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畜牧兽医学报  2007 ,38 (8) :814~821

A ct a V eteri nari a et Zootechnica S i nica

肉鸡肠道 Pe p T1 mRNA 表达的肠段差 异性与发育性变化 王修启 ,邹仕庚 ,左建军 ,苏海林 ,黄志毅 ,冯定远 3 ( 华南农业大学动物科学学院 ,广州 510642)

摘  要 : 选用遗传背景相同的 1 日龄父母代雄性 Arbor Acre ( AA ) 鸡和父母代雄性岭南黄肉雏鸡各 120 羽 , 采用 相对定量 R T2PCR 方法 ,以 30 d 时岭南黄鸡肠道样品为模板 ,研究肉鸡肠道寡肽转运载体 1 ( Peptide t ranspo rter 1 , Pep T1) mRNA 表达的肠段差异性 ; 以 AA 肉鸡和岭南黄鸡十二指肠和空肠样品为模板 , 研究不同品种肉鸡肠道 Pe p T1 mRNA 表达的发育性变化 。结果显示 : ( 1) 岭南黄肉鸡肠道 Pe p T1 mRNA 的表达丰度从十二指肠 、 空肠 、

回肠到结直肠依次降低 ,其中十二指肠显著高于结直肠 ( P < 01 05) ; (2) AA 鸡和岭南黄肉鸡 Pe p T1 mRNA 在十二 指肠及空肠中的表达具有相同的发育模式 ,16 d 表达丰度最高 ,16~44 d 逐渐下降 ,58 d 略微回升 ; 不同基因型之 间 Pe p T1 mRNA 丰度比较 , AA 鸡和岭南黄肉鸡两品种间 Pe p T1 mRNA 的表达没有显著差异 ( P > 01 05) 。以上 结果说明 : ( 1) 随着肠道空间位置的后移 ,岭南黄肉鸡肠道 Pe p T1 mRNA 的表达丰度逐渐降低 ,其中十二指肠的表 达丰度显著高于结直肠 ( P < 01 05) ; ( 2) 不同品种肉鸡十二指肠及空肠 Pe p T1 mRNA 的表达具有相同的发育模式 , 且同日龄两品种间的表达丰度未见明显差异 ,表明 Pe p T1 mRNA 表达受到发育阶段的调控 , 但品种间具有稳定 性。 关键词 : 肉鸡 ; 肠道 ; Pe p T1 mRNA ; 肠道差异性表达 ; 发育性表达 中图分类号 : S8311 2     文献标识码 : A     文章编号 :036626964 ( 2007) 0820814208

Regional and Ontogenetic Expression of Pe p T1 mRNA in Intestine of Broiler WAN G Xiu2qi ,ZOU Shi2geng , ZUO J ian2jun ,SU Hai2lin , HU AN G Zhi2yi , F EN G Ding2yuan 3 ( College of A nimal Science , S outh China A gricultural Universit y , Guangz hou 510642 , China)

Abstract : 120 12day2old parental male Arbor Acre ( AA ) broiler and 120 12day2old parental male Lingnan yellow broiler were rando mly divided into 4 replicates , respectively1 Regio nal exp ressio n of Pep tide t ransporter 1 ( Pep T1 ) mRNA in different intestinal t ract segment s of Lingnan yellow broiler o n 30 d and o ntogeny of Pe p T1 mRNA in duodenum and jejunum of AA broiler and yellow broiler were determined by relative quantitative R T2PCR1 The result s showed t hat : ( 1 ) Regio nal exp ressio n of Pe p T1 mRNA in duo denum , jejunum , ileum and colo rect um was declined gradually1 The abundance of Pe p T1 mRNA in duodenum was higher t han in colorect um ( P < 01 05) ; ( 2 ) Ontogeny pat terns of Pe p T1 mRNA in duodenum and jejunum were co nsistent be2 t ween AA broiler and Lingnan yellow broiler1 The abundance of Pe p T1 mRNA in two st rains was t he highest o n day 16 , decreased f ro m day 16 to day 44 and slightly increased again o n day 581 While co mpared t wo breeds directly , t he abundance of Pe p T1 mRNA in AA broiler was not significant difference t han t hat in Lingnan yellow broiler f ro m day 2 to day 58 ( P > 01 05) 1 These result s indicated t hat : ( 1 ) Regio nal exp ressio n of Pe p T1 mRNA in intestine of Lingnan yellow broiler was declined gradually alo ng t he downward intestine f ro m duodenum , jejunum , and ileum 收稿日期 :2006209226 基金项目 “ : 国家重点基础研究发展计划”(973) 项目 (2004CB117501) ; 国家自然科学基金 (30671519) 作者简介 : 王修启 (19682) ,男 ,河南新乡人 ,博士 ,副研究员 ,主要从事动物分子营养研究 , E2mail :qidi2936 @1261 co m , Tel :020285285469 3 通讯作者 : 冯定远 , E2mail :fengdy @scau1 edu1 cn


8 期

王修启等 : 肉鸡肠道 Pe p T1 mRNA 表达的肠段差异性与发育性变化

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to colorect um1 The abundance of Pe p T1 mRNA in duodenum was higher t han in colorect um ( P < 01 05) ; ( 2) Ontogeny of Pe p T1 mRNA in t wo breeds had t he same pat tern in duodenum and je2 junum , and t here was no difference at same develop ment stage bet ween AA broiler and Lingnan yellow broiler , indicating t hat Pe pt T1 mRNA exp ressio n co uld be regulated by develop mental stage but not breeds1 Key words : broiler ; intestine ; Pe p T1 mRNA ; intestinal regio nal exp ressio n ; o nto genetic exp res2 sio n

  游离氨基酸和寡肽 ( 二肽和三肽) 是日粮蛋白质 在肠道的主要消化产物 。蛋白质在肠道最终的吸收 机制主要有两种 ,一是由特异的氨基酸转运系统转 运游离氨基酸 , 另一种是由寡肽转运载体 ( Peptide t ranspo rter ,Pep T) 转运寡肽 [ 1 ] 。目前已知的寡肽 转运载体包括 Pep T1 和 Pep T2 ,均是质子依赖性寡 肽转运载体 ( Proto n dependent oligopeptide t rans2 po rters , PO T) 家族的成员 。Pep T1 是低亲和力/ 高 容量的肽载体 , 主要在消化道中表达 ; Pep T2 是高 亲和力/ 低容 量的 肽载体 , 主 要在 肾 脏 中 表 达 [ 2 ] 。 Pep T1 对于大多数二肽和三肽都具有很高的转运 活性 ,但对游离氨基酸 、 四肽及其以上的寡肽没有转 [3 ] 运功能 。二肽和三肽主要是由 Pep T1 以小肠黏 膜细胞 p H 梯度为动力进行转运 。肠上皮刷状缘上 的 Na + / H + 泵在肠黏膜的表面维持了较低的 p H 微 环境 ,有利于寡肽的吸收 [ 4 ] 。   Fei 等首次在兔肠道克隆得到 Pe p T1 基因的 mRNA 序列 [ 5 ] ,随后人[ 6 ] 、 大鼠 [ 7 ] 、 小鼠[ 8 ] 、 绵羊 [ 9 ] 、 鸡 [ 10 ] 和猪[ 11 ] 等动物的 Pe p T1 基因被成功克隆 。人 和兔的 Pe p T1 mRNA 主要在小肠表达 [ 6 ,12 ] 。用取 自绵羊瓣胃 446 bp 长度的 Pe p T1 cDNA 探针对绵 羊、 奶牛 、 猪和鸡 Pe p T1 mRNA 的组织特异性进行 研究 ,发现在受试动物的小肠和绵羊及奶牛的瘤胃 和网胃均有 Pe p T1 mRNA 的存在 , 其大小也因物 种的不同而异 ,而其他组织如皱胃 、 大肠 、 肝脏 、 肾脏 [ 13 ] 和肌肉则无 Pe p T1 mRNA 的存在 。   动物的发育阶段和日粮可显著地调控 Pe p T1 基因 的 表 达[ 14 ] 。对 大 鼠 研 究 表 明 , 小 肠 Pe p T1 mRNA 从近端到远端是平均分布的 ,并且其丰度在 出生后 4 ~ 50d 保持不变 [ 15 ] 。Chen 等研究了发育 阶段对肉鸡肠道 Pe p T1 mRNA 表达的影响 , 结果 表明肉鸡肠道 Pe p T1 mRNA 丰度在胚胎 ( E16 ~ E20 ) 期很少能检测到 , 而在出壳 ( D0 ) 时上升 14 ~ 50 倍 ; 自由采食蛋白质为 24 %的日粮后 ,0 ~ 14 日 龄 Pe p T1 mRNA 丰度下降 ,至 35 日龄时又恢复至

中等水平 [ 16 ] 。对火鸡胚胎期肠道 Pe p T1 mRNA 表 达的研 究 显 示 , 出 壳 前 5 d 到 出 壳 时 , 火 鸡 肠 道 [ 17 ] Pe p T1 mRNA 表达丰度增加了 31 2 倍 。有 关 Pe p T1 mRNA 在不同物种发育性表达的研究 较 少 ,对岭南黄肉鸡出生后不同时期肠道 Pe p T1 mR2 NA 表达的发育性变化还未见报道 。   Arbor Acre ( AA ) 肉鸡以其生长速度快 , 饲料 转化效率高而著称 。岭南黄肉鸡因其肉质鲜美 , 适 应性和抗逆性强而具有广阔的市场前景 。本研究选 用遗传背景相同的 1 d 父母代雄性 AA 鸡和岭南黄 鸡 ,进行两阶段饲养 。分别于 2 、 16 、 30 、 44 和 58 d 采集十二指肠 、 空肠 、 回肠和结直肠样品 , 运用相对 定量 R T2PCR 方 法 研 究 岭 南 黄 肉 鸡 肠 道 Pe p T1 mRNA 表达的肠段差异性 ; 不同基因型肉鸡十二指 肠和空肠 Pe p T1 mRNA 表达的发育模式 , 并进行 品种间比较 ,揭示肉鸡 Pe p T1 mRNA 的表达规律 , 为寡肽营养在肉鸡生产中的应用提供理论依据 。

1  材料和方法 11 1  试验动物与样品采集 11 11 1  试验动物  选用遗传背景和批次相同 、 发育 ( ) 正常的父母代 1 日龄雄性 Arbo r Acre AA 鸡 ( 购

自广东穗屏科宝种鸡场) 和岭南黄 ( 购自广东省农业 科学院畜牧研究所祖代种鸡场 ,快大型 ,8 周龄上市 体重 11 5 kg) 肉雏鸡各 120 羽 ,按照平均体重一致的 原则分为 4 个重复 , 每个重复 30 只鸡 。试验初始 , AA 鸡和岭南黄肉鸡平均重量接近 , 分别为 401 7 g 和 401 1 g 。 11 11 2  日粮组成及营养水平  参照 N RC ( 1994 ) 和 国家标准 ( 1986 ) 0 ~ 8 周龄肉鸡营养需要设计饲料 配方 ,日粮组成和营养水平见表 1 。于试验 31 日龄 开始采用逐步换料的方法 ,至 34 日龄全部更换为后 期日粮 。 11 11 3  饲养管理与免疫  试验在华南农业大学动 物科学学院种鸡场进行 ,粉料饲喂 。红外取暖 ,自由


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畜  牧  兽  医  学  报

饮水和采食 ,人工持续光照 ,育雏温度按照生产程序 进行 ,常规免疫 。 11 11 4  组织采样  分别于 2 、 16 、 30 、 44 和 58 日龄 , 每组取接近平均体重的鸡 , 每重复 2 只共 80 只 , 断 颈宰杀 , 宰前不禁食 。分离 肠道 , 沿纵 向剖 开 , 用 4 ℃预冷的 PBS 缓冲液冲洗 , 吸水纸吸干 。分别从 十二指肠 U 状弯曲的起始处和结束处向下取 3 cm 肠段 ,作为十二指肠和空肠样品 ; 从回盲韧带起始处

38 卷  

t henic acid 12 mg ; Niacin 48 mg ; Folic acid 11 2 mg ; Biotin 01 06 mg ; Roxarsone 50 mg ; Salinomycin 90 mg

11 2  肠道 Pe p T1 mRNA 的相对定量 RT2PCR 11 21 1  样品总 RNA 提取和 RNA 电泳  采用 Tr2 izol ( 北京赛百盛基因技术有限公司 ) 一步抽提法提

取组织样的总 RNA ,紫外比色法测定总 RNA 的浓 度和纯度 ( Eppendorf Bio Photo meter 260 nm ) 。用

和回盲结向下取 3 cm 肠段 ,分别作为回肠和结直肠

11 4 %甲醛变性琼脂糖凝胶电泳 ,根据 28S r RNA 和

样品 。放入 11 5 mL 离心管中 ,置液氮速冻 , - 70 ℃ 冷冻保存 。

18S r RNA 的灰度比评价 RNA 的质量 。

表 1  日粮组成和营养水平 Table 1  Diet composition and calculated nutrients level %

组分 Ingredient s

含量 Content 0 - 30 d

玉米 Corn 651 00 玉米蛋白粉 Corn gluten meal 21 70 豆粕 Soybean meal 261 20 豆油 Soybean oil 0 鱼粉 Fish meal 21 00 石粉 Limestone 01 80 磷酸氢钙 Ca H PO 4 11 57 赖氨酸 L ys (78 %) 01 16 蛋氨酸 Met (98 %) 01 18 食盐 NaCL 01 29 ( ) 氯化胆碱 Choline chlo ride 75 % 01 10 11 00 预混料 3 Premix 合计 Total 100 营养水平 Calculated nut rient s level 代谢能 AM E/ ( MJ / kg) 121 12 粗蛋白 Crude p rotein 201 00 赖氨酸 L ys 11 10 蛋氨酸 Met 01 52 蛋 + 胱 Met + Cys 01 85 钙 Calcium 01 85 磷 Pho sp ho rus 01 67 有效磷 A P 01 45

31 - 58 d 671 65 41 00 221 02 21 00 0 01 87 11 62 01 27 01 15 01 34 01 08 11 00 100 121 75 181 00 11 00 01 45 01 76 01 80 01 61 01 40

3 . 提供 至 每 千 克 全 价 料 : 铜 51 00 mg ; 铁 691 00 mg ; 锌 841 00 mg ; 锰 981 60 mg ; 碘 11 14 mg ; 硒 01 30 mg ; 维生素 A 15 000 IU ; 维生素 D3 3 000 IU ; 维生素 E 251 5 mg ; 维生素 K3 21 1 mg ; 维生素 B1 21 4 mg ; 维生素 B2 9 mg ; 维生素 B 6 51 1 mg ; 维生素 B12 01 02 mg ; 泛酸钙 12 mg ; 烟酸 48 mg ; 叶

酸 11 2 mg ; 生物素 01 06 mg ; 洛克沙胂 50 mg ; 盐霉素 90 mg 3 . Supplied per kg feed : Cu 51 00 mg ; Fe 691 00 mg ; Zn 841 00 mg ; Mn , 981 60 mg ; I 11 14 mg ; Se 01 30 mg ; VA 15 000 IU ; VD3 3 000 IU ; V E 251 5 mg ; V K3 21 1 mg ; VB 1 21 4 mg ; VB2 9 mg ; VB6 51 1 mg ; VB12 01 02 mg ; Panto2

11 21 2  反转录  分别准确量取 2 μg 各样品的总 RNA 进 行 反 转 录 。建 立 各 样 品 RNA 的 cDNA ( R T p roduct ) 。反转录反应体积为 20 μL , 其中含 Oligo d T ( 18 ) 5 μmol/ L 引物 , 1 mmol/ L dN TPs ( 北京赛百盛基因技术有限公司) ,20 U RNA 酶抑

制剂 ( RNase inhibitor , Ta Ka Ra ,大连) ,200 U 反转 录酶 ( MML V R T , Pro mega ) , 4 μL 5 ×R T Buffer ( 含 250 mol/ L Tris2 HCl p H81 3 , 50 mol/ L MgCl 2 , 250 mol/ L KCl , 50 mol/ L D T T , 21 5 mol/ L Sper2 midine) 。样品总 RNA 、 Oligo d T ( 18 ) 和 dN TPs 在

反转录前 70 ℃变性 5 min ,冰上放置 5 min , 再加入 其余试剂 , 混匀后于 42 ℃反应 60 min ,95 ℃变性 5 min 。反 转 录 产 物 ( R T p roduct s ) - 20 ℃保 存 备 用。    以 30 d 时岭南黄鸡肠道各段样品为模板 ,研究 肉鸡肠道 Pe p T1 mRNA 表达的肠段差异性 ; AA 肉鸡和岭南黄鸡十二指肠和空肠样品为模板 , 研究 不同品种肉鸡肠道 Pe p T1 mRNA 表达的发育性变 化。 11 21 3  目的基因引物设计和 PCR 反应条件  PCR 引物采用 Primer 软件设计 ,由北京赛百盛基因技术 有限公司合成 ,引物序列及参数见表 2 。以 β2acti n 管家基因作为内标 , 对 Pe p T1 进行相对定量分析 。 PCR 反应在 MJ R P TC - 200 PCR 仪上进行 。   内 标 基 因 β 2acti n Primers ( 10 μmol/ L ) 和 Co mpetimers ( 10 μmol/ L ) 参 照 Dieffenbach 的 方

法 [ 18 ] ,将β2acti n Primers 的 3′ 端进行修饰 ( 北京赛 百盛基因技术有限公司) , 使其在 PCR 过程中只能 与模板结合而不能延伸 , 得到 β2acti n Co mpetim2 ers 。将β2acti n Primer s 和 Co mpetimer s 均稀释至 10 μmol/ L 备用 。   PCR 反应条件 : 采用单管法进行 PCR 扩增 , 以 混合样 ( 待测样品等比例混合) 对 PCR 反应条件 、 循


8 期

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王修启等 : 肉鸡肠道 Pe p T1 mRNA 表达的肠段差异性与发育性变化 表 2  Pe p T1 目的基因和 β2acti n 内标基因引物参数 Table 2  Parameters of primer pairs for Pe p T1 and β2acti n genes

目的基因

引物位置/ bp

引物序列

产物/ bp

Target genes

Localization

Primer sequences

Product s

Pe p T1

1 463~1 480

Sense 5′ 2C GCA TAC T GTCACCA TCA 23′

(A Y029615 GenBank)

2 031~2 014

Antisense 5′ 2 T TC T GCCCAC T GC TCAC T23′

β2acti n (L08165 GenBank)

83~101 373~355

Sense 5′ 2 T GC T GC GC TC GT T GT T GAC23′ Antisense 5′ 2 GGGT GC TCC TCA GGGGC TA23′

环数以及目的基因 Pe p T1 和内标基因 β2acti n 的 引物浓度等进行优化 。 Pe p T1 的 R T2PCR 条件如 下 : 在 20 μL 的反应体系中含有 1 μL 反转录产物 ,2 μL 10 × PCR Buffer , 11 5 mmol/ L MgCl 2 , 01 2 mmol/ L dN TPs ,01 8 μmol/ L 目的基因的上 、 下游 引物 , 01 4 μL β2acti n Primer s 和 11 6 μL Co mpe2 timer s ( 组织特异性研究) 或 01 6 μL β2acti n Primer s 和 11 4 μL Co mpetimers ( 发育性变化 ) , 01 5 U T aq DNA polymerase ( Fermentas , Liet uva ) 。PCR 反 应条件为 :94 ℃预变性 5 min ;94 ℃变性 30 s ,56 ℃退 火 30 s ,72 ℃延伸 50 s , 共 25 ( 组织特异性研究 ) 或 26 ( 发育性变化) 个循环 ;72 ℃延伸 10 min 。   电泳及灰度分析 : 取 10 μL PCR 产物在 21 0 %

569 291

Cambridge , U K) 进 行 , 根 据 目 的 基 因 和 β 2acti n PCR 产物的灰度比 , 确定样品中 Pe p T1 mRNA 表

达的相对含量 ,R T2PCR 过程至少重复 3 次 。 11 3  数据分析   试验数据以平均数 ±标准误 ( X ±S E) 表示 , 用 SPSS111 5 统计 ,差异显著性检验用独立样本 t 检验 和 单 因 子 方 差 分 析 ( o ne2way ANOVA ) , 以 Duncan′ S方法进行多重比较 。

2  结  果 21 1  岭南黄肉鸡 30 d 肠道 Pe p T1 mRNA 表达的

组织特异性   岭南黄肉鸡 30 d 时不同肠段之间 Pe p T1 mR2

EtBr 染色的琼脂糖凝胶上电泳 。图象处理及灰度

NA R T2PCR 产物代表性琼脂糖凝胶电泳见图 1 ,不

分析用 LabWorks Image Acquisitio n and A nalysis Soft ware 41 0 ( Ult ra 2 Violet Product s L t d 1 ,

同肠段组织中 Pe p T1 mRNA 基因表达的相对丰度 见

M. Marker (200DL) ;MiX. 混合样 ;D. 十二指肠 ;J . 空肠 ; I. 回肠 ;C. 结直肠 ( 图 2 同) , n = 8 M. Marker (2000 DL ) ; Mix. Mixt ure ;D. Duodenum ;J . J ejunum ; I. Ileum ;C. Colo rect um ( Fig. 2 is samel) ,n = 8 图 1  岭南黄鸡不同肠段间 Pe p T1 mRNA RT2PCR 产物代表性琼脂糖凝胶电泳 Fig1 1   Representative agarose gel electrophorese of Pe p T1 mRNA RT2PCR in different intestinal segments in Lingnan yellow broiler

图 2 。岭南黄肉鸡肠道 Pe p T1 mRNA 的表���丰度 从十二指肠 、 空肠 、 回肠到结直肠依次降低 , 其中十 二指肠表达丰度显著高于结直肠 ( P < 01 05) 。 21 2  不同品种肉鸡十二指肠 Pe p T1 mRNA 表达的 发育性变化   不同品种肉鸡十二指肠 Pe p T1 mRNA R T2 PCR 产物代表性琼脂糖凝胶电泳见图 3 , 不同品种

肉鸡十二指肠 Pe p T1 mRNA 表达的发育性变化见 图 4。   AA 鸡和岭南黄肉鸡十二指肠 Pe p T1 mRNA 表达具有相同的发育模式 , 16 d 表达丰度最高 ,16 d 到 44 d 逐渐下降 ,58 d 略微回升 。AA 鸡十二指 肠的 Pe p T1 mRNA 丰度 16 d 显著高于 2 和 44 d ( P < 01 05 ) ,30 d 显著高于 2 d ( P < 01 05) ; 而 16 和


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30 d差异不显著 ( P > 01 05 ) ;2 、 44 和 58 d 之间差异 亦不显 著 ( P > 01 05 ) 。岭 南 黄 肉 鸡 十 二 指 肠 的 Pe p T1mRNA 丰度 16 d 显著高于 2 d ( P < 01 05 ) ,

但与 30 、 44 和 58 d 差异不显著 ( P > 01 05) ;2 、 30 、 44 和 58 d 差异亦不显著 ( P > 01 05) 。不同品种之间十 二指肠 Pe p T1 mRNA 表达丰度比较 , 所有采样时 间点 ,两品种间差异均不显著 ( P > 01 05) 。 21 3  不同品种肉鸡空肠 Pe p T1 mRNA 表达的发育 性变化 无相同字母者表示同一品种同一日龄之间差异显著 ( P < 01 05) ,n = 8 Bars wit hout t he same letters indicate significant difference in different intestinal segment s ( P < 01 05) ,n = 8 图 2  岭南黄肉鸡肠道 Pe p T1 mRNA 表达的肠段差异性 Fig1 2  Regional expression of Pe p T1 mRNA in different in2 testinal segments of Lingnan yellow broiler

  不同品种肉鸡空肠 Pe p T1 mRNA R T2PCR 产 物代表性琼脂糖凝胶电泳见图 5 , 不同品种肉鸡空 肠 Pe p T1 mRNA 表达的发育性变化见图 6 。   AA 鸡和岭南黄肉鸡空肠 Pe p T1 mRNA 表达 具 有相同的发育趋势 ,16 d表达丰度最高 ,16到

M. Marker (DL2000) ; Mix. 混合样 ; A2 、 A16 、 A30 、 A44 和 A58 分别代表 2 、 16 、 30 、 44 和 58 d AA 鸡样品 。 Y2 、Y16 、 Y30 、Y44 和 Y58 分别代表 2 、 16 、 30 、 44 和 58 d 岭南黄肉鸡样品 ,n = 8 ,图 5 同 M. Marker (DL2000) ; Mix. Mixt ure ; A2 , A16 , A30 , A44 and A58 rep resent 2 , 16 , 30 , 44 and 58 d samples of AA chickens , respectively. Y2 , Y16 , Y30 , Y44 and Y58 rep resent 2 , 16 , 30 , 44 and 58 d samples of Lingnan yellow broil2 er , respectively , n = 8 , Fig. 5 is same 图 3  不同品种肉鸡十二指肠 Pe p T1 mRNA RT2PCR 产物代表性琼脂糖凝胶电泳 Fig1 3  Representative agarose gel electrophorese of Pe p T1 mRNA RT2PCR in duodenum of different broiler breed

44 d逐渐下降 ,58 d 略微回升 ; 与十二指肠相比 ,44 d 时的下降趋势与 58 d 时的回升趋势都较明显 。 AA 鸡空肠的 Pe p T1 mRNA 丰度 16 d 显著高于 2 、 44 和 58 d ( P < 01 05) ;30 d 显著高于 2 和 44 d ( P < 01 05) ;2 、 44 和 58 d 之间差异不显著 ( P > 01 05 ) 。

转运载体和寡肽转运载体吸收转运进入体内 。寡肽 转运载体对动物的营养有着特殊的意义 , 寡肽转运 载体和氨基酸转运载体是不同的 , 因而可以消除以

岭南黄肉鸡空肠的 Pe p T1 mRNA 丰度 16 d 显著高 于 2 和 44 d ( P < 01 05 ) ;2 、 30 、 44 和 58 d 差异不显 著 ( P > 01 05 ) 。不同品种之间空肠 Pe p T1 mRNA

游离氨基酸形式吸收时氨基酸之间的相互竞争 [ 2 ] 。   Pe p T1 mRNA 主要在肠道表达 , 肝脏和肾脏 中表达较少 。Pep T1 的蛋白质和 mRNA 在几种哺 乳动物的十二指肠和空肠表达丰度较高 , 在回肠低 丰度表达 ,结肠在正常情况下不表达 [ 2 ] 。免疫组化

表达丰度比较 ,与十二指肠相似 , 所有采样时间点 , 两品种间差异均不显著 ( P > 01 05) 。

研究表明 ,大鼠 Pep T1 蛋白质是位于肠细胞刷状缘 膜 ( BBM ) 上的 [ 19 ] 。尽管 Pe p T1 mRNA 主要位于

3  讨  论

出生后及成年大鼠肠黏膜细胞刷状缘的顶端 , 在刚 出生大鼠黏膜细胞的基底部及顶端下部的细胞质也 可以检测到 [ 15 ] 。本研究采用 R T2PCR 的方法对岭

  蛋白质在胃和小肠经消化酶作用后的最终产物 为游离氨基酸和寡肽 ( 二肽和三肽 ) , 分别由氨基酸

南黄肉鸡在 30 d 时肠道 Pe p T1 mRNA 表达的组织


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王修启等 : 肉鸡肠道 Pe p T1 mRNA 表达的肠段差异性与发育性变化

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特异性进行了研究 , 结果表明 , Pe p T1 mRNA 表达 丰度从十二指肠 、 空肠 、 回肠到结直肠依次降低 , 其 中十二指 肠表达 量显 著高 于结 直肠 ( P < 01 05 ) 。 Chen 等对来航蛋鸡和肉鸡的研究表明 , 十二指肠 Pe p T1 mRNA 的 表 达 丰 度 最 高 , 空 肠 和 回 肠 次

之 [ 13 ] 。Nort hern Blot 检测显示 , 肉鸡的十二指肠 、 空肠和回肠有高丰度的 Pe p T1 mRNA 表达 [ 10 ] 。刘 国华 等 用 R T2PCR 法 研 究 白 羽 肉 鸡 小 肠 Pe p T1 mRNA 表 达 , 结 果 表 明 十 二 指 肠 和 空 肠 Pe p T1 AA. AA 肉鸡 , Y. 岭南黄肉鸡 ; 无相同字母者 ( 大写字母 , AA 肉鸡 ; 小写字母 ,岭南黄肉鸡 ) , 表示同一品种不同日龄 之间差异显著 ( P < 01 05) , n = 8 ,图 6 同 AA. Arbo r Acre , Y. Yellow2feat hered chicken ;Bars wit hout t he same letters ( capital letters for AA and lower case let2 ters fo r Y) indicate significant difference between days in t he same breed ( P < 0. 05) , n = 8 , Fig. 6 is same 图 4  不同品种肉鸡十二指肠 Pe p T1 mRNA 表达的发育性 变化 Fig1 4  Ontogenetic expression of Pe p T1 mRNA in duode2 num of different broiler breeds

mRNA 表达水平显著高于回肠 [ 21 ] 。本研究的结果

与前人对肉鸡肠道 Pe p T1 mRNA 表达的组织特异 性研究结果较为相似 ,十二指肠和空肠 Pe p T1 mR2 NA 表达丰度较高 ; 肉鸡肠道 Pe p T1 mRNA 的表达 模式与哺乳动物类似 , 肠道前段的表达显著高于后 段。   动物肠道 Pe p T1 mRNA 的表达受多种因素的 调控 ,主要有发育阶段 、 体液因素 、 营养及生理状况 [2 ] 等 。特 定 的 氨 基 酸 、寡 肽 及 生 长 因 子 可 调 控 [ 22 ] Pe p T1 mRNA 的表达 。在多种情况下营养不良

图 5  不同品种肉鸡空肠 Pe p T1 mRNA RT2PCR 产物代表性琼脂糖凝胶电泳图 Fig1 5  Representative agarose gel electrophorese of Pe p T1 mRNA RT2PCR in jejunum of different broiler breeds

Miyamoto 等 研 究 发 现 , 4 日 龄 大 鼠 肠 道 Pe p T1 mRNA 的丰度很高 , 至 28 日龄时下降到成年大鼠

的表达水平 [ 25 ] 。本研究的结果发现 ,AA 鸡和岭南 黄肉鸡十二指肠及空肠 Pe p T1 mRNA 的表达具有 相同的发育模式 , 16 d 表达量最高 ,30~44 d 下降 , 55 d 略微回升 , 且在相同时间点两品种间 Pe p T1 mRNA 的表达丰度未见明显差异 。 Pe p T1 mRNA

的发育性表达与我们先前对 AA 鸡和岭南黄肉鸡十 图 6  不同品种肉鸡空肠 Pe p T1 mRNA 表达的发育性变化 Fig1 6  Ontogenetic expression of Pe p T1 mRNA in jejunum of different broiler breeds

时会增强 Pe p T1 mRNA 的表达[ 23 ] 。Shen 等报道 分娩可 诱导 大 鼠 肠 道 Pe p T1 mRNA 的 表 达 [ 24 ] 。

二指肠 S GL T1 [ 26 ] 、rB A T 和 y + L A T2 [ 27 ] mRNA 表 达的发育性变化研究结果较为一致 ,表明 Pep T1 和 + S GL T1 、 rBA T 、 y L A T2 作为肠道营养物质吸收转

运的主要功能载体 , 其对发育阶段的调控有着相似 的反应 。   Hump hrey 等指出[ 28 ] , 动物组织对于饲料成分


820

畜  牧  兽  医  学  报

以及营养水平变化的适应性反应在其对于这些营养 物质转运载体类型和数量的变化 , 日粮的化学组成 可以直接或间接影响基因表达 。Shiraga 等研究[ 14 ] 表明 ,给大鼠饲喂含 50 %酪蛋白的日粮 , 相对于无 蛋白日粮其肠道 Pe p T1 mRNA 的表达丰度约增加 2 倍 ; 对 Pep T1 活性提高的动力学分析发现 ,是由于 该载体的 V max 而不是 Km 值增加所致 , 这表明日粮 蛋白质水平的提高对 Pe p T1 基因表达的调控发生 在转录水平 。   44 d 时 , AA 鸡空肠 Pe p T1 mRNA 的表达丰 度显著低于 30 d ,岭南黄肉鸡的表达量虽然也表现 为下降的趋势 ,但统计检验差异不显著 。对应于 34 d 时 , 日粮类型由高蛋白变更为低蛋白水平 ( 20 % vs1 18 %) ,提示 AA 肉鸡对换料应激的反应比岭南 黄肉鸡更为敏感 。Chen 等[ 16 ] 研究表明 , 给肉鸡饲 喂低蛋白水平 ( 12 %) 的日粮 ,其肠道 Pe p T1 mRNA 表达丰度降低 ,限制饲喂高蛋白水平 ( 18 %和 24 %) 的日粮 ,其肠道 Pe p T1 mRNA 表达丰度增加 ,与本 研究结果相一致 。有关日粮成分及营养水平对肉鸡 肠道 Pe p T1 mRNA 表达的调控 , 尚有待于进一步 研究 。

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肉鸡肠道PepT1mRNA表达的肠段差异性与发育性变化