Page 1

CRISTALOGRAFÍA DE RAYOS X Hay que vencer muchos obstáculos experimentales antes de que la estructura tridimensional de una macromolécula sea determinada por difracción de rayos X de cristales. Primero la molécula debe ser cristalizada y el cristal debe ser singular (no más de una conformación en el mismo arreglo) y de calidad perfecta. Innumerables esfuerzos por determinar estructuras moleculares han fallado en este parte. La cristalización de proteínas es más que una ciencia, un arte. Muchas moléculas importantes no aparecen en el PDB porque han fallado los intentos por tener cristales adecuados. Las moléculas con porciones altamente hidrofóbicas no pueden ser cristalizadas, pero en algunos casos, los cristales se pueden obtener en presencia de detergentes. Esto explica la casi nula presencia de porciones transmembranales de proteínas en el PDB (a pesar de que existen algunos ejemplos de proteínas en soluciones de detergente resueltas por RMN). Se ha tenido mucho éxito al cristalizar dominios extracelulares clonados y expresados o porciones de receptores de membrana, porciones que carecen de las regiones hidrofóbicas unidas a la membrana.

Figura: un cristal de proteína. Una vez que se ha obtenido el cristal, se produce un patrón de difracción por irradiación de rayos X. Este patrón consiste de miles de puntos que son los datos crudos.

Figura: patrón de difracción de una proteína La posición e intensidad de cada punto es determinada relativamente fácil, las fases de las ondas que formaron cada punto debe ser también determinada para producir un mapa de densidad electrónica.


Figura: mapa de densidad electrónica de una proteína Resolver el "problema de la fase" es el segundo obstáculo. A menudo esto se acompaña al irradiar dos o más derivados del mismo cristal que difieren solamente en la presencia de iones de metales pesados. Este es el método del "remplazo isomórfico" y requiere que los iones de metal sean incorporados en un cristal sin afectar la estructura, lo cual en ocasiones no es posible. Una solución más reciente para resolver el problema de la fase involucra utilizar la radiación de zincrotrón a varias longitudes de onda y ha acelerado la velocidad para resolver estructuras cristalinas. La descripción completa de cada reflexión - su posición, intensidad y fase - es denominada "factor de estructura". Los factores de estructura están disponibles en el PDB para aproximadamente 25 % de las entidades cristalográficas. Al publicar los factores de estructura, permite a otros investigadores generar y examinar los mapas de densidad o tratar refinamientos alternativos o métodos de fase.

Figura: posición de los átomos resueltos por cristalografía de rayos X. Los rayos X son difractados por los electrones de las moléculas en el cristal, de ahí que los resultados de una cristalización exitosa y la solución del problema de fase es una imagen tridimensional de las nubes electrónicas (un mapa de densidad electrónica). Esta imagen se interpreta al construir un modelo de la proteína que se ajuste al mapa. Un modelo molecular de la secuencia de aminoácidos o nucleótidos que se conozca mejor independientemente, es ajustado dentro del mapa de densidades electrónicas y se termina con una serie de refinamientos. El resultado es un juego de coordenadas Cartesianas X, Y, Z para cada átomo que no sea un hidrógeno en la molécula.


Figura: ¿cómo funciona un difractómetro de rayos x? Un resultado del refinamiento es la asignación de un factor de temperatura para cada átomo en el modelo final. Un factor de temperatura elevado sugiere desorden o movimiento térmico. Aquí desorden significa que el átomo ocupa diferentes posiciones en diferentes moléculas del cristal y movimiento térmico se refiere a vibraciones de un átomo sobre su posición de reposo. Estas posibilidades no pueden ser distinguidas únicamente a partir de los datos de difracción. Si porciones de una cadena tienen alta movilidad o desorden, producen densidades electrónicas pobres o poco homogéneas, lo que hace imposible asignar posiciones a los átomos en esas regiones. Por esta razón es común encontrar que los extremos amino o carboxilo terminal y tal vez que uno o dos giros de una proteína carezcan de coordenadas cristalográficas. Los programas de cómputo RasMol y Chime tienen en sus menús de color un esquema designado. "temperatura". Este proceso asigna colores cálidos a factores de temperatura elevados y colores fríos a los bajos.

Cristalografia de rayos x  

Hay que vencer muchos obstáculos experimentales antes de que la estructura tridimensional de una macromolécula sea determinada por difracció...

Read more
Read more
Similar to
Popular now
Just for you