Page 1

Львівський національний університет імені Івана Франка

МОЛЕКУЛЯРНА ГЕНЕТИКА МІКРООРГАНІЗМІВ © В.О. Федоренко Електронний лекційний курс 1


Генетична трансформація бактерій      

Відкриття генетичної трансформації бактерій. Досліди Ф. Гріффітса та О. Евері Етапи генетичної трансформації бактерій Стан компетентності бактерій Механізми проникнення ДНК у клітини бактерій Механізм рекомбінації ДНК під час трансформації бактерій Використання генетичної трансформації для картування генів


Генетична трансформація - це виникнення стабільних генетичних змін у бактерій унаслідок поглинання екзогенної ДНК (чистої, не зв’язаної з клітинами або білками) •

За природних умов багато видів бактерій здатні поглинати екзогенну ДНК. Цю здатність виявлено у > 80 видів бактерій

Трансформація є одним з головних чинників горизонтального перенесення генів

Генетична трансформація – найголовніший метод перенесення ДНК у генно-інженерних експериментах •

Поглинатися може будь-яка ДНК, як клітин свого, так і інших видів, Є види бактерій для яких властиве видоспецифічне поглинання ДНК

Механізм трансформації найкраще вивчений у Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae

Ефективність трансформації оцінюється за кількістю клітин трансформантів • на 1 мкг використаної ДНК


Відкриття генетичної трансформації бактерій. Досліди Ф. Гріффітса (1928) R-штам, невірулентний, не утворює капсул

S-штам Streptoсoccus pneumoniae, вірулентний утворює капсули

Миші гинуть Миші живуть

Живий R-штам

S-штам, вбитий нагріванням

Миші гинуть Миші живуть

S-штам, вбитий нагріванням

За присутності вбитих S-штамів живі R-штами набувають здатності утворювати капсули

Це перетворення (трансформація) відбувається на генетичному рівні. Здатність утворювати капсулу успадковується. Трансформанти можуть бути джерелом ДНК для наступних трансформацій


Streptococcus pneumoniae

Клітини S-штаму

Колонії S (від smooth, гладенький) - штаму

Колонії R (від rough, шорсткий) штаму

R

S Клітини R-штаму

 R-штами – це мутанти S-штамів, що втратили здатність синтезувати полімер капсули


Генетичну трансформацію бактерій зумовлює ДНК. Досліди О. Евері, К. МакЛеода і М. МакКарті (1944)  Генетична трансформація може відбуватися in vitro:

 Живі клітини R-штаму можуть перетворюватися у капсульні клітини Sштаму після додавання безклітинного екстракту S-штаму  Трансформація проходить, якщо розщепити білки і РНК  Руйнування ДНК у безклітинному екстракті ДНК-азою унеможливлює трансформацію


Полісахарид капсули Streptococcus pneumoniae ....

Залишок глюкуронової кислоти

COOH O

O HO

OH O

O

OH

O HO CH2OH

OH

Залишок глюкози

COOH O

.....

O

OH

n O HN

CH2OH O OH OH

O P

O

OH

O O

O

P

O

O H2 C O

N

УДФ-глюкоза

O OHOH

УДФ-глюкозодегідрогеназа HN

COOH O OH OH

OH

O

O O

P O

O O

P

O

O H2 C O

O OHOH

N

УДФглюкуронова кислота

 R-штами S. pneumoniae мають мутацію в гені УДФ-глюкозодегідрогенази. Під час трансформації вони успадковують цей ген від S-штамів


 У кінці 40-х, на початку 50-х років ХХ століття Р. Хочкіс опрацював методи отримання високоочищених препаратів ДНК  Він довів, що за допомогою трансформації можуть переноситися гени, що визначають стійкість пневмококів до антибіотиків пеніциліну і стрептоміцину  Результати його досліджень створили можливість кількісного аналізу трансформації

Трансформанти Донор PenR Роллін Хочкіс (1911 – 2004)

S

Реципієнт

PenR

R

PenS

PenS

S

PenR

S

R

• Роль ДНК не “фізіологічна”, а “інформаційна” (генетична). Її роль - не безпосередній вплив на синтез капсули, а перенесення генетичної інформації про ознаки бактерій, у тому числі про синтез капсули • Гени, що контролюють утворення капсули і стійкість до пеніциліну переносяться у різних молекулах ДНК, бо трансформації, що зумовлюють появу штамів, які успадкували обидві ознаки від донора, проходять як дві незалежні події • У дослідах з трансформації можна аналізувати зчепленість маркерів. Наприклад маркери стійкості до стрептоміцину (StrR) і здатності засвоювати манітол (Man+) переносилися з частотою у ~ 15 разів вищою, ніж це очікувалося, як що б вони переносилися у результаті двох незалежних (послідовних чи одночасних) актів трансформації


Схема досліду з генетичної трансформації бактерій Виділення і очищення ДНК з клітин бактерії-донора

Pro+

Отримання компетентної культури бактерії-реципієнта

Pro-

Додавання ДНК донора до клітин реципієнта. Інкубування клітин ДНК донора для її поглинання клітинами реципієнта

Посів клітин реципієнта на селективне середовище (СС) для CC без відбору рекомбінантів (трансформантів) проліну

Відбір і аналіз трансформантів, які виникають унаслідок рекомбінації між фрагментом ДНК донора і хромосомою реципієнта

Pro+


Етапи генетичної трансформації бактерій 

Зв’язування клітинами двониткової ДНК

Подвійну ДНК можуть зв’язувати і компетентні і некомпетентні клітини Однак компетентні клітини зв’язують її так, що вона не може бути звільнена від клітин простим відмиванням • З клітинами може зв’язуватися будь-яка ДНК • Мінімальний розмір ДНК, яка може бути зв’язана ~ 500 п.н. Певні білки клітинної поверхні виконують роль рецепторів ДНК (у B. subtilis – ComEA)

Розщеплення зв’язаної двониткової ДНК на фрагменти • Двониткові розриви в ДНК вносить ендонуклеаза (EndA у B. subtilis) Утворені фрагменти мають розміри ~ 6 т.п.н у S. pneumoniae і 13,5 – 18 т.п.н у B. subtilis

Руйнування одного з двох ланцюгів ДНК. Перенесення одного ланцюга через цитоплазматичну мембрану у цитоплазму реципієнтної клітини

Гомологічна рекомбінація між перенесеною ДНК донора і ДНК клітини-реципієнта


Поглинати ДНК з довкілля здатні клітини, що перебувають у стані компетентності (компетентні клітини)

Штучно викликана

Ca-хлоридний метод

Електропорація

Компетентність

Природна

За лабораторних умов описана для ~ 40 видів бактерій

Контролюється спеціальним набором генів – (генів компетентності, або com-генів)

Com-гени забезпечують перебіг основних етапи природної трансформації та її регуляцію Бактерії, які підлягають природній трансформації, діляться на 2 групи залежно від розвитку стану компетентності:  Ті, в яких компетентність – це тимчасовий фізіологічний стан, який індукується (наприклад, Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis, Нaemophilus influenzae) 

Ті, які постійно (конститутивно) перебувають у стані компетентності (Neisseria gonorrhoeae)


Компетентність бактерій індукується:  За погіршення умов живлення в кінці фази експоненціального росту під час переходу до стаціонарної фази, коли сильно зростає титр клітин у культурі • •

Перенесення на багате середовище елімінує стан компетентності

Після перенесення клітин у середовище, в якому припиняється ріст культури

За умов блокування поділу клітин, агентами, що пригнічують синтез ДНК •

Зміни температурних умов росту

Додаванням бактеріофагів до культури бактерій

• Компетентність може розвиватися протягом декількох хвилин • Частка компетентних клітин у культурі коливається від декількох відсотків у Pseudomonas stutzeri, до 10 – 15 % у B. subtilis і майже 100 % у H. influenzae і S. pneumoniae


Бактерії, які підлягають природній трансформації

Поглинають будь яку ДНК Streptococcus pneumoniae

Поглинають ДНК, яка виділяється з клітин свого виду Haemophilus influenzae

Bacillus subtilis

Neisseria gonorrhoeae

ДНК, яка використовується для трансформації: Випадкова ДНК

• Виділяється у середовище внаслідок лізису клітин різних видів у тому числі і свого • Активно виділяється з клітин за допомогою систем секреції типу IV • Потрапляє у середовище внаслідок вбивання некомпетентних клітин компетентними клітинами свого виду

ДНК свого виду


Tри моделі eволюції систем поглинання ДНК: • • •

Поглинута ДНК сприяє генетичній різноманітності – успадкування нових метаболічних функцій, ознак вірулентності і стійкості до антибіотиків. Поглинута ДНК бере участь у репарації — зовнішня ДНК з близьких бактерій може служити матрицею для виправлення пошкоджень ДНК Поглинута ДНК може бути використана як джерело карбону, нітрогену і фосфору

Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis: Високий рівень генетичного обміну потрібний:

• для створення антигенної різноманітності для уникнення дії імунної відповіді • розповсюдження гонококової інфекції

• розповсюдження генів стійкості до антибіотиків


Видоспецифічне поглинання ДНК під час трансформації  Деякі грам-негативні бактерії поглинають лише ту ДНК, що містить певні послідовності  Послідовність, що потрібна для ефективного поглинання, має назву DUS (від DNA uptake sequences) або USS (від uptake signal sequences)  У Neisseria sp. це 5′-GCCGTCTGAA-3′, а у H. influenzae - 5′-AAGTGCGGT-3′  Оскільки геноми цих бактерій містять багато таких послідовностей. Наприклад в хромосомі H. influenzae є 1471 USS-послідовностей, у Neisseria sp. - 1965, то поглинання ДНК свого виду переважає  У поглинанні ДНК H. influenzae беруть участь трансформосоми

USS

ДНК трасформосома

внутрішня мембрана

3’


 Сигналом високої густини клітин у культурі Bacillus subtilis є нагромадження фактора компетентності - пептиду ComX (10 амінокислотних залишків)

 ComX синтезується у цитоплазмі. Спочатку формується попередник пре-ComX (55 амінокислотних залишків)  За участю білка СomQ пре-ComX перетворюється у ComX  СоmX виділяється у середовище (А)  Нагромадження ComX у середовищі у високій концентрації відбуваться лише за умови високої густини клітин у культурі (Б)


Висока концентрація ComX у середовищі (зовнішній сигнал) фіксується системою молекулярної комунікації, яку називають двокомпонентною системою трансдукції (передачі) сигналу

Ця система складається з двох білків: • Сенсорної кінази

• Регулятора відповіді (responseregulator protein)  Cенсорна кіназа пронизує клітинну мембрану. Одна її частина експонована в зовнішнє середовище і сприймає зовнішні сигнали. Друга знаходиться у цитоплазмі клітини  У відповідь на ці сигнали сенсорна кіназа автофосфорилюється (фосфорилюються консервативний залишок гістидину)  Потім фосфат переноситься на залишок аспарагіну білка-регулятора  Фосфорильований регулятор здатний активувати або репресувати гени. Така регуляція дає змогу клітині відповідати на певні зміни в середовищі її існування


 Експресія com-генів – це приклад функціонування двокомпонентної системи трансдукції сигналу

 Сенсорна гістидинкіназа СomP –сприймає сигнали з довкілля  

зв’язує ComX

автофосфорилюється

 Залишок фосфату переноситься на регулятор ComA  У фосфорильованій формі ComA активує транскрипцію гена comS,  білок ComS, звязуючись з протеазою ClpCP, перешкоджає протеолізу білка ComK  Нагромадившись, ComK активує транскрипцію генів компетентності

 Індукування стану компетентності приклад явища “відчуття кворуму” (quorum sensing) – cистеми, яка виявляє зміни в клітинній густині і використовує цю інформацію для зміни експресії генів і поведінки бактерій


Апарат поглинання ДНК складається: • • •      

з трансформаційних пілів (псевдопілів), які формують головно субодиниці білка ComGC у Грам-позитивних бактерій і PilE у Грам-негативних бактерій, які захоплюють двониткову ДНК (dsDNA) ДНК-рецептора ComEA (ComE) трансмембранної пори ComEC (ComA) У Streptococcus pneumoniae нуклеаза EndA (і неідентифіковані нуклеази у інших бактерій) розщеплює один з ланцюгів ДНК Однониткова ДНК (ssDNA) проникає через пору ComEC - у Firmicutes за участю АТФ-залежної транслокази ComFA У Грам-негативних бактерій, таких як Neiserria gonorrhoeae, канал сформований секретином PilQ дає змогу пілям, які головно складаються з субодиниць PilE, пройти через зовнішню мембрану Двониткова ДНК також використовує канал PilQ для проходження через зовнішню мембрану Додаткові білки (ComGA і ComGB у Firmicutes) потрібні для поглинання ДНК. У Грам-негативних бактерій присутні гомологи ComFA-транслокази, роль яких нез’ясована


Проникнення ДНК в компетентні клітини У транспортуванні ДНК в клітини задіяні білки, що беруть участь у формуванні псевдопілів і ДНК-транслоказа - комплекс білків цитоплазматичної мембрани

Схема перенесення ДНК у B. subtilis під час трансформації

Головний псевдопілін ComGC (коричневі) і мінорні псевдопіліни ComGD, -GE і –GG (сині) підлягають процесингу препілінпетидазою ComC, і збираються у псевдопілі. У цьому процесі беруть участь мембранний білок ComGB і транспортна НТФ-аза ComGA

Псевдопілі забезпечують доступ екзогенної ДНК до її мембранного рецептора ComEA, який доставляє зв’язану ДНК до каналу в цитоплазматичній мембрані, який формується субодиницями білка ComEC. ATФ-зв’язувальний білок ComFA задіяний у транспорті ДНК через мембрану.

Один ланцюг входить в цитоплазму, інший ланцюг деградує і продукти деградації звільняються в середовище

З внесеним ланцюгом ДНК взаємодіють білки SsbB і DprA. DprA cприяє зв’язуванню з ланцюгом ДНК білка RecA, що каталізує процес гомологічної рекомбінації

Формується комплекс RecA-ДНК, який бере участь в гомологічний рекомбінації


Механізм рекомбінації ДНК під час трансформації ДНК донора

ДНК реципієнта Синапсис

Ендонуклеази

Екзонуклеази

ДНК-полімераза ДНК-лігаза Гетеродуплекс Реплікація ДНК трансформанта


Принципи картування генів за допомогою трансфоормації  Коли хромосомну ДНК ізолюють з донорних бактерій, вона розривається на сотні фрагментів  Два генетичних маркери трансформуються разом (котрансформуються) лише за умови, що вони знаходяться поряд і можуть переноситися в одному фрагменті ДНК

 За умови високої частки комптентних клітин у суспензії клітин-реципієнтів і надлишку ДНК донора трансформація більшості генів відбувається з частотою ~ 10-3 на 1 клітину  Котрансформація двох генів у складі двох різних фрагментів – це дві незалежні події. У цьому разі частота котранформації двох генів дорівнює добутку частот трансформації кожного гена окремо ~ 10-6  Якщо частота котрансформації двох генів значно вища, ніж у та, яка б спостерігалася при двох незалежних трансформаціях, то це свідчить про їхню тісну зчепленість

Profile for v.fedorenko

Molecular_Genetics_of_Bacteria_13  

Molecular_Genetics_of_Bacteria_13  

Advertisement