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Giovanni DI BONAVENTURA, Ph.D. Università “G. D’Annunzio”, Chieti


 L’ingestione

di microrganismi patogeni può causare un gran numero di infezioni, confinate all’intestino o disseminate  Quotidianamente vengono ingerite quantità rilevanti di microrganismi. Tuttavia, grazie ai numerosi meccanismi di difesa dell’ospite, raramente essi sopravvivono fin all’intestino in un numero sufficiente per causare infezione  Un’ampia gamma di microrganismi, sia batterici che virali, può infettare il tratto gastroenterico


tossinfezioni alimentari insorgono in seguito ad ingestione di cibo contaminato con tossine batteriche (Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus)  Nel caso di infezioni veicolate da alimenti, il cibo costituisce terreno di coltura per i patogeni che si accrescono fino a raggiungere concentrazioni infettanti (Salmonella) oppure il cibo funge da solo veicolo (Campylobacter)  Le


La diarrea è il sintomo più comune delle infezioni del tratto gastroenterico  Esse possono presentarsi come forme lievi, moderati e gravi fino all’exitus del paziente  Rappresentano un meccanismo di clearance dell’infezione ma anche di sua diffusione  Nel Terzo Mondo la diarrea è tra le principali cause di morte nell’infanzia 

non diagnosticate per modesta sintomatologia  assenza di strutture mediche adeguate 



Nei Paesi industrializzati, invece, la diarrea è modesta ed auto-limitante, tranne che nei neonati, anziani ed immunocompromessi


 



Escherichia coli appartiene alla Famiglia delle Enterobacteriaceae. E’ uno dei patogeni più versatili esistenti in natura. Accanto ai ceppi apatogeni (flora autoctona intestinale) esistono ceppi virulenti in grado di causare infezioni nel tratto gastroenterico ed in altri apparati, quello urinario in particolare. Inizialmente tutti classificati come enteropatogeni, E. coli in grado di causare infezioni gastroenteriche con meccanismi peculiari sono classificati in 6 diversi gruppi:      

E. coli ENTEROPATOGENI (EPEC) E. coli ENTEROTOSSIGENI (ETEC) E. coli ENTEROEMORRAGICI (EHEC) E. coli ENTEROINVASIVI (EIEC) E. coli ENTEROAGGREGATIVI (EAEC) E. coli DIFFUSIVI-AGGREGATIVI (DAEC)




EPEC sono in grado di aderire all’epitelio del tenue grazie alla produzione di:   

  

pili riuniti in fasci (bundle-forming pili, Bfp) intimina (adesina) proteina associata all’intimina (traslocated intimin receptor, Tir)

Provocano distruzione dei microvilli con conseguente diarrea (soprattutto nei lattanti e bambini) Insieme con ETEC, gli EPEC sono gli agenti causali di diarrea più frequenti in tutto il mondo DIAGNOSI DI LABORATORIO:    

Coprocoltura (isolamento) Determinazione del sierotipo con sieri polivalenti Tests molecolari per fattori di adesività Adesione a cellule in coltura (colorazione con actina fluorescente)


EPEC and EHEC bind to plasma membrane of epithelial cells via hollow EspA filaments (a). Protein translocation is followed by interaction between the outer membrane adhesin intimin (d) and Tir (e,f). Intimin-Tir interaction leads to reorganisation of both micro (e) and intermediate (ck) filaments (f) underneath the attached bacteria, pedestal formation (c) and intimate attachment (b).

EPEC aderiscono agli enterociti, distruggendo la normale architettura dei microvilli, inducendo la caratterisica lesione “adesione-distacco�. Riarangiamenti del citoscheletro sono accompagnati da risposta infiammatoria e diarrea. 1. Adesione iniziale, 2. Traslocazione proteina mediante secrezione di tipo III, 3. Formazione di pedestalli.


 

ETEC sono in grado di aderire all’epitelio del tenue grazie alla produzione di adesine fimbriali Producono potenti enterotossine: Tossina termolabile (LT-1), causa sindrome colera-like poichè simile per struttura e meccanismo d’azione alla tox colerica  Altri ceppi producono le tossine termostabili (ST-s), da sole o in associazione con LT-1. Meccanismo simile a LT-1: attivano la guanilato –ciclasi causando un aumento di GTP e conseguente incremento di secrezione di fluidi nel lume intestinale 



 

Principale causa della diarrea del viaggiatore. Insieme con gli EPEC, ETEC sono la più frequente causa batterica di diarrea nel mondo L’acqua contaminata da deiezioni umane/animali è la principale fonte di contagio DIAGNOSI DI LABORATORIO: Abbondanti feci diarroiche acquose  Coprocoltura (isolamento)  Ricerca sierologica delle tossine nel surnatante di colture batteriche  Tests molecolari (sonde geniche) per i geni codficanti LT-1 e STs, per la ricerca in feci, alimenti ed acqua 


Laboratory methods for isolation and identification of ETEC. (Medical Microbiology. S. Baron, 4th edition)




EHEC sono in grado di aderire all’epitelio del crasso con un meccanismo simile agli EPEC



Producono la verotossina (tossica vs cellule Vero), simile a quella prodotta da Shigella, che danneggia direttamente l’epitelio causando diarrea con abbondante sangue. Sono agenti di: 

Colite emorragica



Sindrome uremo-emolitica (recettori per verotox anche sull’epitelio renale)



Il sierotipo più comune è O157:H7



Alimenti (carne cruda) e latte pastorizzato sono importanti per la diffusione



DIAGNOSI DI LABORATORIO: 

Coprocoltura (isolamento): la proporzione di EHEC nel campione può essere molto bassa (< 1% E. coli totali)



Ricerca sierologica (ELISA, EIA) della verotox nel campione fecale



Saggio biologico



Sonde geniche per la ricerca dei geni codificanti verotox


EIA, ELISA tests per la ricerca di verotox

EHEC causa adesione-distruzione nel colon. Caratteristica di EHEC è la produzione di verotox, il cui assorbimento sistemico determina gravi complicanze. (Kaper, JB, Nataro JP, Mobley HLT. 2004. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology 2, 123-140)




EHEC invadono le cellule sfruttando il meccanismo della endocitosi



Una volta nelle cellule, lisano il vacuolo e invadono cellule adiacenti, provocando danno tessutale, infiammazione, necrosi (alla base del reperto di sangue e muco nelle feci)





Infezioni di origine esclusivamente alimentare

DIAGNOSI DI LABORATORIO: Coprocoltura (isolamento)  Ricerca sierologica (ELISA, EIA) delle proteine invasive  Saggio di invasivitĂ  in colture cellulari  Tests molecolari per la ricerca di geni codificanti proteine invasive 


EIEC invadono lâ&#x20AC;&#x2122;epitelio colico, lisano i fagosomi e si muovono attraverso le cellule nucleando i microfilamenti di actina. I batteri possono muoversi lateralmente attraverso lâ&#x20AC;&#x2122;epitelio attraverso cellule contigue o possono uscire per poi reinvadere la cellula nella membrana baso-laterale. (Kaper, JB, Nataro JP, Mobley HLT. 2004. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology 2, 123-14)








EAEC 

tendono a formare aggregati, per la presenza di fimbrie codificate da plasmidi. Producono anche tossine termo-labili sebbene a significato patogenetico incerto.



Causano diarree infantili persistenti nei Paesi in via di sviluppo

DAEC 

producono una Îą-emolisina ed il fattore citotossico necrotizzante 1



incerto significato patogenetico nella malattia diarroica

DIAGNOSI DI LABORATORIO: 

Coprocoltura (isolamento)



Utilizzo di colture cellulari per lâ&#x20AC;&#x2122;evidenziazione del caratteristico pattern aggregativo-adesivo



Tests molecolari per la ricerca di geni codificanti proteine invasive


EAEC aderisce al piccolo e largo intestino organizzandosi come biofilm e secerne enterotossine e citotossine. DAEC induce una caratteristica trasduzione del segnale negli enterociti del piccolo intestino che si manifesta con la formazione di proiezioni cellulari finger-like che avvolgono il batterio. AAF, aggregative adherence fimbriae; DAF, decay-accelerating factor; EAST1, enteroaggregative E. coli ST1; ShET1, Shigella enterotoxin 1. (Kaper, JB, Nataro JP, Mobley HLT. 2004. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology 2, 123-140)


 

E’ la causa più frequente di diarrea associata al consumo di alimenti in molte nazioni sviluppate Appartiene alla Famiglia delle Enterobacteriaceae. Oltre 2000 sierotipi: antigeni di parete cellulare (O)  antigeni flagellari (H) 

  



Tutte le salmonelle, ad eccezione di S. typhi e S. paratyphi, si repertano sia negli animali che nell’uomo S. enterica è la più virulenta per l’uomo Esistenza di un rilevante serbatoio animale che trasferisce all’uomo l’infezione mediante ingestione di cibi (pollame, prodotti caseari) contaminato. Meno frequente è la diffusione dell’infezione mediante acqua E’ possibile la trasmissione interpersonale 

epidemie secondarie all’interno di nuclei familiari


DIAGNOSI DI LABORATORIO:  La diarrea da Salmonella può essere diagnosticata mediante isolamento colturale (coprocoltura):    

Semina su terreni selettivi Incubazione per 24 h (non esigente) Rapida identificazione preliminare Tipizzazione completa richiede almeno 48 h


 Sono

fra le più comuni cause di diarrea.  La diarrea è clinicamente simile a quella causata da Salmonella e Shigella, sebbene la malattia possa avere un periodo di incubazione più lungo.  Analogamente a Salmonella, esiste un importante serbatoio animale da cui l’uomo (per ingestione di cibi, acqua e latte contaminati) contrae l’infezione.  Microaerofili e termofili (optimum di crescita a 42°C)


  



  

A differenza di Salmonella e Campylobacter, V. cholerae causa infezioni solo nell’uomo Gli individui asintomatici sono probabilmente il serbatoio naturale della malattia La trasmissione diretta interpersonale è infrequente ed avviene principalmente mediante contaminazione fecale del cibo La sua azione patogena è da ricondursi alla produzione di una enterotossina, sebbene mostri anche altri fattori di virulenza Sierotipo O1 (2 biotipi: classico, El Tor) è il più importante Produzione di feci ad “acqua di riso” (perdita di fluidi > 1 L/h, fino a 20 L/die) In assenza di terapia, la mortalità è pari al 40-60%


 Morfologia

caratteristica (RNA ds, frammentato)  I rotavirus in attiva proliferazione causano diarrea in quanto interferiscono con i normali meccanismi di trasporto delle molecole e dei fluidi nell’intestino  L’infezione è comune nei bambini < 2 aa, con sintomatologia più grave nei Paesi in via di sviluppo  DIAGNOSI DI LABORATORIO:  

Microscopia elettronica Individuazione antigeni virali nelle feci (ELISA)




A differenza della semplicità di raccolta del campione, l’isolamento dei patogeni è, invece, complicata dalla presenza di un’abbondante flora autoctona a livello intestinale



Il campione fecale viene raccolto e posto in un recipiente apposito a bocca larga a chiusura ermetica (tappo a vite). Evitare contaminazione con urine



Il campione deve essere trasportato in lab entro 1-2 h dal prelievo. Alternativamente, almeno 2 gr di campione prelevati mediante tampone, debbono essere trasferiti in terreno di trasporto (Stuart, Amies, Cary-Blair). Eccezionalmente, il campin epuò essere conservato a +4°C per max 24 h.



Il campione viene “arricchito” in terreno liquido:







Brodo-selenite F: inibisce la crescita di commensali (E. coli ed altri batteri coliformi, batteri Gram-positivi, lieviti), favorendo la crescita di Salmonella e Shigella



Acqua peptonata alcalina (peptone 1%, NaCl 1%, pH 8.6) per V. cholerae

Semina brodo di arricchimento su terreni selettivi: 

Salmonella-Shigella (SS) agar, Hektoen enteric (HE) agar: per Salmonella e Shigella



Agar saccarosio tiosolfato citrato ai sali biliari (TCBS): per V. cholerae

Incubazione: Salmonella e Shigella richiedono 24h a 37°C (10% CO2, 42°C, 4872h per isolamento Campylobacter)



Identificazione di specie mediante saggi biochimici e sierologici




 



 

Ricerche particolari (Yersinia, Clostridium difficile,Vibrioni, E. coli O157, Rotavirus, protozoi) devono essere specificamente richieste. Se il campione di feci non è accompagnato da richieste specifiche, il laboratorio di norma esegue di base la ricerca di Salmonella, Shigella e Campylobacter. La richiesta di indagini aggiuntive potrebbe richiedere più campioni. ROTAVIRUS. Dopo i 5/6 anni di età la ricerca dei Rotavirus è sconsigliata in quanto i pazienti sono nella quasi totalità immunizzati. CLOSTRIDIUM DIFFICILE. La ricerca di C. difficile va richiesta nei pazienti sottoposti a terapia antibiotica, comunque in situazioni di dismicrobismo. MICOBATTERI. Raccogliere tre campioni fecali n tre giorni diversi (consegnare ogni campione entro 2 h dal prelievo) PROTOZOI. Nel caso di ricerca di Giardia o Amoeba porre il campione in un contenitore termostatico (thermos)


The six recognized categories of diarrhoeagenic E. coli each have unique features in their interaction with eukaryotic cells. Here, the interaction of each category with a typical target cell is schematically represented. These descriptions are largely the result of in vitro studies and might not completely reflect the phenomena that occurs in infected humans. a | EPEC adhere to small bowel enterocytes, but destroy the normal microvillar architecture, inducing the characteristic attaching and effacing lesion. Cytoskeletal derangements are accompanied by an inflammatory response and diarrhoea. 1. Initial adhesion, 2. Protein translocation by type III secretion, 3. Pedestal formation. b | EHEC also induce the attaching and effacing lesion, but in the colon. The distinguishing feature of EHEC is the elaboration of Shiga toxin (Stx), systemic absorption of which leads to potentially life-threatening complications. c | Similarly, ETEC adhere to small bowel enterocytes and induce watery diarrhoea by the secretion of heat-labile (LT) and/or heat-stable (ST) enterotoxins. d | EAEC adheres to small and large bowel epithelia in a thick biofilm and elaborates secretory enterotoxins and cytotoxins. e | EIEC invades the colonic epithelial cell, lyses the phagosome and moves through the cell by nucleating actin microfilaments. The bacteria might move laterally through the epithelium by direct cell-to-cell spread or might exit and reenter the baso-lateral plasma membrane. f | DAEC elicits a characteristic signal transduction effect in small bowel enterocytes that manifests as the growth of long finger-like cellular projections, which wrap around the bacteria. AAF, aggregative adherence fimbriae; BFP, bundle-forming pilus; CFA, colonization factor antigen; DAF, decay-accelerating factor; EAST1, enteroaggregative E. coli ST1; LT, heat-labile enterotoxin; ShET1, Shigella enterotoxin 1; ST, heat-stable enterotoxin. (from: Kaper, JB, Nataro JP, Mobley HLT. 2004. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology 2, 123-140)


Med lab lezione 8 infezioni gastrointestinali