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October 2013 出刊

EGFR mutation test method Lung Cancer Symposium

INTRODUTION

May 11, 2013

台灣肺癌學會 彭瑞鵬理事長 方法。 然而,目前健保局雖然給付藥物,卻尚未給付 EGFR mutation test本身。最近肺癌學會有一個機會 去找健保局蔡副局長,跟他談論到這個事情,是不 是EGFR mutation test可以開放健保給付。他希望我 們臨床醫師和病理科醫師先得到一個共識,把這個 共識提到台灣的衛生福利部食品藥物管理署(FDA, Food and Drug Administration),只要台灣FDA核可 以後,健保局就可以開放健保給付。所以我們今天 有這個機會,邀請了八位醫師來參加這個討論會, 希望將來大家能得到一個共識,然後把這個案子提 到FDA,請他們核准,以後健保局就可以給付EGFR mutation test以嘉惠病人。最後祝今天會議順利。

肺癌在台灣是相當嚴重的問題,每年大概有一 萬名新病人,大約有八到九千人死於肺癌。自20022003年EGFR-TKI (Epidermal growth factor receptorTyrosine kinase inhibitor) 治療問世以後,晚期肺腺癌 的治療成績有急遽的改變;尤其在2004年發現EGFR mutation後,現已知EGFR mutation positive 的病人對 EGFR-TKI的反應率可以達到70%左右。EGFR-TKI 的治療效果不但非常好,而且治療方式非常方便, 一天口服一顆,沒有很大的副作用,接受度非常 高,但就是費用較高。現在健保的給付規定是晚期 肺腺癌同時是EGFR mutation positive,病患就可以在 第一線治療時使用EGFR-TKI。EGFR mutation的檢測 方法有很多,今天我們邀請了許多專家來介紹各種

Tissue sampling issue

成大附醫病理部 何中良主任 一點蠟塊以得到一個平面,再正式切檢體送檢,於 是就會有切了再切,到最後出現檢體不足的現象。 如果病理一開始就可以決定好大概需要做哪些檢 查,就可以盡量避免切了再切的現象。 3. DNA 品質不好 這和檢體的固定和包埋有關係,這部份希望傳達三 個數字:1、6和48。“1”是指檢體取出後到浸入福馬 林的時間要小於1小時。因為RNA、DNA、蛋白質這

分子病理診斷的品質是從檢體的處理開始, 前面的檢體如果有狀況,後面的檢驗其實就會有問 題,最嚴重的問題就是無法得到檢驗結果,因此就 必需要退件。而退件的主要原因有:1. 脫鈣、2. 腫 瘤細胞不足、3. DNA品質不好。 1. 脫鈣 我們的經驗中,經過脫鈣之後的免疫染色是沒有問 題的,但是DNA分子檢驗卻幾乎沒有成功過的。因 為含鈣高的檢體(例如骨骼),必須先經過脫鈣才能做 後續的切片;因此當臨床懷疑骨骼轉移,送骨骼切 片檢體時,建議臨床醫師分開兩部份送:硬的部分 (骨骼)送一管,軟的部分(腫瘤)另外送一管;軟的那 一管不會經過脫鈣,要做EGFR的分子檢測就不會是 問題。外科病理的同仁也請注意,如果送檢單看得 出懷疑是肺癌合併骨轉移,也請將檢體分成兩份, 一個脫鈣,另一個不要脫鈣。 2. 腫瘤細胞不足 檢體中的腫瘤細胞不足,有時是先天的因素,有時 是病理切了再切的結果。一般而言,做病理診斷是 先看HE染色,有些時候可能要做各種免疫染色,其 後可能需要再做分子檢驗,每次檢查都需要先削掉

Optimal tissue handling requirements Cold ischemic time (≤1hour)

Adequate volume of fixative: >10-fold volume of the specimen HER2:Sample sliceed at 5~10 mm intervals ER/PgR:Sample sliceed at 5 mm intervals

HER2:Fixed in 10% NBF for 6 to 48hrs ER/PgR:Fixed in 10% NBF for 6 to 72 hrs

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EGFR mutation test method 些分子都會在檢體被取出後就會逐漸被破壞,直到 檢體浸到福馬林為止,所以CAP (College of American Pathologists)的建議是這段時間要在1小時內完成。 “6”是指檢體在福馬林固定的時間要超過6小時。另 外,福馬林一定要被正確的稀釋(10倍),且pH在7左 右 (6.8-7.2)才可以用。福馬林的用途是要讓蛋白質 之間形成cross-linking,所以檢體的固定需要時間, CAP的建議是至少要6小時,但over fixation也不好, 一般的建議是48小時,不要超過72小時。 成大附醫在2010/9到2013/2總共收件1139份病理 檢體申請做EGFR mutation,退件率大概是1.5%。另 外,細胞檢體也可以做分子病理檢驗,用酒精固定 的濕片才可以做,乾片不行。事實上我們的經驗顯 示,用酒精固定的DNA保存品質比用福馬林固定蠟 包埋(FFPE)的檢體還好;細胞檢體的缺點是一旦刮下 來做檢驗,片子就沒了,將來就無法再看,所以是

臨床醫師採取檢體

外科病理包埋蠟塊

*儘快放入福馬林 *下午兩點以前 *骨頭軟硬分兩管送 *儘快放入福馬林 *固定6小時以上 *骨頭軟硬分兩cassettes *蠟塊避免切了再切

分子檢驗

不是要先照相,還是一開始就多做幾片,都要事先 想好。用細胞檢體做分子檢驗,日本及新加坡其實 都做的蠻多的,因為用酒精固定的DNA品質真的很 好,尤其是新鮮的檢體,我們也許可以多思考這件 事。

Methodology-Direct sequencing

林口長庚解剖病理科 陳澤卿主任

今天談的Direct sequencing和五屆諾貝爾獎 得主有關,其中Frederick Sanger更是因為發明 DNA sequencing而得到諾貝爾化學獎,因為Direct sequencing的方法是Frederick Sanger發明的,所以 Direct sequencing也稱為Sanger sequencing。它主要 的方法是在DNA合成的過程中,除了加入一般的去 氧核苷酸(dNTP),也加入改造過後的雙去氧核苷酸 (ddNTP,dideoxyNTP),因為它缺少 3'-OH group,無 法和下一個去氧核苷酸形成phosphodiester bond,故 會終止DNA的合成,藉由使用放射線或螢光物質去 標記ddNTP,就可以逐一讀出DNA片段的序列。 DNA sequencing包含四個步驟:首先病理科醫 師要做silde reading,選出檢體中有腫瘤的地方,我 們的經驗顯示,臨床上50%以上的肺切片檢體中的腫 瘤比例不到30%,因為direct sequencing最大的缺點

就是sensitivity,所以如果不事先在玻片上檢選有腫 瘤的部位,偽陰性的結果就會很高,所以第一個步 驟是最重要的。其次分別是DNA extraction,PCR及 direct sequencing和最後的interpretation,這些大概都 不會有太大的問題。 關於direct sequencing的sensitivity,我們實驗 室曾經用laser capture microdissection從一般蠟塊包 埋的檢體,取得癌細胞和正常細胞,再混合在一起 去看direct sequencing的sensitivity,我們發現direct sequencing大概可以在含有10%癌細胞的混合物中偵 測到mutation的訊號,臨床上我們決定取兩倍的訊 號,所以目前林口長庚規定,檢體的癌細胞比例必 須超過20%才做direct sequencing,如果不到標準, 則考慮讓檢體先做manual microdissection,或甚至是 laser capture microdissection。另外,有些實驗室為節

Advantages and disadvantages of screening and targeted methods for EGFR mutation testing Direct Sequencing

Targetd methods

Advantages

• All mutations, induding novel mutations, may be detected (analytical sensitivity) • Widely available

• Less time-consuming than the screening method direct sequencing, leading to reduced turnaround times • Sensitivity (limit of detection) tends to be higher than with direct Sequencing • Fairly widely available

Disadvantages

• Rare mutations not assayed for are not detected • Sensitivity tends to be lower than with targeted • Reagents may be more expensive than for screening methods methods such as direct sequencing • Often require enrichment of tumour cells by macroor micro-dissection • Experienced operators needed • Tend to be more labour intensive and time consuming than targeted methods, leading to longer turnaround times (Adapted from J Clin Pathol 2013;66:79-89)

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EGFR mutation test method 省成本只做單向定序,林口長庚則是要求必須同時 做正股與反股的雙向定序以確認mutation的存在。 因此我們現在的流程大概是,選片以後如果 檢體的癌細胞比例超過20%就用direct sequencing, 5-20%就用Quigen的ARMS Scorpion,如果是1-5%就 用ABI的TaqMan方法。關於檢驗的validation,每個 實驗室都必須做,有四個方法,一個是找其他醫院 合作,一個是CAP認證,另外一個是台灣病理學會 也有在做認證,第四個是有些廠商會提供樣本。最 後,最有意義的當然是用臨床使用藥物後的反應來 驗證。 臨床醫師所關心的turnaround time,目前林口 長庚大概80%是在小於或等於五天,超過八天的大 約只有3%。至於direct sequencing的優缺點,它最大

的好處是所有種類的mutation都可以偵測,缺點是 sensitivity太低,常需要做microdissection,比較花時 間,需要熟悉的技術員等等也都是它的缺點。

Detec%on Sensi%vity  in  FFPE  Tissue   50%  

Methodology-IHC

25%

10%

台北榮總病理檢驗部 葉奕成醫師

大家同意分子檢驗方法應該是EGFR mutation test的標準,也是我們目前治療病患的基準,但分子 檢驗並不是每個醫院的實驗室都有。其原因很多, 一方面因為需要比較昂貴的器材,另一方面技術上 相對也比較困難,所需的時間跟人力也比較多。另 外,就如前面陳主任所說,檢體中的腫瘤細胞量會 影分子檢驗的sensitivity,所以就有人想有沒有比 較簡單的方法,雖然沒辦法跟分子檢驗一樣的準 確,但卻可以稍微克服這些問題。2009年的時候, Cell Signaling這個公司的研究團隊就發表了一篇研 究,運用免疫染色的方法去偵測EGFR mutation。簡 單的說,因為雖然EGFR mutation的種類很多,但 exon 19 deletion跟L858R卻佔了90%,所以他們發展 出兩個可以做免疫染色的抗體,一個針對exon 19的 E746-A750 deletion,另一個針對L858R mutation,利 用這兩個抗體做免疫染色去偵測EGFR mutation。免 疫染色有許多好處:首先,它是一個我們一直很熟 悉的方式,不需要複雜的儀器,幾乎所有的病理實

驗室都有在用這個方法;另一方面,它可以很快執 行完畢,通常一天之內就可以完成;第三,其成本 效益還不錯,並不會很貴。最後,臨床上會碰到的 檢體種類幾乎都可以做,細胞檢體可以做,腫瘤細 胞量少的檢體也可以做。 至於判讀方法,目前最常用的是4-tier scoring system,簡單來說就是把染色的強度分為0到3,強度 的score是在1以上,超過10%的癌細胞有染上,就算 是positive。檢驗的sensitivity跟specificity,是用免疫 染色偵測EGFR mutation的罩門所在。雖然每一篇研 究的結果不太一樣,但都有一個類似現象:L858R mutation抗體的specificity將近100%,但是sensitivity 的差異就很大,低到24%,高到100%都有報告; exon 19 deletion也是類似,specificity將近100%,但 是sensitivity低到40%,高到94%都有。台北榮總的 經驗也是類似,我們做了134個檢體,它的specificity 非常好,幾乎是100%,但是sensitivity大概落在5060%左右。至於什麼樣的因素會影響免疫染色的表

Literature review of sensitivity and specificity of mutation-specific immunohistochemistry N

L858R

E746_A750del

Sensitivity

Specificity

Sensitivity

Specificity

Simonetti et al.

78

100%

100%

63%

100%

Kato Y et al.

70

75%

97%

82%

100%

Kitamura A et al.

343

36%

97%

40%

99%

Brevet M et al.

194

76%

100%

67%

100%

Wu SG et al.

143

88%

77%

94%

95%

Kozu Y et al.

577

76%

98%

42%

99%

Hofman P et al.

154

24%

98%

55%

97%

(Adapted from Diagn Pathol 2013;8:27)

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EGFR mutation test method

Summary

現,第一是染色的protocol,每個實驗室都有點不太 一樣;第二是檢體的種類,病理標本染上的免疫染 色強度大概會比細胞檢體強一些;第三是mutation 的種類,因為偵測exon 19 deletion的抗體是針對 E746-A750這段deletion去開發出來的,所以對這一段 的exon 19 deletion的表現會最好,在其他不同種類的 deletion的sensitivity就會比較低。在北榮的經驗,如 果把exon 19 deletion整體一起看,它的sensitivity大概 是57%,specificity是100%;假如只針對E746-A750這 段deletion,它的sensitivity可以到86%,specificity是 98.2%。第四是total EGFR protein的表現,因為免疫 染色是認protein,所以如果案例的total EGFR protein 表現低,也許它是有EGFR mutation,但是用免疫 染色卻會染不太出來,因此,如果想要降低用免疫 染色偵測EGFR mutation的偽陰性,可以再加上total EGFR protein的染色。

•  Immunohistochemistry with  EGFR  muta5on  specific   an5bodies  is  an  alterna5ve  method  of  EGFR  muta5on  test   •  Specifically  detect  L858R  muta5on  and  Exon  19  dele5on   (E746_A750,  some5mes  other  types  of  dele5on  as  well)   •  Fast  and  easy  to  perform   •  Can  be  used  in  resec5on,  biopsy,  or  cytology  specimens     •  High  specificity  (nearly  100%)   •  Variable  sensi5vity  (24  to  100%)  

When will  IHC  be  helpful?   •  Cases  need  urgent  muta-on  test  result   •  Cases  with  very  low  tumor  cell  percentage   •  Cases  with  poor  DNA  quality  

Methodology-ARMS

高雄長庚解剖病理科 黃昭誠醫師 Scorpion PCR primer成功的認出並黏上有突變的檢體 DNA,PCR便可以順利進行,在PCR升溫到denature 的階段時,Scorpion primer以及在它後面所做出來 的DNA便會和template分開變成單股,當PCR再降溫 時,它尾巴hair-pin的序列因為和新做出的DNA序列 互補,hair-pin便會打開而倒勾回來和新做出的DNA 序列形成internal hybridization,由於此時hair-pin已打 開,quencher和fluorophore分離,fluorophore便可放 出螢光讓機器可以偵測到訊號。 一般來說,要做Scorpion ARMS assay大概需要 1-5片tissue section,即使是biopsy通常3片就夠了,除 非腫瘤細胞很少。和Direct sequencing相比,Scorpion ARMS的sensitivity比較高,一般認為當檢體中腫瘤細 胞的比例在20-25%時,Direct sequencing還可以偵測 到,但如果再往下降,檢驗的sensitivity會比較差; 至於Scorpion ARMS,當腫瘤細胞的比例降到1%都還

Scorpion-ARMS突變檢測方法牽涉到3個技術, 一個是所謂的ARMS,用來辨識mutation,一個是 real-time PCR,最後是用Scorpion技術來偵測訊號。 ARMS,是Amplification Refractory Mutation System的縮寫,它的原理是針對不同種類的mutation 設計個別的PCR primer,所以如果檢體有特定的 EGFR mutation,PCR primer黏得上去,PCR就可以 往前做;可是如果遇到一個wild-type EGFR,因為 沒有辦法match,所以PCR就沒有辦法往前進行。至 於Scorpion method如同一隻蠍子,尾巴往上翹而倒 勾回來,在設計Scorpion PCR primer時,在5’端會 設計一個hair-pin,然後在hair-pin的一邊接上一個會 產生螢光的fluorophore,在hair-pin的另一邊則有一 個quencher,當quencher和fluorophore靠在一起的時 候,會讓fluorophore不能發光;另外,hair-pin的序 列要設計成和將來做出來的DNA序列互補。所以當

Detectable EGFR Mutations

ARMS Scorpions vs. Direct Sequencing ARMS PCR  Assay  

DNA Direct   Sequencing  

Lower Limit  of  Detec;on  

< 1%  

Analy;cal Sensi;vity  

> 99%  

Amplicon  Size  

~100 bp  

200bp

Procedure Time  

< 3  h  

11 h  

Complexity

Low

High

Result Output  

Objec;ve

Subjec;ve

Cost

High

Low

Ability to  Detect  Mutants      

Known mutants  

All

EGFR RGQ  PCR  Kit   •  G719X    (exon  18)   •  exon  19  Dele9ons   •  T790M  (exon  20)   •  S768I  (exon  20)   •  exon  20  inser9ons     •  L858R  (exon  21)   •  L861Q   Total:    29  muta9ons    

25-­‐30% 70-­‐75%  

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Cobas EGFR  Muta9on  Test   •  G719X    (exon  18)   •  exon  19  Dele9ons   •  T790M  (exon  20)   •  S768I  (exon  20)   •  exon  20  inser9ons     •  L858R  (exon  21)     Total:    41  muta9ons  


EGFR mutation test method 另外在5’端有Allele-specific blocker與wild-type DNA 結合,使PCR primer無法與wild-type DNA結合,藉 此達到mutant enrichment的目的。當設計好的PCR primer黏上有突變的檢體的DNA template並往下做 extension時,便會解離TaqMan probe,使quencher 和fluorophore分離,fluorophore便會放出螢光讓機器 偵測到訊號。雖然兩者的原理差不多,必須注意的 是,Q廠商設計的Scorpion ARMS套組可以偵測29種 EGFR突變,R廠商的TaqMan PCR套組則可以偵測到 41種突變,其中exon 19 deletion的種類多了13種,但 卻不能偵測L861Q。

可以有效的偵測到mutation的存在。另外,Scorpion ARMS還有幾個優勢:它所需的檢驗時間較短,因為 都是ready-to-use,所以操作比較簡單,結果的判斷 也比較客觀;但也有兩個缺點:一個是價格昂貴, 另一個是它只能偵測到已知的、而且廠商有設計出 PCR primer的EGFR mutation種類。 除了Scorpion-ARMS以外,還有其他assay也是 利用allele-specific PCR的方法來偵測EGFR mutation, 只是它不是用Scorpion技術,而是用TaqMan probe原 理來發出螢光。簡單說,TaqMan probe的兩端分別 有quencher和fluorophore,它的序列和template中段 DNA序列互補,所以會黏在template上;有的assay

Methodology-PNA-LNA

台中榮總整合性癌症中心 張基晟主任

台灣比較少人在做PNA-LNA,但是日本很多, 這方法對各種檢體幾乎都可以處理,它的sensitivity 大概可以到1%,算是一個不錯的方式。它的原理 大概和上述的TaqMan probe差不多。首先它設計 一個用PNA做成的Clamp primer,它會去認wildtype,另外設計2個用LNA做成的TaqMan probe,一 個是Total probe,另一個是會去認mutant的Mutation probe,且各自帶著會發出不同螢光的fluorophore。 PNA(Peptide Nucleic Acid)和DNA的結構有一些不一 樣,雖然還會辨認並黏上DNA template,但卻不會 被Taq DNA polymerase水解,因此當它黏上template 時便會像clamp,阻止PCR的繼續進行。LNA(Locked Nucleic Acid) 的結構和DNA類似,可以被Taq DNA polymerase水解,但還是和DNA有一點不一樣,所以 其binding和melting temperature就會有點不一樣,增 加它和DNA template binding的穩定度及專一性,這 在用LNA做Mutation probe時很重要。 當檢體是wild type時,Total probe和Clamp primer會黏上去,當PCR進行時,Total probe會被解 離並放出螢光,但當PCR進行到Clamp primer時就 會無法再進行下去。但若當檢體是mutant時,Total probe和Mutation probe都會黏上去,因此當PCR進行 時,Total probe和Mutation probe都會在PCR extension

Clamp PCR Wild type allele

Primer

Total probe

LNA

Detectable mutation

Time-consuming

ARMS-Scorpions

PNA-LNA clamp

All

Specific mutation

Specific mutation

4-5 days (6-10 days)

2 days

Primer

Total probe

High

Intermediate

Sensitivity

>10%

1%

1%

++

+++++

+

Cost

Mutation probe

LNA

Clamp primer

PNA

時被解離,其兩端的quencher和fluorophore會分開, 各自的fluorophore便會放出各自不同的螢光,而且 PCR可以繼續進行,使mutant allele可以被增幅。 我們實驗室曾經針對EGFR mutation plasmid DNA跟wild type genomic DNA去做1:1的混合,然後 一直稀釋到1:1000,再用Direct sequencing和PNALNA去做比對。Direct sequencing在1:1的時候效果相 當不錯,1:10的時候還可以看的出來,1:100的時候 和background的判讀就有難度,所以它在1:10的時候

2 days

Low

PNA

Mutant allele

(3-5 days)

Complexity of procedures

LNA

Clamp primer

Clamp PCR

LNA

Direct Sequencing

Mutation probe

5


EGFR mutation test method 大概是沒有問題。但是我們看clamp method,大概除 了L858R比較例外(1:100),其他稀釋到1:1000都還可 以偵測到。結論,跟其他方式比起來,PNA-LNA方 法的複雜度算中等、sensitivity不錯、檢測快速、最 重要的是便宜。

另外,目前我們實驗室還利用改變LNA而發展 出一個新的ZNA,可以提高檢測的敏感性到千分之 一以上,目前正在申請專利中,希望將來可以用來 偵測血液中的EGFR mutation,甚至將來可以和digital PCR結合,讓敏感性可以達到萬分之一以上。

Methodology-MASS Spectrometry

台大檢驗暨生物技術學系 俞松良副教授

當我們看到臨床檢體的時候,有兩件事情會 讓我們思考,一個是臨床檢體品質常常不好,第二 個部分是定量,有沒有辦法去定mutation的量,而 mutation的定量在臨床上有沒有意義,我們考慮到這 些問題。所以我們選擇用MASS system來檢測EGFR mutation。 MASS的原理很簡單,它其實就是一個分子天 平,先經過PCR放大,然後透過在mutation位點設計 extension primer,經過single nucleotide extension,因 為mutation nucleotide的重量不一樣,最後在Spectrum 上就會跑出不同的訊號。也因為Spectrum可以很長, 從5000到9000,所以它可以做一個multiplex反應,臨 床上的優勢就是可以用很少量的DNA,卻可以同時 偵測20幾種mutation,不只是EGFR,也同時可以看 KRAS、BRAF及HER2等等。另外,它可以透過計算 來定量mutant和wild type的比例。 和direct sequencing相比,direct sequencing的 優點是可以偵測到未知的mutation,這是其它包括 MASS等等方法都沒辦法做到的。但另一方面, MASS的敏感性較高,其sensitivity大概是1%,direct sequencing大概是12.5%;除此之外,MASS可以定 量,訊號和背景雜訊比值較低(singal-to-noise ratio), 偵測每個突變的單價較低,需要的檢體量也較少。 和其它非direct sequencing的檢驗方法相比,MASS 最重要的好處是它的flexibility,如果今天有一個新 的mutation出現,我們可以很快的就把probe設計在 裡面,這是一般商業化的檢驗組套所沒有辦法做到 的。 至於用這個檢驗方法對mutation定量出來的結 果是不是真的有臨床上的意義,我們的研究成果顯

核酸質譜儀檢測原理

Wild-type

Mutant

Starting template (sample)

PCR Amplification

Single primer extension Final products with different mass by single nucleotide extension

Mass Spectrometer

Analysis by MALDI-TOF MS

Primers for PCR reaction to amply interested region Probes for specific wild-type/mutation allele detection

核酸質譜儀優缺點 Comparison of MALTI-TOF MS and direct sequencing Technique comparison Direct sequencing 1.  2.  3.  4.  5. 

Low sensitivity Un-quantitative High SNR High cost/one mutation High amount sample requirement

1.  2.  3.  4.  5. 

High sensitivity quantitative Low SNR Low cost/one mutation Low amount sample requirement

MALDI-TOF MS

Limitation: un-de novo exploration

Convenience and Flexibility

示:臨床上使用EGFR-TKI的disease-free survival比較 差的病人,他的T790M的frequency確實是比較高。 關於檢驗的turnaround time,此平台剛開始設立時大 概是6天多一點,目前時間已經縮短到小於4.8天。

Clinical application and limitation

台大醫院內科部 施金元教授 TKI標靶治療的response rate是一般化療的兩倍, progression-free survival也是化療的兩倍,病人生活 品質指標也較接受化療者好。所以臨床上很明顯的 看到,對有EGFR mutation的病人而言,使用標靶藥 物的確比較有效。 臨床上常會看到亞洲、不抽菸的女性、腺癌, 使用標靶藥物比較有效,這是因為這類病患有較高 的EGFR mutation比率。IPASS研究用臨床因子來選

現在治療肺癌病患,不只要知道其細胞組織型 態,還要知道其各種mutation的報告,各種mutation 都有相對應的藥物治療,雖然很多標靶治療還在 臨床試驗階段。健保規定肺腺癌要檢測出EGFR mutation陽性,才可以用EGFR-TKI標靶藥物當做病 患的第一線治療,萬一是陰性或檢測不出來,就只 能做化療。會有這種結論是因為有數個第三期臨床 試驗顯示,對有EGFR mutation的病人,給EGFR-

6


EGFR mutation test method 半的病人有效,吃藥有效的時間也會比較短。exon 20 insertion就跟wild type一樣沒效,但是也有研究發 表一些特殊的exon 20 insertion是有效的。至於一些 奇怪少見的point mutation,通常也是無效。臨床上偶 而會看到病患有complex mutation,如果是合併exon 19 deletion或是L858R,則EGFR-TKI的效果還是不 錯,可是如果complex mutation合併的不是sensitive mutation,那效果會比較差。反過來說,以前可能看 到某些檢驗結果是EGFR wild type的病患卻對EGFRTKI有效,有可能是因為一些少見或是之前不知道的 mutation,我們卻把它當成wild type的情況。 第二個是quantity,中國大陸有一個研究,分 別用Direct sequencing和ARMS Scorpion去做EGFR mutation testing,理論上EGFR mutation量高的, 兩個方法都會驗的出來,EGFR mutation量低的就 只有ARMS Scorpion才驗的出來。最終他們發現 EGFR mutation量的高低會影響EGFR-TKI治療的 progression-free survival,量比較高的可以用到16個 月,量比較低的只能用到11個月。 再來是pretreatment T790M的量,我們都認為 T790M是抗藥性的突變,如果是用high sensitivity 的方法,例如ARMS和MASS spectrometry,測到 pretreatment T790M,也許治療還是會有效,只是 progression-free survival會比較短;但如果是用Direct sequencing測出pretreatment T790M,那麼第一線治療 也許就不太適合使用EGFR-TKI。有些研究發現Bim 的表現量可以來預測吃藥的時間長短,有一篇研究 是用免疫組織染色的方法去檢測,發現Bim染色結果 的高低跟吃藥的有效時間是有相關的,另一篇研究 則是發現Bim基因的polymorphism和抗藥性有關。另 外,我們的研究顯示,如果病患檢體EGFR mutation 陽性,而TTF-1免疫組織染色為陰性,病人吃藥的有 效時間比TTF-1免疫組織染色為陽性的病人短。

擇病人,隨機分配病患使用EGFR-TKI標靶治療或 是化療,事後再把病患的檢體拿來檢測,發現有 EGFR mutation的病患使用標靶藥物的progression-free survival比同樣有突變但使用化療 (taxol及carboplatin) 的病患好;但如果是EGFR wild type的病人使用標 靶治療,則會比化療差。這個研究其實告訴我們, 不應該用病人的臨床特徵來選擇藥物,而是應該做 EGFR mutation testing,有突變的就可以用EGFRTKI,沒突變的就應該用化療。另外,這個研究也同 時收集病人的quality of life資料,發現有mutation的 病人使用標靶藥的quality of life會比傳統化療好,但 是對wild type則剛好相反,因為沒有效,所以quality of life也會比化療差。整理來講,對EGFR mutation positive的病人,第一線用標靶治療可以看到比較好 的progression- free survival和response rate,還有比較 好的quality of life,又因為其毒性比較小,病人的接 受度也比較高。另外,日本在Iressa上市前,第四期 肺癌的病人平均存活一年,Iressa上市後,平均存活 期變成一年半。這是整體成績,如果單看EGFR沒有 突變的病人,平均存活期並沒有改變;真正改變的 是EGFR mutation positive的病人,在Iressa上市前的 存活期中位數是13個月,上市後存活期中位數是27 個月。 臨床上有些因素會影響EGFR-TKI有效的時間 的長短,第一個最重要的是mutation type,第二個是 quantity。不同的mutation type對EGFR-TKI的藥效是 不一樣的,常見的exon 19 deletion跟L858R對EGFRTKI最有效;exon 19 deletion中,E746-A750是最常 見的,還有一種是E747-A750約佔25%,這些吃藥大 概都有效,有時候用Direct sequencing會看到一些比 較少見的deletion,這些在臨床上看到的效果比較不 好,常見的exon 19 deletion的response rate大概是7080%,但是那些少見的exon 19 deletion,大概不到一

Diagnostic algorithm, lab certiication and TFDA regulation: Proposal of a Taiwan consensus 病理醫師在肺癌的診斷及治療上,扮演越 來越重要的角色,肺癌最常見的四種癌型分別是 adenocarcinoma、squamous cell carcinoma、large cell carcinoma及small cell carcinoma,對非小細胞肺癌而 言,病理醫師至少要能正確的區分出squamous cell 和 non-squamous cell NSCLC,因為這會牽涉到臨床上用 藥的效果及毒性。 再來是分子病理檢驗,進一步分析病人有沒 有特殊的基因突變,可以知道這個病人是否適合 某些標靶藥物治療。在做分析的時候必須考慮到 癌細胞的變異性(tumor cell heterogeneity) 和組織的 變異性(tissue cells heterogeneity),通常在做分子病 理檢驗時,不管是用什麼方法,都會希望先做一

台北榮總病理檢驗部 周德盈主任

Lung Carcinoma  Histology    The  Present:  “Molecular-­‐Therapeu�c  Triage”   Carcinoma (CA) Non-small Cell CA (NSCC) Small Cell CA

Squamous Cell CA Non-squamous Cell NSCC Adenocarcinoma Other NSCC

Typical Carcinoid Atypical Carcinoid

Large Cell CA

Molecular Analysis EGFRoma, ALKoma…

Other Large Cell CA Large Cell Neuroendocrine CA

Neuroendocrine CA

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EGFR mutation test method Study of Lung Cancer (IASLC), 和Association for Molecular Pathology (AMP)三大醫學會所聯合發表的 一個最新指引,值得我們借鏡。 Ref: Molecular testing guideline for selection of lung cancer patients for EGFR and ALK tyrosine kinase inhibitors: guideline from the College of American Pathologists, International Association for the Study of Lung Cancer, and Association for Molecular Pathology. J Thorac Oncol. 2013 Jul;8(7):823-59.

個microdissection,目的是在enrich標本裡面腫瘤細 胞的比例。病理科醫師可以依據不同的sensitivity 要求、不同的標本、不同的DNA含量來選擇EGFR mutation testing的方法,目前北榮的經驗是做Direct sequencing、和real-time PCR-based system (包括 Qiagen Scorpion ARMS和Roche Cobas system)。 談到台灣要形成EGFR mutation testing的共 識,一定要提到今年4月間,由College of American Pathologists (CAP), International Association for the

CAP IASLC AMP MOLECULAR TESTING GUIDELINE Q1.什麼樣的肺癌病人需要做EGFR mutation testing?

1. 腺癌 2. 含有腺癌成分的混合癌型肺癌 3. 標本裡面無法完全排除沒有腺癌成分 4. 病理是鱗狀上皮癌或小細胞肺癌,但臨床上是年輕、或是沒有吸菸史的病患

Q2.什麼時間點需要做EGFR mutation testing?

1. 第一次診斷為晚期肺癌 2. 當疾病治療過後但復發或惡化時

Q3.檢驗報告的時間可以多快?

在實驗室收到標本的兩週(10個工作天)內

Q4.標本應該如何處理?

1. 福馬林固定蠟包埋(FFPE)、新鮮冷凍或酒精固定的標本都可以 2. 經過強酸或重金屬固定,或是脫鈣處理的標本應該避免 3. 細胞標本可以做,細胞蠟塊比抹片好

Q5.標本有甚麼需求?

1. 癌細胞以及DNA的量和品質 2. 癌細胞在標本中要有一定的比例及總量 3. 病理醫師應該要檢視每個標本的腫瘤狀況,有需要的時候要做顯微切割 (microdissection)以增加送檢檢體中的癌細胞比例

Q6.要怎麼樣去做EGFR mutation testing?

1. 任何經過認可而且表現穩定的檢測方法都可以 2. 檢測的方法應該基本至少能夠偵測到癌細胞比例大於50%檢體的突變,但最好 能夠敏感到偵測癌細胞比例大於10%檢體的突變 3. 要能檢測出文獻報告佔肺腺癌所有種類EGFR mutation超過1%的突變 4. 不建議用total EGFR免疫染色的結果去選擇EGFR-TKI用藥 5. 不建議用EGFR拷貝數分析(例如FISH或CISH)的結果去選擇EGFR-TKI用藥

Q7.KRAS檢測在EGFR-TKI治療上 的角色?

不建議用KRAS的檢測結果作為選擇是否使用EGFR-TKI治療的主要決策

Q8.在EGFR-TKI出現抗藥性後的 EGFR mutation testing,有什麼 額外需要考慮的問題?

當病患出現EGFR-TKI抗藥性後的EGFR mutation testing,應該要使用能夠偵測到 癌細胞比例只有5%檢體的EGFR T790M突變的檢測方法。

Q9.肺癌有其他分子標記需要做 嗎?

1. EGFR mutation testing是肺腺癌分子標記的首要檢測 2. 在EGFR mutation testing之後,ALK mutation testing是第二個應該考慮的檢測

Q10.所有肺腺癌都應該同時檢測 EGFR和ALK嗎?

實驗室可考慮建立檢驗流程,以期能強化肺腺癌分子檢測的效率

Q11.EGFR和ALK的檢驗結果應該 檢驗結果及判讀的報告應該要讓腫瘤科醫師及非專科的病理科醫師能夠清楚容易 如何報告? 地了解 Q12.要如何認證EGFR和ALK testing?

和其他分子檢測以及FISH testing一樣的準則

Q13.要如何維繫品質保證?

EGFR及ALK testing和其他臨床實驗室檢測的品質管制及品質保證的政策及過程 是類似的。如果可以,有執行EGFR及ALK testing的實驗室應該參加能力試驗 (proficiency testing)

本刊物由台灣肺癌學會發行,邱昭華秘書長、林宜婷、許萍萍製作,刊物內容皆已取得演講者授權同意出版。 感謝EGFR mutation test method symposium活動參與者分享研究心得與臨床經驗。 感謝臺灣阿斯特捷利康股份有限公司、羅氏大藥廠股份有限公司支持贊助。

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EGFR monograph  
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