Issuu on Google+

КАБІНЕТ МІНІСТРІВ УКРАЇНИ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ БІОРЕСУРСІВ І ПРИРОДОКОРИСТУВАННЯ УКРАЇНИ

МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ до самостійної роботи студентів з дисципліни “Інструментальні методи аналізу” для підготовки фахівців напряму 0514 «Біотехнологія» зі спеціальності 6.051401 – «Біотехнологія» в аграрних вищих навчальних закладах ІІІ - ІV рівнів акредитації

заочна форма навчання

Кафедра екобіотехнології та біорізноманіття

Київ – 2013


Методичні рекомендації призначені для підготовки студентів біотехнологів заочної форми навчання напрямку 6.051401 «Біотехнологія», які вивчають курс «Інструментальні методи аналізу». У методичному посібнику запропоновано комплексний підхід до використання оптичних методів аналізу рослин з використанням методів гістохімічної діагностики тканин, що пов’язані з визначенням вмісту в клітинах біохімічних компонентів, які утворюються у рослинному організму в процесі онтогенезу: полісахаридів, дубильних речовин, танінів, компонентів Ф- та М-лігніну, пектинових речовин, целюлозі, активності пероксидази, яка відіграє важливу роль у формуванні конституціональної та індукованої стійкості рослин від патогенів, а також виявлення в тканинах патогенних грибів. «Біотехнологія», за спеціальністю «Біотехнологія» „ 12 ” січня, 2013 р. 32 с. Розробник: доцент кафедри екобіотехнології та біорізноманіття, к.б.н. Ліханов А.Ф.

Робоча програма затверджена на засіданні кафедри екобіотехнології та біорізноманіття Протокол від “25 ” грудня 2012 р. № 8 Завідувач кафедри екобіотехнології та біорізноманіття ______________

О.Л. Кляченко

(підпис)

(прізвище та ініціали)

“25 ” грудня 2012 р. Схвалено вченою радою факультету біотехнології Протокол від “21 ” січня 2013 р. № 6 “ 22 ” січня 2013 р.

Голова Ю.В. Коломієць _________________ (підпис)

(прізвище та ініціали)

Ó_________ , 2013 р. 2


Вступ Правильна підготовка матеріалу до дослідження патогенезу рослинних тканин значною мірою визначає вірогідність отриманих результатів, тому що всяке перекручування об'єкта веде до невірної оцінки й помилкового тлумачення спостережуваної мікроскопічної картини. Зрозуміти й правильно оцінити структурну складність тканин можна тільки шляхом мікроскопічного вивчення зрізу. Таким чином, опис прийомів, застосовуваних при безпосереднім спостереженні під мікроскопом живих зрізів, і способів обробки цих зрізів для готування тимчасового або постійного препарату становить зміст мікроскопічної техніки. Обробку живого матеріалу й готування гістохімічного препарату можна розділити на ряд етапів. 1. Фіксація матеріалу. Тканини вбивають, фіксуючи їх у рідині певного хімічного складу, що зберігає цілісність структури й уміст клітин по можливості незмінними (відповідному живому стану). 2. Ущільнюють і консервують матеріал. Із клітин видаляють воду, поступово витісняючи її етиловим або іншим спиртами, тобто збезводнюють тканини. 3. Готують зрізи небезпечною бритвою від руки або на мікротомі. 4. Тканини просочують парафіном, а потім заливають у парафінові блоки. 5. Тканини, просочені парафіном і залиті в парафінові блоки, ріжуть на мікротомі. 6. Зрізи наклеюють на предметні стекла. 7. Видаляють зі зрізів парафін. 8. Офарблюють зрізи. 9. Містять зрізи в середовище, використовувану для готування препаратів, а зверху закривають їхнім покривним скельцем. У такому стані зрізи можуть зберігатися тривалий час. Щоб одержати гарної якості препарат варто попередньо переглянути живий матеріал під лупою або мікроскопом. Такий перегляд необхідний для перевірки якості матеріалу. Якщо бажано мати якісний вигляд тканин того або іншого органа, потрібно ретельно оглянути його: на наявність уражень яким-небудь грибним захворюванням. Крім цього, такий перегляд необхідний для правильного підбора фіксатора, тому що складові частини фіксуючої рідини можуть розчиняти ті або інші хімічні речовини, наявні в клітинах і тканинах, або, навпаки, осаджувати в тканинах речовини, що перебувають у живій рослині в розчині (інулін, слизи). Нарешті, необхідно встановити характер тканин того або іншого органа рослин, тому що м'які й пухкі тканини фіксують одними, а твердими й щільні - іншими рідинами.

3


1. Фіксація матеріалу Мета фіксації – попередити порушення клітинних структур, які спотворюють анатомічну будову тканини в цілому. Тому клітини й тканини вбивають, занурюючи їх у розчин фіксатора, що призначений для того, щоб призупинити життєві процеси, що відбуваються в клітинах, і по можливості краще зберегти тонку структуру клітин і органоїдів. Підготовка матеріалу до фіксації. Необхідна щоб досліджуваний матеріал був свіжим. У зв'язку із цим матеріал найкраще фіксувати на місці. Якщо це з якихось причин неможливо, то краще взяти окремий пагін з листками або бутонами й загорнути у вологий папір. У деяких випадках, коли тканини рослин містять багато слизу, що набухає від води й надалі перешкоджаючому проникненню фіксатора й барвника в клітини, матеріал не треба перед фіксацією зберігати у воді. Не можна фіксувати органи рослини цілком. У цьому випадку не буде повного проникнення фіксуючої рідини в тканині, що надалі призведе до перекрученої анатомічної картини й може привести до неправильних висновків. Для кращого проникнення фіксатора в тканині стебла, кореневища й кореня останні розрізують гострим скальпелем або бритвою на невеликі шматки, розміром 0,5 см (для мікротомних препаратів) і 2-4 см (для різання зрізів бритвою від руки), з огляду на просторову орієнтацію органів. Стебло, кореневище й корені краще різати перпендикулярно до осі органа; циліндричні листки необхідно розрізати на частини перпендикулярно до жилок. Пластинчасті листки ріжуть на частини тільки перпендикулярно до кільової, серединної жилки. Луски цибулин (наприклад, цибулі) розрізують звичайно уздовж великих жилок. Для дослідження розвитку насіння (особливо шкірки) матеріал для фіксації варто брати у фазі бутонізації, цвітіння, закінчення цвітіння й до повного дозрівання насіння. Дуже дрібні й молоді бутони занурюють у фіксатор, не препаруючи. Великі бутони варто звільняти від квіткових покривів, тому що останні часто несуть на собі волоски або залозки, які виділяють ефірні масла або смоляні речовини, що затримують проникнення фіксуючих рідин у внутрішні частини бутонів. У таких випадках краще користуватися спиртовими фіксаторами, які легко витісняють повітря, розчиняючи хімічні речовини, і таким чином швидше просочують всі тканини. Для одержання більше точних порівняльних даних необхідно фіксувати органи однакового віку. Для вивчення динаміки патогенезу варто зразки декілька разів, з огляду на морфологічні зміни органів. Для детального дослідження формування структури покривної, провідної, основної й механічної тканини необхідно проводити темпоральні фіксації, спочатку два рази, а потім один раз на день. Потім фіксації варто робити через 5-10 днів і потім один раз на місяць. 4


Для повної анатомічної картини патогенезу необхідно для фіксації брати матеріал з нижньої, середньої й верхньої його частини. 1.1 Проведення фіксації Для кращого проникнення фіксатора в тканині фіксуюча рідина повинна проникати в матеріал по можливості з усіх боків. Тому дно посудини до приміщення в нього шматочків матеріалу, який фіксується потрібно покривати скляною ватою, фільтрувальним папером або ватою. Шматочки пагонів або інших органів можна також підвішувати на нитці або поміщати в порцеляновий фільтр у верхній зоні рідини. Під час фіксації доцільно час від часу помішувати рідину. При проведенні фіксації треба враховувати, що осмієва й пікринова кислоти дифундують у тканину дуже повільно, тоді як формалін, оцтова кислота, навпроти, відносно швидко. Процес фіксації звичайно зв'язаний зі зміною об’єму матеріалу, який фіксується, що можна помітити на окремих структурних елементах. Найчастіше відзначається стиск, в інших випадках – розм'якшення тканин органа. Ступінь зміни різний і залежить від будови, фізіолого-біохімічного стану матеріалу, а також від фіксуючої рідини. Так, стебла й листки соковитих м'ясистих рослин після фіксації спиртом стають м’якими й погано ріжуться небезпечною бритвою. Відбувається це тому, що спирт, відтягаючи воду із тканин, сильно обводнюється й втрачає ущільнюючу властивість. Тому такий матеріал повинен зберігатися в спирті кілька днів, а потім його варто перемінити свіжою порцією спирту. У анатомічній практиці фіксацію звичайно проводять при кімнатній температурі. У особливих випадках може виявитися успішною фіксація в киплячій рідині. Слід зазначити, що не можна користуватися однієї й тією же порцією фіксатора. Фіксуючі рідини часто екстрагують різні хімічні речовини (ефірні масла, алкалоїди, глюкозиди), які міняють склад фіксатора, що може шкідливо діяти на клітинні структури інших рослин. Тривалість фіксації. Шматочки різних органів рослин можна витягати з фіксуючої рідини не раніше, ніж вона повністю просочить тканини. У сумнівних випадках об'єкт розрізають гострою бритвою й легко встановлюють проникнення рідини по різниці фарбування й консистенції. Листки рослин звичайно чорніють або буріють, а стебла стають тендітними й кришаться. У той же час дія фіксуючої рідини не слід розтягувати на необмежений час, тому що матеріал у багатьох фіксаторах згодом стає тендітним, що погано фарбується, мацерованим, стислим або м'яким. Тільки деякі рідини, наприклад, розведений формалін (1:9) і 70-75°-ний етиловий спирт, придатні для тривалого зберігання матеріалу. Важливе значення при цьому має обсяг фіксуючої рідини. Останній повинен в 50-100 5


разів перевищувати величину органа, який фіксується, інакше на якості фіксації може шкідливо визначитися дія води, яка втримується в тканинах. 1.2. Фіксатори Етиловий спирт є одним з найстарших фіксаторів. Фіксуюча дія спирту заснована, насамперед, на відібранні води, причому забарвлення клітин і тканин при багатьох методиках виявляється гарною. Етиловий спирт досить швидко проникає в тканини й сильно їх ущільнює в порівнянні з іншими фіксаторами, за винятком пікринової кислоти. Дифундуючи в тканини, спирт скорочує цитоплазму і ядро; ці структури стають грубо гранульованими. Слиз і інші розчинні у воді речовини при спиртовій фіксації зберігаються. В анатомічній практиці для готування зрізів бритвою від руки використовують 70- і 75°-ний етиловий спирт. Фіксація триває протягом 10 днів, залежно від одерев’яніння тканин. Для готування мікротомних препаратів звичайно використовують для фіксації 75-, 96°-ний або абсолютний етиловий спирт. У цьому випадку шматочки беруть невеликі, 3—5 мм товщиною. Фіксація в 96°-ному і абсолютному спирті триває не більше 3— 4 год, в 75°-ному спирті – 2-3 дні, інакше шматочки органів стають надто твердими. Варто брати рясна кількість фіксуючої рідини. Потім матеріал заливають у парафін або желатину. Етиловий спирт має досить широке застосування при виготовленні анатомічних препаратів, зневоднюванні об'єктів при заливанні в парафін і т.д. Абсолютний етиловий спирт можна одержати з 96°-ного етилового спирту дією безводного мідного купоросу. Для одержання безводного купоросу треба прокалити у порцеляновій чашці під витяжною шафою хімічно чистий кристалічний мідний купорос. Прожарювати треба обережно, щоб не відбулося відновлення мідного купоросу до закису міді. Прожарений мідний купорос повинен мати вигляд порошку білого кольору з невеликим, ледве помітним блакитним відтінком. Пожовтіння останнього вказує на псування реактиву. У посудину з абсолютним спиртом рекомендується класти кілька шматочків прогрітої в термостаті желатини, що поглинає сліди води. Оцтова кислота. Основна властивість оцтової кислоти як фіксатора - це здатність зберігати без зміни структуру ядер і хромосом. Вона швидко проникає в тканині й може викликати набрякання й морщення клітин. Оцтова кислота розм'якшує тканини, тим самим попереджає їхнє затвердіння, що викликається іншими фіксаторами. Однак вона не вживається самостійно як фіксатор, а входить до складу цілого ряду фіксуючих рідин. Оцтова кислота в концентраціях, звичайно застосовуваних у 6


фіксаторах, не впливає на жири, які надалі розчиняються при зневоднюванні, якщо тільки не будуть вжиті відповідні заходи. Хромова кислота. Хромова кислота є сильним окислювачем і легко відновлюється до окису хрому, тому її, як правило, не слід змішувати з відновлювачами, наприклад з формаліном. Хромова кислота не впливає на жири. Тканини, фіксовані хромовою кислотою, не слід піддавати впливу яскравого світла, тому що це погіршує результати фіксації. Крім цього, хромова кислота надає тканинам кращу консистенцію для заливання в парафін і забезпечує краще фарбування зрізів. Двухромовокислий калій розчинний у воді приблизно на 12%. Водяні розчини його слабко кислотні. Цей реактив не фіксує вуглеводи, але стабілізує жири й служить прекрасним фіксатором клітини в цілому. Він зберігає цитоплазму в стані, подібному при житті. Двухромовокислий калій уживається і як один з компонентів для готування суміші для знежирення предметних стекол. Формалін (формол) - один із кращих фіксаторів. Добре зберігає фарбування й структуру фіксованого органу. Внаслідок своєї гарної дифузійної здатності й слабкого осаджуючої дії він проникає відносно швидко у великі органи рослин. Формалін надає тканині щільність, що цілком підходить і для різання на заморожуючому мікротомі. Однак клітинні оболонки, особливо мезофілу листка, часто твердіють у формаліні настільки сильно, що при різанні руйнуються. Матеріал, який зафіксовано у формаліні може зберігатися роками, залишаючись здатним до фарбування. Особливо цінним є властивість формаліну зберігати в складі тканини жири й ліпоїди. Формалін містить невелику кількість мурашиної кислоти й непостійну кількість метилового спирту. Формалін, що надходить у продаж, містить звичайно 40% формальдегіду. 1.3. Склад фіксуючих рідин Для фіксації анатомічних структур найбільше широко використовуються суміші формаліну c оцтовою кислотою й етиловим спиртом або ж формаліном, оцтової й хромової кислот. Крім того, для вивчення патогенезу генеративних бруньок і молодих пагонів можна рекомендувати рідину Карнуа, яка швидко проникає в тканині і є чудовим фіксатором для м'ясистих частин рослини Серед анатомів і фітопатологів також популярна суміш формаліну, оцтової кислоти й етилового спирту (ФУС) або ж спирту й формаліну. Формалін протидіє грубій осаджуючій дії, яка викликається спиртом, і одночасно ці речовини фіксують тканини, тобто роблять нерозчинними білки. Спирт викликає деформацію протопласта, а оцтова кислота - його набрякання. У той же час спирт і формалін викликають затвердіння тканин, а оцтова кислота перешкоджає цьому. У багатьох випадках ця суміш викликає 7


значне зморщування тканин і затвердіння клітин. У зв'язку із цим ФУС може бути використаний для анатомічних досліджень клітинних оболонок. Суміш швидко проникає в тканині й у зв'язку із цим її можна рекомендувати для фіксації тканин у польових умовах. Готування рідини Карнуа Склад: 30 мл абсолютного етилового спирту, 5 мл крижаної оцтової кислоти, 15 мл хлороформу. Матеріал фіксують у рідині Карнуа протягом 24 год, тому що ця суміш дуже швидко проникає в рослинні тканини. Потім промивають кілька разів 96°-ним етиловим спиртом поки не зникне запах оцтової кислоти. Потім його варто промити абсолютним етиловим спиртом і перенести в спирт хлороформ і т.д., поступово готуючи матеріал для просочування парафіном. Якщо матеріал не призначається для парафінування, то його потрібно залишити в 96°-ному етиловому спирті. Спосіб готування фіксатора ФУС ( формалін-оцтова кислота - спирт) Склад: 90 мл 50°-ного етилового спирту, 5 мл крижаної оцтової кислоти, 5 мл формаліну, що йде на продаж (40% формальдегіду) Матеріал залишають у фіксаторі протягом 4 год і більше, потім промивають в 50°-ном етиловому спирті й доводять до 96°-ного етилового спирту, де й зберігають матеріал. Спосіб готування фіксатора спирт-формалін Склад: 96°-ний етиловий спирт, 40%-ний формальдегід. Спосіб готування. Потрібно взяти 9 частин 96°-ного етилового спирту й 1 частина 40%-ного формальдегіду. Спосіб використання. 1. Матеріал фіксують 12-24 год у суміші фіксатора. 2. Ретельно промивають у проточній воді. 3. Через спирти міцність яких підвищується, до 75° -ного етилового спирту, де й зберігають його. Готування фіксатора за М. С. Навашиним Склад реактивів: I. 5 г триокиси хрому (хромової кислоти), 50 мол крижаної оцтової кислоти, 320 мол дистильованої води. II. 200 мол 40 %-ного формальдегіду, 175 мол дистильованої води. Спосіб готування. Розчини I і II змішати в рівних обсягах безпосередньо перед приміщенням матеріалу у фіксатор. Фіксатор Навашина 8


проникає в тканині не так добре, як ФУС, тому при застосуванні цього фіксатора доводиться у більшості випадків використовувати вакуумну інфільтрацію. Слід зазначити, що триокис хрому, вступаючи в сполуку з водою, утворює хромову кислоту. Триокис хрому отрутна і є сильним окислювачем. 1.4. Промивання фіксованого матеріалу Тривалість зберігання матеріалу у фіксаторі обмежена певним часом, тому для того, щоб не викликати надмірне ущільнення й крихкість або, навпаки, мацерацію, матеріал після фіксації повинен бути піддадуть ретельному промиванню. Промивання матеріалу проводять або спиртом, або водою залежно від складу фіксуючої рідини. Для цієї мети анатомічні об'єкти поміщають у невеликі мішечки з бавовняної тканини (марлі). Поміщають туди шматочки матеріалу, розташовуючи їх вільно, і зав'язують марлю (не щільно). Потім ці мішечки поміщають у відкриту посудину й ставлять під водопровідний кран; промивання ведуть у проточній воді. Якщо фіксованого матеріалу багато, він великий і не дуже ніжний, то його можна помістити в хімічну склянку. У останній вставляється лійка, що розташовується під водопровідним краном, струмінь води попадає через лійку в склянку й витікає з-під лійки через край. Тривалість промивання залежить від щільності матеріалу й розмірів фіксованих шматочків і триває в середньому від години до доби. На швидкість і якість промивання впливає температура води: чим тепліше вода, тим промивання йде швидше. Матеріал, що промито водою, переносять спочатку в спирт невеликої концентрації, а потім по черзі в спирти, концентрація яких поступово підвищується, доходячи до 96°-ного. Якщо переносити матеріал з води прямо в 96°-ний етиловий спирт, то він сильно ущільнюється, що може викликати його псування. Число розчинів послідовної міцності спиртів залежить від характеру матеріалу, а тривалість перебування в кожному з них – від кількості матеріалу, що промивається одночасно, і розмірів його шматочків. Ніжні об'єкти після промивання водою переносять в 10°-ний етиловий спирт, потім послідовно в 20-, 30-, 40-, 50-, 65-, 75-, 85- і 96°-ний. Для більше твердих об'єктів деякої суміші можна виключити й залишити тільки 20-, 40-, 65-, 85- і 96°-ний. Тривалість перебування об'єкта в сумішах спирту різна. Звичайно в анатомічній практиці тверді об'єкти в перших чотирьохп'яти сумішах, починаючи з 10°-ного спирту, тримають усього 3—4 год, тобто менш години в кожній, наступні спирти вже можна міняти ранком і ввечері. У випадку ніжних об'єктів проводку через спирти різної концентрації можна прискорити, тримаючи їх у спирті до 60°-ного по 30—40 хв у кожному, а починаючи з 60°-ного — по годині (у кожному). Потім об'єкти переносять для тривалого зберігання в 96°-ний етиловий спирт. Якщо матеріал буде залишений для подальшого зберігання 9


(консервування), то він витягає з фіксуючої рідини, відмивається від фіксатора чистим спиртом тої ж міцності й зберігається в 96°-ном етиловому спирті. Тверді об'єкти (як деревина, насіння й ін.), що важко піддаються різанню після фіксації, промивають водою або спиртом залежно від фіксатора, а потім для зберігання поміщають у суміші, що розм'якшують деревину й складаються з: 1) 96°-ного етилового спирту й дистильованої води в рівних кількостях; 2) 96°-ного етилового спирту (3 частини), дистильованої води (2 частини) і гліцерину (1 частина); 3) 96°-ного етилового спирту й гліцерину в рівних пропорціях; 4) 75°-ного етилового спирту. 1.5. Готування мікротомних зрізів для постійних препаратів При анатомічних дослідженнях патологічних змін тканин і органів рослин не завжди можна користуватися зрізами від руки за допомогою небезпечної бритви або за допомогою ручного мікротома. Причиною цього може бути величина об'єкта (занадто малий), або ж дослідникові необхідно мати серію послідовних зрізів. Для цього потрібне масове готування постійних препаратів, для чого необхідно матеріал містити в парафін, целоїдин або в желатину. 1.5.1 Просочування матеріалу парафіном Підготовка матеріалу до парафінування. Перш ніж укласти матеріал у парафін, його попередньо збезводнюють. Для цієї мети використовують чистий етиловий спирт (ректифікат). Після того як об'єкт пробуде не менш 1—2 год в 96°-ном етиловому спирті, його поміщають в абсолютний спирт, де тримають стільки ж часу, після чого переводять у нову порцію абсолютного спирту. Подальша підготовка матеріалу до парафінування зводиться до заміни спирту, що просочує, рідиною, що розчиняє парафін і в той же час добре змішується зі спиртом. Такими проміжними рідинами можуть бути толуол, ксилол, хлороформ і кедрове масло. Для просочування рослинних об'єктів уживають звичайно парафін із точкою плавлення від 48 до 52°. Більше тверді об'єкти варто просочувати парафіном з більше високою температурою плавлення (приблизно 50—52°). До тугоплавкого парафіну рекомендується додавати 5-10% воску, тоді при різанні на мікротомі він не кришиться й виходить гарна парафінова стрічка. Для визначення температури плавлення парафіну тонку скляну трубочку заповнюють рідким парафіном, дають йому застигти, після чого трубочку прив'язують до кульки термометра, поміщають у хімічну посудину або колбу з водою й нагрівають. Як тільки в скляній трубочці парафін стане прозорим, відзначають температуру; це й буде точкою плавлення парафіну. Для тендітних об'єктів застосовують суміш Альтмана. При анатомічних дослідженнях умови затвердіння парафіну при 10


заливанні об'єкта досить важливі. Коли розплавлений парафін починає застигати, то в певний момент на його поверхні виникає пластівчаста плівка. Потім починають утворюватися кристали, з яких складається парафін. Це зміна стану парафіну спричиняє зменшення його об’єму приблизно на 5-10%, що обумовлює константні деформації забитої в парафін тканини. Тому перед дослідником є важливе завдання: одержати парафінові суміші, що дають мінімальну деформацію клітинних структур тканин рослин. Органічні розчинники хоча і є кращими для розчинення парафіну, але часто роблять матеріал тендітним і стискають тканини, тому що віднімають залишки води. Тому ксилол, бензол, толуол і хлороформ можуть бути замінені кедровим маслом у тих же пропорціях, як і у випадку органічних розчинників: 1) 1 частина кедрового масла й 3 частини абсолютного спирту; 2) 2 частини кедрового; масла й 2 частини абсолютного спирту; 3) 3 частини кедрового масла й 1 частина абсолютного спирту; 4) чисте кедрове масло. Цей спосіб зручний при застосуванні до деревини, пронизаної гіфами грибів, тому що проведення через кедрове масло значно полегшує просочування парафіном. При роботі з деревиною можна рекомендувати замінити звичайні органічні розчинники н-бутиловим спиртом. Парафін, що погано або нерівномірно ріжеться рекомендується кілька разів розплавити й остудити у витяжній шафі. Потім парафін залишити на кілька тижнів в останньому для того, щоб забруднюючі його летучі речовини могли випаруватися. Заливання матеріалу в парафін. Для остаточного заливання матеріалу в парафін останній наливають у бюкси або в паперові коробочки, у ванночки або в порцелянові прямокутні лоточки. Стінки цих вмістищ попередньо змазують гліцерином для того, щоб можна було легко вийняти парафінований матеріал з паперових ванночок, коробочок і ін. Потім остуджують парафін, для цього ванночки й коробочки опускають у крижану воду так, щоб вода не заливала парафін. У міру затвердіння парафіну ванночку занурюють у воду цілком. Слід зазначити, що в рідкому парафіні, який налитий у ванночку або коробочку, треба намагатися розташувати шматочки матеріалу так, щоб можна було один за іншим відокремлювати від краю блоку ділянки парафіну разом зі шматочками, що втримувалися в них, матеріалу. Дрібні об'єкти, такі, як молодих корінь, черешки листка, квітконіжки, можна в багатьох випадках розміщати й різати групами - по двох, трьох і більше. Залитий у парафін матеріал можна зберігати довгий час у прохолодному місці, не побоюючись, що це відіб'ється на анатомічній будові тканини. 1.5.2. Готування мікротомних парафінових зрізів Готування блоків з парафінованого матеріалу. Рекомендується два способи прикріплення об'єкта до дерев'яного блоку. 11


1. Об'єкт, залитий у парафін, вирізують ножем у вигляді кубика, причому з п'яти боків прямокутного шматка зрізують якнайбільше зайвого парафіну, а шостою стороною його приплавляють до дерев'яного блоку, що потім закріплюють затиском об’єктоутримувача на мікротомі. Апаті рекомендує для цього циліндрики з білого липового дерева довжиною 2-3 см і шириною 1,5 см. Парафіновий блок з матеріалом прикріплюють у такий спосіб: гарячим металевим скальпелем наносять на дерев'яний блок небагато парафіну й швидко вдавлюють у нього парафіновий блок, по нижній стороні якого попередньо проводять гарячим шпателем. Після цього гарячим шпателем оплавляють небагато бічні сторони парафінового блоку й занурюють його в холодну воду. 2. Об'єкт, запитий у парафін, виплавляють за допомогою нагрітого шпателя або очного зонда й переносять на предметне скло. Попередньо готовлять із розплавленого й профільтрованого парафіну тонкі парафінові палички, виливши рідкий парафін у заздалегідь приготовлені паперові коробочки. Обережно підігріваючи таку паличку, наносять на дерев'яний блок кілька крапель парафіну, потім кінчиком зонда посередині краплі проплавляють невелику ямку. У неї переносять об'єкт із предметного скла нагрітим зондом. Дають застигти парафіну. Після цього швидко наносять ще трохи краплі парафіну й зондом об'єкт орієнтують у потрібному напрямку: у поперечному або поздовжньому. Потім треба кілька разів обвести нагрітим зондом навколо об'єкта, що перебуває в парафіні, щоб добре проплавити його. Не слід допускати, щоб об'єкт застигав, коли на нього наносять краплі парафіну. Шматок матеріалу треба розташувати так, щоб поздовжня вісь його була паралельна ріжучому краю ножа. Після того як блок буде поставлений на місце й правильно орієнтований, починають робити зрізи. 1.5.3 Готування мікротомних парафінових зрізів Існують два основних типи мікротомів: ротаційний, у якого приводиться в рух столик мікротома, а ніж прикріплений нерухомо, і санний, у якого столик прикріплюється нерухомо, а ніж приводиться в рух. У мікротомів всіх типів столик з'єднується з мікрометричним гвинтом таким чином, що з кожним рухом ніж піднімається на певну висоту, що дозволяє отримати зрізи потрібної товщини. На якість мікротомних зрізів впливають багато факторів: температура, рух повітря, вологість і ін. Тому успішне готування зрізів не завжди може залежати від самого працівника, навіть якщо він і має великий досвід у цій галузі. Нижче перераховані деякі причини неполадок, що часто зустрічаються при роботі з мікротомом, і можливості їхнього усунення. 1. На якість зрізів впливає стан ріжучого ножа. Тому мікротомний ніж повинен бути добре відточений і правильно поставлений на мікротомі так, щоб лезо бритви розташовувалося паралельно краю парафінового блоку. 12


2. Якщо серійні зрізи не виходять або вони скручуються, то варто підвищити навколишню температуру повітря, наприклад, електричною лампочкою. 3. Якщо стрічка виходить не пряма, значить треба виправити неправильно обрізані краї парафінового блоку. 4. Зрізи сильно мнуться на ножі й потім погано розправляються. Це може залежати від того, що парафін занадто м'який або навколишня температура повітря занадто висока. У цих випадках треба або остудити блок холодною водою, або перескласти об'єкт у парафін з більше високою точкою плавлення; повільніше вести бритву. 5. Якщо на зворотню сторону леза налипнув парафін, то при русі блоку нагору він зриває зрізи з ножа. Варто почистити ніж. 6. Коли на зрізі утворяться подряпини, отже, на ножі є зазублини. Тоді потрібно пересунути бритву в утримувачі, щоб перемінити місце бритви, яким ріжеться блок. 7. Присутність на ріжучому краї ножа бруду або волокон тканини, що випадково залишилися на ножі після витирання, може привести до розриву парафінової стрічки. 8. У деяких випадках об'єкт кришиться й випадає з парафіну: об'єкт погано просочений парафіном і його потрібно знову піддати цьому процесу. 9. Матеріал може не піддаватися різанню через велику його твердість. У цьому випадку необхідно об'єкт депарафінізувати і укласти в целоідін. 10. Якщо зрізи виходять неоднакової товщини або мікротом не робить зрізів, то ніж занадто нахилений стосовно об'єкта. Необхідно виправити нахил ножа. 11. Під сильним напором ножа матеріал також може кришитися, тому потрібно вести ніж плавно. 12. Зрізи можуть придбати електростатичний заряд. У цьому випадку зрізи розсипаються, прилипають до поверхні ножа, до блоку або до рук і одягу працюючого, або літають у повітрі. Усунути електростатичний заряд можна різними способами, але жоден з них не досягає повного успіху. Перший спосіб складається в підвищенні вологості повітря шляхом кип'ятіння води в приміщенні, де виконується робота; другий спосіб заземлення мікротома; третій заснований на іонізації повітря в безпосередній близькості від ножа, блоку й зрізів. Для якості парафінових зрізів важливе значення має товщина зрізів. Для анатомічних препаратів кореня зрізи можна робити товщиною 10-15 мкм, товщина зрізів стебла може бути в межах 10-25 мкм. Однак точно визначити товщину зрізів можна тільки шляхом ряду пробних зрізів. Парафінові зрізи у вигляді стрічок, отримані при різанні на мікротомі, варто поміщати в коробочку, дно якої вкрито чорним матовим папером. На чорному фоні легше нарізати парафінову стрічку на відрізки, що містять певну й однакову кількість зрізів. 13


1.5.4 Підготовка предметних стекол для наклейки парафінових зрізів Підбір предметного скла. Зрізи поміщають на предметне скло з довжиною сторін 76х26 мм. Використовують лише чисті білі стекла, позбавлені смуг і не занадто товсті. Мутні предметні стекла бракуються. Шліфовані краї не обов'язкові. Предметне скло, яке при розгляді з боку ребра виглядають зеленуватими, зроблені зі скла поганої якості, і їх не слід уживати для наклейки зрізів. Предметні стекла, призначені для наклейки парафінових зрізів, повинні бути зовсім чистими й знежиреними. Знежирення скла. Для знежирення предметне скло миють у гарячій воді із зеленим милом (або із синтетичним пральним порошком) і зберігають у різних сумішах. Так, можна зберігати предметне скло в суміші 96°-ного етилового спирту (гідролізний) з ефіром (в однакових пропорціях). Для зберігання чистих і одночасно знежирення предметного скла можна рекомендувати хромову суміш (хромпік). Для цього приготовлений насичений розчин двохромовокислого калію у дистильованій воді треба змішати з міцною сірчаною кислотою в пропорції 3:1 або 4:1. Причому при змішуванні сірчаної кислоти з водою в будь-яких пропорціях відбувається велике виділення тепла. У зв'язку із цим необхідно з великою обережністю лити у воду сірчану кислоту. У цій суміші скло може перебувати тривалий час, але не менш доби. Можна також протримати скло кілька днів у хромовій суміші, потім добре промити дистильованою водою й зберігати до вживання в 96°-ном етиловому спирті (гідролізному) у банку із притертою пробкою. На такі знежирені скельця можна наклеювати парафінові зрізи без білка або інших речовин, що приклеюють. Предметне скло, виймають із розчинів, що знежирюють, ретельно промивають у проточній воді, обполіскують кілька разів у дистильованій воді, після чого їх застосовують для наклейки зрізів. Процес наклейки парафінових зрізів Перед наклеюванням зрізів предметні скельця, виймають із хромпіку або інших рідин, що знежирюють, ретельно промивають у проточній воді, обполіскують дистильованою водою й переносять у склянку з такою ж водою. Потім виймають пінцетом предметне скло й, тримаючи його за краї, протирають нижню сторону досуха. На верхню сторону наносять краплі розчину, що приклеюється і трохи дистильованої води так, щоб вона рівномірно покрила всю поверхню предметного скла. Потім препарувальною голкою або пензликом (якщо зрізи тонкі), змоченим у воді, переносять відрізки парафінової стрічки з однаковою кількістю зрізів і розташовують їх у рядковій послідовності або радіальних рядах. Для зручності заготовлюють пластмасову пластинку, подібну за розміром із предметним склом, на якій позначені розміри покривного скла. Цю патронку підставляють під 14


предметне скло, на якому зрізи легко розташувати чітко у вертикальному або горизонтальному напрямку. Скло зі зрізами поміщають на поверхню нагрівального столика для розправлення парафінових зрізів. Вода, нагріваючись, розширюється й розтягує зрізи, які при цьому розправляються. 1.6. Фарбування зрізів, заключення їх у бальзам або інші середовища Застосування в анатомічній практиці барвників значною мірою засновано на чисто емпіричних поданнях, тому що, незважаючи на численні дослідження, ще не вдалося внести ясність у сутність і умови процесу фарбування клітин і тканин. Якщо недавно більшість авторів дотримувалося хімічної теорії, у якій фарбування зводилося до солеутворення або до виникнення комплексних хімічних сполук, то в цей час цей процес намагаються пояснити за допомогою фізико-хімічних явищ. Серед фізичних факторів для фарбування значну роль грають швидкість дифузії й концентрація розчину барвника, а також структурна щільність (величина й число пор) об'єкта. Провідну роль також грають електричні властивості барвників і субстратів (тканин). Вміст у розчині барвника кислот і лугів впливає на результат фарбування тканин. Елементи тканин поводяться при цьому порізному, завдяки чому вдається більш-менш елективно виявляти певні структури при характерних для них концентраціях Н-іонів. Ці дослідження дали основу для електростатичного розуміння природи тканинних фарбувань. Деякі дослідники вважають, що барвники краще розділити на дві основні групи: 1) прогресивні, що офарблюють тканини тільки до бажаного відтінку; 2) регресивні - тканини спершу офарблюють можливо інтенсивніше, а потім уже послабляють фарбування, або диференціюють її до бажаного тону. По своїх хімічних властивостях барвники можуть бути розділені на основні й кислотні. Основні барвники являють собою солі барвних основ, найчастіше це хлоргідрати. Їхня властивість залежать від аміногрупи (заміщеної або незаміщеної), що вони містять. Структурні елементи тканин, що елективно забарвлюються основними барвниками, називаються базофільними. До основних барвників належать фуксин основний, метиловий синій, толуїдиновий синій, метиловий зелений. У спирті вони більше розчинні, аніж у воді. До кислотних барвників належать вільні пофарбовані кислоти або солі цих кислот, звичайно солі натрію. Барвники цієї групи виявляють взагалі й при фарбуванні, зокрема, властивості кислот: вони з'єднуються з основами, утворюючи розчинні й нерозчинні солеутворюючі сполуки. Кислоти виділяють із цих солей вільні барвники. Всі ці властивості, характерні для 15


кислот, пояснюються присутністю в частках барвників гідроокисів або груп SO2OH і СООН. Тканинні елементи, що красяться елективно кислотними барвниками, називають оксифільними, або ацидофільними. Кислотними барвниками є: конго червоний, еозин, нігрозин, світлий зелений, пікринова кислота, кислий фуксин, міцний зелений, оранжевий G і ін. Їхня розчинність у воді значно більша, ніж у спирті У нейтральних барвниках базофільні елементи тканини офарблюються основним компонентом барвника, а ацидофільні - відповідно кислотним компонентом. Нейтральний барвник являє собою сіль барвної основи й барвної кислоти. Із цим не слід змішувати так звану нейтральну барвну суміш, що, ані в хімічному відношенні, ані відносно барвної дії не ідентична з нейтральними барвниками. Істотним для нейтральної барвної суміші є одночасна присутність основного й кислотного ба��вника. Як приклад нейтрального барвника можна вказати еозиновокислий метиловий синій і триацидную суміш (метиловий зелений - кислотний фуксин - оранжевий G). Остання являє собою нейтральну барвну суміш. Індиферентні барвники - це барвники, що не мають солеутврюючих властивостей, їх можна тільки умовно називати барвниками. У гістохімії їх уживають для «фарбування» жирових речовин. Але це фарбування принципово відрізняється від звичайного фарбування. До індиферентних барвників належать важливі для фарбування жирів судан III і шарлах R. Фарбування цими барвниками являє собою типовий приклад барвного процесу, в основі якого лежать чисто фізичні явища. Фарбування фіксованих зрізів як основними, так і кислотними барвниками являє собою процес адсорбції, у свою чергу тісно пов'язаний з електричним зарядом тканини. Барвники зобов'язані своїм кольором присутності в їхній молекулі специфічних груп, що носять назву хромофорів. Найбільш важливі хромофорні групи - це хіноїдні кільця й азогрупи. Барвники - сафранін, гематоксилін, зелений міцний і аніліновим синій - є сполуками, що містять хіноїдні кільця, тоді як оранжевий G являє собою азобарвник. Дія барвників, що перебувають у розчині, залежить від іонів, які вони утворять (позитивних і негативних). Ті з них, що діючою основою мають позитивні заряди, називаються основними барвниками, а ті, у яких цю роль виконують негативні заряди, називаються кислотними барвниками. Різні хімічні речовини клітини несуть певні електричні заряди, які часто залежать від рН розчину й від характеру фіксації. Варто звернути увагу дослідника на те, що різні тканинні структури дуже часто поводяться однаково стосовно різних барвників. Крім того, попередня обробка препарату (фіксація, знебарвлення й т.д.) може змінити реакції тканин. При фарбуванні, як і при фіксації, потрібно брати до уваги можливість появи артефакту. Тому велике значення має порівняння з незабарвленими й особливо зі свіжими, нефіксованими препаратами. 16


1.7. Фарбування зрізів при готуванні постійних препаратів Видалення парафіну зі зрізів. При дослідженні зрізів незалежно від способу готування прибігають до їхнього фарбування. Для цього потрібно видалити із тканин парафін, помістивши препарат у ксилол. Для видалення парафіну потрібно 5—10 хв залежно від товщини зрізу. Після цього препарат переносять у розчин ксилолу в абсолютному етиловому спирті (1:1), а потім у чистий абсолютний етиловий спирт. Потім для підвищення води в зрізах препарат проводять через спадний ряд спиртів: 96-, 85-, 70-, 50-, 25- і 10°ний, де тримають по 2—5 хв, і, нарешті, доводять до дистильованої води. Якщо барвник, яким обробляють препарат, є водяним розчином, то перед зануренням препарату в цей розчин необхідно довести його до води. Якщо барвник розчинений у спирті, то препарати потрібно перенести зі спирту тої ж концентрації, що входить у серію спиртів, що необхідні для зневоднювання тканин. Увесь процес звільнення зрізу від парафіну й проводку через проміжні розчинники (ксилол, спирти) краще проводити в скляних циліндрах, у так званих біологічних стаканчиках, висотою 8,5-9,0 см і діаметром 3,5 см, що щільно закриваються пробкою або скляною кришкою. У стаканчики наливають потрібні реактиви, спирти й розташовують їх у ряди (батарею), помістивши в особливі дерев'яні стійки (можна й без них). Перенос предметного скла з одного стаканчика в інший зручно робити за допомогою простого пінцета. При переносі препаратів з одного реактиву в іншій треба уникати забруднення їх. Так, переносячи препарат зі стаканчика із ксилолом і спиртом у стаканчик з абсолютним етиловим спиртом, необхідно зворотну сторону предметного скла й самі зрізи обполоскати декількома краплями абсолютного етилового спирту й тільки після цього поставити препарат у чистий абсолютний спирт. Необхідно пам'ятати, що препарат не повинен підсихати під час переносу з одного реактиву в іншій. Фарбування препаратів. Фарбування й диференціювання зрізів можна проводити на предметному склі (у випадку готування зрізів від руки небезпечною бритвою) або ж поміщати їх у біологічні стаканчики у які наливають барвники. У процесі фарбування й промивання зрізів треба стежити за тим, щоб не було підсушування зрізів, особливо це легко може відбутися, коли промивання виробляється на предметному склі. У цьому випадку спирт легко розтікається по склу й зрізи швидко висихають. Слід зазначити, що порція барвника в біологічному стаканчику може служити тільки кілька разів, тому що розчин забруднюється й у ньому з'являється осад, що погано змивається із препарату й викликає його псування. У зв'язку із цим перед наступним уживанням розчин барвника потрібно профільтрувати. Часта присутність слизу і гуми заважає одержанню чіткої анатомічної 17


картини тканин рослини. У цьому випадку гуми видаляють кип'ятінням у дистильованій воді, а слизові речовини - за допомогою дії лугу. Крім того, зрізи можна витримати в 10%-ному водяному розчині оцтового свинцю, що викликає сильне ущільнення цих речовин, які одночасно втрачають і здатність до набрякання. Іноді фарбуванню анатомічної структури листка або стебла заважає великий вміст крохмалю в тканинах. У цьому випадку зрізи потрібно прокип'ятити в дистильованій воді й ретельно промити в холодній дистильованій воді до повного видалення клейстеру. Після цього варто зробити контрольну реакцію за допомогою йодної реакції. Якщо йод дає характерне забарвлення, то необхідно промити їх ще раз дистильованою водою. Якщо й після ретельного промивання в тканинах залишаються сліди крохмалю, то до води потрібно додати трохи краплі соляної кислоти, що повністю видалить із клітин зерна крохмалю. Видаляти крохмаль зі зрізів можна також за допомогою хлоралгідрату. Після розчинення крохмалю зрізи варто ретельно промити дистильованою водою, а потім можна приступати до їхнього фарбування. Користуючись різними барвниками, можна одержати зріз, пофарбований диференційовано, тобто на зрізі офарблюється якась частина клітини (наприклад, оболонка), або ж різні тканини будуть пофарбовані в різні кольори. У практиці анатомічного дослідження краще користуватися диференційованим типом фарбування зрізів. У цьому випадку дослідник відразу може судити й про хімічну природу елементів клітини, і про анатомічну будову тканин. При підборі барвників потрібно вибирати контрастні барвники й, крім того, необхідно враховувати можливість вимивання одного барвника іншим. Слід зазначити, що в анатомічній практиці частіше використовують регресивне фарбування тканин. Прогресивний тип фарбування також застосовується, але в меншому ступені. При прогресивному фарбуванні тканин зріз поміщають у порівняно слабкий розчин барвника, у якому фарбування зрізу збільшується поступово. До прогресивних барвників можна віднести залізний гематоксилін, толуїдиновий синій, сафранін і еозин. При регресивному фарбуванні препаратів тканини спочатку офарблюють дуже інтенсивно, а потім роблять їх диференціювання, тобто видаляють надлишок барвника шляхом відмивання зрізів відповідним розчинником. У якості таких служать розчини алюмокалієвих і аміачних квасців, підкислений етиловий спирт (до останнього додають 1-2 краплі соляної кислоти на 100 мол спирту). Процес диференціювання, як правило, ведуть під мікроскопом. Необхідно уважно стежити за тим, щоб ослаблення фарбування дійшло до бажаного відтінку й не привело б до повного знебарвлення препарату. Гістохімічна техніка порівняно проста й не викликає особливих труднощів для дослідника. Однак, незважаючи на це, не слід забувати про наступних прості, але дуже важливі умови роботи. 18


1. Матеріал найкраще досліджувати в живому стані, коли органоїди клітини й речовини, що утримуються в них, не піддалися посмертним змінам. 2. У тих випадках, коли необхідно провести фіксацію й потім реакцію або фарбування, варто критично переглянути всю гістохімічну процедуру в цілому, з огляду на при цьому природу й характер тої речовини, зміст якого підлягає виявленню. 3. Дослідження вимагає повторності, тому що вміст багатьох речовин у клітинах і тканинах змінюється під впливом умов зовнішнього середовища, від сезонного й добового режиму й т.д. У противному випадку отримані результати можуть привести до помилкового висновку. 4. При готуванні зрізи не повинні змочуватися водою або іншими рідинами, якщо того не вимагають правила виробництва реакції. 5. Розчини, барвники й реактиви повинні бути хімічно чистими, а посуд, предметні й покривні стекла й т.д. перебувати в ідеальній чистоті. 6. Варто заздалегідь видалити речовини, які впливають негативно на хід реакції. 7. У всіх випадках необхідний контроль. 8. Необхідно виробити в собі звичку становити докладний опис результатів гістохімічної реакції й робити малюнки за допомогою малювального апарата, використовуючи при цьому кольорові олівці або акварельні фарби. 1.8 Характеристика деяких барвників, що найбільш часто застосовується в анатомічній практиці Сафранін (основний барвник). Офарблює тканини при спиртовій фіксації й після фіксації сумішами, що містя��ь хромову або осмієву кислоту. Він добре комбінується з водним синім, або світлим зеленим. Сафранін офарблює всі здеревілі тканини в червоний колір. Водний синій (кислотний барвник). Використовується як одиночний барвник, так: і в комбінованому фарбуванні, особливо із сафраніном і хризаідіном. Офарблює тканини при спиртовій фіксації. Всі живі тканини офарблюються водним синім у синій колір. Оранж G (кислотний барвник). Використовується в 1%-ном водному й 1%-ном спиртовому розчинах. Найчастіше в анатомічній практиці користуються насиченим розчином оранжа G у гвоздиковому й евгенольному маслах. У них зрізи одночасно офарблюються, і просвітлюються. Можна використовувати оранж G і в триацидному фарбуванні в комбінації із сафраніном і водний синім. У цьому випадку оранж G офарблює коленхіму й первинні флоемні волокна в жовтий колір, сафранін офарблює деревину в червоний, а водний синій флоемну паренхіму й клітини-супутники в блакитнувато-зелений колір. Еозин (кислотний барвник). Для фарбування тканини застосовують 1%-ний водний розчин і 1%-ний розчин еозину в 70°-ном етиловому спирті. Еозин дає гарну комбінацію з метиловим синім і азуром II. При 19


комбінованому фарбуванні з метиловим синім незадерев’янілі оболонки офарблюються в рожевий колір, а деревина - у голубий. В окремих випадках користуються еозином (розчиненим у гвоздиковому маслі), що добре офарблює слиз. Гвоздикове масло з еозином варто застосовувати після зневоднювання зрізів 100 процентним етиловим спиртом, потім промити ксилолом і укласти їх у канадський бальзам. Генціановий фіолетовий (основний барвник). Використовується 10%ний водяний розчин барвника, що офарблює в ліловий колір здеревілі оболонки й крохмальні зерна. Гематоксилін (кислотний барвник). Цей барвник готовлять із деревини кампешевого дерева. Існує кілька способів готування гематоксиліну, але для анатомічних робіт можна рекомендувати тільки розчин гематоксиліну, приготований за методикою Делафільда, що зберігає придатність протягом багатьох років за умови зберігання його в темній склянці й у темряві. Перед уживанням його звичайно розбавляють водою (100 мл дистильованої води на 30 мл барвника). Гематоксиліном Делафільда всі незадерев’янілі і оболонки офарблюються в ліловий колір, інші тканина залишаються незабарвленими. Фарбування гематоксиліном Делафільда необхідно контролювати під мікроскопом: як тільки оболонки досягнуть бажаної інтенсивності, розчин зливають, а зрізи споліскують дистильованою водою. Як додаткове фарбування на здеревілі тканини можна скористатися фарбуванням сафраніном або хризоїдином. Диференціювання й зневоднювання роблять 96°-ним етиловим спиртом. Фарбування гематоксиліном Делафільда застосовують і при укладанні препаратів у гліцерин-желатину. Спочатку препарати переносять у гліцерин, а потім у гліцерин-желатину. В анатомічній практиці найбільш придатні подвійні й потрійні фарбування зрізів. 1. Сафранін з водною синню. 2. Гематоксилін по Делафільду зі спиртовим розчином еозину 3. Гематоксилін по Делафільду й сафранін. Це подвійне фарбування рекомендується як одна із кращих для фарбування деревини. Зрізи офарблюють спочатку гематоксиліном до пурпурового фарбування, потім поміщають у водяний розчин вуглекислого кальцію або натрію. Після цього ретельно промивають дистильованою водою й переносять на 1-2 год у спиртової розчин сафраніну. З останнього зрізи переносять в абсолютний етиловий спирт, а потім у ксилол або бензол і містять у канадський бальзам. 4. Основний фуксин і пікринова кислота. Цей барвник також є одним із кращих для фарбування здеревілих тканин, причому розчин барвника дуже довго зберігається. Зрізи поміщають на 15—30 хв у водяний розчин основного фуксину, потім на короткий час — у розчин пікринової кислоти, приготовлений за способом Альтмана (1 частина насиченого спиртового розчину пікринової кислоти й 2 частини дистильованої води). Потім ретельно промивають 96°-ним етиловим спиртом, збезводнюють, просвітлюють у 20


гвоздиковому або евгенольному маслі й містять у канадський бальзам. Після цього фарбування деревина офарблюється в червоний колір, пробка - у голубий. 5. Танін - хлористе залізо - сафранін. Ця потрійна комбінація дає гарні результати при фарбуванні меристематичних тканин; причому первинні клітинні оболонки офарблюються в чорний колір, вторинні оболонки - у червоний, а цитоплазма - у сірий. Ядерця й хромосоми здобувають червоне фарбування. При цьому фарбуванні танін вступає в сполуку з білками й реагує з пектином і іншими вуглеводами первинної стінки. Іони хлористого заліза утворять із таніном комплексне сполуку, що надає тканинам синьо-чорне фарбування. Сафранін є вторинним барвником, що контрастує. Слід зазначити, що сафранін, що бере участь майже у всіх вищезгаданих комбінованих фарбуваннях, вступає у зв'язок з компонентами тканини, здатними з ним реагувати, а незв'язаний барвник адсорбується поверхнями клітинних структур. Надалі для видалення хімічно не зв'язаного барвника зрізи ретельно промивають водою, а потім знебарвлюють його в подкісленому 96°-ном етиловому спирті. Лігнін, що входить до складу оболонок, ядерця й хромосоми міцно втримують барвник. 6. Азур II - еозин (нейтральні барвники). Всі барвники типу азур II мають поліхромну дію. Колір, що має барвник у розчині, називають ортохроматичним, другий відтінок, що виникає при фарбуванні тканин, метахроматичним. Для визначення локалізації ДНК і РНК азур ІІ характеризується двома піками поглинання, а при підвищеній концентрації барвника, як і у випадку фарбування тканин, з'являється ще й третій пік. Наприклад, ортохроматичний колір - темно-синій, а метахроматичний – синьо-фіолетовий. Кутикула й ситоподібні пластинки стають червонуватими, що відповідало третьому піку поглинання. 1.9 Укладення зрізів у різні середовища Підготовка покривних стекол. Після фарбування зрізів їх збезводнюють і покривають покривним скельцем товщиною 0,15- 2,0 мм. При використанні імерсійної системи вибирають за можливістю більш тонкі покривні скельця, які повинні бути абсолютно чистими. Покривні скельця миють, використовуючи гідролізний спирт, потім витирають тонкою тканиною, що не залишає на склі волокон. Скельце потрібно тримати між двома шматками тканини великим і вказівним пальцями й протирати, намагаючись натискувати на скельце однаково з обох боків. Процес накладення покривного скла на зрізи. Після фарбування зрізів предметне скло виймають із ксилолу так, щоб зрізи були нагорі, нижню сторону скла варто обережно витерти чистою тканиною. На зрізи наносять 13 краплі канадського бальзаму або епоксидної смоли. Беруть покривне скельце пінцетом і тримають його так, щоб лівий його край доторкався до предметного скла - саме уздовж лівої границі наклеєних на нього зрізів. 21


Потім поступово опускають протилежний край покривного скла доти, поки воно не стикнеться із краплею канадського бальзаму, нанесеної на зрізи. При опусканні покривного скла потрібно стежити, щоб у тканину й у бальзам не потрапили пухирці повітря. При нанесенні на препарат канадського бальзаму для укладення зрізів необхідно, щоб його кількість була достатньою для заповнення всього простору під покривним скельцем, але разом для того, щоб він не видавлювався з-під скла. Із часом розчинник бальзаму випаровується й покривне скельце щільне приклеюється до предметного. Якщо через кілька тижнів виявиться, що бальзам не повністю заповнює простір між стеклами, то на відповідний край покривного скла наносять нову порцію канадського бальзаму, що і проникає в щілину. Цьому можна допомогти легким нагріванням. Укладення зрізів у різні середовища. Закрита покривним скельцем тканина являє собою постійний препарат. Для закріплення покривного скла користуються спеціальними середовищами, які повинні мати той же показник переломлення, що й стекло, і не робити впливу на зорове сприйняття пофарбованої тканини. Традиційне середовище для укладення постійних препаратів – канадський бальзам, розведений ксилолом. Однак є ще багато середовищ, до яких відносяться синтетичні смоли, кларит, клирмаунт, піколіт цедакс і дамарова смола, а також не смоляні середовища. В анатомічній практиці широке застосування знайшли гліцеринжелатину у водному або спиртовому розчині, чистий желатин, гумі-сироп за Апаті, цукровий сироп Каро й гліцерин. 2. Підготовка матеріалу для дослідження Для гістохімічнго аналізу можна застосовувати не тільки живий, але й фіксований матеріал. Крім того, деякі гістохімічні реакції проводять також на сухому (гербарному), замороженому й ліофілізованому матеріалі. Живий матеріал. При узятті живих об'єктів для гістохімічного аналізу потрібно враховувати стадії вегетації рослин, їхній вік, а також час доби. Добова динаміка вмісту в листку вуглеводів загальновідома, те ж з’ясовано й для ряду інших речовин. Крім того, необхідно повторне вивчення органа в динаміку його розвитку під час вегетації й навіть у річному циклі розвитку. Необхідно з обережністю ставитися до збереження зібраного матеріалу у воді, куди його часто ставлять перед аналізами. При довгому стоянні у воді метаболізм тканин перетерплює істотні зміни, запасні речовини частково споживаються (цукру), інші можуть розпастися й не бути тому виявленими. Найкраще матеріал зберігати в холодильнику при зниженій плюсовій температурі (7—10°). Фіксований і ущільнений матеріал. Використання деяких способів фіксації буває іноді необхідно для проведення реакцій на фосфоліпіди, при вивченні ядерного апарата, цитоплазми й хлоропластів. Спосіб фіксації залежить в основному від завдань гістохімічного дослідження рослин. Більшість з розчинних у спирті речовин вимиваються із тканин, але 22


деякі зберігають свою цілісність, не руйнуються від дії спирту й продовжують діяти в спиртовому матеріалі. У той же час водорозчинні речовини (інсулін, цукри, фосфати й інші неорганічні солі) при цьому випадають. Хлорофіл і багато інших пігментів знебарвлюються й витягають із клітин спиртом. У хлорофілоносних тканинах спостерігається побуріння вмісту клітин, що говорить про те, що там триває дія ферментативної системи. Тому в цьому випадку зручно застосовувати для фіксації тканин киплячий спирт. Після цієї операції матеріал для зберігання переносять у звичайний 96°-ний етиловий спирт, де подальших змін у фарбуванні тканин не відбувається. Можна рекомендувати для фіксації матеріалу також застосування пари абсолютного етилового спирту. Для цього на дно герметично, що закривається банки, кладуть скляну вату, фільтрувальний папір або бавовняну вату й потім наливають небагато абсолютного спирту. Матеріал підвішують до пробки на нитці так, щоб він не торкався спирту, потім банку ставлять у термостат при температурі 25° для посилення паротворення. Отриманий у такий спосіб матеріал стає тендітним і легко кришиться, тому до аналізу його треба помістити на 1- 2 год у суміш гліцерину з водою (1:1), що надає йому еластичність і м'якість. Після цього виконують обробку й різання матеріалу. Формалін (40%-ний формальдегід) застосовують у тих випадках, коли бажають уникнути зморщування й знебарвлення тканин органа, які відбуваються в спирті. Формалін розбавляють двома-трьома об’ємами дистильованої води й наливають у банку із притертою пробкою. Фарбування матеріалу при цьому зберігається, крім пелюстків квітки й дубильних речовин у тканинах, які здобувають бурий колір. Висушений матеріал. У гербарному сухому матеріалі можна визначати тільки деякі речовини (наприклад, лігнін, мінеральні відкладення й деякі неорганічні речовини). Повільне сушіння сприяє розпаду ферментативної системи, при швидкій підсилюється втрата летучих з'єднань. При швидкому сушінні (шляхом температурного впливу) речовини, що перебували у вигляді розчинів, які імпрегнують стінки клітин. Багато речовин у процесі сублімації якщо не випаровуються зовсім, те переміщаються в невластиві їхньому знаходженню тканини або ж кристалізуються. Матеріал, отриманий таким чином, сильно спотворюється. 2.1. Вуглеводні компоненти клітинних стінок Пектинові речовини Ці речовини належать до числа найбільш важливих хімічних сполук, що входять до складу клітинних оболонок, але гарних методів виявлення їхньої локалізації мало. Фарбування рутенієм червоним дають не надійні результати у зв'язку з тим, що він не специфічний для пектинових речовин, тому що офарблює також азотовмісні речовини. 23


Фарбування виходить чистіше й сильніше, якщо зрізи попередньо обробляються жавелевою водою, після чого вони повинні бути промиті у воді, підкисленою оцтовою кислотою. Перед фарбуванням рутенієвим червоним зрізи крім того обполіскуються слабкою аміачною водою. Розходження між пектиновими кислотами й пектинами встановлюється по їхньому відношенню до основних барвників: перші від основних барвників коагулюють, другі ж ні. Фарбування рутенієвим червоним Цей барвник застосовується досить часто. Готується водяний розчин у розведенні 1 : 5000 до 1 : 10000, що при захисті від світла досить стійок (рутенієвий червоний розчинний у розчині хлористого кальцію й розчині квасців, не розчинний у винному спирті, гліцерині, гвоздиковому маслі). Цей барвник не є специфічним для пектинів, Разом з останніми офарблюються їм і азотовмісні речовини: забарвлюється зерниста протоплазма, хроматин, клітинне ядро (після обробки квасцами й кислим алкоголем), а так само волютин, глікоген і ізоліхенін. Проте, при критичному до неї відношенні, фарбування рутенієвим червоним є гарним способом. Фарбування зберігається в канадському бальзамі й у гліцерин-желатині (на противагу іншим методам фарбування пектинових речовин). Фарбування за Дево Зрізи вносяться на кілька секунд у розчин сірчанокислого заліза й відмиваються спершу дистильованою водою, а потім водою, злегка підкисленою оцтовою кислотою. Після обробки фероцианкалієм, оболонки (тобто їхні пектини) стають синіми. Фарбування, що може бути посилено соляною кислотою, яка є стійкою в постійних препаратах. Ніжні оболонки офарблюються найбільше сильно. Зрізи, з яких відповідною обробкою були вилучені пектинові речовини, не офарблюються; здеревілі оболонки після впливу сильно розведеною кислотою залишаються безбарвними. Видалення пектинових речовин із клітинних стінок Беруть тільки свіжий матеріал, зрізи роблять від руки небезпечною бритвою й поміщають на предметне скло в дистильовану воду. Потім приступають до видалення пектинових речовин із тканин рослин за допомогою водяного розчину лугу або щавлевокислого амонію. 1. У першому випадку зрізи покривають покривним скельцем і потім уже з однієї сторони його відсмоктують фільтрувальним папером воду й одночасно з іншої сторони поступово вводять під скельце міцний водяний розчин КОН. 2. Надлишок лугу із предметного скла видаляють за допомогою фільтрувального паперу й обережно підігрівають над спиртовим пальником доти, поки під покривним скельцем не закипить розчин лугу. 3. Після кип'ятіння зрізів у КОН під покривне скельце кілька разів з піпетки вводять дистильовану воду й одночасно відсмоктують її 24


фільтрувальним папером. Потім покривне скельце знімають і вже більш ретельно промивають водою зрізи на предметному склі. 4. Обсушують зрізи фільтрувальним папером і, не даючи їм підсохнути на повітрі, відразу діють розчином для визначення клітковини й пектинових речовин у стінках клітин. У другому випадку зрізи не покривають покривним скельцем, а відразу поміщають в 0,5% -ний водяний розчин щавлевокислого амонію. Ставлять препарат у термостат при 90° на 12 год (у два прийоми по 6 год). Потім ретельно промивають дистильованою водою, висушують на повітрі й далі проводять необхідну гістохімічну реакцію. Целюлоза Целюлоза в більшості рослин складає основу клітинної оболонки, за винятком грибів (хітин) і деяких водоростей. Тільки в молодих органах рослини оболонка складається із чистої клітковини. Клітковина являє собою полісахарид. Молекула його велика, дуже стійка й нерозчинна в слабких кислотах і інших розчинниках. Клітковина прозора, має подвійну променезаломлюваність, показник переломлення n=1,5. Для виявлення клітковини в стінках клітин використовують звичайно дві класичні методики: 1) хлор-цинк-йод і 2) йод у йодистому калії із сірчаною кислотою. За даними реакціями йод накопичується усередині молекули клітковини. Однак його проникнення туди виявляється можливим лише після руйнування нативної структури молекули клітковини. Тому клітковину обробляють розчином кислоти або солі, щоб розірвати водневі зв'язки, за рахунок яких підтримується нормальна структура молекули. У результаті розриву цих зв'язків тяжи глюкози розходяться й у просторах, що розширилися, між ними накопичується йод і з'являється синє забарвлення. У зв'язку з тим, що в стінках клітин і тканин у деяких рослин відкладається багато пектинових речовин, що перешкоджають реакції, попередньо видаляють їх із тканин розведеним лугом. 2.2. Поліфенольні компоненти клітинних стінок Лігнін Лігнін являє собою складну сполуку, хімічна природа якого ще повністю не з'ясована. Основні структурні одиниці, з яких побудований лігнін, - це ще маловивчені речовини, до складу яких входять ароматичні ядра. Для цього сполуку характерна наявність подвійних зв'язків, які вказують на те, що лігнін повинен поглинати ультрафіолетові промені. Оскільки інші речовини оболонок цією властивості не мають, вона може бути використана для визначення локалізації лігніну за допомогою люмінесценції. Методи виявлення лігніну пов'язані з такими ж труднощами, як і інші 25


методи, які спрямовані на визначення локалізації речовин у клітинних оболонках. Рекомендуються дві найбільш характерні гістохімічні реакції, що відкривають дві великі групи лігніну: компоненти М-- і Ф-лігніну, за термінологією А. Н. Бояркіна. Флороглюцинова реакція відкриває компонент Ф-Лігніну, а реакція Меулє (перманганатна) - компонент М. Установлений залежність між бузковим альдегідом і реакцією Меулє, а також між ваніліном і флороглюциновою реакцією. Флороглюцин офарблює, крім ваніліну, коніферин, евгенол і деякі інші ароматичні сполуку, що містяться в лігніні. Флороглюцинова реакц��я для визначення Ф-лігніну Склад реактивів:

5 %-ний спиртової розчин флороглюцину, 25 %-ная сірчана кислота.

Спосіб виявлення 1. Користуються свіжим і фіксованим матеріалом, зрізи роблять від руки небезпечною бритвою. 2. Свіжі зрізи відразу поміщають на предметне скло в дистильовану воду. 3. Зрізи звільняють від води за допомогою фільтрувального паперу. 4. Поміщають зрізи в 5%-ний спиртової розчин флороглюцина, де тримають 3 хв. 5. Потім піпеткою капають на зрізи 3-4 краплі 25%-ний сірчаної кислоти, покривають покривним скельцем і дивляться під мікроскопом. Результати реакції. Флороглюцин офарблюють Ф-Лігнін у вишневі й червоно-фіолетові тони різної інтенсивності. Фарбування здеревілих тканин тримається 5-7 хв, потім знебарвлюється. Перманганатна реакція за Меулє для визначення компонентів Млігніну Склад реактивів: 1 %-ний водяний розчин марганцевокислого калію 15 %-на соляна кислота аміак Спосіб виявлення 1. Користуються свіжим і фіксованим матеріалом, зрізи роблять від руки небезпечною бритвою. 2. Свіжі зрізи відразу поміщають на предметне скло в дистильовану воду. 3. Зрізи звільняють від води й заливають 2-3 краплями 1%-ного розчину марганцевокислого калію на 5 хв, потім його видаляють фільтрувальним папером. Розчин перманганату повинен мати протягом всієї реакції бордовий-бордовий або вишнево-бордовий колір. Якщо він на 26


поверхні зрізу відразу ж здобуває буре фарбування, значить розчин окислився і його треба замінити свіжим, інакше реакція на М-Лігнін буде недоброякісною. 4. Швидко промивають зрізи дистильованою водою й видаляють її фільтрувальним папером. 5. Потім зрізи заливають 15%-ний соляною кислотою й тримають у ній до повного знебарвлення тканин. 6. Видаляють соляну кислоту фільтрувальним папером і ретельно промивають зрізи дистильованою водою. 7. Видаляють воду фільтрувальним папером., наносять на зрізи 2-3 краплі розчину міцного аміаку, накривають покривним скельцем і розглядають під мікроскопом. Результат реакції. Оболонки клітин, що містять М-Лігнін офарблюються в червоні-томатно-червоні тони різної інтенсивності. Це забарвлення зберігається протягом декількох мінут. Дубильні речовини До дубильних речовин належать різноманітні сполуки, що зустрічаються в різних тканинах дуже багатьох рослин. Дубильні речовини це аморфні, в'язкі сполуки, які при взаємодії із солями тривалентного заліза утворять пофарбовані сполуку. Дубильні речовини осаджують із розчинів желатину й розчиняються в гарячій воді. У живій клітині дубильні речовини перебувають у двох формах: 1) розчинені в клітинному соку; 2) у хімічній сполуці або слабко адсорбовані целлюлозоподібними колоїдами. При гістохимічному визначенні дубильних речовин можна рекомендувати використовувати сполуки заліза (розчини із сірчанокислим тривалентним і хлорним залізом). У першому випадку дубильні речовини реагують із сірчанокислим тривалентним залізом і дають синє забарвлення клітин. Однак ця реакція не є специфічною. У розчині хлорного заліза клітини, що містять дубильні речовини, офарблюються в темно-синій або в темно-зелений колір. Реакція Шиф-Йодної кислоти (ШИК) для виявлення нерозчинних полісахаридів Склад розчинів: 0,5 %-ний розчин йодної кислоти в дистильованій воді, 0,5 г основного фуксину, 0,5 г метабісульфіта калію або натрію, 100 мол 0,15 н. соляної кислоти, 300 мг активованого вугілля, 2 %-ний розчин бісульфіту натрію. 27


Спосіб готування. Стандартний розчин Шифа готують у такий спосіб. Розчиняють 0,5 г основного фуксину й 0,5 г метабісульфіта калію або натрію в 100 мол 0,5 н. соляної кислоти. Протягом 2-3 год струшують суміш доти, поки барвник не знебарвиться, тобто перетвориться у фуксин-сірчисту кислоту. Додають для повного знебарвлення розчину 300 мг свіжого активованого вугілля, потім струшують суміш не менш 5 хв. Потім фільтрують суміш через твердий фільтрувальний папір. Фільтрат повинен бути прозорим і безбарвним. У противному випадку потрібно ще два рази профільтрувати його. Реактив Шифа варто тримати в холодильнику. Спосіб виявлення. 1. Узяти фіксований матеріал, а також ліофілізовані тканини. 2. Звільняють зрізи від парафіну й доводять їх до дистильованої води через серію спиртів різної міцності. 3. Поміщають препарати в 0,5%-ний розчин йодної кислоти в дистильованій воді на 15-30 хв (при кімнатній температурі). 4. Промивають зрізи в проточній воді 5 хв. 5. Поміщають зрізи в реактив Шифа на 10-15 хв. 6. Обполіскують зрізи дистильованою водою. 7. Потім поміщають зрізи в 2%-ний розчин бісульфату натрію на 1-2 хв. 8. Промивають зрізи в проточній водопровідній воді. 9. При бажанні можна підфарбувати зрізи й потім збезводнити, просвітлити у гвоздиковому або евгенольному маслі й укласти в канадський бальзам. Результати реакції. Полісахариди офарблюються в червоний-пурпурночервоний колір. Цитоплазма стає безбарвною, ядра слабко пофарбовані; структура оболонок чітко виражена. Крохмаль дає інтенсивну реакцію. Крохмаль Реакція з йодом у розчині йодистого калію на визначення крохмалю Склад реактиву: 2 г йодисті калії, 0,2 г кристалічні йоди, 100 мл дистильованої води. Спосіб використання 1. Можна користуватися як свіжими, так і фіксованими тканинами, а також після ліофілізації й заміщенню в замороженому стані. 2. Зрізи поміщають у розчин йодистого калію. Результати реакції. Крохмаль офарблюється в кольори від синього до чорного. Крохмальні зерна, що утворилися можуть мати червоне або пурпурове фарбування. Визначення дубильних речовин за методом Рива Склад реактивів: I. 10 %-ний азотнокислий натрій. 28


II. 20 %-ная сечовина. III. 10 %-ная оцтова кислота. IV. 2 н. їдкий натрій. Всі розчини тримають окремо. Спосіб використання. 1. Беруть свіжі зрізи. 2. Піддають зрізи послідовній обробці наступними реактивами, узятими в рівних об’ємах: а) тримають зрізи в 10%-ном азотнокислому натрії 5 хв, потім розчин видаляють фільтрувальним папером; б) поміщають зрізи в 20%-ную сечовину на 5 хв, потім її видаляють фільтрувальним папером; в) поміщають зрізи в 10%-ную оцтову кислоту на 5 хв; г) швидко обполіскують зрізи дистильованою водою, видаляють воду фільтрувальним папером. 3. Поміщають зрізи на 5 хв у 2 н. розчин їдкого натрію. Результати реакції. Поява червоного-вишнево-червоного фарбування вказує на присутність дубильних речовин із групи катехінів. Реакція із хлорним залізом для визначення дубильних речовин Склад розчину: Насичений розчин хлорного заліза (Fе2Сl3). Дистильована вода. Спосіб готування. Насичений розчин хлорного заліза зберігають у склянці з темного скла. Перед уживанням розбавляють дистильованою водою (1 частина хлорного заліза на 10 частин води). Спосіб уживання. 1. Використовують живий матеріал. 2. Зрізи роблять від руки небезпечною бритвою, відразу ж занурюють у розчин хлорного заліза й поміщають у темне місце, де тримають 15 хв, потім покривають покривним скельцем. Результат реакції. Під дією розчину хлорного заліза клітини, що містять дубильні речовини, офарблюються в темно-синій колір. Фуксин - фенолова реакція на кутинові речовини за М. Н. Прозиною Склад розчину: 5 г основного фуксину, 5%-ний водяний розчин фенолу (карболова кислота). Спосіб готування. Фуксин розчиняють в 5%-ном водному розчині фенолу й залишають у склянці з притертою пробкою в темному місці, час від часу збовтуючи розчин. Потім барвник фільтрують, і він готовий до вживання. Спосіб використання. 1. Свіжі зрізи поміщають у розчин фуксин-фенолу на 1 хв, потім 29


підігрівають їх на предметному склі до появи випаровування розчину. 2. Ретельно промивають дистильованою водою від зайвої фарби, просушують зрізи фільтрувальним папером. 3. Проводять диференціювання 66%-ний соляною кислотою до повного знебарвлення тканин. 4. Промивають ретельно зрізи дистильованою водою. 5. Просушують фільтрувальним папером і поміщають зрізи на 5 хв в 0,05%-ний розчин метилового синього. 6. Обполіскують дистильованою водою й містять у водний гліцерин (1:1), а потім у чистий. Результат фарбування. Стінки клітин, що містять кутин, офарблюються фуксин - фенолом у малинові тони. Визначення пероксидази бензидиновой реакцією по методу Бояркіна Склад розчинів:. I. 0,2%-ний розчин бензидину в 96°-ном етиловому спирті, 10 мол крижаної оцтової кислоти II. Продажний пергідроль. Спосіб готування. До 100 мл спиртового розчину бензидину додають 10 мл крижаної оцтової кислоти. Водяний розчин пергідролю складається з 99 частин дистильованої води й 1 частини продажного пергідролю. Розчини в окремих склянках із притертими пробками зберігають у темному місці, перед уживанням готують суміш із рівних частин розчину бензидину й пергідролю. Спосіб уживання. 1. Беруть свіжий матеріал. 2. Зрізи роблять від руки небезпечною бритвою, поміщають у розчин бензидину в пергідролі й відразу покривають покривним скельцем. Результат реакції. Клітини й тканини, що містять пероксидазу, дають блакитнувато-синє забарвлення. Контрольні реакції. 1. Інкубація зрізів без перекису водню. 2. Попередня інкубація зрізів у розчині азиду. Метод фарбування гіф грибів у рослинних тканинах Для виявлення гіф грибів у тканинах рослин використовують поперечні й поздовжні зрізи, що готуються від руки, кореневих закінчень, стебе�� і листів. Ці зрізи офарблюють розчином анілінової сині в молочній кислоті за методом Кобеля: Склад розчинів: анілінова синь 0,1 г; молочна кислота 50 г; вода 100 г 30


Зрізи кладуть у розчин на 5 хв, відмиваються водою потім переносять на предметне скло в краплю молочної кислоти й трохи підігрівають. При цьому відбуваються диференціальне фарбування гіф, які інтенсивно поглинають барвник і стають більш виразними. Далі, зрізи знову відмиваються водою (для видалення молочної кислоти) і розглядаються під мікроскопом у краплі води або ж краще - у гліцерині. Препарати довго не зберігаються. Рекомендована література Базова 1. Айвазов Б.В. Практическое руководство по хроматографии. – М.: Высш. шк., 1968 – 279 с. 2. Аналітична хімія / В.В. Болотов, А.Н. Гайдукевич, Е.Н. Свечникова та ін. Під ред. В.В.Болотова. – Харків: Вид-во НФАУ «Золотые страницы», 2004. – С. 232-329. 3. Барыкина Р. П. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы. – М.: Изд-во МГУ, 2004. – 312 с. 4. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул: Пер. с англ. – М.: Мир, 1982. – 448 с. 5. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. М.: Агропромиздат, 1988. – 271 с. 6. Пермяков А.И. Микротехника: Учеб.-метод. пособие. М.: Изд-во МГУ, 1988. – 58 с. 7. Практикум по биохимии: Учеб. пособие/ Под ред. С.Е. Северина, Г.А. Соловьевой. – 2-е изд., перераб. и доп. – М.: Изд-во МГУ, 1989. – 509 с. 8. Ромейс Б. Микроскопическая техника. М.: Изд-во ин. лит., 1954. – 718 с. 9. Роскин Г.И., Левинсон Л.Б. Микроскопическая техника. М.: Сов. наука, 1957. – 467 с. 10. Сайфидинова А.Ф. Двумерная флуоресцентная микроскопия анализа биологических образцов. Учебно-методическое пособие. – СПб.: Соло, 2008. – 72 с. 11. Уильямс Б., Уилсон К. Методы практической биохимии: Пер. с англ. – М.: Мир, 1978. – 269 с. 12. Шатц В.Д., Сахартова О.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография: Основы теории. Методология. Применение в лекарственной химии. – Рига: Зинатне, 1988. – 390 с. Допоміжна 1. Кантере В.М. Теоретические основы технологи микробиологических процессов / В.М. Кантере. - М.: 1990. - 272 с. 31


2. Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам: Пер. с англ./ Под ред. О. Микеша. – М.: Мир, 1982. – Ч. ІІ. – 381 с. 3. Пирс Э. Гистохимия. М.: Изд-во ин. лит-ры, 1962. – 962 с. 4. Скоупс Р. Методы очистки белков: Пер. с англ. – М.: Мир, 1985. – 358 с. 5. Хауссер К.Х., Кальбитцер Х.Р. ЯМР в медицине и биологии: структура молекул, томография, спектроскопия: Пер. с нем./ Под ред. С.М. Рябченко – Киев: Наук. Думка, 1993. – 259 с.

32


%d0%9c%d0%b5%d1%82%d0%be%d0%b4%d0%b8%d1%87%d0%bd%d1%96%20%d0%b2%d0%ba%d0%b0%d0%b7%d1%96%d0%b2%d0%ba%