a product message image
{' '} {' '}
Limited time offer
SAVE % on your upgrade
32 minute read

REFERATE GENERALE

Metode de laborator pentru caracterizarea fizico-chimică a alergenelor recombinate ca standarde de referință

Laboratory Methods for the Physico-Chemical Characterization of Recombinant Allergens as Reference Standards

Mariana Vieru 1 , Florin-Dan Popescu 1 , Laura Haidar 2,3 , Carmen Panaitescu 2,3 1. Disciplina de Alergologie Spitalul Clinic “Nicolae Malaxa”, Universitatea de Medicină și Farmacie „Carol Davila” București, 2. UMF "Victor Babeș" Timișoara, Departamentul III Științe Funcționale, Disciplina de Fiziologie, 3. Centrul de terapii genice și celulare în tratamentul cancerului OncoGen – SCJUPB Timișoara

Autor corespondent: Mariana Vieru, e-mail: mariana.vieru@umfcd.ro

ABSTRACT REZUMAT

The methods used to quantify the physico-chemical parameters of molecular allergens are multiple. The physico-chemical parameters selected for the evaluation of the quality of natural purified and recombinant allergens include the identity of the primary structure, the secondary structure, the purity and homogeneity. However, there is no single method that can analyze all the important characteristics represented by structural, physico-chemical, immunological properties. Keywords: molecular allergens, physico-chemical characteristics, laboratory methods Metodele utilizate pentru cuantificarea parametrilor fizicochimici ai alergenelor moleculare sunt multiple. Parametrii fizico-chimici selectați pentru evaluarea calității alergenelor naturale purificate și recombinate includ identitatea structurii primare, structura secundară, puritatea și omogenitatea. Nu există însă o unică metodă care să poată analiza toate caracteristicile importante reprezentate de proprietăți structurale, fizico-chimice, imunologice. Cuvinte-cheie: alergene moleculare, caracteristici fizico-chimice, metode de laborator

Caracterizarea riguroasă prin metode chimice, fizico-chimice și biologice a produselor bioterapeutice produse prin tehnologia ADN recombinat este esențială, conform recomandărilor Organizației Mondiale a Sănătății (World Health Organization, WHO). Metodele proteomice, biochimice și imunochimice de caracterizare a alergenelor recombinate efectuate în faza de dezvolt a re deter m i nă propr iet ăț i le f izico-ch i m ice, imunochimice, activitatea biologică, puritatea și confirmă calitatea produselor alergenice. Stabilirea unor standarde de referință bine caracterizate bazate pe alergene recombinate și metode de analiză de laborator validate pentru cuantificarea alergenelor moleculare sunt obiective semnificative ale Programului de standardizare biologică al Direcției Europene pentru Calitatea Medicamentelor și a Sănătății (European Directorate for the Quality of Medicines, EDQM) (1-5) . Metodele utilizate pentru cuantificarea parametrilor fizico-chimici ai produselor alergenice sunt multiple (6-9) . Conform unui proiect important finanțat de Uniunea Europeană, denumit CREATE (Development of Certified Reference Materials for Allergenic Products and Validation of Methods for their Quantification), parametrii fizico-chimici selectați pentru evaluarea calității alergenelor naturale purificate și recombinate includ identitatea structurii primare, structura secundară, puritatea și omogenitatea, iar metodele de laborator pentru caracterizarea fizico-chimică a alergenelor recombinate, inclusiv ca standarde de referință (pentru Bet v 1.0101 și Phl p 5.0109), au fost publicate detaliat și le vom menționa în continuare (3-5,10-12) . Nu există însă o metodă unică care să poată analiza toate caracteristicile importante reprezentate de proprietăți structurale, fizico-chimice, imunologice (13,14) .

Metode de laborator utilizate pentru a caracteriza identitatea, cantitatea și structura

Alergenele trebuie să prezinte compoziție și secvențe de aminoacizi în acord cu secvențele primare cunoscute (publicate). Investigarea identității proteice pentru alergenele moleculare recombinate se face prin metode bazate pe spectrometrie de masă și analiza aminoacizilor. Analiza greutății moleculare intacte a unei proteine se face prin spectrometrie de masă (mass spectrometry, MS).

Spectrometria de masă de înaltă rezoluție (high-resolution mass spectrometry, HRMS) este utilizată pentru măsurarea intactă a masei pe diferite platforme care utilizează tehnica cuadrupolului, a trapei orbitale și a trapei ionice. Secvențierea peptidelor (peptide mapping) produse prin digestia enzimatică proteolitică se realizează prin cromatografie nanolichidă cu detecție prin spectrometrie de masă în tandem (nanoscale liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry, NanoLC-MS/MS) ca tehnică principală pentru confirmarea structurii primare proteice (secvența de aminoacizi).

Evaluarea cantitativă proteică este cuantificată prin analiza aminoacizilor (amino acid analysis, AAA). Trebuie să existe o corelație excelentă între compoziția (identitatea) aminoacizilor teoretică și cea observată experimental. Metodele de analiză a aminoacizilor includ hidroliza convențională și derivatizare pre-coloană cu fenilizotiocianat (PITC) și separare prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) sau cu o-ftalaldehidă(OPA) și HPLC în fază inversă (RP-HPLC). Spectroscopia de dicroism circular (circular dichroism, CD) este frecvent utilizată pentru a analiza structura secundară (regiunea spectrală UV îndepărtată). Spectrometrele dedicate măsurării fenomenului de dicroism circular sunt denumite spectropolarimetre. Alergenele recombinate trebuie să aibă structura proteică pliată corespunzător. Dicroismul circular al moleculelor candidate trebuie să prezinte caracteristici spectrale tipice unei proteine pliate cu amplitudini de vârf similare spectrelor de referință. Această metodă nu numai că furnizează informații pur structurale despre alergene, dar poate permite predicții despre activitatea alergenică.

Difractometria cu raze X la unghiuri mici (small-angle X-ray scattering, SAXS) poate furniza de asemenea informații utile, deoarece proteinele denaturate pot prezenta alterarea funcției de distribuție a distanței pentru perechi (pair distance distribution function, PDDF).

Metode de laborator utilizate pentru a caracteriza omogenitatea

Alergenele recombinate trebuie să fie omogene în ceea ce privește greutatea moleculară și să fie comparabile cu omologii lor naturali. Electroforeza în gel de poliacrilamidă cu dodecilsulfat de sodiu (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) sau electroforeza cu focalizare izoelectrică (isoelectric focusing, IEF), cu colorare cu albastru briliant de Coomassie (Coomassie staining), acid periodic Schiff (PAS) sau nitrat de argint (silver staining) separă alergenele moleculare recombinate în cantități de ordinul microgramelor, iar identitatea benzilor vizibile de proteine poate fi relevată prin metodă imunoblotting cu utilizarea de anticorpi monoclonali specifici alergenelor recombinate și eșantion de seruri de la pacienți alergici. Modificările posttranslaționale, de agregare sau degradare pot produce benzi suplimentare.

Metoda care este folosită în mod obișnuit pentru a evalua omogenitatea este cromatografia de filtrare în gel. Pentru proteinele monomerice, eșantionul trebuie să conțină un vârf (peak) unic de greutate moleculară preconizată. Cromatografia lichidă de înaltă performanță (high-performance liquid chromatography, HPLC) de tip gel-filtrare sau cromatografie de excluziune sterică (size-exclusion chromatography, SEC) este utilizată pentru a evalua omogenitatea în soluție, putând fi detectate forme oligomerice sau monomerice, agregate și produse de degradare. Cromatograma de excludere moleculară monitorizată prin semnal de dispersie a luminii în unghi drept (right-angle light scattering, RALS) este extrem de sensibilă pentru agregatele cu greutate moleculară mare. Greutatea moleculară (kDa) și raza hidrodinamică (nm) pot fi determinate prin combinarea RALS cu indicele de refracție și semnalul de viscozitate. Este posibil să se determine dacă alergenul recombinat constă din > 99,9% molecule monomerice omogene.

Microscopia electronică cu tehnică de colorare negativă (negative staining) poate fi utilizată pentru evidențierea prezenței agregatelor de dimensiuni diferite. Difractometria cu raze X la unghiuri mici (small-angle X-ray scattering, SAXS) oferă informații despre statusul agregării moleculelor proteice în soluție. Modificările posttranslaționale și chimice rezultate din procesul de producție prin tehnica de recombinare pot fi detectate și cuantificate prin spectrometria de masă pentru eterogenitate.

Comportamentul de agregare și stabilitatea în soluție sunt investigate prin metoda de dispersie dinamică a luminii (dynamic light scattering, DLS), care evaluează agregatele cu greutate moleculară mai mare și polidispersitatea. În plus, poate detecta modificări ale razei hidrodinamice după mai multe săptămâni de depozitare.

În studiile de stabilitate conformațională a fost adăugată și spectroscopia în infraroșu cu transformată Fourier (Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR).

Metode de laborator utilizate pentru a caracteriza puritatea

Preparatele alergenice trebuie să fie cel puțin 95% pure din punctul de vedere al conținutului proteic. Metoda de elecție pentru puritate este SDS-PAGE în combinație cu colorarea cu argint. Prin SDS-PAGE pot fi detectate proteinele contaminante cu greutate moleculară diferită. Analiza aminoacizilor oferă informații suplimentare despre puritate, deoarece contaminarea cu alte proteine poate modifica conținutul de aminoacizi individuali. Mai mult, la utilizarea MS sau SEC-HPLC, contaminarea cu proteine cu greutate moleculară diferită poate duce la vârfuri (peaks) suplimentare. Trebuie menționat și faptul că SEC-HPLC și alte metode cromatografice, precum cromatografia de imunoafinitate și cromatografia de afinitate cu ioni metalici imobilizați (immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC), sunt utilizate ca metode de purificare a alergenelor recombinate.

În afara metodelor precizate anterior pentru caracterizarea fizico-chimică a alergenelor recombinate,

merită menționate și metodele de caracterizare imunologică (3-5,8,14) . Metodele de caracterizare in vitro a activității biologice sunt reprezentate de testele de inhibare a legării IgE (IgE-binding inhibition), de tip inhibiția RAST (radioallergosorbent test inhibition), inhibiția ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) și inhibiția ImmunoCAP FEIA (fluorescence enzyme immunoassay). Alte metode in vitro de cuantificare a reactivității imune sunt reactivitatea IgE prin analiză imunoblot tip dot-blot și testul de eliberare a histaminei din bazofile cu IgE înlăturate de pe suprafață cu acid lactic (stripped basophil histamine release assay). Integritatea și echivalența epitopilor recombinați cu componentele alergenice moleculare naturale purificate pot fi determinate prin testul de activare a bazofilelor (basophil activation test, BAT) cu cuantificarea expresiei markerului de suprafață CD203c și evaluarea reactivității limfocitelor T alergen-specifice prin teste de proliferare limfocitară cu încorporare de timidină tritiată și rezultate exprimate ca index de stimulare. În final, subliniem importanța datelor EDQM referitoare la caracterizarea și cuantificarea alergenelor recombinate și adoptarea de către Farmacopeea Europeană a metodelor și materialelor de referință pentru cuantificarea alergenelor (2-5,14,15) . De exemplu, rBet v 1.0101 și rPhl p 5.0109, produse în condiții de bună practică de fabricație (good manufacturing practice, GMP), sunt extrem de asemănătoare cu omologii lor naturali din punct de vedere fizico-chimic, structural și biologic, de aceea sunt considerate adecvate ca standarde de referință pentru Farmacopeea Europeană (4,5) . În afara stabilirii standardelor de referință prezentate, recent este discutată necesitatea validării metodelor ELISA de tip sandwich pentru cuantificarea alergenelor moleculare majore ca metodologie standard pentru Farmacopeea Europeană (16) . n

Acest articol a fost elaborat în cadrul proiectului INSPIRED (Strategii inovative pentru prevenția, diagnosticul și terapia afecțiunilor respiratorii induse de polenul de ambrozia) cod SMIS 103662.

Bibliografie

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

World Health Organization. WHO Expert Committee on Biological Standardization. World Health Organ Tech Rep Ser. 2014; (987):1-266 The European Parliament and Council. Directive 2001/83/EC on the community code relating to medicinal products for human use. Official Journal of the European Communities 2001; L331: 67-128. van Ree R, Chapman MD, Ferreira F, Vieths S, Bryan D, Cromwell O, Villalba M, Durham SR, Becker WM, Aalbers M, André C, Barber D, Cistero Bahima A, Custovic A, Didierlaurent A, Dolman C, Dorpema JW, Di Felice G, Eberhardt F, Fernandez Caldas E, Fernandez Rivas M, Fiebig H, Focke M, Fötisch K, Gadermaier G, Das RG, Gonzalez Mancebo E, Himly M, Kinaciyan T, Knulst AC, Kroon AM, Lepp U, Marco FM, Mari A, Moingeon P, Monsalve R, Neubauer A, Notten S, Ooievaar-de Heer P, Pauli G, Pini C, Purohit A, Quiralte J, Rak S, Raulf-Heimsoth M, San Miguel Moncin MM, Simpson B, Tsay A, Vailes L, Wallner M, Weber B. The CREATE project: development of certified reference materials for allergenic products and validation of methods for their quantification. Allergy. 2008; 63(3): 310-326. Himly M, Nony E, Chabre H, Van Overtvelt L, Neubauer A, van Ree R, Buchheit KH, Vieths S, Moingeon P, Ferreira F. Standardization of allergen products: 1. Detailed characterization of GMP-produced recombinant Bet v 1.0101 as biological reference preparation. Allergy. 2009; 64(7): 1038-45. Himly M, Nandy A, Kahlert H, Thilker M, Steiner M, Briza P, Neubauer A, Klysner S, van Ree R, Buchheit KH, Vieths S, Ferreira F. Standardization of allergen products: 2. Detailed characterization of GMP-produced recombinant Phl p 5.0109 as European Pharmacopoeia reference standard. Allergy. 2016; 71(4): 495-504. WHO Position Paper. Allergen immunotherapy: therapeutic vaccines for allergic diseases. Geneva: January 27-29 1997. Allergy. 1998; 53(44 Suppl): 1-42. Becker WM, Vogel L, Vieths S. Standardization of allergen extracts for immunotherapy. Where do we stand? Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2006; 6(6): 470-475. Popescu FD, Vieru M, Popescu F. Standardizarea preparatelor alergenice pentru imunoterapia sublinguală în alergia la polen de graminee. Journal of Romanian Society of Allergology and Clinical Immunology. 2014; 11(3): 86-91. Schmidt H, Gelhaus C, Nebendahl M, Janssen O, Petersen A. Characterization of Phleum pratense pollen extracts by 2-D DIGE and allergen immunoreactivity. Proteomics. 2010; 10(24): 4352-4362. 10. Asam C, Roulias A, Parigiani MA, Haab A, Wallner M, Wolf M, Briza P, Bohle B, Ferreira F, Hauser M. Harmonization of the genetic code effectively enhances the recombinant production of the major birch pollen allergen Bet v 1. Int Arch Allergy Immunol. 2018; 177(2): 116-122. 11. Najafi N, Hofer G, Gattinger P, Smiljkovic D, Blatt K, Selb R, Stoecklinger A, Keller W, Valent P, Niederberger V, Thalhamer J, Valenta R, Flicker S. Fusion proteins consisting of Bet v 1 and Phl p 5 form IgE-reactive aggregates with reduced allergenic activity. Sci Rep. 2019; 9(1):4006. 12. Valenta R, Kraft D. Recombinant allergens: from production and characterization to diagnosis, treatment, and prevention of allergy. Methods. 2004; 32(3): 207-8. 13. Valenta R, Karaulov A, Niederberger V, Zhernov Y, Elisyutina O, Campana R, FockeTejkl M, Curin M, Namazova-Baranova L, Wang JY, Pawankar R, Khaitov M. Allergen extracts for in vivo diagnosis and treatment of allergy: is there a future ?  J Allergy Clin Immunol Pract. 2018; 6(6): 1845-1855. 14. Kaul S, Zimmer J, Dehus O, Costanzo A, Daas A, Buchheit KH, Asturias JA, Barber D, Carnés J, Chapman M, Dayan-Kenigsberg J, Döring S, Führer F, Hanschmann KM, Holzhauser T, Ledesma A, Moingeon P, Nony E, Pini C, Plunkett G, Reese G, Sandberg E, Sander I, Strecker D, Valerio C, van Ree R, Vieths S. Standardization of allergen products: 3. Validation of candidate European Pharmacopoeia standard methods for quantification of major birch allergen Bet v 1. Allergy. 2016; 71(10): 1414-24. 15. Bonini S. Regulatory aspects of allergen-specific immunotherapy: Europe sets the scene for a global approach. World Allergy Organ J. 2012; 5(10): 120-123. 16. Kaul S, Zimmer J, Dehus O, Constanzo A, Daas A, Buchheit KH, Asturias J, Arilla MC, Barber D, Bertocchi A, Brunetto B, Carnes JA, Chapman M, Chaudemanche G, Dayan-Kenigsberg J, Döring S, Führer F, Gallego MT, Iacovacci P, Hanschmann KM, Holzhauser T, Hrabina M, Ledesma A, Moingeon P, Nony E, Pini C, Plunkett G, Raulf M, Reese G, Sandberg E, Sander I, Smith B, Strecker D, Valerio C, van Ree R, Weber B, Vieths S. Validation of ELISA methods for quantification of the major birch allergen Bet v 1 (BSP090). Pharmeur Bio Sci Notes. 2017; 2017: 69-87.

Alergenele recombinate – metode de producere și utilitatea în diagnosticul molecular și în imunoterapia alergenică

Recombinant Allergens – Production Methods and Use in Molecular Diagnosis and Allergen Immunotherapy

Maria-Roxana Buzan 1,2 , Manuela Grijincu 1,2 , Lauriana-Eunice Zbîrcea 1,2 , Laura Haidar 1,2 , Carmen Panaitescu 1,2 , Kuan-Wei Chen 2 1. UMF „Victor Babeș”, Timișoara, Departmentul III Științe Funcționale, Disciplina Fiziologie 2. Centrul de terapii genice și celulare în tratamentul cancerului OncoGen – SCJUPB Timișoara

Autor corespondent: Maria-Roxana Buzan, e-mail: buzan.roxana@yahoo.com

ABSTRACT REZUMAT

Although allergen extracts show some disadvantages, they are widely used both for in vivo diagnosis and for allergen immunotherapy. One way to overcome allergen extracts’ limitations is to use recombinant allergens. Selection of an appropriate expression system is dependent on the characteristics and intended application of the recombinant protein. The prokaryotic expression system is suitable for allergens that do not require post-translational modifications, however, there are allergens that need to be expressed in eukaryotic cells in order to acquire their biological activity. The use of these recombinant proteins ensures an increased specificity and sensitivity of the diagnosis and safer and more effective immunotherapy. Keywords: recombinant allergens, prokaryotic expression system, eukaryotic expression system, molecular diagnosis, molecular allergen immunotherapy Extractele alergenice sunt folosite pe scară largă atât în diagnosticul in vivo, cât și în terapia bolilor alergice, deși prezintă multiple dezavantaje. O soluție pentru a evita limitările extractelor este utilizarea de alergene recombinate. Selecția unui sistem de expresie proteică depinde de caracteristicile și aplicațiile proteinei recombinate. Alergenele care nu necesită modificări posttranslaționale pot fi obținute într-un sistem de expresie de tip procariot, dar există și alergene care trebuie exprimate în celule eucariote pentru a-și putea dobândi activitatea biologică. Utilizarea clinică a acestor proteine recombinate duce la creșterea specificității și sensibilității diagnosticului și asigură o imunoterapie mai sigură și mai eficientă. Cuvinte-cheie: alergene recombinate, sistem de expresie proteică de tip procariot, sistem de expresie proteică de tip eucariot, diagnostic molecular, imunoterapia alergenică moleculară

Introducere

În prezent diagnosticul in vivo al alergiilor și imunoterapia alergenică se bazează în mare pe extracte alergenice obținute din surse naturale. Deși calitatea acestor extracte a crescut în ultimele decenii prin standardizarea procedurii de obținere, faptul că provin din surse naturale le face foarte eterogene, existând variații în ceea ce privește compoziția și cantitatea de molecule alergenice (1,2) . De asemenea, extractele pot fi contaminate cu alergene provenite din alte surse sau pot conține molecule bioactive care pot afecta stabilitatea acestora (enzime proteolitice care pot degrada alergenele) (3,4) . Tehnologiile de obținere a alergenelor recombinate pot fi folosite pentru a înlătura neajunsurile extractelor alergenice. În ultimele decenii a fost produsă o mare varietate de alergene recombinate similare ca structură, funcție și răspuns imun cu omoloagele lor naturale, provenite de la plante, mucegaiuri, acarieni, insecte și mamifere, folosind atât sisteme de expresie de tip procariot, cât și de tip eucariot (5,6) . Utilizarea clinică a acestor produse ajută la creșterea specificității și sensibilității diagnosticului (7) și asigură o imunoterapie mai sigură și mai eficientă (8) . Primul pas în producerea alergenelor recombinate îl reprezintă obținerea secvenței de nucleotide care codifică proteina de interes. Folosind ARN mesager (ARNm) izolat din sursa alergenică, se sintetizează prin reacția de polimerizare în lanț în timp real (RT-PCR) (9,10) ADN complementar (ADNc), care mai apoi este clonat într-un vector specific sistemului de expresie care urmează să fie folosit.

În funcție de complexitatea structurală și funcțională a alergenelor, se pot folosi două sisteme de expresie, de tip bacterian și de tip eucariot. Sistemul de tip bacterian este utilizat cu succes și costuri reduse în cazul proteinelor cu structură simplă, care nu necesită modificări posttranslaționale. Alergenele mai complexe din punct de vedere structural, cu glicozilări și punți disulfidice sunt produse în sisteme de expresie de tip eucariot. Un avantaj al acestui sistem este purificarea simplă, redusă la o singură procedură, cromatografia de afinitate (1) .

Tabelul 1

Caracteristicile diferitelor sisteme de expresie proteică. Prezentare educațională cu modificare după Fernandez et al. (1999) (12)

Caracteristici E. coli Drojdii Celule de insecte Celule de mamifere Creștere celulară rapidă (30 min) rapidă (90 min) lentă (18-24 h) lentă (24 h) Complexitatea mediului de creștere minimă minimă complexă complexă Costul mediului de creștere scăzut scăzut ridicat ridicat Nivelul de expresie ridicat scăzut - ridicat scăzut - ridicat scăzut - moderat Expresie extracelulară secreție în spațiul periplasmic secreție în mediu secreție în mediu secreție în mediu Modificări post-translaționale Împachetarea proteinelor necesită re-împachetare pot necesita reîmpachetare împachetare corespunzătoare împachetare corespunzătoare Glicozilare N-linkată fără bogată în manoză simplă, fără acid sialic complexă Glicozilare O-linkată nu da da da Fosforilare nu da da da Acetilare nu da da da Acilare nu da da da Gama-carboxilare nu nu nu da

Figura 1. Obținerea alergenelor recombinate în celulele de E. coli. Primul pas este reprezentat de clonarea secvenței de nucleotide în vectorul bacterian (plasmid), urmată de transformarea celulelor de E. coli competente. Acestea vor fi cultivate în mediu de cultură urmând să se inducă sinteza proteică. Vor urma pașii de izolare, purificare și analiză a purității alergenul obținut.

Acest articol analizează și compară diferite sisteme de expresie folosite pentru producerea alergenelor recombinate (tabelul 1), precum și utilizarea acestora în vederea îmbunătățirii diagnosticului și terapiei în bolile alergice.

Sistemul de expresie proteică de tip bacterian Escherichia coli este una dintre cele mai utilizate gazde bacteriene pentru producerea cu randament ridicat de proteine recombinate. E. coli este un sistem convenabil și versatil de obținere a unei cantități mari de alergen recombinat, datorită ratei rapide de creștere într-un mediu de cultură ieftin și ușor de preparat (figura 1). Cu toate acestea, este un sistem procariot căruia îi lipsește mecanismul celular responsabil de procesele și modificările posttranslaționale, dezavantajul major fiind reprezentat de eșecul unor proteine recombinate de a dobândi structura secundară nativă, activă biologic. Adesea, supraproducția de proteine străine în citoplasma E. coli determină o agregare a acestora, formând incluziuni celulare insolubile, care necesită solubilizare cu agenți chatropici puternici, urmată de o reîmpachetare graduală pentru a deveni active funcțional (13) . Un astfel de exemplu îl reprezintă alergenul major din chiparos, Cup a 1.02, care a fost exprimat în E. coli și a necesitat solubilizare și reîmpachetare pentru a redobândi forma reactivă IgE a alergenului (13) . Strategiile pentru creșterea calității și randamentului de producere a proteinelor recombinate în celule bacteriene s-au concentrat pe îmbunătățiri genetice, precum construirea unor vectori de expresie mai buni și prin eliminarea genelor codificatoare de proteaze din tulpinile bacteriene. De asemenea, au fost create tulpini bacteriene capabile să faciliteze formarea punților disulfidice. Alergenul Ara h 2, din alune, a fost produs prin expresia într-o tulpină de E. coli modificată, Origami (DE3), care conține în citoplasmă elemente oxidative care permit formarea punților disulfidice (14) .

Figura 2. Expresia alergenelor recombinate în celule de insecte. Etapele expresiei sunt scrise cu litere îngroșate, iar produșii obținuți după fiecare etapă, cu litere normale. Prezentare educațională cu modificare după https://biotop.boku.ac.at/ Projects/2015/Grabherr2015c. html (25)

Sistemul de expresie procariot continuă să fie prima alegere când vine vorba despre producerea de alergene recombinate, numeroase alergene fiind produse în acest sistem (de exemplu, Ara h 1 (15) , Bet v 1 (16) , Fel d 1 (17) , Cor a 1 (18) ).

Sistemul de expresie proteică de tip eucariot

Avantajul major al sistemelor de expresie de tip eucariot este reprezentat de capacitatea de a realiza modificări posttranslaționale, precum formarea legăturilor disulfidice, adăugarea de lipide și carbohidrați. Cele mai utilizate sisteme de expresie de tip eucariot sunt drojdiile, celulele de plante, celulele de insecte și celulele de mamifere.

Având o rată de înmulțire ridicată și necesități minime, sistemul de expresie în drojdii s-a dovedit util pentru producerea de alergene recombinate. Popularitatea crescută a acestui sistem se datorează procesului simplu și a randamentului ridicat de obținere a proteinelor, precum și capacității de a efectua modificări posttranslaționale (formarea de legături disulfidice și glicozilări). Organismul cel mai utilizat este Pichia pastoris, primele alergene exprimate fiind Cyn d 1 (19) , Alt a 1 (20) , Mus m 1 (21) și Bla g 4 (22) . Principalul dezavantaj al sistemului de expresie în drojdii este hiperglicozilarea proteinelor (23) , modelele de glicozilare N- sau O-linkată putând fi diferite de cele ale proteinei native (24) . Sistemul de expresie în celule de insecte, asociat cu un vector baculovirus, devine tot mai des utilizat în domeniul producerii de alergene recombinate. Acest sistem se bazează pe capacitatea baculovirusului de a infecta celulele de insecte, având o specificitate ridicată în ceea ce privește tipul de gazdă infectată. Procesul de obținere a proteinelor recombinate presupune clonarea genei de interes într-un vector bacterian (plasmid helper), cu care sunt mai apoi transformate celulele de E. coli competente care conțin bacmidul (plasmid care conține baculovirusul fără gena de interes). Secvența de nucleotide care codifică alergenul de interes este apoi inserată în bacmid prin transpoziție, rezultând un bac

Figura 3. Strategiile posibile pentru imunoterapiile alergenice moleculare. Pe baza identificării secvenței de nucleotide care codifică alergenul de interes se poate determina secvența de aminoacizi, fiind astfel posibilă construirea alergenelor recombinate (echivalente celor naturale de tip sălbatic) și a unor derivate cu activitate alergenică redusă precum hipoalergenele recombinate și peptidele sintetice derivate din alergenele de interes. Prezentare educațională cu modificare după Zhernov et al. (2019) (43)

mid recombinat care va fi utilizat în transfecția celulelor de insecte (figura 2) care vor asambla baculovirusul, continuându-se infecția. Alergenul recombinat este secretat în mediul de cultură de unde urmează a fi izolat și purificat după 36-96 de ore de la infecție. Baculovirusul distruge celulele de insecte, astfel că nu se poate realiza o producție continuă, neîntreruptă.

Printre alergenele obținute folosind sistemul cu baculovirus se numără: Api m 2 (26) , Fel d 1 (27) , Mal f 1 (28) . Toate aceste alergene recombinate prezintă o capacitate de legare a IgE și activitate biologică similare cu cele ale proteinelor native.

Deoarece necesită echipamente sofisticate și presupune costuri ridicate de producție, cu randament scăzut, sistemul de expresie în celule de mamifereeste foarte rar folosit (Per a 1 (29) ). Pentru expresie se mai pot utiliza și plantele, proteinele putându-se acumula în cantități ridicate în diferite organe ale acestora (s-au obținut Bet v 1 recombinat imunoreactiv și două alergene din latex – Hev b 1 și Hev b 3 –, folosind plante de tutun (30) ). Indiferent de sistemul de expresie proteică folosit, alergenele recombinate obținute urmează numeroși pași de purificare cromatografică și, fiind apoi analizate din punctul de vedere al identității, calității, cantității și stabilității, prin metode precum electroforeza, spectrometria de masă, dicroism circular. De asemenea, vor fi comparate cu omoloagele naturale în ceea ce privește activitatea biologică (reactivitate IgE, teste de activare a bazofilelor).

În cadrul proiectului INSPIRED (Strategii inovative pentru prevenția, diagnosticul și terapia afecțiunilor respiratorii induse de polenul de ambrozie), echipa de cercetători de la centrul OncoGen, Timișoara, a reușit să producă alergene recombinate din polenul de Ambrosia artemisiifolia. Pentru alergenele mai simple din punct de vedere conformațional (Amb a 8, Amb a 9, Amb a 10) s-a folosit sistemul de expresie de tip procariot, iar pentru cele mai complexe (Amb a 1, Amb a 4, Amb a 6), sistemul de expresie în celule de insecte. De asemenea, pentru câteva alergene (Amb a 3, Amb a 5, Amb a 11, Amb a 12) s-a mers în paralel cu ambele sisteme, pentru a stabili care este cel mai potrivit pentru obținerea unei reactivități IgE comparabile cu cea a omologului natural.

Utilizarea alergenelor recombinate în diagnosticul alergiilor

Deși testele diagnostice care conțin alergene recombinate se utilizează tot mai mult, cele bazate pe extracte naturale continuă să fie utilizate pe scară largă (31) . Compoziția unui extract alergenic influențează puternic rezultatele oricărui test bazat pe acel extract. Din extractele disponibile comercial pot să lipsească alergene importante sau compoziția lor alergenică poate varia considerabil de la un lot la altul, ceea ce poate da rezultate fals negative în cazul anumitor pacienți. Aceste variații de concentrație și conținut alergenic au fost demonstrate la soluțiile de testare cutanată prick (skin prick test, SPT) pentru extractul de acarian Dermatophagoides pteronyssinus (32) , mucegai Alternaria alternata (33) și alun (34) , precum și pentru produsele de imunoterapie alergenică sublinguală (SLIT) pentru acarian (35) și polen de mesteacăn (36) . Alergenele recombinate bine caracterizate pot fi folosite ca marker în diagnostic pentru a realiza profilul de sensibilizare al pacienților alergici și pentru a selecta strategiile terapeutice potrivite. Reactivitatea IgE la alergenele cu o reacție încrucișată extrem de ridicată permite identificarea pacienților cu sensibilizare largă sau care sunt expuși riscului de a dezvolta simptome alergice la mai multe surse. Pe de altă parte, alergenele specifice anumitor surse alergenice pot fi folosite pentru a identifica pacienții cu sensibilizare reală (37) . Pentru îmbunătățirea calității unor extracte alergenice din latex (38) , alun (39) și venin de viespe (40) , utilizate în diagnostic, s-a folosit procesul de spiking (adică adăugarea de alergene recombinate). Mai mult decât atât, alergenele recombinate reprezintă o alternativă la alergenele naturale pentru diagnosticul alergiilor, când alergenul natural poate fi izolat doar în cantități mici din sursa inițială (41) .

Tabelul 2

Mecanismele, avantajele și dezavantajele diferitelor molecule recombinate utilizate în AIT. Prezentare educațională cu modificare după Zhernov et al. (2019) (43)

Molecule Mecanism Avantaje Dezavantaje Exemple Alergene recombinate de tip sălbatic Epitopii pentru LB și LT sunt intacți, induc producția de IgG blocant și țintesc LT „ Imunogenicitate bună și inducerea de IgG blocant „ Posibilă inducere de toleranț㠄 Posibile reacții alergice imediate, epitopii IgE fiind intacți „ Reacții cutanate tardive datorită epitopilor alergen-specifici pentru LT „ rBet v 1 (2002-2008) – compararea rBet v 1, nBet v 1 și extract de mesteacăn pentru SCIT – faza II completă44 „ rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5a+b, rPhl p 6 (2002-2014) – amestec de alergene recombinate pentru SCIT – faza III completă45 Peptide sintetice scurte Peptide derivate din epitopii alergenelor pentru LT, induc toleranț㠄 Fără reacții alergice imediate deoarece nu au reactivitate IgE „ Posibila activare a LT reglatoare „ Deoarece peptidele sunt foarte scurte nu se induce producția de IgG blocant „ Posibile reacții cutanate tardive, deoarece se activează LT „ AllervaxCAT (1996-1999) – două peptide cu 27 de aminiacizi derivate din Fel d 1 – SCIT46 „ ToleroMune Ragweed (2009- 2016) peptide scurte din Amb a 1 – intradermic – Faza II Peptide lungi suprapuse Peptide lungi care conțin toți epitopii lineari ai unui alergen, induc toleranță și IgG blocant „ Imunogenicitate bună și inducerea de IgG blocant „ Fără reacții imediate, pentru că nu mai există structură tridimensional㠄 Reacții cutanate tardive și simptome pulmonare din cauza epitopilor pentru LT „ Aplicabile doar pentru sursele simple de alergene „ AllerT (2012-2018) – peptide lungi suprapuse derivate din Bet v 1 – SCIT – Faza IIb47

Strategii bazate pe acizi nucleici

Hipoalergene recombinate (fragmente, mozaicuri)

Hipoalergene recombinate de generația a doua (peptide fuzionate cu proteine carrier)

Anticorpi alergen-specifici recombinați Vaccinarea cu ADN sau ARN care codifică un alergen induce un răspuns imun către limfocitele Th1 „ Reducerea riscului de efecte adverse sistemice „ Potențial pentru abordări terapeutice

Reactivitate IgE redusă datorită structurii secundare modificate, dar cu epitopi LT și LB pentru producerea de IgG și inducerea de toleranță

Epitopii LB sunt fuzionați cu proteine carrier virale pentru inducerea de IgG blocant pentru alergen și pentru proteina virală

Imunoterapie pasivă cu anticorpi IgG alergenspecifici de mare afinitate care sunt în competiție cu IgE

„ Imunogenicitate bună și inducerea de IgG blocant „ Posibilă inducerea de toleranț㠄 Reducerea reacțiilor de fază imediată deoarece nu au reactivitate IgE „ Imunogenicitate bună și inducerea de IgG blocant „ Protecție atât pentru alergie cât și pentru virusul utilizat drept carrier „ Nu induce reacții IgE „ Eficacitate bună cu efecte adverse minime

„ ADN se poate integra în genom „ Studii pe modele animale, puține studii clinice umane

„ Reacții cutanate tardive din cauza epitopilor pentru LT

„ Aplicabil doar pentru sursele cu alergene majore dominante „ Costisitor „ Efecte de scurtă durată

„ CryJ2-DNA-LAMP (2012- 2015) – plasmid cu ADN care codifică alergenul Cry j 2 și poteina membranară asociată lizozomului (LAMP) – Faza I, IB și IC48 „ Bet v 1-FV (2002-2014) – hipoalergen recombiant Bet v 1 cu structură secundară modificată – SCIT – Faza III completă 49

„ BM 32 (2012-2017) – vaccin hipoalergenic compus din patru alergene majore din polenul de graminee și un carrier (PreS) – SCIT Faza IIb completă50

„ Anti-Fel d 1 IgG4 (2013-2017) – anticorpi umani IgG4 specifici pentru Fel d 1 care blochează legarea acestui alergen de IgE – Doză SC unica - Faza 1b51

Utilizarea alergenelor recombinate în imunoterapia alergenică moleculară Izolarea primei secvențe codificatoare a unui alergen a deschis drumul dezvoltării diferitelor tipuri de imunoterapii alergenice (AIT) moleculare (42) (figura 3). Printre acestea se numără alergenele recombinate de tip sălbatic (prezintă toate proprietățile alergenelor naturale); peptidele sintetice care conțin epitopi alergen-specifici pentru limfocitele T (LT) (fără reactivitate IgE); acizi nucleici care codifică alergene; hipoalergene recombinate și sin

tetice, cu alergenicitate scăzută și capacitate redusă de legare IgE, dar cu epitopi alergen-specifici pentru LT (43) . Imunoterapiile personalizate bazate pe profilul de sensibilizare al fiecărui pacient sunt posibile, în teorie. Cu toate acestea, conform ghidurilor actuale, trebuie dovedită siguranța și eficiența clinică pentru fiecare moleculă separat și pentru posibilele combinații, ceea ce face această abordare imposibilă. De aceea imunoterapiile moleculare ar trebui să conțină un panel de alergene relevante clinic provenite de la sursa de interes.

Avantajele și dezavantajele diferitelor molecule recombinate folosite în AIT sunt prezentate în tabelul 2.

Concluzii

Pentru a determina sistemul optim de expresie a unui anumit alergen trebuie să se țină cont de resursele disponibile, timpul necesar, calificarea personalului din laborator și natura alergenului. Există o experiență vastă în ceea ce privește sistemul de expresie procariot, iar kiturile disponibile pe piață sunt mai variate, mai rapide și mai puțin costisitoare decât cele pentru sistemele eucariote. Cu toate acestea, prezintă dezavantajul de a nu putea produce modificările posttranslaționale necesare pentru proteinele complexe structural și funcțional. Mai mult, aproape toate alergenele provin din surse eucariote și este de preferat, în cazul în care activitatea biologică a alergenului recombinat depinde de conformația și/sau modificările posttranslaționale, să se utilizeze sistemele eucariote de expresie proteică.

Tehnologia proteinelor recombinate permite atât producția nelimitată a alergenului de interes, cât și posibilitatea de a modifica structura și proprietățile intrinseci ale acestuia, devenind o alternativă din ce în ce mai atractivă pentru diagnosticul și imunoterapia bolilor alergice. n

Acest articol a fost elaborat în cadrul proiectului INSPIRED (Strategii inovative pentru prevenția, diagnosticul și terapia afecțiunilor respiratorii induse de polenul de ambrozia) cod SMIS 103662.

Bibliografie

1. 1. Chapman MD, Smith AM, Vailes LD, Arruda LK, Dhanaraj V, Pomés A. Recombinant allergens for diagnosis and therapy of allergic disease. J Allergy Clin Immunol. 2000;106(3):409-418. 2. 2. Valenta R, Kraft D. Recombinant allergen molecules: tools to study effector cell activation. Immunol Rev. 2001;179(1):119-127. 3. 3. van der Veen MJ, Mulderb M, Witteman AM, et al. False-positive skin prick test responses to commercially available dog dander extracts caused by contamination with house dust mite (Dermatophagoides pteronyssinus) allergens. J Allergy Clin Immunol. 1996;98(6):1028-1034. 4. 4. Nelson HS, Iklé D, Buchmeier A. Studies of allergen extract stability: the effects of dilution and mixing. J Allergy Clin Immunol. 1996;98(2):382-388. 5. 5. Scheiner O, Kraft D. Basic and practical aspects of recombinant allergens. Allergy. 1995;50(5):384-391. 6. 6. Schmid-Grendelmeier P, Crameri R. Recombinant allergens for skin testing. Int Arch Allergy Immunol. 2001;125(2):96-111. 7. 7. Bousquet J. In vivo and in vitro use of recombinant allergens. Allergy Clin Immunol News. 1994:54-59. 8. 8. Bousquet J, Lockey R, Malling HJ, et al. SPECIAL FEATURES-Allergen Immunotherapy: Therapeutic Vaccines for Allergic Diseases. Ann Allergy Asthma Immunol. 1998;81(5):401-405. 9. 9. Schmidt M, Zargari A, Holt P, et al. The complete cDNA sequence and expression of the first major allergenic protein of Malassezia furfur, Mal f 1. Eur J Biochem. 1997;246(1):181-185. 10. 10. Schmidt M, Walker RB, Hoffman DR, McConnell TJ. Nucleotide sequence of cDNA encoding the fire ant venom protein Sol i II. FEBS Lett. 1993;319(1-2):138-140. 11. 11. Schmidt M, Hoffman DR. Expression systems for production of recombinant allergens. Int Arch Allergy Immunol. 2002;128(4):264-270. 12. 12. Fernandez JM, Hoeffler JP. Gene Expression Systems: Using Nature for the Art of Expression. Elsevier; 1998. 13. 13. Rea G, Iacovacci P, Ferrante P, et al. Refolding of the Cupressus arizonica major pollen allergen Cup a1.02 overexpressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 2004;37(2):419-425. doi:https://doi.org/10.1016/j.pep.2004.06.034 14. 14. Lehmann K, Hoffmann S, Neudecker P, Suhr M, Becker W-M, Rösch P. Highyield expression in Escherichia coli, purification, and characterization of properly folded major peanut allergen Ara h 2. Protein Expr Purif. 2003;31(2):250-259. 15. 15. Kleber-Janke T, Becker W-M. Use of modified BL21 (DE3) Escherichia coli cells for high-level expression of recombinant peanut allergens affected by poor codon usage. Protein Expr Purif. 2000;19(3):419-424. 16. 16. Swoboda I, Jilek A, Ferreira F, et al. Isoforms of Bet v 1, the major birch pollen allergen, analyzed by liquid chromatography, mass spectrometry, and cDNA cloning. J Biol Chem. 1995;270(6):2607-2613. 17. 17. van Ree R, van Leeuwen WA, Bulder I, Bond J, Aalberse RC. Purified natural and recombinant Fel d 1 and cat albumin in in vitro diagnostics for cat allergy. J Allergy Clin Immunol. 1999;104(6):1223-1230. 18. 18. Schenk S, Hoffmann‐Sommergruber K, Breiteneder H, et al. Four recombinant isoforms of Cor a 1, the major allergen of hazel pollen, show different reactivities with allergen‐specific T‐lymphocyte clones. Eur J Biochem. 1994;224(2):717-722. 19. 19. Smith PM, Suphioglu C, Griffith IJ, Theriault K, Knox RB, Singh MB. Cloning and expression in yeast Pichia pastoris of a biologically active form of Cyn d 1, the major allergen of Bermuda grass pollen. J Allergy Clin Immunol. 1996;98(2):331-343. 20. 20. De Vouge MW, Thaker AJ, Curran IH, et al. Isolation and expression of a cDNA clone encoding an Alternaria alternata Alt a 1 subunit. Int Arch Allergy Immunol. 1996;111(4):385-395. doi:10.1159/000237397 21. 21. Ferrari E, Lodi T, Sorbi RT, Tirindelli R, Cavaggioni A, Spisni A. Expression of a lipocalin in Pichia pastoris: secretion, purification and binding activity of a recombinant mouse major urinary protein. FEBS Lett. 1997;401(1):73-77. 22. 22. Vailes LD, Kinter MT, Arruda LK, Chapman MD. High-level expression of cockroach allergen, Bla g 4, in Pichia pastoris. J Allergy Clin Immunol. 1998;101(2):274- 280. 23. 23. Bobrowicz P, Davidson RC, Li H, et al. Engineering of an artificial glycosylation pathway blocked in core oligosaccharide assembly in the yeast Pichia pastoris: production of complex humanized glycoproteins with terminal galactose. Glycobiology. 2004;14(9):757-766. 24. 24. Cereghino JL, Cregg JM. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Microbiol Rev. 2000;24(1):45-66. 25. 25. https://biotop.boku.ac.at/Projects/2015/Grabherr2015c.html. 26. 26. Soldatova LN, Crameri R, Gmachl M, et al. Superior biologic activity of the recombinant bee venom allergen hyaluronidase expressed in baculovirusinfected insect cells as compared with Escherichia coli. J Allergy Clin Immunol. 1998;101(5):691-698. 27. 27. Guyre P, Goldstein J, Wu Z, Sun A. Recombinant cat allergen, Fel dI, expressed in baculovirus for diagnosis and treatment of cat allergy. November 2002. 28. 28. Zargari A, Schmidt M, Lundberg M, Scheynius A, Whitley P. Immunologic characterization of natural and recombinant Mal f 1 yeast allergen. J Allergy Clin Immunol. 1999;103(5):877-884. 29. 29. Wu CH, Lee MF, Wang NM. Expression of the American cockroach Per a 1 allergen in mammalian cells. Allergy. 2000;55(12):1179-1183. 30. 30. Breiteneder H, Krebitz M, Wiedermann U, et al. Rapid production of recombinant allergens in Nicotiana benthamiana and their impact on diagnosis and therapy. Int Arch Allergy Immunol. 2001;124(1-3):48-50. 31. 31. Tscheppe A, Breiteneder H. Recombinant Allergens in Structural Biology, Diagnosis, and Immunotherapy. Int Arch Allergy Immunol. 2017;172(4):187-202. doi:10.1159/000464104 32. 32. Casset A, Mari A, Purohit A, et al. Varying allergen composition and content affects the in vivo allergenic activity of commercial Dermatophagoides pteronyssinus extracts. Int Arch Allergy Immunol. 2012;159(3):253-262. 33. 33. Kespohl S, Maryska S, Zahradnik E, Sander I, Brüning T, Raulf‐Heimsoth M. Biochemical and immunological analysis of mould skin prick test solution: current status of standardization. Clin Exp Allergy. 2013;43(11):1286-1296. 34. 34. Akkerdaas JH, Wensing M, Knulst AC, Aalberse RC, Hefle SL. In vitro and in vivo characterization of hazelnut skin prick test extracts. Arb aus dem Paul-EhrlichInstitut (Bundesamt fur Sera und Impfstoffe) zu Frankfurt aM. 2003;(94):87-95. 35. 35. van Ree R. Indoor allergens: relevance of major allergen measurements and standardization. J Allergy Clin Immunol. 2007;119(2):270-277. 36. 36. Moreno Benítez F, Espinazo Romeu M, Letrán Camacho A, Mas S, García‐Cózar FJ, Tabar AI. Variation in allergen content in sublingual allergen immunotherapy with house dust mites. Allergy. 2015;70(11):1413-1420. 37. 37. Kazemi-Shirazi L, Niederberger V, Linhart B, Lidholm J, Kraft D, Valenta R. Recombinant Marker Allergens: Diagnostic Gatekeepers for the Treatment of Allergy. Int Arch Allergy Immunol. 2002;127(4):259-268. doi:10.1159/000057742 38. 38. Lundberg M, Chen Z, Rihs H, Wrangsjö K. Recombinant spiked allergen extract. Allergy. 2001;56(8):794-795. 39. 39. Andersson K, Ballmer‐Weber BK, Cistero‐Bahima A, et al. Enhancement of hazelnut extract for IgE testing by recombinant allergen spiking. Allergy. 2007;62(8):897-904. 40. 40. Yoshida N, Hirata H, Watanabe M, et al. Improved sensitivity to venom specific-immunoglobulin E by spiking with the allergen component in Japanese patients suspected of Hymenoptera venom allergy. Allergol Int. 2015;64(3):248-252. 41. 41. Mas S, Boissy P, Monsalve RI, et al. A recombinant Sal k 1 isoform as an alternative to the polymorphic allergen from Salsola kali pollen for allergy diagnosis. Int Arch Allergy Immunol. 2015;167(2):83-93. 42. 42. Valenta R, Ferreira F, Focke-Tejkl M, et al. From allergen genes to allergy vaccines. Annu Rev Immunol. 2009;28:211-241. 43. 43. Zhernov Y, Curin M, Khaitov M, Karaulov A, Valenta R. Recombinant allergens for immunotherapy: state of the art. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2019;19(4):402-414.