Page 1

Технологии секвенирования нового поколения

в диагностике и прогнозировании лечения рака

П

ОСЛЕ завершения секвенирования генома человека исследователи и клиницисты ощутили потребность в прочтении все большего количества индивидуальных геномов, чтобы найти ответы на фундаментальные и клинически значимые вопросы. Геномная информация, как ожидалось, даст ключ к пониманию природы болезней и позволит создать специфические диагностические и терапевтические стратегии, в частности, для лечения рака. Тем самым будет реализована идея таргетной и персонализированной медицины. Растущие потребности дали толчок технологическому развитию, и помимо традиционного метода секвенирования по Сенгеру стали появляться новые высокопроизводительные геномные технологии. В 2005 году возникли первые платформы для параллельного ДНК-секвенирования, открыв эру секвенирования нового поколения (next-generation sequencing, NGS). Эти технологии радикально увеличили скорость получения данных о нуклеотидной последовательности – до сотен гигабаз за один запуск прибора, в то время как стоимость секвенирования снизилась на несколько порядков.

– полупроводниковое секвенирование (Ion Torrent),

а также недавно появившиеся технологии: – секвенирования одной молекулы (Helicos Genetic Analysis System),

– наносеквенирование (DNAnanoboll) (Complete Genomic).

Они высокотехнологичны, то есть позволяют определять последовательность нуклеотидов быстрее и дешевле. В настоящее время на рынке лидирует компания Illumina, которая за два-три года собирается довести стоимость секвенирования

Что такое NGS

К технологиям секвенирования нового поколения относятся: – секвенирование путем синтеза с обратимой терминацией (Illumina),

– пиросеквенирование (Roche),

– секвенирование путем лигирования (SOLiD),

HiSeq2000, Illumina

одного генома с 30х покрытием (кратность прочтения) до суммы меньше $1000. Помимо полногеномного секвенирования, которое для многих клинических лабораторий остается слишком затратным, развивается таргетное секвенирование – ограниченное интересующими исследователей участками генома, которые можно прочитать с более высоким покрытием. Наиболее часто используются методы, основанные на обогащении образцов последовательностями исследуемых генов путем ПЦР (PCR-based enrichment methods). Другой вариант – методы обогащения, основанные на гибридизации (hybridization-based enrichment methods) с олигонуклеотидными ДНК-чипами либо в растворе на магнитных частицах-носителях. Преимущество методов гибридизации заключается в возможности охвата большого участка генома.

Сложный геномный ландшафт опухоли

Обстоятельство, осложняющее диагностику и лечение, состоит


в том, что злокачественная опухоль генетически неоднородна. Традиционно опухоль рассматривали как массу трансформированных клеток, которые несут сходные генетические отличия, и, хотя меняются по мере прогрессии заболевания и в ответ на лечение, но меняются в одном направлении. Использование методов NGS показало, что все гораздо сложнее – опухоль представляет собой совокупность клеточных популяций с различными профилями генетических нарушений. Гетерогенность можно считать отличительной чертой злокачественных новообразований, и именно она может стать причиной неточного диагноза и терапевтической устойчивости опухоли. Команда Чарльза Свантона (Charles Swanton) из Института исследований рака Университета Лондона (Cancer Research UK London Research Institute) провела полногеномное исследование клеток из биопсий первичных опухолей и их метастазов, полученных от четырех пациентов с почечно-клеточной карциномой. Убедившись в геномном разнообразии раковых клеток, ученые нашли подтверждение модели «ветвящейся эволюции» (branched evolution) клеточных популяций. В соответствии с этой моделью, опухоль инициирована клетками, несущими первичную мутацию, которые через какое-то время дают начало целому букету клональных клеточных популяций. Эти популяции несут первичную мутацию, но, поскольку в клетках ломается система защиты ДНК, в них быстро накапливают и другие мутации. «Опухолевые клетки гетерогенны на всех уровнях, – говорит Свантон. – От числа копий ДНК и мутаций до изменения уровней экспрессии генов и функциональных нарушений. Гетерогенность раковых клеток, по-видимому, перевешивает их общность». Его группа обнаружила, что анализ биомаркеров даже в

Чарльз Свантон

двух образцах одной и той же опухоли может дать противоречивые прогностические результаты. Это ставит под сомнение то, насколько точно геномный анализ материала, полученного при биопсии из одного или даже нескольких мест опухоли, позволит правильно определить стратегию лечения. Еще больше осложняет ситуацию свойство раковых клеток изменяться в ответ на терапию – так, метастазы, появившиеся после химиотерапии, могут быть генетически не очень похожи на первичную опухоль, из которой они возникли. Но, даже выявив это разнообразие, очень трудно отличить мутации-драйверы, определяющие развитие опухолевого процесса от «случайных пассажиров», по выражению Свантона. Он же говорит о том, что при всей гетерогенности в раковых клетках наблюдаются и признаки конвергентной эволюции, когда ветви с разными мутациями могут приобретать одни и тем же нарушения, например, инактивацию гена PTEN (ген фосфатазы, считающейся опухолевым супрессором). Свантон считает, что это свидетельствует о

Модель «ветвящейся эволюции»

сильном отборе, способствующем возникновению таких мутаций. Более полную информацию о гетерогенности опухоли дают технологии секвенирования единичных клеток, которые позволяют выявлять и разнообразие их геномных нарушений, и изменения транскриптомов. Однако для использования в клинической практике эти технологии пока слишком дороги, и, что еще более важно – результаты этих исследований трудно интерпретировать. Как бы то ни было, методы NGS оказались очень полезны для исследования клональной структуры и генетической эволюции опухоли. А поскольку гетерогенность значительно осложняет поиск биомаркеров и прогнозирование чувствительности опухоли к терапии, внедрение этих знаний в клиническую практику связано с большими ожиданиями по повышению точности постановки диагноза, подбора таргетной и персонализированной терапии.

Мутации, ассоциированные с раком

За последние годы в ходе исследований полногеномных ассоциаций (GWAS) выявлены сотни генетических вариаций, ассоциированных с болезнями. В большинстве случаев это однонуклеотидный полиморфизм (SNP), выражающийся в замене одного нуклеотида на другой. Но GWAS имеют дело только с обычными вариациями (частота встречаемости которых в популяции > 5%). На сегодня более 7000 сильных SNPассоциаций (p < 1.0 х 105) включено в каталог Catalog of Published GenomeWide Association Studies, собранный в Национальном институте исследований генома человека (National Human Genome Research Institute). Однако большинство этих SNP оказывает незначительный эффект и очень редко они являются причиной


патологии. Гипотеза, связывающая обычные вариации с обычными болезнями, оказалась несостоятельной. Методы NGS дали возможность изучить редкие вариации (с частотой встречаемости <5%), связанные с предрасположенностью к болезням, в том числе, к раку. Для поиска редких вариаций необходимо полногеномное секвенирование относительно большой выборки людей. Этой цели должны послужить результаты проекта «1000 геномов», в котором будет составлен каталог генетических вариантов с частотой < 1% в популяции. Более амбициозный проект UK10K ставит своей целью секвенировать 10 тысяч геномов из двух хорошо фенотипически описанных популяций в Великобритании, чтобы описать редкие вариации, ассоциированные с несколькими болезнями. NGS технологии уже помогли выявить некоторые мутации, которые способствуют опухолевой трансформации (см. таблицу ниже). (Jiekun Xuan, Ying Yu a, Tao Qing a at all, 2013) Гены, входящие в диагностические панели, выявляемые методами NGS, представляют собой потенциальные мишени для таргетных препаратов или потенциальные маркеры устойчивости к ним. Большая часть этих лекарств создана для лечения часто диагностируемых раков, таких как

Гистограмма, показывающая диапазон мутации для гена CDKN2A (из базы COSMIC) рак молочной железы или прямой кишки. Для менее изученных форм опухолей методы NGS могут выявить неизвестные ранее ключевые мутации, что может стать основой для разработки новых биомаркеров. Хотя сегодня существуют база данных генетических вариантов, например Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC), собранный Институтом Сенгера (Wellcome Trust Sanger Institute), коллекция “золотого стан-

дарта” прогностических индикаторов пока не создана, и лишь небольшая часть биомаркеров испытана и клинически проверена (менее 100 из нескольких тысяч). Большую проблему представляет интерпретация данных секвенирования. Некоторые компании специализируются на биоинформатических и системно-биологических подходах к этой проблеме, в том числе, разрабатывают компьютерные модели, воспроизводящие

Гены

Тип аберрации

Тип опухоли

Мишень

Эффект

Метод секвенирования

Тип образца

EBF1-PDGFRB, BCRJAK2, NUP214-ABL1 IL7R, SH2B3

слияние

любая

киназный сигнальный путь

активация

полногеномное

мутация

любая

активация

полногеномное

TP53

мутация

клет. карцинома

цитокиновый сигнальный путь регуляция клет.цикла

инактивация

полногеномное

VTI1A-TCF7L2

слияние

прямая кишка

транскрипц. факторы

активация

полногеномное

ARID1A, ARID1B, ARID2, MLL, MLL3 PREX2 ATRX BRIP1 DNMT3A

мутация

печень

регуляция хроматина

инактивация

полногеномное

острая лимфобластическая лейкемия острая лимфобластическая лейкемия перифер. кровь колоректальные аденокарциномы гепатоклеточные карциномы

мутация мутация мутация мутация

меланома нейробластома яичники AML

Rac exchange factor надстройка теломер репарация ДНК метилирование ДНК

инактивация инактивация инактивация инактивация

полногеномное полногеномное полногеномное экзом

CBFB MAGI3-AKT3 N0TCH1 SF3B1

мутация слияние мутация мутация

молочная железа молочная железа клет. карцинома CML

транскрипц. факторы клет. сигнальный путь клет. сигнальный путь сплайсинг мРНК

инактивация активация инактивация инактивация

экзом экзом экзом экзом

MXRA5

мутация

легкое

ремоделирование матрикса

активация

экзом

CSMD3

мутация

легкое

неизвестно

инактивация

экзом

RAC1 GRIN2A SPOP, FOXA1, MED 12 FAT4 ARID1A

мутация мутация мутация мутация мутация

меланома меланома простата желудок желудок

клет. сигнальный путь глутаматные рецепторы регуляция транскрипции клеточная адгезия ремоделирование хроматина

активация неизвестно неизвестно инактивация инактивация

экзом экзом экзом экзом экзом

меланомы нейробластомы перифер. кровь острые моноцитические лейкемии опухоли молочной железы опухоли молочной железы клет. карциномы головы и шеи хронич. лимфоцитические лейкемии немелкоклеточные карциномы легкого немелкоклеточные карциномы легкого меланомы меланомы опухоли простаты аденокарциномы желудка аденокарциномы желудка


сигнальные и транскрипционные пути в организме человека.

Анализ РНК

Методы секвенирования нового поколения позволяют исследовать не только ДНК, но и РНК злокачественных опухолей. Совокупность РНК, которые в настоящий момент синтезируются с ДНК, – транскриптом, представляет собой моментальный снимок спектров экспрессии генов и регуляторных элементов в клетке, ткани или организме при определенном физиологическом состоянии. Транскриптом включает матричные РНК (mRNA), а также микроРНК (miRNA) и другие некодирующие РНК. Разнообразие транскриптов (РНК, синтезируемых с одного гена) увеличивается за счет альтернативного сплайсинга, слияния генов, и редактирования РНК. Образование слитных генов считается одним из общих свойств злокачественной трансформации. Наиболее часто такие перестройки выявляются при гематологических новообразованиях и саркомах костей и мягких тканей, реже в эпителиальных карциномах. Обнаружить слияния генов в обычной солидной опухоли цитогенетическими методами сложно. Анализ РНК методами RNA-Seq значительно облегчает задачу поиска новых слитных генов в различных опухолях, в том числе при раке простаты, раке молочной железы, лимфоме, саркоме, меланоме. Специалисты считают, что появление слитных генов связано с механизмами канцерогенеза в некоторых органах и тканях, и на основе этого можно разработать специфические маркеры. Например, в В-клеточных лимфомах было обнаружено несколько вариантов слитных генов с участием трансактиватора MHC II классаCIITA. Можно предположить, что перестройка CIITA – это новый онкогенный механизм в лимфоидных опухолях. Определен также новый подтип кост-

ной саркомы, вызванной слиянием генов BCOR-CCNB3. Другие варианты слияния генов представлены в различных типах рака. Например, слияние, включающее гены RAF сигнального пути, выявлено при раке простаты, раке желудка и меланоме, что указывает на терапевтическую мишень для всех трех типов рака. Некодирующие РНК участвуют в различных биологических процессах, включая пролиферацию, дифференцировку и апоптоз. Показано, что нарушения их экспрессии сопровождают патогенез многих болезней человека, в том числе рака. К ним относятся длинные некодирующие РНК (lncRNA), состоящие более чем из 200 нуклеотидов, которые задействованы в эпигенетических модификациях, регуляции транскрипции и пост-транскрипционном процессинге мРНК. Участие в возникновении рака доказано для десятков lncRNA, но их функциональный каталог еще далек от завершения. Последнее исследование выявило участие новой lncRNA – PCAT-1 в развитии рака простаты. Другой вид некодирующих

РНК – микроРНК (miRNA), состоящие из ~22 нуклеотидов. Это важнейший регуляторный элемент экспрессии генов, свое влияние они оказывают, соединяясь с комплементарными последовательностями в таргетных областях. МикроРНК могут работать как онкогены или супрессоры опухоли, нарушение их экспрессии было описано при многих формах злокачественных новообразований. Специалисты считают, что профиль микроРНК, который выявляется методами NGS, может быть индикатором типа опухоли и степени злокачественности опухолевого процесса. Выявление микроРНК в биологических жидкостях открывает возможность для разработки методов неинвазивной диагностики и прогноза терапии злокачественных опухолей. Наконец, эпигенетические модификации ДНК (химические изменения, не затрагивающие последовательности нуклеотидов) вовлечены во многие процессы, происходящие в опухолях. Исследователи считают, что мониторинг статуса метилирования ДНК, проведенный NGS

Панель SuraSeq компании Asuragen (Austin, Texas) – таргетное секвенирование от 5 до 52 опухоль-ассоциированных генов.


Майкл Пеллини

Джилл Хэйгенкорд

методами, будет информативен для диагностики, прогноза опухолевого процесса и ответа на терапию.

Что уже делается

Сегодня существует несколько пилотных проектов, развивающих применение методов секвенирования нового поколения в клинике. Так, ученые из Translational Genomics Research Institute (Phoenix, Arizona), в партнерстве с US Oncology Research (Woodlands, Texas) и Life Technologies (Carlsbad, California) используют полногеномное секвенирование, чтобы создать направленную стратегию лечения для 14 пациенток с тройным негативным раком молочной железы. В Мичиганском университете (University of Michigan, Ann Arbor) исследователи, работающие по программе ‘MI-ONCOSEQ’ (Michigan Oncology Sequencing Project), объединили результаты геномного и транскриптомного секвенирования опухолей у пациентов с поздними стадиями рака и нашли мутации, которые помогут разработать для них оптимальное медикаментозное лечение. Команда Foundation Medicine (Cambridge, Massachusetts) проверила свою панель из 182 генетических локусов, ассоциированных с раком, на приблизительно 400 пациентах и представила первичные данные на симпозиуме American Society for Clinical Oncology (ASCO). «Более 70% исследованных нами случаев связаны с клинически корректируемыми нарушениями», – сказал Майкл Пеллини (Michael Pellini), руководитель исследования. Команда специалистов в Genomics and Pathology Services (University of Washington, St. Louis) выполнила таргетное секвенирование 27 отобранных генов у сотен раковых пациентов. «Мы очень осторожны, потому что должны быть абсолютно уверены, что имеем доказательную систему, которую можно использовать в клинике», – говорит руководитель исследования. Компания Asuragen (Austin, Texas) недавно выпустила на рынок панель SuraSeq – три продукта, которые

делают возможным таргетное секвенирование от 5 до 52 опухоль-ассоциированных генов. По словам Гэри Лэтмана (Gary Latham), директора по диагностическим исследованиям и развитию технологий, этот решение основано на клинических реалиях – ограниченном количестве исходного материала: «Обычно бывает, что если

Ханс Лерах вы просите 50 нанограммов ДНК, то получаете 10, а если просите 10, то получаете 2». Компания Ion Torrent пришла к такому же решению, развивая AmpliSeq – панель для секвенирования мутаций в 46 различных опухоль-ассоциированных генах всего из 10 нанограммов ДНК. Другие компании делают ставку на полногеномное секвенирование, например, Complete Genomics (Mountain View, California). Джилл Хэйгенкорд (Jill Hagenkord), медицинский директор компании, замечает, что полногеномное секвенирование открывает возможность идентифицировать типы структурных перестроек, которые в изобилии встречаются в геномах опухолевых клеток, с разрешением, невозможным при традиционных методах исследования кариотипа. Он считает, что полногеномное секвенирование гораздо информативнее, чем таргетное. Многие специалисты обратились к анализу транскриптома. Например, компания Genomic Health (Redwood City, California) продвигает на рынок продукты линии Oncotype DX, использующие ПЦР с обратной транс-

крипцией (RT-PCR), чтобы проследить изменение профиля экспрессии ключевых генов, связанных с прогрессией и рецидивами рака молочной железы и прямой кишки. Специалисты, работающие по программе MI-ONCOSEQ, сделали трансриптомику ключевым компонентом своих исследований. «В биологии опухоли анализ транскриптома очень информативен», – говорит директор программы Ханс Лерах (Hans Lehrach). Он подчеркивает, что основная задача опухоли – устранить ограничение роста, и добиться этого она может любым способом – делецией участка хромосомы, приобретением точечной мутации в экзоне или аномальным метилированием промотора. Грандиозный проект в настоящее время планируется в Норвегии, его организатор Norwegian Cancer Genomics Consortium, участвуют в нем исследовательские группы в клиниках, биотехнологические и фармакологические компании. Цель проекта – секвенирование опухолевых и

Ола Майклбост нормальных тканей каждого онкологического пациента в стране. Это первая национальная инициатива такого рода, она получила поддержку норвежского правительства. «Мы начали с того, что планируем секвенировать экзомы образцов опухолей и крови двух тысяч пациентов, охватив при этом восемь типов рака», – сказал Ола Майклбост (Ola Myklebost), лидер проекта (Oslo University Hospital).

Еще более амбициозен IT-Future of Medicine (ITFOM) – обширный международный проект, входящий в программу Европейского Союза Future and Emerging Technologies (FET). Он ставит целью объединение разных источников данных – геномики, метагеномики, эпигеномики, транскриптомики, протеомики и метаболомики, для создания общих предсказательных моделей, пригодных для всех онкологических пациентов в Европе. Материал предоставлен компанией «Персональная биомедицина»

Внедрение в клиническую практику методов полногеномного секвенирования геномов раковых клеток