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HEREDITAS (Beijing) 2007 年 2 月, 29(2): 230― 234 ISSN 0253-9772 www.chinagene.cn

研究报告

DOI: 10.1360/yc-007-0230

鸡 H-FABP 基因多态性及其与屠宰性能的关联分析 游小燕, 刘益平, 朱庆, 杨志勤 四川农业大学动物科技学院, 雅安

625014

摘要: 以 90 日龄草科鸡为实验材料, 对 H-FABP 基因进行 PCR 扩增, 采用 PCR-SSCP 技术结合测序分析了 H-FABP 基因在草科鸡中的多态性。结果表明: 草科鸡中存在 332 G→A、534 G→A、835 C→T、1131→A、1294C →A、2329C→T、2372C→T、2636C→T 等 8 处突变。经过基因型与屠宰性能的关联分析得知: 在 7 对产生多 态的引物中, 只有第 1 对引物的各基因型与活重、屠体重、胸肌重、腿肌重和半净膛重差异显著(P<0.05); 全净 膛重在不同基因型间差异极显著(P<0.01)。 由此推测, H-FABP 可能对于鸡屠宰性能具有很大的影响或与控制 屠宰性能的主基因连锁。 关键词: H-FABP; PCR-SSCP; 草科鸡; 屠宰性能

Study on SNP of the H-FABP gene and its association with slaughter performance in chicken YOU Xiao-Yan, LIU Yi-Ping, ZHU Qing, YANG Zhi-Qin College of Animal Science and Technology, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China

Abstract: In this experiment, Caoke chicken was used to analyze H-FABP gene polymorphism by PCR-SSCP. Results indicated that there were eight mutation sites in Caoke chicken: 332G→A, 534G→A, 835C→T, 1131→A, 1294C→A, 2329C→T, 2372C→T, 2636C→T. In seven pairs of primers that generated polymorphisms, only the first pair resulted in genotypes that showed a significant difference in body weight, carcass weight, breast weight, leg weight and half-eviscerated weight (P < 0.05). It implied that H-FABP could have a major effect on slaughter performance or could be linked to gene(s) that significantly affect slaughter performance in chicken. Keywords: H-FABP; PCR-SSCP; caoke chicken; slaughter performance

草科鸡因产于石棉县草科藏族乡而得名。1982

发达, 成年公鸡胸腿肌重达 1,169.2 g, 占胴体重的

年草科鸡作为石棉县特有的一个禽类品种, 通过了

40%~50%, 母鸡胸腿肌重 1,033.7 g, 占胴体重比值

国家畜牧总局的认定。草科鸡有乌骨黑羽和青脚麻

与公鸡相近 [1]。草科鸡是蛋肉兼用型地方优良品种,

羽两大品系, 乌骨鸡约占 27.1%, 乌骨鸡公鸡全身

是培育现代肉鸡的重要品种资源之一。到目前为止,

羽毛黑色发亮。草科鸡体格硕大, 肉质鲜美深受广

利用分子生物学技术手段来研究草科鸡的遗传多样

大养殖户的欢迎。成年公鸡体重 3.7~6.0 kg, 母鸡

性的报道甚少。

体重 3.1~4.2 kg, 草科鸡肉用性能的特点是胸腿肌

美国学者 Ockner 等 [2]在研究肠道吸收脂肪酸的

收稿日期: 2006-05-15; 修回日期: 2006-08-14 基金项目: 四川省科技厅十五攻关项目(编号: 01NG002-06)资助[Supported by the Province Key Technologies R & D Program of Science and Technology Institution in Sichuan during the 10th Five-Years Plan Period (No. 01NG002-06)] 作者简介: 游小燕(1980—), 女, 硕士研究生, 专业方向: 家禽遗传育种。E-mail: youxiaoyan156@sohu.com 通讯作者: 朱庆(1959—), 男, 教授, 博士生导师, 研究方向: 家禽遗传育种。E-mail: zhuqing5959@vip.163.com


第2期

游小燕等: 鸡 H-FABP 基因多态性及其与屠宰性能的关联分析

231

过程中发现了脂肪酸结合蛋白(fatty acid-binding

日龄健康无病的草科鸡 60 只公母各 30 羽采集翅静

protein, FABP)。FABPs 是相对分子量为 15 kDa 的细

脉血液, EDTA 抗凝, 编号后于−20℃保存。

胞质蛋白质, 主要功能是推动细胞内长链脂肪酸的

1.2

运输, 协助将脂肪酸运至进行β-氧化的场所以及甘 油三酯和磷脂的合成部位 [3,4], 同时 FABPs 还使细胞 得以拥有一个细胞内脂肪酸及其 CoA 的储存库, 能 够在较大范围内以调节脂肪酸浓度的方式来调控机 体内多种生化过程, 尤其是脂类代谢过程 [5]。FABPs 分布于哺乳动物的心肌、小肠、肝脏、脂肪组织、 脑、表皮等组织中 [6,7], 到目前为止, 已发现了 9 种 不同的 FABP 且每一种都展现了各自独特的组织分 布特性, 但它们都有一个相对稳定的半衰期(2~3 天)。不同型 FABP 的序列有着较大的同源性 [8]。其 中心脏型脂肪酸结合蛋白(heart fatty acid-binding protein, H-FABP)是 1988 年在损伤的心肌中首次发 现的。H-FABP 能在很多组织中表达如心肌、骨骼 [8]

[9]

肌 、肾的管状细胞末梢 、大脑的某些部位

[10]

基因组 DNA 的制备 取 30 µL 鸡全血加入 450 µL 1× STE、30 µL

10%SDS 以及 20 µL (2 mg/mL)蛋白酶 K, 充分混匀后 于 55℃恒温水浴, 消化过夜。经酚氯仿抽提与乙醇沉 淀后, 获得基因组 DNA, 干燥后加 50~100 µL TE(pH 8.0)于 4℃冰箱溶解过夜。最终提取得基因组 DNA 样 品分成两份, 一份于 4℃备用, 一份于-20℃保存。 1.3

PCR 扩增反应 实验所用引物根据鸡 H-FABP 基因的 DNA 序列

(GenBank AY648562)采用 Primer 5.0 和 oligo 6.0 软 件设计, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合 成。引物序列、PCR 产物大小及所在的位置详见表 1。 1.4

PCR-SSCP 法检测单核苷酸多态性

、分

用引物对草科鸡基因组 DNA 进行 PCR 扩增,

泌乳汁的乳腺和胎盘等。H-FABP 是一种脂溶性蛋白,

对扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺电泳统计各种基

它对甘油三酯的积累和氧化以及脂肪酸在细胞内的

因型的个体数量。

运送起重要作用[11,12], 当心肌梗塞或萎缩的时候它常 常作为一种生物标记被释放到血液循环中[13,14]。正因

1.5

克隆测序 经 SSCP 分析后, 不同纯合基因型个体的 PCR

为 H-FABP 能在心肌和脂肪细胞中沉积甘油三酯, 从 而增加肌内脂肪(Intramuscular fat, IMF), 因此, 把

扩增产物送至上海博亚公司测序。

它作为影响肌内脂肪含量的候选基因加以研究。

1.6

1 1.1

表1

数据统计分析 统计有多态的 PCR 扩增片段 SSCP 出现的每种

材料和方法

基因型的数量, 计算它们的基因型和基因频率, 了

实验材料

解每种类型在群体间的分布关系。用软件(SAS8.0)

在四川农业大学家禽育种实验场, 随机选取 90

对屠宰性状进行单因素方差分析。

PCR 扩增所用的引物序列、产物大小及位置

Table 1

Primer sequences corresponding to PCR product sizes and positions 引物序号 Primer

引物序列(5′→3′) Sequences(5′→3′)

引物位置(bp) Location (bp)

片段大小(bp) Fragment (bp)

1

CAGAAATAGGAATAGGAAAGCG GGATGGAGGATTCAGGACA

274 447

174

2

AGGTGCAGCATCTGAGTG TTCACCGTCGCCTTGT

528 792

265

3

CGACAAGGCGACGGTGAA TGGGGCAGGAAGGAGTTT

775 1049

275

4

AAGGCGATGCTGTAACCA GGAGCAGACGATGAAGACA

960 1168

209

5

CTGCCCGCTTTGTCTCGT CCAGTTTGGTGGCTCCTC

1281 1551

271

GAAGCATTAGGGCATCTGT GACTCTGCATTGGTTTTGAT GCTAGTGCGGGAGCTGAA TTCTCATAGGTGCGGGTG

1644 1909 2593 2852

6 7

266 160


232

HEREDITAS (Beijing)

结果与分析

2 2.1

第 29 卷

2007

在这 7 对引物的扩增片段上都发现了 3 种基因型,

PCR 扩增结果

两种纯合型和一种杂合性(图 3 和图 4)。

用 所 设 计 的 引 物 对 草 科 鸡 基 因 组 DNA 进 行 PCR 扩增, 所得 PCR 产物用 1%琼脂糖电泳检测, 由 电泳图谱可知(图 1 和图 2): 扩增片段与目的片段大 小一致且特异性好, 无杂带的产生, 可以直接进行 SSCP 分析。 图3

P1 对不同个体的 SSCP 检测结果

Fig. 3 PCR-SSCP analysis using P1, showing individual phenotypes

图1

图4

P2 扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测

P7 对不同个体的 SSCP 检测结果

Fig. 4 PCR-SSCP analysis using P7, showing the genotypes

1~13 为不同个体的 PCR 扩增产物, M 为 DNA marker。

Fig. 1 Analysis of PCR amplification using P2 1-13: Individual PCR products; M: DNA marker.

2.3

individual

H-FABP 基因型频率和基因频率分析 对草科鸡进行了基因型检测, 其具体的基因型

频率和基因频率见表 2。 2.4

测序分析结果 在 SSCP 中呈现多态的 PCR 产物送至上海博亚

公司直接测序, 进一步证实了多态位点的存在(图 5 和图 6)。 将两个纯合型测序结果与 GenBank 上的序列在 图2

软件 Lasergene6 中进行比对。结果发现存在 332 G →A、534 G→A、835 C→T、1131-→A、1294C→A、

P6 扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测

1~5 为不同个体的 PCR 扩增产物; M 为 DNA marker。

2329C→T、2372C→T、2636C→T 等 8 处突变。

Fig. 2 Analysis of PCR amplification using P6 1-5: Individual PCR products; M: DNA marker.

2.2

2.5

SSCP 检测结果

将引物的扩增片段的 SSCP 结果定义的基因型

用 7 对引物 PCR 扩增产物片段进行 SSCP 检测, 表2

基因型与屠宰性能关系的统计分析

与屠宰性能进行单因素方差分析(表 3)。

草科鸡 H-FABP 基因基因型频率和基因频率分析

Table 2

Analysis of H-FABP genotype frequency and gene frequency in caoke chicken

引物 Primer

个数(只) Number

基因型频率 Genotype frequences

P1

60

AA: 0.333

BB: 0.133

AB: 0.534

A: 0.6

B: 0.4

P2

60

CC: 0.200

DD: 0.667

CD: 0.133

C: 0.733

D: 0.267

P3

60

EE: 0.333

FF: 0.400

EF: 0.267

E: 0.467

F: 0.533

HH: 0.366

GH: 0.367

G: 0.45

H: 0.55

P4

60

GG: 0.267

P5

60

II: 0.867

P6

60

KK: 0.6

LL: 0.2

P7

60

MM: 0.167

NN: 0.333

JJ: 0

基因频率 Gene frequences

IJ: 0.133

I: 0.934

J: 0.066

KL: 0.2

K: 0.7

L: 0.3

MN: 0.500

M: 0.417

N: 0.583


第2期

表3

游小燕等: 鸡 H-FABP 基因多态性及其与屠宰性能的关联分析

233

H-FABP 基因型与屠宰性能关系的显著性检验

Table 3

Testing for the effect of H-FABP genotypes on slaughter performance

引物 Primer

活重 Body weigh

屠体重 Carcass weight

胸肌重 Breast weight

腿肌重 Leg weight

半净膛重 Half eviscerate weight

全净膛重 Eviscerate weight

P-1

0.0478*

0.0389*

0.0487*

0.0496*

0.0415*

0.0069**

P-2

0.4872

0.6759

0.7345

0.5835

0.6898

0.4522

P-3

0.8768

0.8207

0.7458

0.6159

0.9018

0.8102

P-4

0.3215

0.2887

0.6150

0.4778

0.4561

0.5106

P-5

0.8445

0.8560

0.8168

0.8858

0.8185

0.866

P-6

0.8616

0.8713

0.3611

0.4814

0.7637

0.3373

P-7

0.8017

0.6691

0.9838

0.9846

0.7374

0.9443

*: 差异显著(P<0.05); **: 差异极显著(P<0.01)。 *:P<0.05; **:P<0.01.

列相对保守, 因为外显子担负着编码氨基酸的重任, 外显子的突变可能会改变氨基酸序列, 从而导致蛋 白质结构的改变, 会影响其编码产物的生物活性。 另外, 该基因第二内含子中有多个 SNP 位点, 已研 究的结果表明内含子可能与基因的表达调控有关, 对某些基因的特异性表达是必不可少的。基因型与 屠宰性状的分析结果表明, 在第一对引物中不同基 因型间的活重、屠体重、胸肌重、腿肌重和半净膛 重差异显著(P<0.05), 且各屠宰性状 BB 型均值均高 图5

KK 型和 LL 型测序图谱(2329C→T)

Fig. 5 Partial chromatogram of the KK and LL genotypes(2329C→T)

于 AA 型和 AB 型。因此 H-FABP 可能对于鸡屠宰性 能具 有 很大 的影 响 或与 控制 屠 宰性 能的 主 基因 连 锁。可在更多群体中检测 332 G→A 突变位点能否用 于鸡屠宰性状的分子辅助选择。

参考文献(References):

图6

MM 型和 NN 型测序图谱(2636C→T)

Fig. 6 Partial chromatogram of the MM and NN genotypes(2636C→T)

根据以上的分析结果可以表明: 在 7 对产生多 态的引物中, 只有第 1 对引物的各基因型与活重、 屠体重、胸肌重、腿肌重和半净膛重差异显著 (P<0.05); 全 净 膛 重 在 不 同 基 因 型 间 差 异 极 显 著 (P<0.01)。

3

讨 论 本研究对 H-FABP 基因 SNP 检测的结果表明:

除了在外显子 2 存在 835 C→T 的突变, 在其他外显 子上没有发现 SNP 多态。一般来说, 基因外显子序

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HEREDITAS (Beijing)

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第 29 卷

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ˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇ

第二届植物分子育种国际学术研讨会 2007 年 3 月 23-27 日在海南省三亚市召开 (http://www.icpmb.org) 现代农业已经发展到了“分子农业” 时代,基因工 程、转基因技术等分子生物学手段广泛应用于植物的遗 传育种,基因组学的研究成为植物基因资源发掘的基本 科学平台,分子育种成为植物育种的最主要手段之一。 为加强与国际植物分子育种领域的合作与交流,推动应 用基因与组学植物分子育种科学的发展。The Generation Challenge Programme (全球挑战计划)、国际水稻研究所、 海南省科学技术协会、中国农业科学院、海南省热带农业 资源开发利用研究所等单位发起,定于 2007 年 3 月 23-27 日在海南省三亚市举办 “第二届植物分子育种国际学术 研讨会”。 大会荣誉主席 Jean-Marcel Ribaut 博士,国际挑战计划主席,国际 小麦玉米改良中心主任 张启发博士,亚洲水稻生物技术协作网指导委员会 主席,中国科学院院士、华中农业大学教授,作物 遗 传 改良国家重点实验室主任。 大会主席 黎志康博士,国际水稻研究所资深科学家、作物基 因资源与遗传改良国家重大工程首席科学家、中国 农 科 院作物所研究员、国际分子育种项目协调科学家。

组委会执行委员 方宣钧博士,海南省热带农业资源开发利用研究所, 所长、研究员,海南农作物分子育种重点实验室主任 黎志康博士,国际水稻研究所资深科学家、作物基因 资源与遗传改良国家重大工程首席科学家、中国农科院作 物所研究员、国际分子育种项目协调科学家

大会主题 本次大会主题为“应用基因组学与植物分子育种”。 主要议题 (一) (二) (三) (四) (五) (六)

应用植物基因组学:从基因组走向大田 分子标记与植物育种:一种整合 植物育种中新型的分子工具和技术 转基因新技术、产品及其市场 设计育种:基因发现和性状改良的连接 转基因植物中知识产权的问题

组委会办公室联系方式: 海南省海口市海秀中路 107 号北岸青年公寓 507 室 邮编:570206 电话:86-898-68966415 传真:86-898-68968180 手机:13807532037 Email: xuanjunfang@vip.sina.com

鸡H_FABP基因多态性及其与屠宰性能的关联分析  

[1] , , , , , 27.1%, , 1 (P&lt;0.05); 3.76.0 kg, 3.14.2 kg, Ockner [2] (P&lt;0.01) , H-FABP , 1,169.2 g, 40%50%, 1,033.7 g,...

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