espaço epidural, entre Co1 e Co2, de 8 ml de lidocaína a 2%. A potencial recidiva foi prevenida pela aplicação de 4 alfinetes obstétricos na base do esfíncter vulvar. Efectuou-se a antibioterapia com 25 ml (IM, SID) de amoxicilina (150 mg/ml), durante 5 dias, de forma a prevenir eventuais complicações, como a septicemia e infecção intra-uterina, conduzindo à morte fetal, devido ao desaparecimento do tampão mucoso. Foram dadas instruções ao proprietário do animal para retirar os alfinetes um dia antes da data prevista para o parto. A vaca pariu normalmente, sem assistência, com a expulsão de um feto viável e sem ocorrência de retenção placentária. Não foi observada qualquer recidiva do prolapso vaginal e o animal voltou a reproduzir-se normalmente. Caso n.º 3 – Distócia de origem fetal por monstro celosomiano Uma vaca multípara, com idade superior a 7 anos, encontrava-se com dificuldades do seu 5º parto, havia mais de 12 horas. Após palpação vaginal, foi exteriorizada parte das vísceras fetais de um monstro simples (celosomiano) Identificando-se uma distócia de origem fetal, por apresentação visceral de um Schistosoma reflexus (Fig. 5). A classificação deste monstro foi efectuada por reconstituição das partes retiradas por fetotomia. Figura 5. Vísceras de um Schistosoma reflexus, as quais se encontravam no canal do parto, antes da sua exteriorização manual.

Após anestesia epidural baixa (10 ml de lidocaína 2%), procedeu-se à remoção das vísceras fetais. Através de fetotomia percutânea das extremidades e do abdómen, retirou-se, por partes, a totalidade do feto. Foi administrada 25 ml (IM, SID) de associação de penicilina (200.000 UI/ml) e estreptomicina (250 mg/ml) e 10 ml (IM, SID) de flunixim meglumine (50 mg/ml) durante 4 dias. Patologias da reprodução em bovinos da raça Maronesa http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040805po.pdf

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Não se verificou qualquer sequela visível nos dias imediatos à resolução do parto distócico. Casos n.º 4 e n.º 5 – Degenerescência quística do ovário No 1º caso, uma vaca multípara com 15 anos de idade e 4 meses após o último parto apresentava, como motivo de consulta, sinais de ninfomania, com vocalização e temperamento mais agressivo que o normal. Por palpação transrectal foi-lhe detectado um quisto no ovário direito e 2 no esquerdo e elaborou-se um diagnóstico presuntivo de quistos foliculares. Foi efectuado um exame ecográfico 10 dias após a 1ª palpação de forma a estabelecer o diagnóstico definitivo (Fig.6).

Figura 6. Dois sonogramas obtidos a partir de cada ovário com pelo menos um quisto folicular. Não se observa a presença de tecido luteínico nas paredes dos quistos. As barras laterais representam a distância de 10 mm entre si.

Foi, então, efectuado um tratamento único com 20 µg de acetato de burselina (GnRH) seguido, 10 dias mais tarde, da aplicação de 500 µg de cloprostenol, ambos por via intramuscular. O comportamento da vaca, incluindo o seu temperamento, alterou-se 4 dias após a administração de burselina, sendo observado um cio 3 dias após a administração da prostaglandina. O animal foi beneficiado no cio seguinte e, 60 dias mais tarde, foi efectuado um diagnóstico de gestação positivo, por palpação transrectal. No 2º caso, foi observada uma vaca com 8 partos (13 anos de idade), cujo motivo da consulta foi a ausência de cios desde o último parto normal, ocorrido havia cerca de 3 meses. Por palpação transrectal, identificou-se o ovário direito de conformação oval com mais de 50 mm do eixo maior e do qual sobressaía uma estrutura de grande dimensão, superior a 25 mm, com superfície esponjosa/rugosa. O ovário esquerdo apresentava-se normal, com folículos de pequeno tamanho. Foi diagnosticada a presumível presença de um quisto luteínico. O diagnóstico definitivo foi efectuado 10 dias mais tarde, através de exame ecográfico (Fig. 7), antes da aplicação de qualquer tratamento. Patologias da reprodução em bovinos da raça Maronesa http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040805po.pdf

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Figura 7. Sonograma do ovário direito em plano sagital. Observa-se um quisto cuja parede se encontra impregnada com tecido luteínico (textura granular hipoecogénica) de espessura variável e com o diâmetro maior superior a 40 mm. As barras laterais representam a distância de 10 mm entre si.

Foi então administrado (IM) um análogo sintético da prostanglandina (25 mg de dinoprost), observando-se sinais de estro 3 dias após o tratamento. A vaca foi beneficiada no cio seguinte e o diagnóstico positivo de gestação foi efectuado cerca de 60 dias após a monta. DISCUSSÃO A raça Maronesa não parece diferir de outras raças bovinas com aptidão carne, no que se refere à ocorrência e evolução de alterações da gestação e do tracto reprodutivo, antes e após tratamento, como demonstraram estes casos clínicos. Hidropisias As hidropisias são caracterizadas, em bovinos, pela acumulação de grandes quantidades de fluido (até 200 litros) na cavidade alantóide (hidroalantóide) ou na cavidade amniótica (hidroamnios), O hidroalantóide ocorre em 90% das situações de hidropisia (1 em cada 7500 gestações; Sloss and Dufty, 1980) formando-se em fase final da gestação com uma evolução geralmente inferior a 1 mês. A extrema distensão da parede uterina impede a palpação dos placentomas e do feto dificultando a sua detecção. Esta situação pode originar, por compressão, em estádio avançado, dificuldades de deglutição e locomoção das vacas ou mesmo ruptura do tendão pré-púbico. A causa está associada a uma disfunção placentária, uma vez que surge associada a um menor número de placentomas e a alterações das vilosidades placentárias (Drost, 2007). Também foi observada uma maior prevalência em gestações ocorridas por transferência de embriões fertilizados in vitro (Hasler et al., 1995). Patologias da reprodução em bovinos da raça Maronesa http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040805po.pdf

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As retenções placentárias após indução do parto e as metrites são complicações frequentes. Já o hidroâmnios desenvolve-se durante a 2ª metade de gestação com uma acumulação progressiva de fluidos viscosos e com presença de mecônio. A silhueta da vaca adquire uma conformação em pêra. A causa está associada a alterações congénitas ou genéticas fetais tais como disfagia e agenesia ou disgenesia renal (Drost, 2007). Embora o feto seja inviável, o prognóstico futuro da fertilidade da mãe é favorável. Prolapsos vaginais Os prolapsos vaginais ocorrem principalmente nas últimas 2 semanas de gestação, quando se inicia o relaxamento das estruturas perivaginais. O aumento do teor plasmático de estrogénios observados por esta altura, o maior número de partos, a excessiva deposição perineal de gordura, factores mecânicos (aumento de pressão intra-abdominal por fetos grandes; declives de terreno montanhoso) e heritabilidade são factores que predispõem a esta afecção. Os prolapsos são classificados em 4 graus (Hooper et al., 1999): 1º grau inversão de uma pequena porção da parede vaginal somente quando a vaca se encontra deitada; 2º grau- a protusão da parede vaginal mantémse mesmo quando a vaca está em pé (a cérvix mantém-se selada); 3º grau- ocorre inversão da parede da vagina e da cérvix (prolapso cervical) podendo estar envolvida a bexiga e; 4º grau- presença de lesões necróticas na parede vaginal e cérvix expostas. A inflamação e o edema ocorrem devido a traumas da mucosa e a congestão venosa passiva. O tratamento passa geralmente pela aplicação de suturas de retenção. Geralmente são utilizadas a sutura de Bühner e suturas de colchoeiro em U horizontais (Simões e Quaresma, 2001) ou ainda a aplicação de alfinetes ou pinos (método de Flessa) com o cuidado de monitorizar eventuais infecções locais e de remover a sutura antes do parto, principalmente se a sua ocorrência é previsível nos dias seguintes. Em alternativa, e nos casos onde persista o tenesmo pode realizar-se a correcção cirúrgica através de cervicopéxia (técnica de Winkler) ou vaginopéxia (método de Minchev modificado) (Hooper et al., 1999). O prognóstico depende da gravidade das lesões e facilmente o prolapso pode recorrer em parto posterior (Drost, 2007). Schistosoma reflexus O Schistosoma reflexus é uma desordem congénita rara e fatal, com ocorrência principalmente em ruminantes, caracterizada primariamente Patologias da reprodução em bovinos da raça Maronesa 9 http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040805po.pdf


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por inversão da coluna vertebral, eventração das vísceras devido a fissura abdominal e anquiloses dos membros (Laughton et al., 2005). Encontrámos descritos na literatura relatos da ocorrência desta malformação em bovinos (Khan et al., 2005), suínos (Reyes Avila et al., 2006), caprinos (Bedford, 1967), ovinos (Dennis and Meyer, 1965) dromedários (Elias, 1991), asininos e equinos (Dubbin et al., 1990) e mesmo em gatos (Kawata and Tiba, 1961). Embora de etiologia desconhecida, a sua origem genética tem sido sugerida (Laughton et al., 2005). A cesariana é uma das formas mais frequentes de resolver este tipo de distócia fetal, se bem que a fetotomia é uma alternativa viável (Herr, 1979), principalmente quando existe facilidade da prévia remoção das vísceras, como são os casos de apresentação visceral. Degenerescência quística dos ovários A degenerescência quística dos ovários, ou quistos ováricos, é caracterizada pelo aparecimento de folículos anovulatórios com mais de 25 mm, geralmente na ausência de corpo lúteo, e com persistência para além dos 10 dias (Gaverick, 1997). Podem desaparecer espontaneamente e são considerados patológicos quando aumentam o intervalo entre partos (López-Gatius et al., 2002). A sua luteinização pode ocorrer (quistos luteínicos) ou não (quistos folículares), originando um comportamento de anestro patológico ou de ninfomania, respectivamente. Um dos modelos mais aceites para justificar o seu aparecimento, é a diminuição da sensibilidade do hipotálamo ao estradiol devido a baixos níveis de progesterona originando a ausência do pico pré-ovulatório de LH e consequentemente um crescimento prolongado do folículo dominante com dimensões superior a 25 mm (Wiltbank et al., 2002). Num estudo realizado em explorações de bovinos leiteiras da raça HolteinFrisian, no interior norte de Portugal, observou-se que a degenerescência quística dos ovários correspondia a 30% (1/4 foram quistos luteínicos) de 102 afecções reprodutivas diagnosticadas no pós-parto, num universo de 682 animais examinados e que, após tratamento adequado, o diagnóstico de gestação foi positivo em mais de 90% dos casos (Santos et al., 2007). Seria interessante estudar a incidência desta patologia na raça Maronesa, até porque é sabido que está relacionada com os níveis de produção leiteira (Crane et al., 2006b). Os tratamentos clássicos com prostaglandinas de forma a provocar a luteólise da parede de quistos luteínicos de forma natural ou por um protocolo constituído por administração de GnRH, ou seu análogo Patologias da reprodução em bovinos da raça Maronesa 10 http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040805po.pdf


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sintético, de forma a promover a luteinização da parede e de prostaglandina após 12 dias em quistos foliculares são tratamentos efectivos Também o uso de progestagénios (PRID, CIDR) durante 10 a 12 dias é uma alternativa eficaz, principalmente nos tratamentos de quistos foliculares (Arthur et al., 1996; Crane et al., 2006a). CONCLUSÃO Foram descritas algumas alterações reprodutivas com impacto na fertilidade individual no gado de carne Maronês. A sua baixa incidência, nesta como noutras raças, associada a uma etiopatogenia mal esclarecida pode ocasionar algumas dificuldades à sua abordagem clínica pelos veterinários assistentes das explorações. Uma investigação mais aprofundada para determinar as causas destas afecções, poderia contribuir para melhorar seu diagnóstico, tratamento, prognóstico e, sobretudo, a sua prevenção. O tratamento adequado, quando feito atempadamente, não põe em risco a fertilidade das fêmeas, mas traduz-se sempre num alongamento do ciclo reprodutivo que, associado ao custo dos tratamentos, constitui uma perda económica significativa para o criador. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Alves V, Teixeira P. Raça Bovina Maronesa. Voz da Terra (Coimbra). 2006; 46: 11-20. 2. Arthur GH, Noakes DE, Pearson H, Parkinson TJ. Veterinary reproduction and obstetrics. 7th ed. London: Saunders; 1996. 3. Bedford PGC. Schistosoma reflexus in a goat: a case report. Vet Rec. 1967: 80: 326. 4. Crane MB, Bartolome J, Melendez P, de Vries A, Risco C, Archbald LF. Comparison of synchronization of ovulation with timed insemination and exogenous progesterone as therapeutic strategies for ovarian cysts in lactating dairy cows. Theriogenology. 2006a; 65:1563-1574. 5. Crane MB, Melendez P, Bartolome J, de Vries A, Risco C, Archbald LF. Association between milk production and treatment response of ovarian cysts in lactating dairy cows using the Ovsynch protocol. Theriogenology. 2006b; 66:1243-1248. 6. Dennis SM, Meyer EP. Schistosomus reflexus in a sheep. Vet Rec. 1965; 77: 1386-1387. 7. Drost M. Complications during gestation in the cow. Theriogenology. 2007; 68: 487–491. 8. Dubbin ES, Welker FH, Veit HP, Modransky PD, Talley MR. Dystocia attributable to a fetal monster resembling Schistosomus reflexus in a donkey. J Am Vet Med Assoc. 1990; 197: 605-607. Patologias da reprodução em bovinos da raça Maronesa 11 http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n040408/040805po.pdf


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