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畜牧兽医学报 ,2006 ,37 (1) ,12~17

A ct a V eteri nari a et Zootechnica S i nica

鸡肠道 SGL T1 和 GL UT2 mRNA 表达的 组织特异性研究 王修启 ,谭会泽 ,束  刚 ,苏海林 ,陈黎龙 ,江青艳 ,冯定远 3 ( 华南农业大学动物科学学院 ,广州 510642)

摘  要 : 运用相对定量 R T2PCR 方法 ,研究不同肠段 Arbo r Acre ( AA ) 肉鸡肠道葡萄糖吸收转运主要载体 S GL T1 和 GL U T2 mRNA 表达的组织特异性 。结果发现 ,随着肠道空间位置的后移 ,S GL T1 mRNA 的表达量逐步降低 。 十二指肠 SGL T1 mRNA 的丰度比结直肠高 761 19 % ,差异极显著 ( P < 01 01 ) ; 而空肠和回肠 SGL T1 mRNA 的表 达量分别比结直肠高 421 86 %和 381 10 % ,差异不显著 ( P > 01 05) ,但有提高的趋势 ( P 值分别为 01 06 和 01 07 ) 。十 二指肠与空肠和回肠相比 , S GL T1 mRNA 的表达量虽然分别高 231 33 %和 271 59 % , 但差异不显著 ( P 值分别为 01 18 和 01 10) 。相对定量分析表明 ,十二指肠和空肠 GL U T2 mRNA 丰度非常接近 ,差异不显著 ( P > 01 05 ) 。定性

研究显示 ,十二指肠与空肠 GL U T2 mRNA 丰度高于回肠和结直肠 。鸡肠道 SGL T1 和 GL U T2 mRNA 表达的组 织特异性之生理功能 ,有待于进一步研究 。 关键词 : 肠道 ; SGL T1 mRNA ; GL U T2 mRNA ; 组织特异性 中图分类号 : S831. 2     文献标识码 : A     文章编号 : 036626964 (2006) 0120012206

Study on Tissue2specif ic Expression of SGL T1 and GL UT2 mRNA in Chicken Intestine WAN G Xiu2qi , TAN Hui2ze , S HU Gang , SU Hai2lin , C H EN Li2lo ng , J IAN G qing2yan , F EN G Ding2yuan 3 ( Col le ge of A ni m al S cience , S out h Chi na A g ricul t u ral U ni versi t y , Guan g z hou 510642 , Chi na)

Abstract :The o bjective of t his st udy was to investigate tissue2specific exp ressio n of S GL T1 and GL U T2 mRNA in different intestine segment s of Arbor Acre ( AA ) chicken by relative quantative R T2 PCR. The result s showed t hat t he exp ressio n of S GL T1 mRNA decreased gradually alo ng t he downward intestine. S GL T1 mRNA abundance of duo denum , jejunum and ileum was 761 19 % ( P < 01 01) , 421 86 % ( P = 01 06 ) and 381 10 % ( P = 01 07 ) higher t han t hat of colorect um , respective2 ly. A nd S GL T1 mRNA exp ressio n of duodenum was higher 231 33 % ( P = 01 18 ) and 271 59 % ( P = 01 10) t han t hat of jejunum and ileum , respectively. The GL U T2 mRNA exp ressio n of duodenum was clo se to t hat of jejunum , t he difference was not significant ( P > 01 05) . Single gene PCR re2 sult s indicated t he GL U T2 mRNA abundance of duodenum and jejunum were much more higher t han t hat of ileum and colorect um. Furt her researches sho uld be do ne o n t he p hysiological f unc2 tio n of tissue2specific exp ressio n of S GL T1 and GL U T2 mRNA in chicken intestine. Key words : intestine ; S GL T1 mRNA ; GL U T2 mRNA ; tissue2specific

收稿日期 :2005203211 基金项目 : 国家重点基础研究发展计划项目 (2004CB117501) ; 广东省自然科学基金资助项目 (05300836) 作者简介 : 王修启 (19682) ,男 ,博士后 ,副研究员 ,主要从事动物分子营养与营养消化生理研究 3 通讯作者 : 冯定远 , 教授 ,博导 。E2mail : fengdy @scau. edu. cn


1 期

王修启等 : 鸡肠道 SGL T1 和 GL U T2 mRNA 表达的组织特异性研究

13

  葡萄糖是真核生物主要的能量来源 , 在维持机 体代谢和细胞动态平衡方面起着重要作用 , 许多真

1  材料与方法

核细胞依靠葡萄糖的连续供应以生成三磷酸腺苷 ( A TP) [ 1 ,2 ] 。机体对葡萄糖的吸收利用涉及 3 个过

1. 1  试验动物与样品采集

程的调节 ,首先被肠道吸收 , 其次生成肝糖元 , 然后 被组织细胞利用[ 3 ] 。整个过程由两个家族的跨膜转 运载体蛋白 - 钠葡萄糖共转运载体系统 ( sodium/

1. 1. 1  试验动物  选用遗传背景相同 、 同批次 、 发 育正常的 1 日龄雄性 Arbor Acre ( AA ) 父母代肉雏

S GL T1 ,S GL T2 和 S GL T3 ; GL U Ts 家族目前已发

鸡 ( 购自广东穗屏科宝种鸡场 ) 120 羽 , 随机分为 4 个重复 ( 经统计检验各重复间初始体重差异不显 著) ,每个重复 30 只鸡 。 1. 1. 2  日粮组成及营养水平  参照 1994 年 N RC 和 1986 年国家标准 0~4 周龄肉鸡营养需要设计饲 料配方 , 日 粮 组 成 为 : 玉 米 651 00 % , 玉 米 蛋 白 粉

现 14 个成员 ( GL U T1 ~ 12 、HM I T 和 GL U T14 ) ,

21 70 % , 豆 粕 261 20 % , 秘 鲁 鱼 粉 21 00 % , 石 粉

分布于不同的组织器官

01 80 % ,磷酸氢钙 11 57 % ,78 %赖氨酸 01 16 % ,98 %

gluco se cot ransporters ,S GL Ts) 和葡萄糖协助扩散

转运 载 体 系 统 ( facilitative gluco se t ransporters , GL U Ts) 来完成 。S GL Ts 家族有 3 个成员 , 分别是

[4 ]

肠道负责转运葡萄糖的载体主要是 S GL T1 和 GL U T2 , 其 转 运 过 程 是 : 首 先 由 位 于 刷 状 缘 的 S GL T1 与 Na + 和葡萄糖耦联 , 形成 Na + 2载体2葡萄

糖复 合 物 , 顺 Na + 的 浓 度 梯 度 进 入 细 胞 , Na + 被 Na + 2 K + 2A TPase 泵出 , 以维持细胞内外 Na + 的浓

度平衡 ; 随着肠黏膜细胞内葡萄糖的聚集 ,由位于基 底膜的协助扩散转运载体 GL U T2 , 顺葡萄糖浓度 梯度协助转运其进入组织间隙液[ 5~7 ] 。 Kellet t [ 8 ] 指 出 ,当餐后肠腔内葡萄糖浓度高于 50 mmol/ L 时 , GL U T2 可以瞬间开放 , 允许高流量的葡萄糖快速

通过 GL U T2 被吸收 。在葡萄糖的吸收转运过程 中 ,起主导作用的是 S GL T1 , 逆浓度梯度的葡萄糖 吸收由 S GL T1 完成 , 其转运葡萄糖是一个间接消 耗 A TP 的主动运输过程 ,同时通过 S GL T1 激活的 蛋白激酶 C ( P KC) 依赖性通路调节 GL U T2 对葡萄 糖的 转 运 。葡 萄 糖 在 小 肠 黏 膜 的 吸 收 虽 然 由 S GL T1 和 GL U T2 两 种 载 体 共 同 完 成 , 但 是 S GL T1 载体数量的多少 , 是葡萄糖吸收的决定因

素 。在鸡胚胎发育过程中 ,血浆葡萄糖含量的上升 , 缘于葡萄糖转运载体数量的增加 , 而非载体亲和力 的增加[ 9 ] 。Garriga 等 [ 10 ] 研究表明 , 鸡小肠对甲基2 D2葡萄糖苷的最大转运速度与 S GL T1 蛋白的密度

具有 良 好 的 相 关 性 , 葡 萄 糖 吸 收 增 加 的 原 因 是 S GL T1 载体数量的增加 。

本文通过采集肠道不同部位组织样品 , 运用相 对定量 R T2PCR 方法 ,研究 AA 肉鸡肠道葡萄糖吸 收转运主要载体 S GL T1 和 GL U T2 mRNA 表达的 组织特异性 ,从而在基因表达水平揭示不同肠段对 葡萄糖吸收转运能力的差异 。

蛋 氨 酸 01 18 % , 食 盐 01 29 % , 75 % 氯 化 胆 碱 01 10 % ,预混料 1 % ( 每千克全价料 : Cu 51 00 mg , Fe 691 00 mg , Zn 841 00 mg , Mn 981 6 mg , I 11 14 mg , Se 01 30 mg ; VA 15 000 IU , VD3 3 000 IU , V E 251 5 mg , V K3 21 1 mg , VB1 21 4 mg , VB2 9 mg , VB6 51 1 mg , VB12 01 02 mg , 泛酸钙 12 mg , 烟酸 48 mg , 叶酸 11 2 mg , 生物素 01 06 mg ; 洛克 沙胂 50 mg , 盐霉素 90 mg ) 。营养 水平 : 代谢 能 121 13MJ / kg ,粗蛋白 201 00 % ,赖氨酸 11 10 % ,蛋氨

酸 01 52 % , 蛋 + 胱 01 85 % , 钙 01 67 % , 有 效 磷 01 45 % 。 1. 1. 3  饲养管理与免疫  试验在华南农业大学动 物科学学院种鸡场进行 ,粉料饲喂 。红外取暖 ,自由 饮水和采食 ,人工持续光照 , 保持正常育雏温度 , 常 规免疫 。 1. 1. 4  组织采样  于 30 日龄取接近平均体重的鸡 每重复 2 只共 8 只 ,断颈宰杀 ,宰前不禁食 。分离肠 道 ,沿纵向剖开 ,用 4 ℃预冷的 PBS 缓冲液冲洗 ,吸 水纸吸干 。分别从十二指肠 U 状弯曲的起始处和 结束处向下取 3 cm 肠段 , 作为十二指肠和空肠样 品 ; 从回盲韧带起始处和回盲结向下取 3 cm 肠段 , 分别作为回肠和结直肠样品 。放入 11 5 mL 离心管 中 ,置液氮速冻 , - 70 ℃冷冻保存 。 1. 2  肠道 SGL T1 和 GL UT2 mRNA 的相对定量 RT2PCR 1. 2. 1  样品总 RNA 提取和 RNA 电泳  采用 Tr2 izol ( 北京赛百盛基因技术有限公司 ) 一步抽提法提 取组织样的总 RNA ,紫外比色法测定总 RNA 的浓 度和纯度 ( Eppendorf Bio Photo meter 260 nm ) 。用 11 4 %甲醛变性琼脂糖凝胶电泳 ,根据 28S r RNA 和


14

畜  牧  兽  医  学  报

37 卷  

18S r RNA 的灰度比评价 RNA 的质量 。

midine) 。样品总 RNA 、 Oligo d T ( 18 ) 和 dN TP 在

1. 2. 2  反转录  分别准确量取 2 μg 各样品的总

反转录前 70 ℃变性 5 min ,冰上放置 5 min ,再加入 其余试剂 ,混匀后于 42 ℃反应 60 min ,95 ℃变性 5 min 。反转录产物 ( R T Pro duct s) - 20 ℃保存备用 。

RNA 进 行 反 转 录 。建 立 各 样 品 RNA 的 cDNA ( R T p roduct ) 。反转录反应体积为 20 μL , 其中含 Oligo d T ( 18 ) 5 μmol/ L 引物 ,1 mmol/ L dN TP ( 北

1. 2. 3  目的基因引物设计和 PCR 反应条件  PCR

京赛百盛基因技术有限公司) ,20 U RNA 酶抑制剂 ( RNase inhibito r , Takara , 大连 ) , 200 U 反转录酶 ( MML V R T , Pro mega ) , 4 μL 5 ×R T Buffer ( 含

引物采用 Primer 软件设计 ,由北京赛百盛基因技术 有限公司合成 ,引物序列及参数见表 1 。以β2actin 管 家基因作为内标 ,对 SGL T1 和 GLU T2 进行相对定

250 mol/ L Tris2 HCl p H81 3 , 50 mol/ L MgCl 2 ,

量分析。PCR 反应在 MJ R P TC2200 PCP 仪上进行。

250 mol/ L KCl , 50 mol/ L D T T , 21 5 mol/ L Sper2 表 1  SGL T1 、GL UT2 目的基因和β2actin 内标基因引物参数 Table 1  Parameters of primer pairs for SGL T1 , GL UT2 andβ2actin gene

目的基因 Target gene S GL T1 (AJ 236903 Genbank) GL U T2

( Z22932 Genbank) β2A cti n (L08165 Genbank)

引物位置 Localizatio n 46~65

引物序列 Primer sequence Sense  5′ 2 T GGT T GT TC TA GGA T GGGT G23′

534~515 1 126~1 143

Antisense  5′ 2CA GT GACA GCA TC TC GGAA G23′ Sense  5′ 2ACCA T T GGC GT T GGA GT G23′

1 567~1 548 83~101

Antisense  5′ 2CC T TC GT T TC GGGTAC T T T G23′ Sense  5′ 2 T GC T GC GC TC GT T GT T GAC23′

373~355

Antisense  5′ 2 GGGT GC TCC TCA GGGGC TA23′

   内 标 基 因 β2actin Primer s ( 10 μmol/ L ) 和 Co mpetimer s ( 10 μmol/ L ) : 参照《 PCR 技术实验指 南》[ 11 ] 所提供的方法 ,将β2actin Primers 的 3′端进 行修饰 ( 北京赛百盛基因技术有限公司 ) , 使其在 PCR 过程中只能与模板结合而不能延伸 ,得到β2ac2

产物/ bp Product 489 442 291

电泳及灰度分析 : 取 10 μL PCR 产物在 21 0 % EB 染色的琼脂糖凝胶上电泳 。图象处理及灰度分

析 用 LabWo rks Image Acquisitio n and A nalysis Soft ware 41 0 ( Ult ra2Violet Product s L t d. , Cam2 bridge , U K) 进行 , 根据目的基因和β - actin PCR

tin Co mpetimers 。将β2actin Primer s 和 Co mpetim2

产物的灰度比 ,确定样品中 S GL T1 和 GL U T2 mR2

er s 均稀释至 10 μmol/ L 备用 。 PCR 反应条件 :采用单管法进行 PCR 扩增 ,以混 合样 (待测样品等比例混合) 对 PCR 反应条件、 循环 圈数以及目的基因 S GL T1 、 GL U T2 和内标基因β2ac2 tin 的引物浓度等进行优化。S GL T1 和 GL U T2 RT2 PCR 条件如下 :在 25 μL 的反应体系中含有 2 μL RT Product s , 21 5 μL 10 × PCR Buffer , 11 5 mmol/ L MgCl2 , 01 2 mmol/ L dN TP , 01 8 μmol/ L 目的基因的

NA 基 因表达 的相 对含 量 。每 一基 因的 检测 , 其

primer pair , 11 2 μL β2actin primer pair ( GLU T2 为 1

μL ) , 01 8 μL ( GLU T2 为 1 μL ) Competimers ( 单基因 扩增只加目的基因引物) , 01 5 U Taq DNA polymer2 ase ( Fermentas , Lietuva ) 。PCR 反应条件为 : 94 ℃ 预变性 5 min ;94 ℃变性 30 s ,57 ℃退火 30 s , 72 ℃ 延伸 50 s ,共 25 ( GLU T2 为 26 , GLU T2 单基因扩增 为 31) 循环 ;72 ℃延伸 10 min 。

R T2PCR 过程至少重复 3 次 。 1. 3  数据分析

试验数据以平均数 ±标准误 ( X ±SEM ) 表示 , 用 SPSS111 5 统计软件进行单因子方差分析 ( o ne2 way ANOVA ) ,以 Duncan 方法进行多重比较 。

2  结  果 2. 1  鸡不同肠段之间 SGL T1 mRNA 表达的组织特

异性 鸡不同肠段之间 S GL T1 mRNA R T2PCR 产物 代表性琼 脂糖 凝胶 电泳 见图 1 , 不同 肠段 组织 中 S GL T1 mRNA 基因表达的相对丰度见图 2 。十二

指 肠 S GL T1 mRNA 的 表 达 量 比 结 直 肠 高 761 19 % , 差 异 极 显 著 ( P < 01 01 ) ; 而 空 肠 和 回 肠


1 期

王修启等 : 鸡肠道 SGL T1 和 GL U T2 mRNA 表达的组织特异性研究

S GL T1 mRNA 的表达量分别比结直肠高 421 86 %

和 381 10 % ,差异不显著 ( P > 01 05 ) , 但有提高的趋 势 ( P 值分别为 01 06 和 01 07 ) 。十二指肠与空肠和

15

回肠 相 比 , S GL T1 mRNA 的 表 达 量 虽 然 分 别 高 231 33 %和 271 59 % , 但 差 异 不 显 著 ( P 值 分 别 为 01 18 和 01 10) 。

图 1  SGL T1 mRNA RT2PCR 产物代表性琼脂糖凝胶电泳图 Fig. 1  Representive agarose gel electrophorese of RT2PCR results for intestinal SGL T1 mRNA

2. 2  十二指肠和空肠 GL UT2 mRNA 表达的组织

特异性 十二指肠和空肠 GL U T2 mRNA R T2PCR 产 物琼脂糖凝胶电泳见图 3 ,十二指肠和空肠 GL U T2 mRNA 基因表达的相对丰度见图 4 , 两者 GL U T2 mRNA 丰度非常接近 ,差异不显著 ( P > 01 05) 。 2. 3  各肠段 GL UT2 mRNA 表达的定性研究 图 2  不同肠段间 SGL T1 mRNA 表达的组织特 异性 Fig. 2  Tissue specif ic of SGL T1 mRNA expres2 sion among all different intestinal seg2 ments

各肠段 GL U T2 mRNA 表达的定性研究结果 见图 5 。 在以β2actin 作内标 , 对 4 个肠段进行 GL U T2 mRNA 表达进行相对定量研究时发现 , 回肠和结直 肠几乎没有 GL U T2 mRNA 表达 ( 结果未显示) 。

图 3  GL UT2 mRNA RT2PCR 产物代表性琼脂糖凝胶电泳图 Fig. 3  Representive agarose gel electrophorese of RT2PCR results for intes2 tinal GL UT2 mRNA

随后 分 别 以 4 个 肠 段 的 混 合 样 , 进 行 目 的 基 因 GL U T2 的 PCR 扩增 ,结果见图 5 ,十二指肠和空肠 GL U T2 mRNA 电泳条带亮度比较接近 , 回肠电泳 条带比较暗 ,而结直肠电泳条带非常暗 。

的需要 。作为主要能源物质的碳水化合物 , 在肠道 被分解为单糖后才可以被吸收 。动物通过肠黏膜吸 收的单糖为葡萄糖 、 半乳糖和果糖 , 其中葡萄糖占 80 %[ 12 ] ,糖在禽类循环中的主要形式是 D - 葡萄糖 ( 1 8 0 ~ 2 4 0 mg / 1 0 0 mL ) 、D 2果 糖 ( 1 ~ 3 mg /

3  讨  论 动物营养的需要 , 最基本的是对能量和蛋白质

100 mL ) 、 D - 半乳糖 ( 不到 1 mg/ 100 mL ) [ 9 ] 。葡萄

糖在肠黏膜的吸收虽然由 S GL T1 和 GL U T2 两种


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畜  牧  兽  医  学  报

37 卷  

PCR 检测具有较高的灵敏度 。J enkins 等 研究 表

明 [ 18 ] ,小鼠小肠近端 S GL T1 mRNA 的表达水平比 远端高两倍 。本试验中十二指肠 S GL T1 mRNA 的 表达 量 比 结 直 肠 高 761 19 % , 差 异 极 显 著 ( P < 01 01 ) ,而空肠和回肠 S GL T1 mRNA 的表达量分别 比结直肠高 421 86 %和 381 10 % , 差异不显著 ( P > 01 05 ) , 但 有 提 高 的 趋 势 ( P 值 分 别 为 01 06 和 01 07 ) 。随着肠道位置的后移 , S GL T1 mRNA 表达

丰度呈逐渐降低的趋势 , 这与 Kojima 等 [ 19 ] 报道的 大鼠 S GL T1 mRNA 从十二指肠至回盲结表达丰度 逐渐降低的趋势相一致 , 提示不同的动物物种之间 可能存在有相似的肠道 S GL T1 mRNA 表达规律 。 十二指肠和空肠 GL U T2 mRNA 丰度非常接 近 ,差异不显著 ( P > 01 05 ) 。单基因 PCR 扩增显

图 4  十二指肠和空肠 GL UT2 mRNA 表达的 组织特异性 Fig. 4  Tissue specif ic of GL UT2 mRNA ex2 pression bet ween duodenum and jeju2 num

示 ,十二指肠和空肠 GL U T2 mRNA 电泳条带亮度 非常接近 ,回肠电泳条带比较暗 ,而结直肠电泳条带 非常暗 。Cherbuy 等[ 20 ] 报道 , 新生仔猪哺乳期 , 刺 激空肠前段而非后段 GL U T2 , 导致葡萄糖吸收的

图 5  各肠段 GL UT2 单基因扩增 RT2PCR 产物 琼脂糖凝胶电泳图 Fig. 5  Agarose gel electrophorese of single gene RT2PCR results for four different intesti2 nal segments GL UT2 mRNA

载体共同完成 ,但是 S GL T1 载体数量的多少 , 是葡 萄糖吸 收 的 决 定 因 素 。个 体 发 育 的 不 同 时 期 , S GL T1 的表达不同 ,Barf ull 等 [ 13 ] 对 2 日龄和 5 周

龄的鸡研究表明 ,成年鸡单位面积空肠刷状缘黏膜 蛋 白 ( brush border membrane p rotein , BBM P ) S GL T1 表达的降低 ,导致其转运α2D2葡萄糖比刚孵

增加 ,认为肠道葡萄糖吸收具有位置特异性 ,即主要 在空肠前段被吸收 。本研究结果表明 , 鸡 S GL T1 和 GL U T2 mRNA 在十二指肠和空肠均有较高表 达 ,推测鸡肠道对葡萄糖的吸收可能主要是在小肠 前段 ,并由 S GL T1 和 GL U T2 共同完成 。回肠和结 直肠 S GL T1 和 GL U T2 mRNA 的表达比例关系 , 与小肠前段有着明显的不同 , GL U T2 协助转运葡 萄糖依赖于细胞内葡萄糖的浓度 , 其在回肠和结直 肠的微量表达 ,是否说明回肠和结直肠对葡萄糖的 吸收可能起着拾遗补缺的作用 ? 还是回肠和结直肠 S GL T1 的表达 ,除吸收葡萄糖外 , 同时与肠道后段 对水分的吸收有关 ( 因为肠道 S GL T1 可以逆渗透

压共转运 Na + 和水分子 [ 21~23 ] ) ? 其生理功能尚需 要大量的研究工作来进一步证实 。

化的鸡减少 40 % ; 由于成年鸡肠腔面积的增加 , 其 肠黏膜总 S GL T1 的数量显著增加 , 使成年动物吸

参考文献 :

收葡萄糖的能力得到加强 。

[ 1 ]  Gould G W , Holman G D. The gluco se t ranspo rter

S GL T1 主要分布于肠道 、 肾小管 、 心脏

脑屏障

[ 15 ]

[ 14 ]

和血

等组织器官 。 GL U T2 主要分布于小肠 、

肾小管 、 肝脏和胰岛β 细胞 [ 16 ] 。 Yo shida 等 [ 17 ] 用免 疫组化的方法研究大鼠消化道 S GL T1 的分布 , 发 现十二指肠 、 空肠和回肠均存在有 S GL T1 , 而结肠

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鸡肠道SGLT1和GLUT2mRNA表达的组织特异性研究