Issuu on Google+

ansformación bacteriana pGLO baixo luz ambiente

pGLO baixo luz UV

Nesta práctica realizarase unha transformación xenética. Un xen é un fragmento de ADN que provee as instruccións para a biosíntese dunha (ou codifica para unha) proteína. Esta proteína dalle a un organismo unha característica particular. A transformación xenética ocorre cando unha célula incorpora e expresa dentro dela un novo pedazo de material xenético (ADN). Esta nova información xenética moitas veces proporciona ó organismo unha nova característica que pode ser identificada logo de que teña lugar a transformación. Unha transformación xenética é polo tanto un cambio na constitución xénica dun organismo e conleva a inserción de un ou máis xenes en orde de cambiar as características do mesmo.

A transformación xenética é utilizada en moitas áreas da biotecnoloxía. Na agricultura, os xenes que codifican para características como a resistencia á descomposición, á conxelación ou ás alimañas, poden ser transformadas xenéticamente nas prantas. Na biorremediación, as bacterias poden ser xenéticamente transformadas con xenes que lle permitan dixerir verquidos de petróleo ou outros compostos. Na medicina, estanse empezando a tratar con terapia xénica enfermedades causadas por xenes defectuosos, o que implica a transformación xénica dunha célula da persona enferma con copias sans do xen defectuoso que causa a enfermidade.

Os xenes poden ser sacados do xenoma humano, animal ou vexetal e postos dentro dunha bacteria. Por exemplo, a hormona insulina humana é producida agora por bacterias, purificada e vendida nas nosas farmacias para o tratamento da diabete, cubríndose deste xeito a carencia que supón a inactividade deses xenes nos individuos enfermos.

Nesta práctica utilizarase un procedemento que transformará a bacteria E. coli con un xen que codifica para unha proteína fluorescente de cor verde (GFP). Este xen foi extraído da medusa Aequorea victoria, que é fluorescente e bioluminiscente. A proteína fluorescente verdosa fai que a medusa brile na escuridade. Despois do proceso de transformación, a bacteria expresa o xen de medusa adquirido e produce a proteína fluorescente, que fai que as colonias teñan aspecto verde brilante baixo a luz ultravioleta.

Nesta actividade pódese ver o proceso de transferencia dun xen desde un organismo a outro coa axuda dun plásmido. As bacterias ademáis de posuir un cromosoma grande, comúnmente


teñen pequenas moléculas circulares de ADN chamados plásmidos (unha ou máis). O ADN do plásmido adoita conter xenes para unha ou máis características que poden ser beneficiosa para a supervivencia da bacteria. Na natureza as bacterias poden transferir plásmidos entre elas permitindo así compartir xenes beneficiosos. Este mecanismo na natureza permítelle ás bacterias adaptarse a novos ambientes. No exercicio utilizamos o plásmido pGLO que contén o xen para a síntese da GFP. Introduciráse o pGLO na bacteria E. coli propiciándose que teña lugar unha transformación bacteriana.

Os plásmidos pGLO que se usarán conteñen ademáis un xen de resistencia ó antibiótico ampicilina (amp). O pGLO tamén incorpora un sistema especial de regulación xenética. Este sistema pode ser usado no control da expresión da proteína fluorescente en células transformadas. Xa que logo, o xen da GFP pode ser activado en células transformadas ó engadir o sucre arabinosa no medio de cultivo onde medran as células.

Logo de realizar a transformación fanse medrar as células en medio LB-Agar en presenza de ampicilina. A ampicilina evita que as bacterias non transformadas medren na placa de cultivo. As colonias de células transformadas aparecen de cor branca nas placas que conteñen medio LB e ampicilina. Para inducir a expresión do xen da GFP ten que se facer medrar as bacterias en presenza de arabinosa. As bacterias que medran en LB con arabinosa e con ampicilina vense fluorescentes e de cor verde no lugar de brancas.

Procedemiento:

1. Etiquetar un micro tubo con +DNA e outro con –DNA. Colocar o identificador de alumno/grupos. Colocar os microtubos na gradilla.

2. Abrir os tubos e, utilizando unha pipeta de transferencia estéril, engadir 250 µL da solución de transformación (CaCl2).

3. Colocar os tubos en xeo. 4. Con un asa estéril tomar unha colonia illada da placa que contén o cultivo bacteriano. Colocalo no microtubo rotulado +DNA, verificar que a colonia se dispersa na solución de transformación. Colocar o tubo novamente no xeo. Repetir este procedemiento co tubo rotulado –DNA.


5. Observar a solución de DNA pGLO baixo luz ultravioleta. Anotar as observacións. Mergullar un asa estéril no tubo co plásmido, observar que teña solución e mesturar no tubo rotulado +DNA. Pechar o tubo e colocar de novo en xeo. Non engadir o plásmido ó tubo rotulado DNA.

6. Incubar os tubos en xeo durante 10 minutos

7. Mentres os tubos están no xeo; rotular as placas de agar seguindo o indicado no esquema do protocolo.

8. Realizar o choque de calor. Transferir ambos tubos no baño de auga axustado a 42 °C , durante 50 segundos exactamente. Asegurarse de que tódolos tubos estean mergullados na auga. Cando pase o tempo requerido, colocar os tubos no xeo. Para mellores resultados os cambios de xeo (0°C) a 42°C e de 42ºC a xeo teñen que ser rápidos. Incubar os tubos no xeo durante 2 minutos.

9. Retirar do xeo a gradilla que contén os tubos. Usando unha pipeta estéril, engadir 250 μl do caldo LB en cada tubo y pechalo. Repetir o mesmo co outro tubo e incubar ambos tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente.

10. Tapar os tubos e mesturar. Usando unha pipeta nova, transferir 100 μl das suspensións de transformación e de control.

11. Utilizar unha pipeta estéril para cada placa. Extender ben sobre a superficie do agar en cada placa usando asas de Drigalsky. 12. Invertir as placas. Rotular e colocar na estufa de cultivos a 37°C durante unhas 24horas.



teoria transformacion bacteriana