Page 1

Lambda. Cuestións de aplicación. Guía de respostas Lección 1. Enzimas de restricción. Un par de cuestións traballando cos datos das bases de datos moleculares. Accede á páxina do NCBI coa secuencia completa do fago lambda: (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/215104) e contesta ás seguintes preguntas: Localiza as secuencias palíndromicas de corte das enzimas EcoRI (GAATTC/CTTAAG), HindIII (AAGCTT/TTCGAA) e PstI (CTGCAG/GACGTC). Cantos fragmentos se espera que produzan os ataques sobre o xenoma completo do fago lambda con cada un deses enzimas?Os resultados se presentan nunha táboa na seguinte ligazón: http://goo.gl/7oCri. Para cada secuencia de corte, á paxina devolve as posicións dentro da secuencia do xenoma completo do seguinte modo: Neste exemplo, o punto de corte número 10 dun total de 28 para a secuencia de corte da enzima PstI (CTGCAG), comeza no par de bases da posición 5214 e remata na 5219 (a referencia J02459 é o número de acceso correspondente ó xenoma do fago lambda na páxina web da NCBI, observa que é o mesmo en tódolos resultados deste exercicio). Construindo unha sinxela folla de cálculo podemos obter o número de pares de bases de cada fragmento. Para os últimos fragmentos cómpre ter en conta que a secuencia completa do xenoma do fago lambda contén un total de 48502pb (dato que tamén proporciona a páxina indicada no enunciado). Cantos pares de bases ten cada un deses fragmentos? Se non es quen de resolver esta pregunta na páxina do NCBI, podes usar o geneboy (http://www.dnai.org/geneboy/) para resolver esta cuestión.Podes atopar os resultados na táboa á que se fai referencia na resposta anterior: http://goo.gl/7oCri. Unhas cuestións sobre o realizado no laboratorio. Describe o aspecto macroscópico do ADN en disolución. É visible o ADN? (Podes tomar como referencia para comparar o que viches na práctica “xenética a domicilio”). Se pensas que hai algunha diferencia entre as dúas observacións, a que se pode deber?O ADN non é visible nesta práctica. A disolución que contén o ADN é totalmente transparente. A diferencia coa práctica “xenética a domicilio” é a cantidade de ADN, que neste caso é moito menor. Enche a táboa seguinte cos volumes usados na práctica. Tubo Lambda Tampón PstI


EcoRI HindIII P 4μL 5μL 1μL E 4μL 5μL 1μL H 4μL 5μL 1μL L 4μL 5μL En que tubo pensas que non vai a haber cambios, que non se van a producir fragmentos de restricción do ADN?No tubo no que non se introduce nengunha enzima de restricción, o tubo L. Compara o tubo P e o tubo L, qué pensas que pasará no tubo P comparado co tubo L? Xustifica a resposta.No tubo P terá lugar unha dixestión enzimática do ADN do fago lambda. O resultado será a formación dun número determinado de fragmentos por cada molécula completa de ADN orixinal. Se o ADN aparecese fragmentado ó final da reacció no tubo L, que teríamos que concluir?O máis probable é que se producira unha contaminación a partires de algunha punta de pipeta e que chegaran a ese tubo algunha enzimas de restricción. Outra posibilidade è que a contaminación proveña do propio operario por non usares luvas ou por utilizares instrumental non axeitado; deste modo é doado transmitir ADN-asas que poderían ter fragmentado o ADN. Lección 2. Electroforese en xel de agarosa


Indica cal será o ordenamento relativo dos fragmentos de ADN segundo o seu tamaño, dentro do xel de agarosa. Indica cal é a causa de ese ordenamento.Os máis grandes, con máis pares de bases, desprázanse máis lonxe das pozas do xel, mentres os máis pequenos quedan máis preto. Os fragmentos máis grandes teñen máis problema para se desprazar a través da matriz do xel, que ofrece máis resistencia, mentres que os máis pequenos poden facelo de xeito tanto máis doado canto menores son. Supoñendo que tiveramos 500 pequenos anacos de cada un dos catro fragmentos logo dun tratamento con enzimas de restricción, cantas bandas aparecerían no xel de agarosa?Non importa o número de fragmentos, mentres teñan o mesmo tamaño hanse desprazar xuntos dando lugar a unha única banda no xel. Se hai 500 anacos de cada un dos catro tamaños diferentes de fragmentos resultantes dunha dixestión enzimática, aparecerán catro bandas. Enche a seguinte táboa cos datos obtidos na práctica:Variable segundo a imaxe usada (en todo caso, poden servir coma exemplo os datos proporcionados nos resultados de referencia xa publicados. Máis que as distancias en sí mesmas, o interesante é observar se hai coincidencia entre o observado no laboratorio e o esperado en función da análise bioinformática (cuestións 1 e 2 da lección 1). No caso de qwue non sexa así, por exemplo nos datos obtidos a partires da dixestión con PstI (agardábamos observar 29 bandas), hai que pensar que os tamaños dos fragmentos máis pequenos son tan reducidos que precisariamos unha cantidade moito maior de mostra para observalos, ademáis de que a tinción FastBlast tampouco é a mellor, probablemente veríamos máis bandas usando bromuro de etidio. M M L L PstI PstI EcoRI EcoRI HindIII HindIII mm pb mm pb


mm pb mm pb mm pb Banda 1 Banda 2 Banda 3 Banda 4 Banda 5 Banda 6 mm= distancia en mm; pb= número de pares de bases do fragmento Lección 3. Cómo se fai para converter en visible o ADN migrado nun xel de agarosa. Indica a utilidade do tampón de carga e da tinción Fast Blast.O tampón de carga permite observar a mostra no momento de pinchala nas pozas do xel de agarosa e tamén observar a fronte de avance durante a migración electroforética. Pola contra, a tinción FastBlast á que se somete o xel logo da migración serve para tinguir o ADN e facer visibles as diferentes bandas no xel. Outro tipo de tinción usado é o Bromuro de etidio. Indica as principais diferencias en comparanza co Fast Blast.O bromuro de etidio fai visibles as bandas baixo luz UV, non con luz visible. Na outra man, a capacidade de observar bandas de baixa concentración de mostra é moito maior co bromuro de etidio que co Fast Blast. Por último, a peligrosidade do bromuro de etidio é ben coñecida polo seu carácter canceríxeno e teratoxénico.

verdaderas respuestas de fago lambda  
verdaderas respuestas de fago lambda  

verdaderas respuestas de fago lambda

Advertisement