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Cuantificación del contenido de azúcares reductores XIII Congreso de Fitomejoramiento: Contribuyendo al sostenimiento de la vida a través del fitomejoramiento 6 - 8 de noviembre, Corpoica, Tibaitatá – Mosquera, Cundinamarca

Cuantificación del contenido de azúcares reductores y no reductores y su asociación genética con marcadores SNPs en Solanum tuberosum grupo Phureja (Resultados preliminares)

Diana Duarte-Delgado, Luz Patricia Restrepo, Ajjamada Kushalappa y Teresa Mosquera


Introducci贸n Incremento en la demanda de alimentos procesados (FAO, 2009)

Cambios en los h谩bitos de consumo a nivel mundial (FAO, 2009)

Oportunidad: Papa criolla (Solanum tuberosum grupo Phureja)

Incrementar valor agregado

Contribuir a la seguridad alimentaria en comunidades vulnerables


Cultivar de papa criolla para procesamiento en hojuela: necesita desarrollo

Problema: contenido de azĂşcares reductores

Werij et al., 2012 Contenido de azĂşcares reductores


Reacci贸n de Maillard

+

Reductores

+

amino acid

No reductores


Degradaci贸n del almid贸n en c茅lulas de almacenamiento

Nader, 2011


Cultivar de papa criolla para procesamiento en hojuela: necesita desarrollo

Problema: contenido de azĂşcares reductores

Werij et al., 2012 Contenido de azĂşcares reductores

Calidad de procesamiento en hojuela: rasgo complejo


Basic science Genome structure and evolution

Genomic sequencing

Comparative maps

Application

The molecular basis of complex traits

*omics

Precision breeding

Association studies

Diagnostic markers for population-based MAS

Biodiversity, haplotypes

Engineering agronomic traits

Candidate genes Function maps for pathogen resistance and tuber traits Molecular maps

R-gene cloning Markers for introgression breeding Ch. Gebhardt MPIZ


Mapeo por asociaci贸n Phenotypic trait

Balding, 2006


Cuello de botella‌


Pregunta de investigación ¿Cuáles regiones del genoma de papa se asocian al contenido de azúcares reductores y no reductores en una población natural de Solanum tuberosum grupo Phureja, al emplear marcadores SNPs distribuidos ampliamente por el genoma y en regiones de genes candidatos?


Objetivo General Explorar la variación alélica de Solanum tuberosum grupo Phureja y su asociación genética con contenidos de azúcares reductores y no reductores


Objetivos específicos 1.Ajustar la metodología para la cuantificación de azúcares reductores y no reductores en grupo Phureja a través de la técnica de HPLC. 2.Caracterizar fenotípicamente la Colección Central Colombiana (CCC) de grupo Phureja y otros genotipos por su contenido de azúcares. 3.Asociar genéticamente los contenidos de azúcares reductores y no reductores con marcadores SNPs distribuidos ampliamente por el genoma y en regiones de genes candidatos.


Materiales y métodos Ajustes para el análisis del contenido de azúcares • Agua • Doble tratamiento con MeOH • MeOH con carbón activado • MeOH con reflujo

Métodos de extracción de azúcares

Equipo: UHPLC Ultimate 3000 Dionex   Detector: Índice de refracción Shodex   Columna: Aminex HPX 87H 300 mm x 7.8 mm Fase movil: Ácido sulfúrico 10 mM

4 Cultivares comerciales

Aproximación GWAS: Metodología GBS

Mapeo por Asociación 10 genes candidatos: Diseño y amplificación de primers Identificación de SNPs

Condiciones cromatográficas

Caracterización fenotípica del contenido de azúcares : Latice rectangular triple

8 accessiones IPK German Germplasm Bank 110 accessiones Colección Central Colombiana (CCC)


Materiales y métodos Ajustes para el análisis del contenido de azúcares • Agua • Doble tratamiento con MeOH • MeOH con carbón activado • MeOH con reflujo

Métodos de extracción de azúcares

Equipo: UHPLC Ultimate 3000 Dionex   Detector: Índice de refracción Shodex   Columna: Aminex HPX 87H 300 mm x 7.8 mm Fase móvil: Ácido sulfúrico 10 mM

4 Cultivares comerciales

Aproximación GWAS: Metodología GBS

Mapeo por Asociación 10 genes candidatos: Diseño y amplificación de Primers Identificación de SNPs

Condiciones cromatográficas

Caracterización fenotípica del contenido de azúcares : Latice rectangular triple

8 accessiones IPK German Germplasm Bank 110 accessiones Colección Central Colombiana (CCC)


Resultados Objetivo específico 1 Ajustar la metodología para la cuantificación de azúcares reductores y no reductores en grupo Phureja a través de la técnica de HPLC. •  Condiciones cromatográficas: Condiciones cromatográficas   Temperatura de la columna  

18°C  

Temperatura del detector  

35°C  

Fase móvil  

Ácido sulfúrico 10mM  

Fase de almacenamiento  

Ácido sulfúrico 5mM  

Fase de limpieza  

Acetonitrilo 2,5% en ácido sulfúrico 5mM  

Flujo  

0,3ml/min  

Volumen de inyección  

20 µl  

Tiempo por muestra  

35 min  


•  Selección de la metodología para extracción de azúcares: Análisis de un DCA y pruebas de Tukey

Método  

Concentración promedio sacarosa (ppm)  

Agua (Cunningham et al., 1988)  

2566,22 a  

Doble tratamiento con MeOH (Karkacier et al., 2003)   4925,64 c   MeOH con carbón activado (Marangoni et al., 1997)   3479,68 ab   MeOH con reflujo (Arevalo & Sastoque, 1999)  

4322,76 b  


•  Validación del método de cuantificación

Límite de Límite de % de Recuperación detección (ppm) cuantificación (ppm) Glucosa 4 5 111.47 Fructosa 2 3 103.10 Sacarosa 2 2 96.13

    Glucosa Fructosa Sacarosa

Reproducibilidad   Repetibilidad   Linealidad   Promedio (ppm)  CV (%)  Promedio (ppm)   CV (%)   Promedio R²   SD   40.08   40.42   40.41  

1.21   0.83   0.72  

52.06   41.33   40.49  

4.61   3.67   4.44  

0.9998   0.9997   0.9997  

0.00015   0.00021   0.00016  


Cromatogramas de patrones y de tubĂŠrculo crudo

a.

b.

a. Cromatograma de patrones en mezcla b. Cromatograma de Col 102


Cromatogramas para azĂşcares en tubĂŠrculo crudo a.

b.

Cromatogramas de genotipos contrastantes a. Col 52 b. IPK-170031


Objetivo específico 3 Asociar genéticamente los contenidos de azúcares reductores y no reductores con marcadores SNPs distribuidos ampliamente por el genoma y en regiones de genes candidatos. Genes candidatos seleccionados para diseño de primers Gen Candidato InvGE Pain-1 Stp23 StpL AGPaseS-a SssI GWD UGPase Sps G6pdh

Función Apoplastic invertase Vacuolar acid invertase Plastidic starch phosphorylase Plastidic starch phosphorylase ADP-glucose pyrophosphorylase Soluble starch synthase Glucan-water dikinase UDP-glucose pyrophosphorylase Sucrose phosphate synthase Glucose-6-phosphate dehydrogenase

Cromosoma IX III III V I III V XI VII II


Degradaci贸n del almid贸n en c茅lulas de almacenamiento

Nader, 2011


Conclusiones y perspectivas •  Se ha ajustado una metodología cromatográfica precisa, reproducible y repetible para la cuantificación de azúcares en tubérculos de grupo Phureja. •  Los resultados obtenidos revelan variabilidad en el contenido de azúcares de genotipos de grupo Phureja. •  Una vez se cuenten con los datos fenotípicos completos, el análisis de asociación será llevado a cabo a partir de SNPs con el propósito de identificar regiones genómicas con influencia en la calidad de fritura, en este importante grupo de papas cultivadas para Colombia.


Seguridad Alimentaria y Nutrición El  mejoramiento  de  la  producción  de  papa  como  contribución  a  la  seguridad     alimentaria  en  comunidades  nativas  en  Colombia  

Agradecimientos

Contrato de acceso al recurso genético RGE0069

Grupo: Genética de rasgos de interés agronómico Proyecto desarrollado con el apoyo financiero del International Development Research Centre (IDRC), www.idrc.ca, y el Gobierno de Canadá, a través del Department of Foreign Affairs, Trade and Development Canada (DFATD), Canada, www.international.gc.ca


隆Gracias por su atenci贸n!


2013 11 cong nal fitomejoramiento azucares reductores en papa diana duarte