Page 1

ПРОЕКТ

Разработка и валидизация маркеров старения


Форма 4. Описание научного исследования Раздел 1. Общая информация по проекту 1.1. Область наук Биомедицинские науки 1.2. Направление научного исследования Долголетие и возрастные заболевания 1.3. Цель проекта Исследование и валидация биомаркеров с целью оценки физиологического возраста человека и прогнозирования продолжительности жизни для создания практической и коммерчески жизнеспособной платформы для расчета эффективности диетотерапии или фармакологического вмешательства в процессе старения или в прогрессировании заболеваний и состояний, зависящих от возраста. Для достижения цели предложено 4 задачи: (1) Набрать участников (в течение года 1 и года 2) для долгосрочной оценки состояния их здоровья, слабых сторон и ответа на рекомендованное вмешательство. Участники пройдут скрининг для определения стандартных индикаторов возраста (например, время ответа, вариабельность частоты сердечных сокращений) и риска заболеваний, связанных с возрастом (например, индекс массы тела (BMI), профиль холестерина, реакция на глюкозу, концентрация IGF-1 (инсулиноподобный фактор роста 1) в крови, тип аполипопротеина Е и т.д.), кроме того, у участников возьмут образцы крови и мочи для скрининга на биомаркеры. Кровь будет разделена на сыворотку, эритроциты и лейкоциты для проведения отдельных анализов. (2) Использовать современные методы протеомики и метаболомики для скрининга на возможные биомаркеры, которые коррелируют с возрастом в продольных исследованиях (наблюдение за каждым участником в течение 3-10 лет); изменяются в направлении «молодости» в соответствии с соблюдением рекомендованных мероприятий, для которых установлено продление срока жизни и/или снижение риска заболеваний, связанных с возрастом; возможно, указывают на возраст или встречаемость заболевания/недостатка в поперечных сравнениях. (3) Применить такие потенциальные биомаркеры для расширения и валидации их прогностической ценности в отношении новых участников и данных, а также определить оптимальные наборы прогностических маркеров. (4) Уменьшить оптимизированные наборы маркеров до экономически выгодных, используя количественный иммуноанализ (или жидкостную хроматографию/тандемную массспектрометрию (LC-MS/MS), или ядерно-магнитный резонанс (ЯМР), или их сочетание) для клинического и коммерческого применения, и оценить рынок для коммерческой реализации по нескольким ценам/в виде нескольких услуг. Для облегчения выполнения данных задач предложено создать «Центр здоровья и долголетия Казанского федерального университета», в котором будет проводиться оценка участников, консультирование и изменение и мониторинг образа жизни. Научные сотрудники центра будут встречаться с группами участников, чтобы объяснить важность участия и соблюдения рекомендованных режимов, а также проводить подготовку и создание банков образцов для


последующего анализа биомаркеров после хранения в жидком азоте. Протеомный и метаболомный анализы будут проводиться с помощью современных аппаратов для массспектрометрии и ядерно-магнитного резонанса в НИИ Физико-химической Медицины, Москва, Россия; уменьшение до экономически выгодных наборов будет проводиться в Казанском федеральном университете и в Арканзасском университете медицинских наук (Литтл Рок, Арканзас, США). 1.4. Задачи проекта Мы предлагаем исследовать зависимость от возраста и продолжительности жизни для большого количества биомаркеров, отобранных на основании клинического опыта и базовых исследований на экспериментальных животных моделях и дополненных широкомасштабным протеомным и метаболомным скринингом. Мы будем использовать биоинформатический подход для получения прогностических алгоритмов, которые наилучшим образом предсказывают возраст и продолжительность жизни на основании группы маркерных значений. Кроме того, мы предлагаем исследовать признанную и стабильную способность ограничений диеты (DR) и аспирина (ASA) увеличивать продолжительность жизни многих биологических видов, чтобы оценить эффективность потенциальных биомаркеров у человека. Таким образом, корректные маркеры старения должны стабильно изменяться с возрастом и в зависимости от семейного долгожительства, но такие тенденции должны замедляться или менять направление при DR, применении аспирина и других «антивозрастных» препаратов, которые считаются перспективными в исходных исследованиях (рис. 1). В качестве второй стратегии валидации биомаркеры будут протестированы на наличие корреляции с клиническими показателями, специфичными для заболеваний, которые считаются факторами риска для заболеваний, зависящих от возраста, таких как диабет 2 типа, резистентность к инсулину и метаболический синдром; сердечные заболевания, повышенное артериальное давление и инсульт; нейродегенеративные заболевания, например, болезнь Альцгеймера; различные раковые заболевания с поздним проявлением. Такие клинические показатели вряд ли сами по себе будут являться биомаркерами старения, так как обычно они представляют интерес только при прогнозировании одного связанного с возрастом заболевания, но признаки, характерные для большинства болезней (на основании связи с генотипами), должны хорошо коррелировать с биомаркерами, связанными с физиологическим или молекулярным старением. Для валидации потенциального биомаркера с помощью данной стратегии, маркер должен соответствовать хотя бы 2 из следующих критериев в популяциях исследования: (а) показывать неизменную тенденцию с возрастом; (б) показывать компенсирующую тенденцию с увеличением продолжительности жизни, либо у индивидуальных участников (3-, 6- и 10-летнее последующее наблюдение), либо у ближайших родственников (по данным регистрации); (в) возрастные тенденции должны замедляться или менять направление при DR или применении аспирина у индивидуального участника в течение нескольких месяцев после начала вмешательства; (г) значения биомаркеров должны коррелировать с ранее установленным мета-набором факторов риска для заболеваний, связанных с возрастом; (д) биомаркеры должны предсказывать, у каких участников в группе с высоким риском в силу возраста пола и генотипа будут развиваться клинические симптомы заболеваний, связанных с возрастом, в течение 3-10летнего периода наблюдения. 1.5. Ожидаемые результаты проекта Мы рассчитываем, что сможем набрать 2000 участников в первые 1,5-2 года после данного предложения, а с учетом объяснения участникам преимуществ для здоровья, связанных с участием, мы рассчитываем сохранить не менее 1400 участников в течение 3 лет после данного предложения. Мы ожидаем, что степень соблюдения особых режимов будет варьировать, но в предложенном дизайне исследования учитывается данная проблема клинических исследований, так как установлены объективные показатели приверженности, а степень приверженности


включена в различные процедуры анализа данных (например, как ковариата в логистической регрессии). Одновременная оценка биомаркеров и проводимых вмешательств облегчит процесс выявления, так как несколько видов вмешательств, для которые ранее было установлено увеличение продолжительности жизни на животных моделях, либо обеспечивают аналогичные преимущества для человека, либо могут потенциально их обеспечивать. Например, ограничение диеты (DR) увеличивает продолжительность жизни у каждого протестированного вида [1-3], а у человека зависимое от возраста снижение вариабельности частоты сердечных сокращений значительно замедляется при долгосрочном DR [1]. DR дополняется физическими нагрузками, то есть у упражняющихся людей наблюдаются более молодые индикаторы здоровья, напоминая умеренное ограничение потребления калорий, а дальнейшие физические нагрузки улучшают некоторые индикаторы у животных с ограниченным потреблением калорий, предотвращают потерю мышечной массы и снижают «возобновление» набора массы тела [4-6]. Упражнявшиеся грызуны также жили дольше, чем те, которые вели сидячий образ жизни, независимо от ограничений диеты [7]. Постоянный прием аспирина в низкой дозировке (81 мг/сутки), видимо, снижает смертность по любой причине у мужчин [8], как и у мышей [9]. Мы рассчитываем, что корректные биомаркеры человеческого старения будут увеличиваться или уменьшаться с возрастом участника (в случае данных, объединенных для множества участников - после нормализации каждого участника по исходным измеренным значениям), но тенденция будет меняться на обратную при ограничении диеты и приеме аспирина (т.е. тенденция к значениям, характерным для молодого возраста). Аналогичным образом рапамицин и метформин увеличивают продолжительность жизни у мышей [10,11], что ведет к предположению, что один или оба эти препарата могут предоставлять преимущества и для человека и сдвигать корректные биомаркеры в «молодом» направлении. Чтобы валидировать краткосрочные показатели биологического возраста, их также будут проверять на наличие корреляции с установленными клиническими результатами для связанных с возрастом заболеваний. Как указано выше, мы получим преимущество при включении в нашу популяцию участников, которые желают изменить свою диету ad libitem на употребление ограниченного количества калорий (80% от ad libitem) или на диету с модифицированным содержанием жиров, белков или глюкозы; или участников, которые желают (после проведения первых 2-3 анализов для определения исходного уровня) начать прием аспирина, рапамицина или метформина. Мы рассчитываем, что некоторые новые потенциальные биомаркеры будут коррелировать с вариабельностью частоты сердечных сокращений, чувствительностью к инсулину, временем ответа или с другими клиническими показателями, для которые известно прогрессивное изменение с возрастом, а также в белковыми маркерами сыворотки, которые прогнозируют риск развития связанных с возрастом состояний/заболеваний (например, уровень адипонектина, лептина, белка, связывающего жирные кислоты, и ретинолсвязывающего белка 4 для ожирения и метаболического синдрома [12,13]; сывороточные липопротеины, окисленные липопротеины низкой плотности (ЛПНП), гомоцистеин, TNF-α (фактор некроза опухолей α), рецептор TNF 1 или динамин-связанный белок для сердечно-сосудистых заболеваний [таблица 2 и ссылки там же]; и снятие характерного метилирования ДНК для многих раковых заболеваний [14,15]). Мы ожидаем, что межгрупповое сравнение (случай-контроль) также принесет значимые результаты, особенно для заболеваний с относительно высокой встречаемостью в нашей популяции исследования, несмотря на относительно умеренную мощность дизайна данного исследования в отношении эффективности применяемых видов вмешательств. Распространенные заболевания, мониторинг которых будет проводиться, включают респираторные инфекции (по сообщениям участников); резистентность к инсулину, диабет и метаболический синдром (изначально выявляемые в тестах толерантности к глюкозе и подтверждаемые после направления


к врачу); сердечно-сосудистые нарушения и инсульты (подтвержденные врачом); рак молочной железы, предстательной железы или легкого (подтвержденные врачом). В качестве вероятного результата мы ожидаем, что корреляции с ранее установленными факторами риска с возрастом и в различных группах терапии/вмешательства могут быть незначительными для популяции исследования в целом, но значимыми в восприимчивых подгруппах, определенных по генотипическим или эпигенетическим профилям или с помощью более традиционных показателей клинического риска. Предполагаемые результаты включают: (а) интегрированный анализ, который точно и надежно оценивает физиологический возраст участника по высокой корреляции проспективных показателей (последующая встречаемость заболевания, заболеваемость и смертность) и ретроспективных параметров (клинические факторы риска, установленные для основных зависящих от возраста заболеваний); (б) прототип франшизы для распространения Центров здоровья и долголетия, аналогичных описанному здесь; (в) новые открытия, касающиеся механизмов определения долголетия и, следовательно, открытие ранее неизвестных мишеней для фармакологического воздействия или вмешательства в образ жизни; (г) снижение затрат на здравоохранение в России, так как доступность широко применяемых показателей физиологического возраста станет мощным стимулом для перехода к здоровому образу жизни, который уже известен (диета и физические упражнения), а новые препараты, валидированные с помощью нашего набора биомаркеров, могут еще более расширить популяцию, для которой принесет пользу данное исследование и снижение затрат, связанных с заболеваниями пожилого возраста.

Раздел 2. Описание проекта 2.1. Описание предлагаемого научного исследования Продолжительность жизни в основном контролируется генетически, за счет чего наблюдается невероятное разнообразие продолжительности жизни у разных видов млекопитающих; но она также может меняться в зависимости от диеты и лекарственной терапии. Недавние открытия, касающиеся нашего понимания молекулярных механизмов, которые регулируют долголетие, подготовили почву для исследования и внедрения схем продления срока жизни у человека. Исключительная продолжительность жизни человека, и без того одна из самых больших среди млекопитающих, стала обескураживающим препятствием для проведения такого исследования. Чтобы ускорить переход с животных моделей на исследования долголетия с участием человека, потребуется валидация надежных биомаркеров возраста человека и установление набора маркеров для прогнозирования потенциальной выживаемости. Кроме предоставления инструмента для выявления индивидуумов с наивысшим риском развития зависящих от возраста заболеваний, такой набор сильно ускорит развитие мероприятий, которые замедляют или обращают разрушительные процессы, которые подлежат мониторингу. Несмотря на то, что для многих распространенных в Росси и в большей части западного общества заболеваний, связанных с возрастом, включая диабет 2 типа, сердечно-сосудистые заболевания и многие раковые заболевания, хорошо известные генетические, клинические и связанные с образом жизни факторы риска, клинические биомаркеры, указывающие на предрасположенность к каждому состоянию, по большей части специфичны для каждого заболевания. В отличие от этого одни и те же показатели, связанные с диетой и физическими упражнениями, которые увеличивают риск или являются защитными факторами, в значительной мере общие для многих заболеваний. Например, высокое потребление жиров является фактором риска для диабета, сердечнососудистых заболеваний и многих раковых заболеваний, тогда как ограничения питания и физические упражнения защищают от этих и многих других состояний [1-7]. Недавно появились профили увеличения продолжительности жизни, полученные на животных моделях [16-21], но за


исключением связи с генотипом их еще предстоит протестировать на человеке [22]. После их валидации для человека мы ожидаем выявить людей с низким риском с «молодым» профилем, которые выглядят физиологически молодыми для своего возраста, и людей с признаками раннего старения и повышенным относительным риском многих заболеваний, ассоциированных со старостью. Если бы люди с высоким риском могли сократить недостатки, сопровождающие старение, перейдя к соответствующему образу жизни или принимая защитные препараты, это могло бы принести значительную пользу для общества и для возрастающей стоимости здравоохранения. Анализ того, снижает ли вмешательство значимо смертность или встречаемость заболеваний в генетически и экологически разнообразной популяции, является дорогим и занимает много времени. Однако, сдвиг профиля биомаркеров в сторону уменьшения риска можно зарегистрировать гораздо быстрее и дешевле. Несмотря на то, что появление или рецидивы специфических заболеваний снижаются при следовании диете и/или физических упражнениях [1,2,4,5], подлежащий процесс старения изучался на молекулярном уровне лишь на нескольких животных моделях. Аспирин представляет интригующий пример богатого урожая, который можно собрать по результатам молекулярного анализа старения человека. Аспирин (ацетилсалициловая кислота или ASA) является общим ингибитором ЦОГ и ацетилирующим агентом, который в течение многих десятилетий считался противовоспалительным агентом первой помощи. Мета-анализ 6 крупных клинических исследований, спланированных для проверки защиты от сердечно-сосудистых заболеваний, показал, что аспирин также защищает от многих других зависящих от возраста заболеваний, включая диабет, сердечно-сосудистые заболевания, болезнь Альцгеймера и некоторые распространенные раковые заболевания [8,19,20]. Может ли общим фактором для таких различных преимуществ являться само старение? Действительно, смертность по любой причине была немного снижена (на 8%, р≈0,06) среди мужчин, принимающих аспирин [8], тогда как среди диабетиков наблюдалось значительное снижение [19]. Самцы мышей, которые получали аспирин, также показали сходное снижение смертности (8%, р=0,01) [9]. Мы обнаружили, что C. elegans, подвергавшиеся воздействию аспирина в нескольких физиологических дозировках, жили на 20-40% дольше, чем получавшие наполнитель [20]. Благодаря простой «обратной генетике» данного вида мы смогли исследовать подлежащие механизмы с помощью нокдауна РНКинтерференцией генов, которые могли объяснять эффективность аспирина, вызывая воспалительные и инсулиноподобные реакции [20]. Текущее предложение будет первым исследованием биомаркеров, полученных на животных моделях, для определения их полезности в отношении прогнозирования связанных с возрастом результатов у человека. Другие инновационные характеристики включают: (i) исследование взаимодействия препаратов или биологически активных добавок с генетическими маркерами, диетой (включая липидный и аминокислотный состав потребляемой пищи) и физическими упражнениями; (ii) использование дизайна блоков с повторными измерениями (участники в качестве контроля для самих себя), чтобы снизить влияние популяционной и экологической гетерогенности; (iii) исходная валидация потенциальных биомаркеров на основании их реакции на DR или аспирин, а также корреляции с клиническими факторами риска, установленными для связанных с возрастом заболеваний. После валидации наборов краткосрочных прогностических биомаркеров они значительно ускорят тестирования различных видов вмешательств для улучшения связанных с возрастом заболеваний, так как результаты по эффективности смогут быть получены в течение месяцев, а не десятилетий. Влияние предложенных исследований на российскую и мировую экономику значительно, как в краткосрочной, так и в долгосрочной перспективе. В течение 3-5 лет предложенное исследование приведет к созданию интегрированного анализа, который будет иметь клиническую ценность в качестве высокоэффективного инструмента оценки множества факторов риска для целого спектра


заболеваний пожилого возраста, а также будет обладать коммерческой ценностью (аналогично анализам генотипа, таким как «23 и я», которые распространились на рынке, несмотря на очень низкую прогностическую мощность). Таким образом, их можно будет продавать непрофессионалам в качестве инструмента для оценки собственного «биомаркерного возраста», и в то же время постепенно создавать обширную базу данных результатов анализа и соответствующих результатов, касающихся состояния здоровья. Полную разработку набора маркеров с высокой прогностической мощностью можно осуществить в основном за счет потребителей, в то же время мотивируя участников изменять свой образ жизни таким образом, чтобы улучшить состояние здоровья и снизить риск заболеваний, которые представляют наибольший риск для каждого конкретного участника. В последующее десятилетие действительная долгосрочная ценность данного проекта станет очевидной: клинические исследования смогут оценить эффекты широкого спектра воздействий на образ жизни (физические упражнения или изменение количества потребляемых калорий, жиров, аминокислотного баланса и т.д.) в течение нескольких месяцев или лет, а не периодов, сопоставимых с продолжительностью жизни человека. Все вместе такие эффекты значительно снизят груз, который представляет стареющая популяция для мировой экономики. 2.2. Описание научных подходов и методов, используемых для решения поставленных задач Основной экспериментальный дизайн представляет собой повторные измерения (тип дизайна рандомизированных блоков), где каждый участник служит контролем для себя самого/ой в отношении влияния изменения образа жизни или приема препаратов/биологически активных добавок на набор маркеров. Таким образом, исходный период оценки в 1 месяц предваряет период вмешательства/изменений. Для участников будет проводиться автоматизированный и самостоятельный мониторинг физических упражнений и диеты, участники должны будут прийти еще для 2 дополнительных обследований, а затем на собеседование, в ходе которого они получат персональные рекомендации по изменению физической нагрузки и диеты и возможной пользе терапевтических агентов. Для оценки приверженности режиму будут использованы объективные показатели (например, снижение массы тела во время DR; концентрация ASA в крови в течение терапии). Хотя все желающие пациенты будут оставлены в исследовании для анализа данных, результаты будут использованы в зависимости от степени приверженности, чтобы отделить эффекты несоблюдения режима. После терапии для участников будет проведена повторная оценка (рис. 1, А-С). Параллельно будет применяться второй дизайн межгруппового сравнения (дизайн случайконтроль). Каждый протокол мероприятия определяет экспериментальную группу, тогда как контрольные группы для данного дизайна будут состоять из участников, которые проходят исходную оценку, но решают не переходить (или показывают объективные признаки низкой приверженности) к рекомендованному образу жизни или приему препарата/биологически активной добавки. Условием включения в исследование будет письменное согласие на периодическое заполнение краткого опросника состояния здоровья/заболеваний, независимо от следования рекомендованным изменениям диеты, физических упражнений и т.д. Мы не можем предсказать долю участников, которые откажутся от любого из вмешательств (и долю в контрольной группе) до исходных исследований. Положительные результаты будут накапливаться с течением времени и стимулировать продолжение участия. Из-за более высокой вариабельности, а, следовательно, меньшей мощности, ожидается, что такой дизайн будет менее информативен, чем дизайн повторных измерений. Выбор потенциальных биомаркеров На данный момент наилучшими индикаторами возраста человека являются физиологические показатели, такие как время ответа [21], вариабельность частоты сердечных сокращений [1] или


внешний вид [22]. Мы проведем для всех участников оценку полного спектра таких клинических признаков, которые включают многие наилучшие показатели риска для связанных с возрастом заболеваний. Тем не менее, мы также предлагаем проанализировать большой набор известных или предполагаемых белковых биомаркеров сыворотки и мочи. Все в большей степени такие маркеры дополняют (если не замещают) физиологические показатели в качестве прогностических факторов для риска заболеваний. Однако, существует еще более веская причина. Одной из наших целей является разработка быстрого экономически выгодного инструмента скрининга для оценки физиологического возраста и прогнозирования потенциальной продолжительности жизни для взрослых. С этой целью мы предусматриваем единый набор, в котором активное состояние белков и их количество могут быть достаточными для полной оценки «метаболического возраста» и рисков связанных с возрастом заболеваний. Концентрации белков и степень сайт-специфичного фосфорилирования (или других активирующих/дезактивирующих модификаций) может быть определена количественно для многих ключевых компонентов регуляторных и сигнальных путей с помощью масс-спектрометрических методов LC-MS/MS [23-29] или иммуногистохимии на высокоэффективных белковых микрочипах [30,31]. Мы также предлагаем широкомасштабные «омные» подходы, то есть LC-MS метаболомика и ЯМР «метабономика». Выявленные таким образом биомаркеры после их определения можно включить в один набор с помощью специфических антител. В отличие от этого транскрипты (микроРНК, мРНК), геномику и эпигеномику лучше всего исследовать с помощью метода глубокого секвенирования – другой и относительно дорогостоящей технологии. Путем оценки корреляций между данными показателями и установленными физиологическими/клиническими индикаторами старения и риска заболеваний мы надеемся дополнить такие индикаторами молекулярными профилями, которые могут служить их заменителями. Набор ранее применявшихся белковых маркеров приведен в таблице 1; установленные белковые биомаркеры, специфичные для сердечнососудистых заболеваний (связанные с возрастом заболевания, для которых будет проводиться поиск корреляций внутри набора маркеров и между маркерами и факторами риска), указаны в таблице 2. Биомаркеры, которые мы или кто-либо другой обнаружим, могут быть добавлены в набор и проанализированы на хранящихся чипах за умеренную плату. Анализы на основе секвенирования, также являясь потенциально ценными, будут проводиться для дополнительной прогностической ценности и анализа перекрывания с другими маркерами (например, методом пошаговой регрессии). Так как белки и их активность или метаболиты, контролируемые ферментативной активностью, являются центральными регуляторами практически всех процессов в клетке, связанных со старением, имеющиеся доказательства поддерживают использование чипов с белками/модифицированными белками (возможно, дополненные индикаторами метаболитов) в качестве наиболее информативного и эффективного единого инструмента. Составляющие данного предложения: 1. Исходная оценка. Во время исходного собеседования участникам расскажут о процедурах, выгодах и рисках, связанных с участием, и попросят предоставить информированное согласие. Для тех, кто согласится участвовать, будет использован опросник личных и семейных медицинских рисков, затем будет построен «проспективный профиль состояния здоровья» на основе опросника и соответствующих количественных анализов: А. Анализы крови позволят нам (А.1) определить сывороточную концентрацию липопротеинов, окисленных ЛПНП, анаболических гормонов, гормонов щитовидной железы, гомоцистеина и других потенциально информативных метаболитов; (А.2) подготовить ДНК для оценки генетических и эпигенетических факторов риска; (А.3) оценить профили жирных кислот лимфоцитов и маркеры окислительного повреждения (4-HNE (эластаза нейтрофилов человека) и карбонильные продукты присоединения, изопростаны и т.д.). В. Образцы мочи будут брать для анализа белков и метаболитов,


экскретируемых в мочу. С. Спирометрия будет проводиться для определения интенсивности метаболизма и дыхательного коэффициента. D. Будет проводиться представляющая минимальный риск оценка сердечно-сосудистых заболеваний. Во время каждой оценки (3 раза в течение первого месяца для определения исходного уровня, затем ежемесячно) указанные выше показатели количественных анализов будут оцениваться заново и дополняться другими тестами в соответствии с исследованиями на животных моделях долголетия и заболеваний (см. №5 ниже). Пациентов попросят обновлять список принимаемых лекарственных препаратов, как продаваемых без рецепта, так и назначаемых, а также биологически активных добавок. 2. Мониторинг физической активности. Пациентам, придерживающимся режима физической нагрузки, предоставят бесплатный доступ в «Центр здоровья и долголетия Казанского государственного университета» (или в коммерческий фитнес-клуб, при необходимости). Современные тренажеры часто определяют показатели, касающиеся потребляемых калорий, частоты сердечных сокращений и т.д. Кроме того, устройства для вывода данных установлены на многих тренажерах и используются производителями для контроля качества. Они могут быть объединены с устройствами для карт памяти, что позволяет перенести данные участника непосредственно с тренажера в компьютерную базу данных, где записи хранятся и анализируются. Регистрируемые параметры будут включать используемые тренажеры, продолжительность упражнений, общие затраченные работу и энергию и несколько показателей сердечной функции (сохраненная средняя частота сердечных сокращений, достигнутая максимальная частота сердечных сокращений и время поддержания частоты в каждом из диапазонов по отношению к максимальной частоте). На основе этих данных будут вычислены показатели физической работоспособности и сжигания калорий. Сбор данных будет автоматическим и прозрачным для участников. Однако, некоторые типы упражнений (например, плавание) требуют ручного сбора данных или загрузки данных с помощью недорогих мониторов частоты сердечных сокращений (например, «Полар Интсрументс»). Автоматическая отчетность будет частично дублировать ручную отчетность, чтобы проверить надежность данных, вводимых вручную. Факторы коррекции, основанные на сравнении данных, полученных обоими способами, будут применяться для данных, полученных исключительно путем самооценки. Нескорректированные и скорректированные данные будут представлены в базе данных. 3. Потребление пищи будет регистрироваться с помощью тех же выпущенных для участников чиповых карт для всех продуктов питания и напитков, приобретенных (на дотацию) на территории центра. Состав всех пунктов меню соответствующих ресторанов будет храниться в базе данных и использоваться для мониторинга действительного состава потребляемой пищи для тех приемов пищи, которые осуществляются на территории центра или приобретаются на вынос как «сбалансированные» блюда, предлагаемые по разумной цене в ресторанах центра. Мы предлагаем, насколько это возможно, заручиться поддержкой местных ресторанов, предоставляя субсидию каждый раз, когда участник там обедает, а данные о потребленной пище и ее составе загружаются на компьютеры центра. Хотя такое потребление пищи представляет лишь часть от общей диеты, экстраполяция должна быть гораздо точнее, чем ретроспективные воспоминания о съеденной пище, которые использовались в большинстве других исследований влияния диеты на состояние здоровья человека. Как было описано для физических упражнений, ручной ввод данных будет дублировать все автоматические отчеты для оценки надежности данных, вводимых вручную. Фактор коррекции, основанный на сравнении данных, полученных обоими способами, будет применяться для данных, полученных исключительно путем самооценки; нескорректированные и скорректированные данные будут храниться в базе данных. 4. Рекомендации по режимам. Участникам расскажут об их состоянии здоровья и показателях риска заболеваний, полученных из приведенных выше пунктов 1-3. Будут предложены рекомендации по изменению образа жизни с целью снижения риска и улучшения состояния


здоровья и для достижения индивидуальных целей, таких как снижение массы тела, улучшение физической формы/продолжительности жизни, увеличение мышечной силы, выносливости или плотности костей и т.д. Если участник принимает протокол изменения образа жизни, степень приверженности протоколу можно оценить по изменению активности и параметрам диеты, мониторинг которых проводится постоянно (пункты 2 и 3 выше), а не по «круговому выводу», основанному на изменениях в ходе осмотра и анализа биомаркеров. 5. Введение новых метаболических профилей. Биомаркеры, для которых обнаружена способность прогнозировать возраст или долголетие в клинических исследованиях или на животных моделях (таблица 1) будут оцениваться для каждого включенного участника вместе с установленными клиническими показателями риска связанных с возрастом заболеваний (например, сердечно-сосудистые заболевания, указанные в таблице 2). Хотя мы ожидаем, что большинство специфичных для заболеваний биомаркеров будут прогнозировать продолжительность жизни или состояние здоровья только для относительно небольшой части популяции, которая особенно восприимчива к данным заболеваниям, более общие биомаркеры возраста или долголетия должны показать высокую корреляцию с клиническими факторами риска для зависящей от возраста частоты встречаемости заболеваний благодаря сильной зависимости таких результатов от возраста. Таким образом, мы сможем провести валидацию для потенциальных биомаркеров в короткие сроки с помощью дизайна блоков с повторными измерениями, одновременно с их использованием в проспективном исследовании с дизайном межгруппового сравнения. Новые маркеры состояния здоровья и будущего долголетия по мере их выявления на животных моделях или у человека с помощью наших широкомасштабных протеомных и метаболомных анализов могут добавляться в набор протестированных параметров и оцениваться на наличие корреляции и взаимодействия с другими переменными. Пациенты в данном исследовании также пройдут полное секвенирование генома, включая геном митохондрий. Таким образом появится возможность поиска решения по снижению риска или отсрочке для участников с наиболее высокой генетической предрасположенностью к определенным заболеваниям с помощью диетических, фармакологических изменений или изменений образа жизни, добровольно принимаемых в ходе исследования. Анализ данных Мы проведем оценку реальной встречаемости наиболее распространенных зависящих от возраста заболеваний (вирусные инфекции, диабет 2 типа, сердечно-сосудистые заболевания, депрессия, многие раковые заболевания и аутоиммунные/воспалительные заболевания, такие как артрит) в течение 3-10 лет (повторяя анализ не реже 1 раза в год). Такие частоты встречаемости могут быть использованы в различных процессах анализа данных для определения групп биомаркеров, которые наилучшим образом прогнозируют риск специфических заболеваний и общей встречаемости заболеваний, заболеваемости или смертности с учетом генетической предрасположенности (полиморфные локусы, ассоциированные с риском заболевания) в качестве базовой переменной. Особые методы, которые будут применяться, включают многопараметрическую и логистическую регрессию, пошаговую (вперед и назад) регрессию, Байесовы сети и наивную Байесову классификацию, генетические алгоритмы, кластерные и древовидные («решающие деревья») алгоритмы и процедуры для нейронных сетей. Метод размножения выборок, в котором часть данных используется для компьютерного обучения, а остальная часть – для анализа, будет использоваться для оценки валидности (чувствительность и специфичность) прогностических алгоритмов. Перечисленные выше результаты будут использованы для оценки следующего:


a. Валидность новых биомаркеров базовых исследований у человека в качестве прогностических факторов для продолжительности жизни и предрасположенность к связанным с возрастом заболеваниям, здесь – полученные на основе изменений за счет DR или приема аспирина, и корреляции с установленными показателями риска заболеваний в ходе их изменения в течение данного исследования. b. Добавленная прогностическая ценность новых биомаркеров, полученных в ходе метаболомного и протеомного анализов. c. Связь таких индикаторов с другими показателями общего состояния здоровья и с частотой встречаемости распространенных заболеваний, включая вирусные и бактериальные инфекции, а также сердечно-сосудистые заболевания. d. Терапевтическая эффективность для различных исходов, наблюдающаяся в результате специфических изменений образа жизни. e. Эффекты таких маркеров «профиля здоровья», препаратов/биологически активных добавок, рекомендованных и принятых участниками, и взаимодействие таких видов вмешательства с диетой и физическими упражнениями. На основании данных анализов мы определим, какие комбинации показателей являются наилучшими прогностическими факторами для будущего состояния здоровья и риска специфических заболеваний, и какие виды вмешательства наиболее эффективны. Несмотря на то, что биомаркеры можно оценить без других видов вмешательства (т.е. изменения диеты и физические нагрузки можно было бы отложить до валидации биомаркеров), мы предлагаем начать безвредные виды вмешательства (т.е. для которых показан риск, не превышающий минимального) на раннем этапе, не только из-за потенциальной пользы для участников, но и по причине того, что они должны увеличивать диапазон ответа для потенциальных биомаркеров и быть особенно информативными при дизайне блоков с повторными измерениями, который надежен при популяции, гетерогенной по генетическим и экологическим факторам. 2.3. Описание научного задела по проекту и связанных с ним научных результатов коллектива исполнителей Ведущий исследователь, Роберт Дж. Шмуклер Рейс (RJSR) получил несколько грантов Национального института здоровья/Национального института старения (NIH/NIA) для проведения исследований естественный генетических вариаций у нематоды C. Elegans, которые влияют на долголетие, физическую форму и устойчивость к стрессу, а также для изучения генетических основ остеопороза у человека. Его группа открыла более 27 высокозначимых локусов ("QTL"), контролирующих характеристики выживания у нематод [32], и смогла исследовать один из локусов до момента определения подлежащего гена и характеристики его плейотропных эффектов [33]. С помощью аналогичной стратегии картирования в попытке понять генетический контроль остеопении у мышей было выявлено 6 QTL, изменяющих плотность костей при достижении половозрелости или позже [34]. Один из них, находящийся на Х-хромосоме, был отслежен в 2 различных популяциях человека и оказалось, что он оказывает сильное влияние на плотность костей у женщин в постменопаузе, хотя у мужчин данный локус эффекта не проявляет [35]. RJSR получил грант NIH по Программе проекта (2003-2008) для исследования биомаркеров продолжительности жизни у дрожжей, дрозофилы, C. Elegans и мышей. Для нематод они разработали ряд изогенных мутантов по долголетию с различными путями, чтобы найти признаки, общие (и таким образом центральные) для характеристик выживания, которыми они все управляют. Среди биомаркеров, наилучшим образом предсказывающих долголетие, были цепи жирных кислот [36] и метаболиты, участвующие в контроле окислительно-восстановительных и


биоэнергетических процессов. Интересным, что продолжительность жизни положительно коррелировала с относительным содержанием мононенасыщенных жирных кислот (MUFA; R = 0,84), но отрицательно коррелировала с полиненасыщенными жирными кислотами (PUFA; R = 0,82) и длиной цепочки жирной кислоты (R = -0,87) (Рис. 2) [36]. Очень похожие результаты были описаны как характеристика мембран эритроцитов у детей девяностолетних стариков, по сравнению с контрольными детьми сходного возраста от родителей обычного возраста [37]. Группа RJSR затем использовала транскриптомный подход к выявлению биомаркеров у C. Elegans, с помощью того же изогенного ряда мутантов [38,39]. Среди биомаркеров, обнаруженных таким методом, было много известных генов, изменяющих продолжительность жизни, а также еще более крупная группа генов, ранее не ассоциировавшихся со старением или долголетием (рис. 3) [39,40]. В процессе они разработали новые биоинформатические процедуры для мета-анализа больших объемов данных, что значительно увеличило мощность такого подхода [40]. Недавно RJSR был удостоен гранта NIH для переноса биомаркеров долголетия и старении на человека, используя образцы крови и данные, собранные в рамках Инициативы по охране здоровья женщин (WHI). Уроки, полученные в ходе данного ретроспективного анализа, будут бесценны при проведении проспективного исследования, предложенного здесь, которое должно предоставить более точные доказательства, чем это может сделать ретроспективное исследование NIH. Группа Шмуклер Рейс считается высокоинновационной и одной из лучших в мире в области исследований генетических детерминант долголетия, а также (независимо от данного предложения) в области плодотворных исследований роли гомологичной рекомбинации в создании клеточного разнообразия, которое поддерживает развитие раковых заболеваний и их прогрессирование. Они были первыми в обеих областях исследований и среди первых, кто успешно исследовал генетику остеопороза. Данные исследования включали многочисленные совместные работы с коллегами в университетах Калифорнии, Вашингтона, Мичигана и Колорадо, Гарвардском университете, Университете Ноттингема (Великобритания) и в Эдинбургском университете (Великобритания) помимо прочего. Доктор Шмуклер Рейс недавно был назначен профессором Университета Вашингтона, Сиэтл, штат Вашингтон, одного из ведущих мировых учреждений в области исследований старения, где он провел несколько семинаров и инициировал дополнительное сотрудничество. RJSR с коллегами из Медицинского центра Арканзасского университета в прошлом году удостоились престижной награды Центра исследования старения Клода Пеппера, в котором RJSR возглавляет одно из 5 основных отделений.

References Cited 1. Stein PK, Soare A, Meyer TE, Cangemi R, Holloszy JO, Fontana L (2012) Caloric restriction may reverse age-related autonomic decline in humans. Aging Cell 11: 644 – 650. 2. Speakman JR, Mitchell SE (2011) Caloric restriction. Mol Aspects Med 32: 159-221. 3. Wuttke D, Connor R, Vora C, Craig T, Li Y, Wood S, Vasieva O, Shmookler Reis RJ, Tang F, de Magalhães JP (2012) Dissecting the gene network of dietary restriction to identify evolutionarily conserved pathways and new functional genes. PLoS Genetics 8: e1002834. 4. Larson-Meyer DE, Redman L, Heilbronn LK, Martin CK, Ravussin E (2010) Caloric restriction with or without exercise: the fitness versus fatness debate. Med Sci Sports Exerc 42: 152-159. 5. Fontana L, Klein S, Holloszy JO (2010) Effects of long-term calorie restriction and endurance exercise on glucose tolerance, insulin action, and adipokine production. Age (Dordr ) 32: 97-108.


6. Palacios OM, Carmona JJ, Michan S, Chen KY, Manabe Y, Ward JL, Goodyear LJ, Tong Q (2009) Diet and exercise signals regulate SIRT3 and activate AMPK and PGC-1alpha in skeletal muscle. Aging (Albany NY) 1: 771-783. 7. McCarter RJ, Shimokawa I, Ikeno Y, Higami Y, Hubbard GB, Yu BP, McMahan C (1997) Physical activity as a factor in the action of dietary restriction on aging: effects in Fischer 344 rats. Aging (Milano) 9:73-79. 8. Bartolucci AA, Tendera M, Howard G (2011) Meta-analysis of multiple primary prevention trials of cardiovascular events using aspirin. Am J Cardiol 107: 17961801. 9. Strong R, Miller RA, Astle CM, Floyd RA, Flurkey K, Hensley KL, Javors MA, Leeuwenburgh C, Nelson JF, Ongini E, Nadon NL, Warner HR, Harrison DE (2008) Nordihydroguaiaretic acid and aspirin increase lifespan of genetically heterogeneous male mice. Aging Cell 7: 641-650. 10. Anisimov VN, Berstein LM, Popovich IG, Zabezhinski MA, Egormin PA, Piskunova TS, Semenchenko AV, Tyndyk ML, Yurova MN, Kovalenko IG, Poroshina TE (2011) If started early in life, metformin treatment increases lifespan and postpones tumors in female SHR mice. Aging (Albany) 3: 148-57. 11. Harrison DE, Strong R, Sharp ZD, Nelson JF, Astle CM, Flurkey K, Nadon NL, Wilkinson JE, Frenkel K, Carter CS, Pahor M, Javors MA, Fernandez E, Miller RA (2009) Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice. Nature 460: 392-395. 12. Choi KM, Yannakoulia M, Park MS, Cho GJ, Kim JH, Lee SH, Hwang TG, Yang SJ, Kim TN, Yoo HJ, Baik SH, Kim SM, Mantzoros CS (2011) Serum adipocyte fatty acid-binding protein, retinol-binding protein 4, and adiponectin concentrations in relation to the development of the metabolic syndrome in Korean boys: a 3-y prospective cohort study. Am J Clin Nutr 93: 19-26. 13. Fadini GP, Ceolotto G, Pagnin E, de KS, Avogaro A (2011) At the crossroads of longevity and metabolism: the metabolic syndrome and lifespan determinant pathways. Aging Cell 10: 10-17. 14. Wu HC, Wang Q, Delgado-Cruzata L, Santella RM, Terry MB (2012) Genomic methylation changes over time in peripheral blood mononuclear cell DNA: Differences by Assay Type and Baseline Values. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 21: 1314–1318. 15. Xie CH, Naito A, Mizumachi T, Evans TT, Douglas MG, Cooney CA, Fan CY, Higuchi M (2007) Mitochondrial regulation of cancer associated nuclear DNA methylation. Biochem Biophys Res Commun 364: 656-661. 16. Shmookler Reis RJ, Ayyadevara S, Crow WA, Lee TW, Delongchamp RR (2012) Gene categories differentially expressed in C. elegans age-1 mutants of extraordinary longevity: New insights from novel data-mining procedures. J Gerontol A, Biol Sci 67: 366–375. 17. Tazearslan C, Ayyadevara S, Bharill P, Shmookler Reis RJ (2009) Positive feedback between transcriptional and kinase suppression in nematodes with extraordinary longevity and stress resistance. PLoS Genet 5: e1000452. 18. McElwee JJ, Schuster E, Blanc E, Piper MD, Thomas JH, Patel DS, Selman C, Withers DJ, Thornton J, Partridge L, Gems D (2007) Evolutionary conservation of regulated longevity assurance mechanisms. Genome Biol 8: R132. 19. Gems D, McElwee JJ (2005) Broad spectrum detoxification: the major longevity assurance process regulated by insulin/IGF-1 signaling? Mech Ageing Dev 126: 381387.


20. Ayyadevara S, Dandapat A, Singh SP, Siegel ER, Shmookler Reis RJ, Zimniak L, Zimniak P (2007) Life span and stress resistance of Caenorhabditis elegans are differentially affected by glutathione transferases metabolizing 4-hydroxynon-2-enal. Mech Ageing Dev 128: 196-205. 21. Shmookler Reis RJ, Xu L, Lee H, Chae M, Thaden JJ, Bharill P, Tazearslan C, Siegel E, Alla R, Zimniak P, Ayyadevara S (2011) Modulation of lipid biosynthesis contributes to stress resistance and longevity of C. elegans mutants. Aging (Albany NY) 3: 125-147. 22. Suh Y, Atzmon G, Cho M, Hwang D, Liu B, Leahy D, Barzilai N, Cohen P. 2008. Functionally significant insulin-like growth factor I receptor mutations in centenarians. Proc Natl Acad Sci USA 105:3438–3442. 19. Ong G, Davis TM, Davis WA (2010) Aspirin is associated with reduced cardiovascular and all-cause mortality in type 2 diabetes in a primary prevention setting: the Fremantle Diabetes study. Diabetes Care 33: 317-321. 20. Ayyadevara S, Bharill P, Dandapat A, Hu CP, Khaidakov M, Mitra S, Shmookler Reis RJ, Mehta JL (2013) Aspirin inhibits oxidant stress, reduces aging-associated functional declines, and extends lifespan of Caenorhabditis elegans. Antioxid Redox Signaling, 18(5): 481 – 490. 21. Karayanidis F, Whitson LR, Heathcote A, Michie PT (2011) Variability in proactive and reactive cognitive control processes across the adult lifespan. Front Psychol 2: 318. 22. Gunn DA, de Craen AJ, Dick JL, Tomlin CC, van Heemst D, Catt SD, Griffiths T, Ogden S, Maier A, Murray P, Griffiths C, Slagboom PE, Westendorp RG (2013) Facial Appearance Reflects Human Familial Longevity and Cardiovascular Disease Risk in Healthy Individuals. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 68: 145 – 152. 23. Byrum S, Smart SK, Larson SK, Tackett AJ (2012) Analysis of stable and transient protein-protein interactions. Methods Mol Biol 833: 143-152. 24. Byrum S, Mackintosh SG, Edmondson RD, Cheung WL, Taverna SD, Tackett AJ (2011) Analysis of Histone Exchange during Chromatin Purification. J Integr OMICS 1: 61-65. 25. Smart SK, Mackintosh SG, Edmondson RD, Taverna SD, Tackett AJ (2009) Mapping the local protein interactome of the NuA3 histone acetyltransferase. Protein Sci 18: 1987-1997. 26. Westblade LF, Minakhin L, Kuznedelov K, Tackett AJ, Chang EJ, Mooney RA, Vvedenskaya I, Wang QJ, Fenyo D, Rout MP, Landick R, Chait BT, Severinov K, Darst SA (2008) Rapid isolation and identification of bacteriophage T4-encoded modifications of Escherichia coli RNA polymerase: a generic method to study bacteriophage/host interactions. J Proteome Res 7: 1244-1250. 27. Yu LR, Zhu Z, Chan KC, Issaq HJ, Dimitrov DS, Veenstra TD (2008) Improved titanium dioxide enrichment of phosphopeptides from HeLa cells and high confident phosphopeptide identification by cross-validation of MS/MS and MS/MS/MS spectra. J Proteome Res 6: 4150-4162. 28. Zhou W, Liotta LA, Petricoin EF (2012) The spectra count label-free quantitation in cancer proteomics. Cancer Genomics Proteomics 9: 135-142. 29. Zhou W, Ross MM, Tessitore A, Ornstein D, VanMeter A, Liotta LA, Petricoin EF, III (2009) An initial characterization of the serum phosphoproteome. J Proteome Res 8: 5523-5531. 30. Silvestri A, Calvert V, Belluco C, Lipsky M, De MR, Deng J, Colombatti A, De MF, Nitti D, Mammano E, Liotta L, Petricoin E, Pierobon M (2012) Protein pathway


activation mapping of colorectal metastatic progression reveals metastasis-specific network alterations. Clin Exp Metastasis. Epub ahead of print, Sept. 29, 2012. 31. Gallagher RI, Silvestri A, Petricoin EF, III, Liotta LA, Espina V (2011) Reverse phase protein microarrays: fluorometric and colorimetric detection. Methods Mol Biol 723: 275-301. 32. Shmookler Reis RJ, Kang P, Ayyadevara S. (2007) Quantitative trait loci define genes and pathways underlying genetic variation in longevity. Exper Gerontol 41:1046–1054. 33. Vertino A, Ayyadevara S, Thaden J, Shmookler Reis RJ (2011) A narrow quantitative trait locus in C. elegans coordinately affects longevity, thermotolerance, and resistance to paraquat. Front Gen 2: Art. 63. 34. Szumska D, Beneš H, Kang P, Weinstein RS, Jilka RL, Manolagas S, Shmookler Reis RJ (2007) A novel locus on the X chromosome regulates post-maturity bone density changes in mice. Bone 40: 758–766. 35. Parsons CA, Mroczkowski HJ, McGuigan F, Albagha OM, Manolagas S, Reid DM, Ralston SH, Shmookler Reis RJ (2006) Interspecies synteny mapping identifies a quantitative trait locus for bone mineral density on human chromosome Xp22. Hum Mol Genet 14:3141–3148. 36. Shmookler Reis RJ, Xu L, Lee HY, Chae MH, Thaden JJ, Bharill P, Tazearslan C, Siegel E, Alla R, Zimniak P, Ayyadevara S (2011) Modulation of lipid biosynthesis contributes to stress resistance and longevity of C. elegans mutants. Aging (Albany, NY) 3: 125–147. 37. Puca AA, Andrew P, Novelli V, Anselmi CV, et al. (2008) Fatty acid profile of erythrocyte membranes as possible biomarker of longevity. Rejuvenation Res 11: 63 – 72. 38.Tazearslan C, Ayyadevara S, Bharill P, Shmookler Reis RJ (2009) Positive feedback between transcriptional and kinase suppression confers extraordinary longevity and stress resistance. PLoS Genetics 5: e1000452. 39.Ayyadevara S, Tazearslan C, Alla R, Bharill P, Siegel E, Shmookler Reis RJ (2009) C. elegans PI3K mutants reveal novel genes underlying exceptional lifespan and stress resistance. Aging Cell 8: 706–725. 40. Shmookler Reis RJ, Ayyadevara S, Crow WA, Lee TW, Delongchamp R (2012) Gene categories differentially expressed in C. elegans age-1 mutants of extraordinary longevity: New insights from novel data-mining procedures. J Gerontol A, Biol Sci 67: 366–375. 41. Hanson R, Hakimi P (2008) Born to run; the story of the PEPCK-Cmus mouse. Biochimie 90: 383-342.


Table 1. Candidate Protein Biomarkers of Aging Pathway Biomarker Antibodies* 1–3 Insulin/IGF-1 Signaling IGF1, IGF1R, IGF-BP7 total, pY Insulin, Ins-R, ILP total, pY agonists IRS-1, -2 total, pS AKT/PKB total, pS, pT PDK pS PI3KI p110α, class-I PI3K total c.s. PTEN total, pS SHIP1, SHIP2 pY FOXO, FOXO1, pS, pT FOXO3A PEPCK ― Klotho ― 5 TGF- ß signaling TGF-ß receptor ― SMAD1, SMAD2 pS 6 MAPK Stress Signaling MAPK, p38MAPK total, pTEpY MEK1, MEK2 total, pS ERK1, ERK2 total, pT, pY GSK3α, ß total, pS, pY small GTPases total, pS (e.g.RAS) SAPK/JNK total, pT/pY 7 Mitochondrial ROS Generation Shc p66 ― CLK-1 ― UCP-1, -2, -3 ― 8 Antioxidant Defenses SKN1 ― p53 total, pS Mn-SOD total Cu/Zn SOD total Catalases 1, 2, 3 ― GST-A4-4, other GSTs total VDAC1, VDAC3 total Carbonylated proteins total 4HNE-modified proteins total 9 Nutrient Sensing/Response

Evidence of age- or longevity-dependence 1

Signaling decreased (↓) in long-lived nematodes, mice, humans [1,2] 1 mRNA, peptide expression ↓ in long-lived worms, mice, humans [1,3–5] 1 Allelic bias (implying selection) for IRS-2 in long-lived humans [6] 2 AKT levels vary with age, impact insulin and NFκB pathways [7] 2 PDK levels vary with age, impact insulin and NFκB pathways [7] KO worms very long-lived [8]; DN transgene slows cardiac aging in mice [9] 1

Phosphatase opposing PI3K in mammals, worms, flies [1,3,4] Other phosphatases opposing PI3K in mammals [1,3,4] 1 IIS-transcription factors; activity ↑ in long-lived animals, humans [9,10] 1,3 FOXO-dependent; overexpression in mice raises activity, lifespan [11] 4 Membrane/serum hormone; KO  arteriosclerosis; ↑ extends life [12] Signaling ↓ in long-lived worms [1]; ↑ in aging heart, PAI-KO mice [13] Transcription factors regulated by TGF- ß signaling [1,3,4] ↓ in long-lived worms [1], ↑ with aging and diabetes in db/db mice [14] Activities ↑ in aging mouse B-cell progenitors [15] Activities ↑ in aging mouse B-cell progenitors [15] Activated in CNS of both familial and sporadic Alzheimers disease [16] Diverse small GTPases initiate MAPK signaling in stress, aging [17] Stress-activated PK, mediates ROS response; ↑ in mouse aging [18] Mitoch. oxidative-stress-response target of p53; KO mice long-lived [19] Clk-1 mutated nematodes, or heterozygous KO mice, live longer [20] Uncoupling proteins, alter mitochondrial ROS generation; acetylated [21] Activity ↑ in long-lived nematodes, mice, flies [22] Response to dsDNA breaks; ↓ or ↑ can extend life of worms, flies [23] Mitochondrial SOD; transgenic ↑ may extend lifespan of flies & mice [24] ↓ with age; neuronal overexpression extends life in Drosophila [25] mito. catalase transgene slows change to cardiac-aging biomarkers [26] Lipoperoxide defense; KO shortens life of worms, mice, humans [27,28] Redox sensor for oxi-stress resistance, lifespan of diverse species [29] Biomarker of aging, oxidative damage to proteins [30,31] Marker of oxidative/electrophilic damage, including cardiovasc. aging [31] +

SIRT1, HDAC1, 3, 4

total

NAD -dependent deacetylases; upregulation extends life [32]

AMPK (α, ß subunits)

total, pS

Senses redox & nutrient status; activity ↑ in long-lived animals [32,33]

mTOR

total, pS

Integrates IIS, energy level, redox status; mice on rapamycin live longer [2]

RSK3/S6 protein kinase

total, pT/pS

Kinase activated by mTOR; KO extends life, mimics DR [34]

PHA-4/FOXA

9

PHA-4 mediates DR, and activity ↑ in long-lived nematodes [35]

10

Protein Synthesis and Turnover Ribosomal proteins (S6) pS eIF4E, eIF4G, eIF4E-BP total, pS, pT Proteasome 20S C2 total Ubiquitin & ubiq-proteins total 11 Dislipidemia (non-IIS) PPAR-α, γ Adiponectin ATP-citrate lyase Acetyl-CoA carboxylase Cytosol phospholipase A2 Phospholipase C-γ1 Apolipoprotein E4 LRP-6

― ― pS pS pS total, pY ― total

Phosphorylation by S6 kinase (RSK) activates translation, limits life [36] Translational init’n factors; downreg. extends life in worms, mice [36,37] Degrades ubiquinated proteins; subsets are impaired in aging mice [38] Targets proteins for degradation; addition via many complexes [38,39] PPARγ-2 shows allelic bias in aged; PPAR-α in aged- mouse heart [40] Circulating levels ↑ in centenarians, their offspring, and with age [41] ACL limits acetyl-CoA formation, key to lipogenesis; ↓in aging mice [42] ACC converts acetyl-CoA to malonyl-CoA; ↓ in aging mice [42] cPLCA2 cleaves phospholipids; activity ↓ with mouse age [43] Cleaves phospholipids [43]; activation in mouse T cells ↓ with age [44] Positively associated with atherosclerosis, Alzheimer disease [45] LDL-receptor related protein; interacts with ApoE and DKK-1 [46]


Table 2. Protein Biomarkers Specific to Cardiovascular Disease Risk Proteins, Peptides

Antibodies*

Evidence of Correlation to Age or CVD Risk

TNF- α, TNF-receptor1 Total Marker of endothelial stress/aging, risk factor for CHD [47] C-reactive protein (C40-ligand) ― An inflammation-response marker, of CV event risk [48] NT-pro-BNP ― Risk factor for coronary heart disease [49] GDF-15 (cytokine) ― Risk factor for cardiovascular disease [50] Thromboxane ― A measure of COX1, associated with CV risk [51] Inflammation-response markers [52] Cytokines IL-1, -2, -6, -8, -10 Total IL-18 ― An inflammation-response marker,linked to CV risk [47] eNOS total, pS A key regulator of vascular smooth muscle tone [53] Complement component 4 ― mRNA correlates with age in heart and cerebellum [54] AT1A-R ― AT1A-R knockout leads to 20% longer-lived mice [55] Angiotensin II ― Ligand of AT1A-R, regulating CV homeostasis [56] NFκB Total An ‘inflammaging’ marker [57], regulated by acetylation [58] Cox-2 Total Inducible prostaglandin-endoperoxide synthase [59] HSP-27, -70, -90 Total Heat shock proteins, molecular chaperones w. CV roles [60] LOX-1 Total Cell receptor for oxidized LDL, implicated in CV risk [61] Troponins ― Part of cardiac & skeletal muscle; in serum implies CVI [62] NADPH oxidase ― Superoxide generator, activated in angiotensin signaling [63] SP3 ― Transcription factor driving hTERT, regulated via acetylation [64] *Antibodies already validated: total = antibody to protein ± modifications; pS = antibody to protein with specific phosphoserine residue(s); pT = antibody, specific to phosphothreonines; pY = antibody, specific to phosphotyrosines

Notes 1

The insulin and IGF-1 signaling pathways were first implicated as regulating longevity and stress-resistance in C. elegans, but have been found to exert similar effects in Drosophila and mice. Moreover, studies of human centenarians indicate that allelic variation at several loci in these pathways, in particular the IGF1-receptor, PI3K and FOXO loci, are significantly or marginally associated with lifespan. 2 Studies in mice have implicated both insulin and NFkB pathways in lifespan. 3 Mice overexpressing PEPCK in muscle are muscular, hyper-active, and long-lived. PEPCK (a target of FoxO and hence of insulinlike signaling) is also a strong predictor of longevity in nematodes (our unpublished data). 4 Klotho hormone was discovered in mice but has a human ortholog also associated with longevity. 5 TGF-ß signaling interacts with insulin-like signaling, and is involved in development, differentiation and maintenance of tissues, and stress responses as well as inflammatory responses. 6 p38-MAPK stress kinases interact with insulin-like signaling, and are involved in a wide variety of stress-response processes. 7 Numerous worm and mouse studies implicate ROS generation, as byproducts of mitochondrial oxidative phosphorylation, in the control of longevity. 8 Defenses against oxidative damage are the other side of the ROS coin, and are equally implicated in longevity. Many studies in worms and mice show life extension when specific SODs, catalases, and GSTs are overexpressed. Contrary evidence (indicating that this is not the case) may just indicate that those studies lacked sufficient oxidative challenges to require more defense enzymes. Human longevity and resistance to some stresses is associated with allelic differences for specific GSTs (in one case a null allele). 9 AMPK signaling acts via mTOR, ULK1, FoxO, Nrf2/SKN-1, and SIRT’s to modulate rodent lifespan (Salminen & Kaarnitranta, ’12). These are intertwined nutrient-sensing pathways, which have been implicated in lifespan control for yeast, worms, flies, and mammals. 10 Many studies have shown that protein synthesis is reduced with aging, and is tightly coupled to several longevity pathways. A substantial number of studies also have implicated protein aggregation and turnover in longevity and a variety of age-associated diseases. 11 Regulation of lipids is one of the best predictors of lifespan in nematodes, rodents and humans. It is also interesting that lipids and lipid-binding proteins are among the strongest risk factors for many age-associated diseases, including Alzheimer’s, cardiac disease and atherosclerosis, and diabetes (also obesity and insulin resistance, which are themselves risk factors for many diseases including specific cancers).


References Cited in Tables 1 and 2 1. Tazearslan C, Ayyadevara S, Bharill P, Shmookler Reis RJ (2009) Positive feedback between transcriptional and kinase suppression confers extraordinary longevity and stress resistance. PLoS Genetics 5: e1000452. 2. Suh Y, Atzmon G, Cho M, Hwang D, Liu B, Leahy D, Barzilai N, Cohen P. 2008. Functionally significant insulin-like growth factor I receptor mutations in centenarians. Proc Natl Acad Sci USA 105: 3438–42. 3. Fadini GP, Ceolotto G, Pagnin E, de KS, Avogaro A (2011) At the crossroads of longevity and metabolism: the metabolic syndrome and lifespan determinant pathways. Aging Cell 10: 10-17. 4. Bartke A, 2008. Insulin and aging. Cell Cycle 7: 3338-3343. 5. Parrella E, Longo VD. 2010. Insulin/IGF-I and related signaling pathways regulate aging in nondividing cells: from yeast to the mammalian brain. Sci World J 10: 161-177. 6. Barbieri M, Rizzo MR, Papa M, Boccardi V, Esposito A, White MF, Paolisso G. 2010. The IRS2 Gly1057Asp Variant Is Associated With Human Longevity. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 65: 282-286. 7. Salminen A, Kaarniranta K. 2010. Insulin/IGF-1 paradox of aging: regulation via AKT/IKK/NFkappaB signaling. Cell Signaling 22: 573-577. 8. Ayyadevara S, Alla R, Thaden JJ, Shmookler Reis RJ. 2008. Remarkable longevity and stress resistance of nematode PI3K-null mutants. Aging Cell 7: 13–22. PMC1819584 9. Inuzuka Y, Okuda J, Kawashima T, Kato T, Niizuma S, Tamaki Y, Iwanaga Y, Yoshida Y, Kosugi R, Watanabe-Maeda K, Machida Y, Tsuji S, Aburatani H, Izumi T, Kita T, Shioi T. 2009. Suppression of phosphoinositide 3-kinase prevents cardiac aging in mice. Circulation 120: 1695–1703. 10. Willcox B, Donlon T, He Q, Chen R, Grove J, Yano K, Masaki K, Willcox D, Rodriguez B, Curb J. 2008. FOXO3A genotype is strongly associated with human longevity. Proc Natl Acad Sci USA 105:13987–92. 11. Hanson R, Hakimi P. 2008. Born to run; the story of the PEPCK-Cmus mouse. Biochimie 90: 383-342. 12. Kurosu H, Yamamoto M, Clark JD, Pastor JV, Nandi A, Gurnani P, McGuinness OP, Chikuda H, Yamaguchi M, Kawaguchi H, Shimomura I, Takayama Y, Herz J, Kahn DR, Rosenblatt KP, Kuro-o M. 2005. Suppression of aging in mice by the hormone Klotho. Science 309: 1829-1833. 13. Xu Z, Castellino FJ, Ploplis VA. 2010. Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) is cardioprotective in mice by maintaining microvascular integrity and cardiac architecture. Blood 115: 2038 - 2047. 14. Lim A, Nikolic D, Ma F, Ozols E, Thomas M, Flavell RA, Davis RJ, Tesch GH. 2009. Role of MKK3-p38 MAPK signaling in the development of type 2 diabetes and renal injury in obese db/db mice. Diabetologia 52:347-358. 15. King A, Van der Put E, Blomberg B, Riley R. 2007. Accelerated Notch-dependent degradation of E47 proteins in aged B cell precursors is associated with increased ERK-MAPK activation. J Immunol 178: 3521-3529. 16. Hernández F, Avila J. 2008. The role of glycogen synthase kinase 3 in the early stages of Alzheimers' disease. FEBS Lett 582: 3848-3854. 17. DeNicola G, Tuveson D. 2009. RAS in cellular transformation and senescence. Eur J Canc 45(S1):211-216. 18. Hsieh C, Rosenblatt J, Papaconstantinou J. 2003. Age-associated changes in SAPK/JNK and p38 MAPK signaling in response to the generation of ROS by 3-nitropropionic acid. Mech Ageing Dev 124:733-46. 19. Migliaccio E, Giorgio M, Mele S, Pelicci G, Reboldi P, et al. 1999. The p66shc adaptor protein controls oxidative stress response and lifespan in mammals. Nature 402:309–313. 20. Lapointe J, Hekimi S. 2008. Early mitochondrial dysfunction in long-lived Mclk1+/- mice. J Biol Chem 283:26217-26227. 21. Caldeira da Silva CC, Cerqueira FM, Barbosa LF. 2008. Mild mitochondrial uncoupling in mice affects energy metabolism, redox balance and longevity. Aging Cell 7: 552–560. 22. Tullet J, Hertweck M, An J, Baker J, Hwang JY, Liu S, Oliveira R, Baumeister R, Blackwell TK. 2008. Direct Inhibition of the longevity-promoting factor SKN-1 by insulin-like signaling in C. elegans. Cell 132: 1025–1038. 23. Donehower LA 2009. Longevity regulation in flies: A role for p53. Aging (Albany NY) 1: 6–8. 24. Hu D, Cao P, Thiels E, Chu C, Wu G, Oury T, Klann E. 2007. Hippocampal long-term potentiation, memory, and longevity in mice that overexpress mitochondrial superoxide dismutase. Neurobio Learn Mem 87:372-384.


25. Phillips JP, Parkes TL, Hilliker AJ. 2000. Targeted neuronal gene expression and longevity in Drosophila. Exp Gerontol 35: 1157-1164. 26. Dai DF, Santana LF, Vermulst M, Tomazela DM, Emond MJ, MacCoss MJ, Gollahon K, Martin GM, Loeb LA, Ladiges WC, Rabinovitch PS. 2009. Overexpression of catalase targeted to mitochondria attenuates murine cardiac aging. Circulation 119: 2789-2797. 27. Ayyadevara S, Dandapat A, Singh SP, Siegel ER, Shmookler Reis RJ, Zimniak L, Zimniak P. 2008. Life span and stress resistance of Caenorhabditis elegans are differentially affected by glutathione transferases metabolizing 4-hydroxynon-2-enal. Mech Aging Devel 128:196–205. PMC1819584 28. Capoluongo E, Onder G, Concolino P, Russo A, Santonocito C, Bernabei R, Zuppi C, Ameglio F, Landi F. 2009. GSTM1-null polymorphism as possible risk marker for hypertension. Clin Chim Acta 399: 92 – 96. 29. Messina A, Reina S, Guarino F, De Pinto V. 2012. VDAC isoforms in mammals. Biochim Biophys Acta 1818: 1466-1476. 30. Asano S, Rice K, Kakarla S, Katta A, Desai D, Walker E, Wehner P, Blough E. 2007. Aging influences multiple indices of oxidative stress in the heart of the Fischer 344/NNia x Brown Norway/BiNia rat. Redox Rep 12: 167-180. 31. Virtue S, Vidal-Puig A. 2008. It’s not how fat you are, it’s what you do with it that counts. PLoS Biology 6: e237. 32. Greer EL, Banko MR, Brunet A. 2009. AMP-activated protein kinase and FoxO transcription factors in dietary restriction-induced longevity. Ann N Y Acad Sci. 1170: 688-692. 33. Onken B, Driscoll M. 2010. Metformin induces a dietary restriction-like state and the oxidative stress response to extend C. elegans healthspan via AMPK, LKB1, and SKN-1. PLoS One 5: e8758. 34. Selman C, Tullet J, Wieser D, Irvine E, Lingard S, Choudhury A, Claret M, Al-Qassab H, Ramadani F, Woods A, Robinson I, Schuster E, Batterham R, Kozma S, Carling D, Okkenhaug K, Thornton JM, Partridge L, Gems D, Withers D. 2009. Ribosomal protein S6 kinase1 signaling regulates mammalian life span. Science 326:140-144. 35. Panowski SH, Wolff S, Aguilaniu H, Durieux J, Dillin A.2007. PHA-4/Foxa mediates dietrestriction-induced longevity of C. elegans. Nature 447: 550–555. 36. Wessells R, Fitzgerald E, Piazza N, Ocorr K, Morley S, Davies C, Lim HY, Elmén L, Hayes M, Oldham S, Bodmer R. 2009. d4eBP acts downstream of both dTOR and dFoxo to modulate cardiac functional aging in Drosophila. Aging Cell 8: 542-552. 37. Hipkiss A, 2007. On why decreasing protein synthesis can increase lifespan. Mech Ageing Dev 128:412-414. 38. Rodriguez K. 2010. Molecular mechanisms of proteasome plasticity in aging. Mech Ageing Dev 131: 144-155. 39. Mehta R, Steinkraus K, Sutphin GL, Ramos FJ, Shamieh LS, Huh A, Davis C, Chandler D, Kaeberlein M. 2009. Proteasomal regulation of the hypoxic response modulates aging in C. elegans. Science 324:1196-1198. 40. Atherton HJ, Gulston MK, Bailey NJ, Cheng KK, Zhang W, Clarke K, Griffin JL. 2009. Metabolomics of the interaction between PPAR-alpha and age in the PPAR-alpha-null mouse. Mol Syst Biol 5: 259. 41. Atzmon G, Pollin TI, Crandall J, Tanner K, Schechter CB, Scherer PE, Rincon M, Siegel G, Katz M, Lipton RB, Shuldiner AR, Barzilai N. 2008. Adiponectin levels and genotype: A potential regulator of life span in humans. J Gerontol 5: 447–453. 42. Nogalska A, Pankiewicz A, Goyke E, Swierczynski J. The age-related inverse relationship between ob and lipogenic enzymes gene expression in rat white adipose tissue. Exp Gerontol 38: 415-422. 43. Gentili C, Morelli S, de Boland AR.2004. PTH and phospholipase A2 in the aging process of intestinal cells. J Cell Biochem 93: 312-326. 44. Utsuyama M, Wakikawa A, Tamura T, Nariuchi H, Hirokawa K. 1997. Impairment of signal transduction in T cells from old mice. Mech Ageing Dev 93: 131-144. 45. Bonomini F, Filippini F, Hayek T, Aviram M, Keidar S, Rodella L, Coleman R, Rezzani R. 2010. Apolipo-protein E and its role in aging and survival. Exp Gerontol 45: 149–157. 46. De Ferrari GV, Papassotiropoulos A, Biechele T, Wavrant De-Vrieze F, Avila ME, Major MB, Myers A, Sáez K, Henríquez JP, Zhao A, Wollmer MA, Nitsch RM, Hock C, Morris CM, Hardy J, Moon RT. 2007. Common genetic variation within the low-density lipoprotein receptor-related protein 6 and late-onset Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 9434-9439. 47. Welsh P, Woodward M, Rumley A, Macmahon S, Lowe G. 2010. Does interleukin-18 or TNF-α have an independent association with the risk of coronary heart disease? Cytokine. 50:94-98 48. Karakas M, Koenig W. 2009. DRP in cardiovascular disease. Herz 34:607-613.


49. deFilippi C, Christenson R, Gottdiener J, Kop W, Seliger S. 2010. Dynamic cardiovascular risk assessment in elderly people. The role of repeated N-terminal pro-B-type natriuretic peptide testing. J Am Coll Cardiol 55:441-450 50. Kempf T, Wollert KC. 2009. Growth differentiation factor-15: a new biomarker in cardiovascular disease. Herz 34:594-599. 51. Frelinger A, Li Y, Linden M, Barnard M, Fox M, Christie D, Furman M, Michelson AD. 2009. Association of cyclooxygenase-1-dependent and -independent platelet function assays with adverse clinical outcomes in aspirin-treated patients presenting for cardiac catheterization. Circulation 120: 2586–2596. 52. Vasto S, Carruba G, Lio D, Colonna-Romano G, Di Bona D, Candore G, Caruso C. 2009. Inflammation, ageing and cancer. Mech Ageing Dev.130: 40–45. 53. Sindler AL, Delp MD, Reyes R, Wu G, Muller-Delp JM. 2009. Effects of ageing and exercise training on eNOS uncoupling in skeletal muscle resistance arterioles. J Physiol 587(Pt 15): 38853897. 54. Park S, Kim K, Page G, Allison D, Weindruch R, Prolla T. 2009. Gene expression profiling of aging in multiple mouse strains: Identification of aging biomarkers and impact of dietary antioxidants. Aging Cell 8: 484–495. 55. Benigni A, Corna D, Zoja C, Sonzogni A, Latini R, Salio M, Conti S, Rottoli D, Cassis P, Morigi M, Coffman T, Remuzzi G. 2009. Disruption of the Ang II type 1 receptor promotes longevity in mice. J Clin Invest 119:524–30. 56. Shi ST, Li YF. 2007. Interaction of signal transduction between angiotensin AT1 and AT2 receptor subtypes in rat senescent heart. Chin Med J (Engl). 120: 1820-1824. 57. Adler A, Kawahara T, Segal E, Chang H. Reversal of aging by NFκB blockade. Cell Cycle. 2008 7:556-59 58. Kiernan R, Brès V, Ng R, Coudart MP, Messaoudi S, Sardet C, Jin DY, Emiliani S, Benkirane M. 2003. Post-activation turn-off of NF-κB-dependent transcription is regulated by acetylation of p65. J Biol Chem 278: 2758-2766. 59. Richards JA, Petrel TA, Brueggemeier RW. 2002. Signaling pathways regulating aromatase and cyclooxygenases in normal and malignant breast cells. J Steroid Biochem Mol Biol 80: 203–212. 60. Benjamin IJ, McMillan DR 1998. Stress (heat shock) proteins: molecular chaperones in cardiovascular biology and disease. Circulation Research 83: 117–132. 61. Ogura S, Kakino A, Sato Y, Fujita Y, Iwamoto S, Otsui K, Yoshimoto R, Sawamura T. 2009. Lox-1: the multifunctional receptor underlying cardiovascular dysfunction.Circ J. 73: 1993-1999 62. Regnante R, Zuzek R, Weinsier S, Latif S, Linsky R, Ahmed H, Sadiq I. 2009 Clinical characteristics and four-year outcomes of patients in the Rhode Island Takotsubo Cardiomyopathy Registry. Am J Cardiol 103: 1015-1019. 63. Ray R, Shah AM. 2005. NADPH oxidase and endothelial cell function. Clin Sci (Lond). 109: 217-226. 64. Braun H, Koop R, Ertmer A, Nacht S, Suske G. 2001. Transcription factor Sp3 is regulated by acetylation. Nucleic Acids Res. 29: 4994-5000.


stop ASA

b begin ASA

0

stop ASA

0 12

36

24

48

stop ASA

begin ASA

0

time (months)

0 12

24

36

time (months)

12

24

36

48

time (months)

assays of subjects w/o intervention assays of subjects during intervention assays after stopping intervention

0 35

40

45

50

55

65

60

70

75

80

age (years)

LCFAs: R = –0.80, Rs= – 0.34 (P<0.006, P<0.05)

10

SCFAs: R = +0.96, Rs= +0.42 (P<2E–5, P<0.01)

50

B. MUFAs & PUFAs MUFAs: R = +0.84, Rs= +0.28 (P<0.002, N.S.)

40

30

20

PUFAs: R = – 0.82, Rs= – 0.36 (P<0.004, P<0.03)

4

8

Relative Strain Longevity

10

C. ACL

R = – 0.87, Rs= – 0.49 (P<0.002, P<0.003)

18.2

18.0

17.8

17.6

17.4

10

0

2

0

48

25

A. Short- vs. Long-Chain FAs

1

begin ASA

D. Cross-sectional support for age effect (no subject-normalization) 50

15

5

1

1

0

C. Intervention reduces age effect

no ASA

Mean FA Chain Length

20

a

1

Percent of Total Fatty Acids

Percent of Total Fatty Acids

Panels A–C show idealized data for different biomarkers. In A, a marker is shown that is influenced by an intervention (e.g. ASA), but not by subject age. Each subject’s values during treatment are normalized to baseline values measured prior to exposure; analysis compares two assay blocks for grouped subjects: a, before vs. b, during treatment. Points in red indicate subjects who terminated ASA. The marker in B has both an age effect (slope) and an effect of ASA. In C, the marker does not respond to ASA, but shows lower agedependence, suggesting that ASA slows aging. Panel D illustrates crosssectional data compiled for an agedependent marker.

B. Effect of intervention, if additive to age effect

A. Effect of intervention, when there is no age effect

Biomarker Level

Figure 1. Possible outcomes of interventions.

Normalized Level

Figures

1

2

4

8

Relative Strain Longevity

10

1

2

4

8

Relative Strain Longevity

Figure 2. Properties of Fatty Acids Covarying with Longevity Across Ten Isogenic C. elegans Strains Fatty acids were quantified by GC-MS metabolomics, relative to total FAs. Strains are placed along the x-axis in order of longevity, grouping those of identical longevity. R is the Pearson correlation coefficient between the y-axis parameter and lifespan, while RS is the Spearman (nonparametric) coefficient between rank orders of these two variables, for N = 36 distinct biological samples. Strains [adult lifespan±SD]: daf-16; age-1(hx546) [0.9± 0.05], daf16; daf-2(e1370) [0.9± 0.05], wild-type N2DRM [1.0± 0.05], old-1 [1.0±0.02], eat-18 [1.12±0.02], unc-31 [1.16±0.06], age-1(hx546) [1.6±0.1], daf-2(e1370) [2.1 ±0.1], age-1(mg44)-F2 [9.6±1.2]. SD values indicate interexperimental variance after normalization.

10


Log 2 (Transcript Level)

6

0.5 7

a. K07F5.5 (nspd-2)

6

b. T25E12.4 (dkf-2) R = –0.95, P < 3E–5

0.0 -0.5

R = +0.99, P < 2E–10

c. R11A5.4 (PEPCK) R = –0.95, P < 4E–5

5 4

5

-1.0

4

-1.5

3

-2.0

2

-2.5

1

-3.0

0

0

-3.5

-1

3 2 1

-2 1

2

4

8

10

Relative Strain Longevity

1

2

4

8

Relative Strain Longevity

10

1

2

4

8

10

Relative Strain Longevity

Figure 3. Transcript levels plotted as functions of median adult longevity, grouped and analyzed by strain. Ordinates display log2(transcript level); x-axes indicate relative median adult longevities, displayed on a log 2 scale to more evenly distribute the points. Strains, with [relative median adult lifespan], are: N2 DRM [=1.0], daf-2(m41); daf-12 [1.5], daf-2(m41) [1.6], daf-2(e1370) [2.1], daf-2(e1391) [2.3], daf-2(e1370); daf-12 [3.9] and age-1(mg44)-F2 [9.5]. Y error bars indicate the SD of actin-normalized transcript levels from 3 (panel a) or 2 (b and c) independent biological populations/strain.


2.4. План научного исследования № Содержание проводимого научного п/п исследования

Перечень разрабатываемых по результатам исследования документов

Срок исполнения (началоокончание)

2013 год

1.

Набор участников и сбор исходных клинических данных

Регистрация набора; Приблизительно архив 1 год информированных согласий; база данных исходных клинических и биомаркерных данных

2.

Оценка участников; рекомендации по видам вмешательства, даты последующего наблюдения и сбор материала (для биомаркерного анализа)

Расширенная база данных исходных клинических и биомаркерных данных

Приблизительно 1 год

3.

Объединение потенциальных биомаркеров на основе предыдущих данных у человека и на животных моделях

Список кандидатов, расширенный и скорректированный на основе таблицы 1

Приблизительно 0,1 года

4.

Исходные анализы для выявления протеомных, метаболомных (LC-MS) и метабономных (ЯМР) потенциальных маркеров

База данных блоков Приблизительно видов вмешательства, 1 год влияющих на характеристики, по сравнению с исходным уровнем (продольно (по участникам) и/или поперечно (по возрастным группам). Подача статьи по новым биомаркерам, изменяющимся при вмешательстве

5.

Валидация антител, используемых для количественного анализа биомаркеров с помощью обращено-фазового микрочипирования (RPMA)

Данные Приблизительно иммуноэлектрофореза, 0,5 года указывающие на выявление единого белкового компонента каждым антителом; исходные значения для данных маркеров

6.

Идентификация молекул, которые могут быть прогностическими, с помощью LCMS или ЯМР; сокращение анализа до RPMA

Статья по биологическому применению обнаруженных маркеров

Приблизительно 1 год

7.

Исходный количественный анализ

База данных блоков видов вмешательства,

Приблизительно


8.

маркеров

влияющих на 0,5 года характеристики, по сравнению с исходным уровнем (продольно (по участникам) и/или поперечно (по возрастным группам). Подача статьи по изменению маркеров RPMA при вмешательстве.

Повторные визиты для оценки приверженности (используя объективные показатели, например, концентрации в кров, массу тела, индекс массы тела, холестерин и т.д.) и краткосрочного ответа биомаркеров на вмешательство

Записи в базе данных Приблизительно участников; исходный и 1 год последующий анализ данных последующего наблюдения, нормализованных по исходному уровню

2014 год 1 Продолжение набора участников и сбора Регистрация набора;

исходных клинических данных

2 Продолжение оценки участников и

приверженности рекомендациям по видам вмешательства, даты последующего наблюдения и сбор материала (для анализа биомаркеров)

3 Продолжение анализов для выявления

протеомных, метаболомных (LC-MS) и метабономных (ЯМР) потенциальных маркеров

архив информированных согласий; база данных исходных клинических и биомаркерных данных

Расширенная база Приблизительно данных исходных 1 год клинических и биомаркерных данных. Подача и публикация статьи по внутренним последствиям видов вмешательств для состояния здоровья База данных блоков Приблизительно видов вмешательства, 1 год влияющих на характеристики, по сравнению с исходным уровнем (продольно (по участникам) и/или поперечно (по возрастным группам). Публикация статей по изменению биомаркеров при вмешательстве.

4 Идентификация характеристик, которые Данные по паттернам

могут быть прогностическими, с

Приблизительно 0,5 года

молекулярных

Приблизительно


помощью LC-MS или ЯМР; сокращение фрагментов, 0,5 года анализа до обращено-фазового сопоставляемым для микрочипирования (RPMA) идентификации соединений. Будут получены моноклональные антитела. Будут поданы заявки на патенты и статьи, если это допустимо при заявке на патенты. 5 Валидация антител, используемых для

Данные Приблизительно количественного анализа биомаркеров с иммуноэлектрофореза, 0,5 года помощью RPMA указывающие на выявление единого белкового компонента каждым антителом; исходные значения для данных маркеров

2015 год 1 Продолжение оценки участников; сбор Расширенная база

данных и материала (для анализа биомаркеров)

2 Продолжение анализов для выявления

протеомных, метаболомных (LC-MS) и метабономных (ЯМР) потенциальных маркеров

3 «Переключение» обращено-фазового

Приблизительно данных исходных 1 год клинических и биомаркерных данных. Подача и публикация статьи по последствиям видов вмешательств для состояния здоровья Расширенные базы Приблизительно данных по 1 год характеристикам, которые различаются в зависимости от возраста продольно (по участникам, нормализация по исходному уровню) и поперечно (по возрастным группам).

Будут поданы заявки на Приблизительно иммуноанализа для анализа патенты. Стартовая 1 год иммобилизованных антител. RPMA компания может идеально для исследований и разработки продавать данный анализа (серия разведений сыворотки, продукт потребителям моча или лизат клеток многих или продать лицензию участников на слайд; одно антитело на другим компаниям в слайд), но меньше подходит для этой нише. коммерческой разработки, чем серия из многих антител на слайд, инкубированных с образцом от одного


участника 4 Анализы данных с помощью стратегий

анализа данных. Прогнозирование и валидация прогностических алгоритмов с помощью дополнительных данных пациентов.

5 Изучение функциональной роли

используемых биомаркеров и ассоциированных с ними путей с помощью РНК-интреференции на C. elegans и в культуре клеток человека.

Публикация по анализу Приблизительно данных и мета-анализу, 1 год а также по прогностическим наборам биомаркеров старения и распространенных связанных с возрастом заболеваний. Публикация результатов; заявки на патенты, если это допускают результаты

Приблизительно 1 год (продолжится и после 3-летнего периода финансирования)

2.5. Показатели эффективности выполнения проекта № п/п 1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

Наименование показателя

Количество статей ведущего ученого в научной периодике, индексируемой в Web of Science, написанных совместно с сотрудниками лаборатории по заявленному направлению исследования, либо самостоятельно написанных штатными сотрудниками лаборатории по заявленному направлению исследования. Количество новых образовательных курсов созданных и внедренных в образовательный процесс по заявленному направлению научного исследования Количество докторских диссертаций, защищенных сотрудниками лаборатории по заявленному направлению научного исследования Количество кандидатских диссертаций, защищенных сотрудниками лаборатории по заявленному направлению научного исследования Количество сотрудников лаборатории, принятых в аспирантуру и докторантуру по заявленному направлению научного исследования Количество молодых ученых, специалистов и преподавателей (кандидатов наук в возрасте до 35 лет и докторов наук в возрасте до 40 лет, специалистов и преподавателей без ученой степени в возрасте до 30 лет) из сторонних организаций, прошедших профессиональную переподготовку или повышение квалификации в лаборатории по заявленному направлению научного исследования Количество поставленных на учет объектов интеллектуальной собственности или заявок на регистрацию объектов интеллектуальной собственности по заявленному направлению научного исследования, авторами которых являются

Ед. изм.

План 2013 год

2014 год

2015 год

2

6

8

ед.

5

12

12

ед.

2

ед.

0

2

3

чел.

3

4

5

2

8

12

0

2

4

ед.

чел.

ед.


№ п/п

8.

9.

10. 11.

12.

13.

Ед. изм.

Наименование показателя

сотрудники лаборатории Количество грантов, полученных за время выполнения проекта, руководителями которых являются сотрудники лаборатории Количество коммерческих договоров/контрактов, полученных и выполненных сотрудниками лаборатории за время выполнения проекта Другие показатели, установленные вузом/научной организацией самостоятельно

План 2013 год

2014 год

2015 год

ед.

1

3

6

ед.

0

2

4

1

2

2

10

14

1

3

Число научных конференций и школ организованных сотрудниками лаборатории за время выполнения проекта Число курсовых, дипломных и диссертационных работ бакалавров и магистров по заявленному направлению научного исследования Дополнительные центры здоровья и долголетия, открытые под патронажем Казанского университета

– –

Раздел 3. Финансовое обеспечение проекта 3.1. Смета расходов средств гранта № п/п 1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

Наименование статьи расходов Расходы на выплату вознаграждения ведущему ученому и членам научного коллектива, включая налоги и иные социальные выплаты, начисленные на вознаграждения ведущего ученого и членов научного коллектива Расходы на приобретение оборудования для научных исследований Расходы на приобретение материалов и комплектующих для оборудования для проведения исследования Расходы на оплату командировок ведущего ученого и членов научного коллектива Расходы на оплату подготовки, переподготовки и повышения квалификации членов научного коллектива Расходы на оплату участия ведущего ученого и членов научного коллектива в конференциях, научных семинарах, симпозиумах Расходы на оплату организации конференций, научных семинаров, симпозиумов, проводимых научным коллективом лаборатории по

Всего (млн. руб.) 54.0

2013 год (млн. руб.) 18.0

2014 год (млн. руб.) 18.0

2015 год (млн. руб.) 18.0

42 (ведущий ученый) + 40 (сотрудники лаборатории)

4 (ведущий ученый) + 14 (сотрудники лаборатории)

4 ((ведущий ученый) +14 (сотрудники лаборатории)

4 (ведущий ученый) + 14 (сотрудники лаборатории)

25.3

9.3

8.2

7.8

4.4

1.8

1.2

1.4

1.0

0.2

0.4

0.4

3.5

0.7

1.4

1.4


8.

9.

10.

направлению научного исследования Расходы, связанные с опубликованием научных статей и изданием монографий ведущего ученого и (или) членов научного коллектива лаборатории по результатам, полученным в ходе реализации проекта в лаборатории, созданной на базе организации, по направлению научного исследования Расходы на оплату работ, выполняемых сторонними организациями (не более 5% от средств гранта) Расходы на оплату текущего ремонта лаборатории, а также прочие расходы, непосредственно связанные с проведением научного исследования (не более 5% от средств гранта) Итого

1.8

0.8

1.0

90.0

30.0

30.0

30.0

3.2. Расшифровка планируемых расходов средств гранта № п/п

3.2.1. Расходы на приобретение оборудования для научных исследований Наименование оборудования Кол-во Цена, (млн. руб.) 2013 год

Сумма, (млн. руб.)

1. 2. 2014 год

1. 2. 2015 год

3. 4. ИТОГО: 3.2.2. Расходы на выплату вознаграждения членам научного коллектива № 2013 год 2014 год Наименование статьи расходов п/п (млн. руб.) (млн. руб.) 1. Общая сумма вознаграждения ведущему 18 18 ученому и членам научного коллектива, включая налоги и иные социальные выплаты, начисленные на вознаграждения ведущего ученого и членов научного коллектива в том числе сумма вознаграждения, 2. 4.8 5.0 выплаченная молодым ученым, студентам, аспирантам

2015 год (млн. руб.)

18

5.2


Общее количество членов научного коллектива в том числе общее количество молодых ученых, студентов, аспирантов Средняя сумма вознаграждения члена научного коллектива в том числе средняя сумма вознаграждения молодых ученых, студентов, аспирантов

3. 4. 5. 6.

35

35

35

24

25

26

0.31

0.31

0.31

0.20

0.20

0.20

3.2.3. Расходы на оплату услуг/работ сторонних организаций № п/п

Наименование организации

Наименование работ/услуг

Сумма, (млн. руб.)

2013 год

1. 2. 2014 год

1. 2. 2015 год

1. 2. ИТОГО: 3.3. Финансирование проекта со стороны вуза/научной организации 3.3.1. Планируемые источники внебюджетных средств № Наименование внебюджетных Детализация внебюджетных п/п источников источников

1.

2. 3. 4. 5. 6.

Средства вуза/научной организации, полученные от приносящей доход деятельности, предусмотренной уставом организации Ассигнования бюджетов субъектов Российской Федерации и муниципальных бюджетов Кредиты и заемные средства Средства российских и иностранных инвесторов Средства добровольных пожертвований юридических и физических лиц Средства, полученные членами научного коллектива лаборатории на конкурсной основе по направлению научного исследования

Сумма, (млн. руб.)

Собственные средства университета

6.0

Бюджет Республики Татарстан

8.0 – – –

Гранты РФФИ, ФЦП

10


7. 8.

Прочие Итого

24

3.3.2. Смета расходования внебюджетных средств № п/п 1.

2. 3.

4.

5.

6.

7.

8.

9. 10.

Наименование статьи расходов Расходы на выплату вознаграждения ведущему ученому и членам научного коллектива, включая налоги и иные социальные выплаты, начисленные на вознаграждения ведущего ученого и членов научного коллектива Расходы на приобретение оборудования для научных исследований Расходы на приобретение материалов и комплектующих для оборудования для проведения исследования Расходы на оплату командировок ведущего ученого и членов научного коллектива Расходы на оплату подготовки, переподготовки и повышения квалификации членов научного коллектива Расходы на оплату участия ведущего ученого и членов научного коллектива в конференциях, научных семинарах, симпозиумах Расходы на оплату организации конференций, научных семинаров, симпозиумов, проводимых научным коллективом лаборатории по направлению научного исследования Расходы, связанные с опубликованием научных статей и изданием монографий ведущего ученого и (или) членов научного коллектива лаборатории по результатам, полученным в ходе реализации проекта в лаборатории, созданной на базе организации, по направлению научного исследования Расходы на оплату работ, выполняемых сторонними организациями Расходы на оплату текущего ремонта лаборатории, а также прочие расходы, непосредственно связанные с проведением научного исследования Итого

Всего (млн. руб.)

2013 год 2014 год (млн. руб.) (млн. руб.)

2015 год (млн. руб.)

8.0

2.0

3.0

3.0

4.0

2.0

1.0

1.0

1.5

0.5

0.5

0.5

2.0

1.0

1.0

8.5

3.5

2.5

2.5

24.0

8.0

8.0

8.0


Раздел 4. Перспективный облик лаборатории после окончания проекта Начало и завершение предложенного проекта выведет казанскую группу на передний план исследований биомаркеров старения и позволит ей руководить другими проектами со сходными целями, которые в настоящее время находятся в стадии планирования в США (Медицинский колледж Эйнштейна), Италии (Университет Болоньи) и Голландии (Университет Утрехта). Таким запланированным проспективным исследованиям не хватает плана по выявлению и валидации биомаркеров, которые можно измерять с первых этапов, вместо этого они надеются обнаружить биомаркеры в ходе своих долгосрочных исследований и применить их задним числом. Это стратегия, которая может стать успешной для некоторых биомаркеров, которые довольно устойчивы к замораживанию и хранению, но может не подходить для других. В отношении интеллектуальной собственности Казанский федеральный университет сможет запатентовать и лицензировать новые биомаркеры, выявленные в течение данного исследования, 1 или более наборов биомаркеров с максимальной прогностической мощностью для биологического возраста, будущего долголетия и риска множества ассоциированных с возрастом заболеваний, таких как сердечно-сосудистые заболевания (включая инфаркт миокарда и инсульты), нейродегенеративные заболевания (например, болезнь Альцгеймера, Паркинсона и боковой амиотрофический склероз) и различные раковые заболевания с поздним проявлением (миелома, меланома, рак предстательной железы и т.д.). Кроме того, он сможет передавать право эксплуатации или лицензию на концепцию «Медицинского оздоровительного центра», где участники проходят тщательную исходную оценку состояния здоровья и биомаркеров, получают рекомендации по образу жизни и фармакологическим изменениям, регулярно проходят последующие осмотры для оценки приверженности и продвижения к целям, касающимся здоровья. Наконец, в качестве центра для подготовки специалистов в области здравоохранения и исследователей молекулярной биологии старения и долголетия и за выявление и функциональное исследование биомаркеров Казанский федеральный университет получит элитный статус лидера в данной сфере.

Ведущий ученый _________________________ подпись

Robert Joseph Shmookler Reis__________ фамилия, имя, отчество (при наличии) ведущего ученого

От имени Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования “Казанский (Приволжский) федеральный университет”

_________________________________________ Ректор

Гафуров Ильшат Рафкатович______________ фамилия, имя, отчество уполномоченного лица

Разработка и валидизация маркеров старения