Issuu on Google+

13

:: Efecto inhibitorio del pH ácido y del alcalino en la supervivencia de los probióticos Fernando Medina1,2, Álvaro M. Flórez 1, Yadira Pinto1

RESUMEN Objetivo: determinar la viabilidad de los microorganismos que contienen cuatro bioterapeúticos: enterogermina, Saccharomyces boulardii, LBF (Lactobacillus acidophilus Rosell-52, Bifidobacterium bifidum Rosell-7, Bifidobacterium infantis) y VSL # 3 (Streptococcus salivarius subs. Thermophilus, Bifidobacteria (breve, infantis, longum), Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii subes. bulgaricus, Streptoccus faecium y fermentos lácticos liofilizados), a pruebas de tolerancia a pH ácido y alcalino. Métodos: se preparó jugo gástrico artificial con pepsina al 0,32% a pH de 2,18, utilizando cinco tiempos de incubación (0, 30, 60, 90 y 120 minutos) y un pH alcalino con sales biliares en concentraciones de 0,25%, 0,5%, 0,75% y 1%. La viabilidad se determinó por el número de unidades formadoras de colonia por mililitro (UFC/ml) sobre platos de agar para cada probiótico. Resultados: en medio ácido, los cuatro probióticos no presentaron variaciones significativas en el recuento de colonias (p≥0,089). Sin embargo, a pH alcalino se encontró que LBF y S. boulardii disminuyeron sus conteos a partir de 0,50% hasta el 1% de bilis (p≤0,048). Para la enterogermina hubo un aumento en sus conteos y para VSL#3, aunque las variaciones indicaron una disminución en sus conteos, no fueron significativos (p≥0,056). Conclusiones: los probióticos empleados en este estudio sugieren que son capaces de tolerar un pH ácido; aunque la disminución en los conteos observados en S. boulardii, LBF y VSL#3 sugieren un efecto más bacteriostático que bactericida de la bilis, los microorganismos son capaces de soportar condiciones de pH alcalino manteniendo conteos altos. Para la enterogermina, indican que la cepa es capaz de mantener de manera estable la tolerancia a condiciones de pH ácido y alcalino. Aunque estas diferencias observadas en pruebas in vitro dependen de las cepas que constituyen cada bioterapéutico, se puede concluir que los empleados en este estudio pueden tolerar el pH gástrico y biliar. Palabras clave: probióticos, tolerancia pH ácido, tolerancia pH alcalino, viabilidad.

1 Laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología, Facultad de Ciencias, Universidad de Santander, UDES, Bucaramanga, Colombia. 2 Profesor adjunto de Gastroenterología Pediátrica, Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga, Colombia. Correspondencia Laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología, Campus Universitario, Lagos del Cacique, Bloque 3-201, Universidad de Santander, UDES, Bucaramanga, Colombia Teléfono: (577) 651-6500, extensión 253 amflorez@udes.edu.co fernandomedina@hotmail.com :: Pediatría - VOL 42 No.4 - Octubre 2009 ::


14 :: Efecto inhibitorio del pH ácido y del alcalino en la supervivencia de los probióticos ::

ABSTRACT Objective: To determine the viability of microorganisms that contains four probiotics: enterogermin, Saccharomyces boulardii, LBF and VSL#3, to evidence of tolerance to acid and alkaline pH. Methods: Gastric juice prepared with artificial pepsin to 0.32% to pH 2.18 using 5 incubation times (0, 30, 60, 90 and 120 minutes) and an alkaline pH with bile salts at concentrations of 0.25, 0.5, 0.75 and 1%. The viability was determined by the number of colony-stimulating factor units per milliliter (CSF/ml) on agar plates for each probiotic. Results: In the acid media, the four probiotics did not show significant variations in the colony counts (p≥0,089). However, in alkaline pH it was found that S. boulardii and LBF decreased their counts in 0.50% to 1% of bile salt (p≤0,048). Enterogermin shows an increase in their counts and VSL#3, although the changes indicate a decrease in their counts, they were not significant (p≥0,056). Conclusions: The probiotics used in this study suggest that they are able to tolerate a low pH. The decrease in the counts observed in S. boulardii, LBF and VSL#3, suggest a more bacteriostatic that bactericidal effect of bile. The microorganisms are capable of withstanding conditions at alkaline pH maintaining high counts. Enterogermin indicates a stable tolerance to conditions of acid and alkaline pH. Although these differences observed in vitro tests depends on the strains within each probiotic, we conclude that probiotics used in this study can tolerate gastric pH and bile. Keywords: probiotics, pH tolerance, diarrhea, biotherapeutics

INTRODUCCIÓN En la última década se han documentado ampliamente los efectos clínicos y el uso racional de los bioterapeúticos y probióticos sobre la flora bacteriana intestinal para el tratamiento de la diarrea aguda 1,2 intrahospitalaria y la relacionada con los antibióticos 3-5. Aunque en la mayoría de los estudios se demuestra la efectividad de los probióticos y agentes bioterapéuticos en los procesos inflamatorios intestinales, como colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, síndrome de intestino irritable 6,7 y en el tratamiento de Helicobacter pylori 8,9, todavía existen precauciones para su uso 10. Estos mismos también se han utilizado en la reducción de las manifestaciones alérgicas para estimular el sistema inmune 11,12, para reducir la gravedad :: Pediatría - VOL 42 No.4 - Octubre 2009 ::

de las enfermedades en prematuros, como la encefalopatía hepática, para disminuir la sintomatología de la artritis reumatoide y para la prevención en el desarrollo del cáncer, la reducción de la vaginosis bacteriana y el mejoramiento de la calidad de vida en pacientes con VIH/sida 13-15. Aproximadamente, 70% de todo el sistema inmune se localiza en el sistema digestivo. La saliva, las secreciones gástricas y la flora bacteriana son importantes para su óptimo funcionamiento. En total, se producen diariamente cerca de 2,5 litros de saliva, 2,5 litros de secreción gástrica, 0,5 litros de bilis y entre 1 y 5 litros de secreción del intestino delgado y colon. Estas secreciones tienen factores necesarios para el sistema inmune y el control de las infecciones,


:: Efecto inhibitorio del pH ácido y del alcalino en la supervivencia de los probióticos :: 15

como inmunoglobulinas, lactoferrinas, lisozimas y fibronectinas 16. Estas moléculas, junto con otros mecanismos inmunológicos, preservan la tolerancia inmunológica necesaria para que los microorganismos presentes en el tubo digestivo no comprometan la salud del individuo 17. Los microorganismos que allí habitan son los más abundantes y llegan a pesar hasta 2 kg; la mayor concentración se encuentra en el intestino delgado, especialmente el íleon, y el colon 18,19. Algunos microorganismos pertenecientes a los géneros Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus y Streptococcus, entre otros, hacen parte del tubo digestivo y se han venido empleando como constituyentes de medicamentos probióticos, como la enterogermina, VSL #3 (Streptococcus salivarius subs. Thermophilus, Bifidobacteria (breve, infantis, longum), Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii subes. bulgaricus, Streptoccus faecium y fermentos lácticos liofilizados) y LBF (Lactobacillus acidophilus Rosell-52, Bifidobacterium bifidum Rosell-7, Bifidobacterium infantis) 20,21. A diferencia de éstos, se han descubierto otros que exhiben propiedades similares a los probióticos, pero que provienen de plantas como la levadura Saccharomyces boulardii 22. Tanto los bioterapeúticos como Saccharomyces boulardii como los probióticos deben llegar al intestino, en donde inducen la producción de IgA secretora, ayudan a inhibir la producción de IgE, modulan la respuesta de la citocinas estimulando los macrófagos y producen nutrientes y antioxidantes 23,24. Para desempeñar esta función, los probióticos deben colo-

nizar el intestino delgado y el colon, habiendo sobrevivido previamente a las condiciones de pH ácido que se encuentra en el estómago y al pH alcalino producido por las sales biliares en el duodeno. Por su pH, el jugo gástrico y las sales biliares se consideran bactericidas. Por lo tanto, lograr obtener cepas capaces de soportar pH iguales a los del tubo digestivo, es una característica indispensable para todos los bioterapéuticos y probióticos. 25 Aunque hay una gran diferencia entre géneros y especies de las cepas que conforman los bioterapeúticos y los probióticos, éstos exhiben propiedades intrínsecas de tolerancia al pH.26 Sin embargo, en algunos probióticos se ha encontrado una gran sensibilidad a un pH menor de 3,0, con una mortalidad aproximada entre 10² y 104 UFC/g.27,28 Actualmente, existen diversas presentaciones comerciales de las cuales se desconoce el comportamiento de sus constituyentes microbianos al exponerse a un ambiente ácido o alcalino. El objetivo de este estudio consistió en determinar la viabilidad de diferentes microorganismos como constituyentes de bioterapeúticos y probióticos, cuando son sometidos a pH ácido y a sales biliares con pH alcalino. MATERIALES Y MÉTODOS Probióticos y sus componentes Se utilizaron los cuatro medicamentos más usados en la industria farmacéutica colombiana (tabla 1). Estos medicamentos se adquirieron en diferentes depósitos farmacéuticos de la ciudad, se registró el número del lote de producción y se constató que su fecha de caducidad estuviera vigente. :: Pediatría - VOL 42 No.4 - Octubre 2009 ::


16 :: Efecto inhibitorio del pH ácido y del alcalino en la supervivencia de los probióticos ::

Probiótico VSL3#

Composición Streptococcus salivarius

subs . Thermophilus, Bifidobacteria

(breve, infantis, longum), Lactobacillus acidophilus

,

Lactobacillus plantarum , Lactobacillus casei , Lactobacillus delbrueckii subes . bulgaricus , Streptoccus faecium y SB Enterogermina LBF

fermentos lácticos liofilizados Saccharomyces bourlardii Bacillus clausii Lactobacillus acidophilus Rosell-52, Bifidobacterium bifidum Rosell-7, Bifidobacterium infantis

Tabla 1. Composición microbiológica de los probióticos

Recuento de colonias Para realizar el recuento de colonias, se tomaron 0,04 g de VSL#3 y 0,03 g de LBF en condiciones de esterilidad y se resuspendieron en 1 ml de caldo MRS® (Scharlau) que contiene en 1 litro: 10 g de peptona de caseína, 8 g de extracto de carne, 4 g de extracto de levadura, 20 g de D(+)-glucosa, 2 g de fosfato dipotasio de hidrógeno, 1 ml de Tween® 80, 2 g de citrato hidrógeno diamonio, 5 g de acetato de amonio, 0,2 g de sulfato de magnesio, 0,04 g de sulfato de manganeso y 14 g de agar. En el caso de S. boulardii, se pesaron 0,03 g y se resuspendieron en 1 ml de caldo YEPD, que contiene en 1 litro, 20 g de peptona, 20 g de dextrosa y 10 g de extracto de levadura. En el de la enterogermina, se tomaron 40 μl directamente de la ampolla. Los productos se resuspendieron y se hicieron diluciones en base diez y se hicieron las diluciones, así: 10-5, 10-6 y 10-7 en medio Sabouroud Agar® (Scharlau), para S. boulardii; 10-4, 10-5, 10-6 y 10-7 en medio Rogosa Agar® (Scharlau), para VSL#3; 10-4, 10-5, 10-6 y 10-7 en medio Rogosa Agar, para LBF; y, 10-4, 10-5 y 10-6 en medio Luria Bertani® (LB) (Scharlau), para la enterogermina; el medio Luria Bertani® (LB) (Scharlau) contiene :: Pediatría - VOL 42 No.4 - Octubre 2009 ::

en 1 litro: 10 g de peptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de cloruro de sodio y 20 g de agar. Todos los productos se sembraron por duplicado. Se incubaron a 37°C por 48 horas, en aerofilia para S. boulardii, y enterogermina, y en microaerofilia (5% de CO2) para VLS#3 y LBF. Los recuentos se informaron en UFC/ ml y se realizaron en un cuentacolonias digital marca E&Q. Curvas de crecimiento Para realizar la curva de crecimiento, se pesaron 0,04 g de VSL#3 y 0,03 g de LBF, se diluyeron en 1 ml de caldo de cultivo MRS® y se sembraron 100 μl de cada uno en 5 ml de caldo MRS®. Para S. boulardii, se pesaron 0,03 g, se resuspendieron en 1 ml de caldo YEPD y se sembraron 100 μl en 5 ml de caldo YEPD. Para la enterogermina, se tomó 1 ml de la ampolla y se sembró en 4 ml de caldo LB. Todos los medios se incubaron a 37°C por 24 horas, en aerofilia para S. boulardii y enterogermina y, en microaerofilia (5% de CO2) para VLS#3 y LBF. Luego, 100 μl de estos cultivos en crecimiento se inocularon nuevamente en 5 ml de caldo MRS®, YEPD y LB, respectivamente, y se midió la absorbancia a los tiempos de 0 min y 1, 2, 3, 4, 4½, 5, 5½, 6, 6½, 7, 7½ horas, para determinar el comienzo de la fase Log de crecimiento microbiano. Determinación de las unidades formadoras de colonias en fase logarítmica En cada uno de los productos, se determinó el número de UFC en fase logarítmica de acuerdo con el anterior procedimiento. Después


:: Efecto inhibitorio del pH ácido y del alcalino en la supervivencia de los probióticos :: 17

de 24 horas de incubación, se tomaron 100 μl y se reinocularon en 5 ml de caldo MRS para VSL#3 y LBF,en 5 ml de caldo YEPD para S. boulardii y en 5 ml de caldo LB para enterogermina. Posteriormente, se incubaron por 7 horas a 37°C en aerofilia para enterogermina y S. boulardii, y en microaerofilia para VSL#3 y LBF. Luego se realizaron diluciones 1:10 y se prepararon las diluciones 10-6, 10-7 y10-8 en medio Rogosa agar para VLS#3 y LBF, en LB agar para enterogermina y en Sabouroud agar para S. boulardii. Todos los recuentos se hicieron por duplicado. Se incubaron a 37°C por 48 horas en aerofilia para S. boulardii y enterogermina y en microaerofilia (5% de CO2) para VLS#3 y LBF. Se realizó el respectivo recuento en un cuentacolonias digital (E&Q®). Prueba de tolerancia a pH ácido Se preparó una solución de pepsina (Merck®) al 0,32% (p/v) con un pH final de 2,18, igual al pH gástrico. Para cada uno de los probióticos, se cultivó de igual forma que en la determinación de las UFC en fase logarítmico. Luego, los cultivos de cada uno de ellos crecidos a las 7 horas, se centrifugaron a 7.000 rpm por 10 minutos; el botón de las células se lavó con solución tampón de fosfato 1X (PBS) a pH 7,4. Después se centrifugaron nuevamente por 10 minutos a 7.000 rpm y se suspendieron nuevamente en 5 ml de una solución de pepsina al 0,32%, y se dejaron en contacto las células con esta solución por 0, 30, 60, 90 y 120 minutos. A cada uno de los tiempos tratados se le

realizaron diluciones 1:10 y se sembraron en placas de agar, así: 10-6, 10-7 y 10-8 para LBF en agar Rogosa, para S. boulardii en agar Sabouroud, (Scharlau®) y para VSL#3 en agar Rogosa; y 10-5, 10-6 y 10-7 para enterogermina en agar LB. Todos los tratamientos se realizaron por duplicado. Se incubaron a 37°C por 48 horas en aerofilia para S. boulardii y enterogermina, y en microaerofilia para VLS#3 y LBF. El respectivo recuento se realizó en un cuentacolonias digital (E&Q®). Prueba de tolerancia a pH alcalino Se prepararon 5 ml con concentraciones de 0,25%, 0,5%, 0,75% y 1% de sales biliares (Oxoid®), de cada uno de los medios MRS, LB y YEPD. Estos caldos se inocularon con 100 μl de cultivos crecidos por 7 horas y se llevaron a incubar por 24 horas para LBF, S. boulardii y enterogermina, y por 15 horas a 37°C para VSL#3, en aerofilia y microaerofilia según el correspondiente probiótico. Después de este tiempo de incubación, se hicieron diluciones 1:10, y se sembraron 10-6, 10-7 y 10-8 para LBF (agar Rogosa), S. boulardii (agar Sabouroud) y VSL#3 (agar rogosa), y 10-5, 10-6 y 10-7 para enterogermina (agar LB). Todos los tratamientos se realizaron por duplicado. Se incubaron a 37°C por 48 horas, en aerofilia para S. boulardii y enterogermina, y en microaerofilia para VLS#3 y LBF. El respectivo recuento se realizó en un cuentacolonias digital (E&Q®). Análisis estadístico Se determinaron los promedios de los re:: Pediatría - VOL 42 No.4 - Octubre 2009 ::


18 :: Efecto inhibitorio del pH ácido y del alcalino en la supervivencia de los probióticos ::

cuentos en UFC/ml, así como, las desviaciones estándar para cada uno de ellos. Igualmente, se determinó la significancia de los valores de p mediante la prueba t de Student, comparando los valores de los recuentos controles con los cultivos a pH ácido y alcalino. Los valores de p iguales o inferiores a 0,05 se consideraron significativos. RESULTADOS Los estudios de susceptibilidad a pH ácido y pH alcalino de los probióticos analizados en este estudio, se llevaron a cabo mediante reFigura 1. Curvas de crecimiento de probióticos

tiempo cero (control) para los cuatro probióticos (tabla 2). En condiciones de pH alcalino a diferentes concentraciones de bilis, se encontraron variaciones en los recuentos (figura 3); se observaron diferencias significativas en una disminución de los recuentos para S. boulardii y LBF a concentraciones superiores a 0,5% de bilis a 24 horas de incubación (tabla 3) (p≤0,048). Para VSL#3 las variaciones no fueron significativas (p≥0,056) (tabla 3), aunque se observó una disminución en los recuentos que ocurrió a partir de concentraciones de bilis de 0,25% a 15 horas de incubación (figura 4). Para la enterogermina no se demostraron variaciones significativas a condiciones de pH ácido o alcalino. DISCUSIÓN Un número importante de microorganismos presentes en el tubo digestivo han desarrollado mecanismos que les permite tolerar condiciones

Figura 1. Curvas de crecimiento determinadas por espectrofotometría en absorbancia a DO=600 nm para cada uno de los probióticos estudiados

cuento de colonias viables en placas de agar por volumen, teniendo en cuenta la fase logarítmica o fase logarítmica de crecimiento microbiano y que, para efectos de los ensayos de susceptibilidad, se estandarizó a las 7 horas para todos los probióticos (figura 1). Para los ensayos de tolerancia a condiciones de pH ácido, hubo variaciones en los recuentos a diferentes tiempos de contacto (figura 2); no obstante, estas variaciones no fueron significativas (p≥0,089) cuando se compararon con el :: Pediatría - VOL 42 No.4 - Octubre 2009 ::

Figura 2. Prueba de tolerancia a pH ácido determinada en UFC/ml en pepsina 0,32% a pH 2,18 en tiempos de contacto de 0, 30, 60, 90 y 120 minutos.

extremas de pH; además, han desarrollado mecanismos bioquímicos que complementan el equilibrio de la flora intestinal y mejoran la


:: Efecto inhibitorio del pH ácido y del alcalino en la supervivencia de los probióticos :: 19

Tabla 2. Valores de p de tolerancia a pH

Tiempo

Enterogermina

SB

LBF

VSL#3

(minutos) 30

0,202

0,179

0,089

0,356

60

0,235

0,216

0,129

0,436

90

0,255

0,302

0,086

0,215

120

0,292

0,207

0,165

0,217

Valores de p de tolerancia a pH ácido obtenidos mediante la comparación de UFC/ml para cada punto de crecimiento a diferentes tiempos de contacto en pepsina 0,32% a pH 2,18

motilidad en el vaciamiento gástrico e influyen en los complejos motores intestinales.5,24 El uso de probióticos ha ido en aumento por las propiedades que se relacionan con su efecto benéfico sobre el sistema inmunológico11 y por las relaciones simbióticas con la flora microbiana que se producen en el tubo digestivo, para el tratamiento de la diarrea y de las enfermedades intestinales.4,29 Para cumplir con los efectos terapéuticos deseados, estos probióticos, además de poseer características microbiológicas y de seguridad, deben ser resistentes al pH ácido y a la bilis, dado que es necesario que alcancen el intestino delgado y logren colonizar el huésped. Generalmente, los microorganismos constituyentes de los probióticos son de los géneros Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Bacillus y levaduras como Saccharomyces, entre otros, que son intrínsicamente resistentes al pH ácido.5 En este estudio, se analizó la tolerancia al pH ácido (pepsina) y al alcalino (bilis) de los constituyentes biológicos de cuatro probióticos, de los cuales LBF y VSL#3 están constituidos por múltiples cepas, y enterogermina y S. boulardii están compuestos por una sola cepa. Por lo tanto, y dado que los aislamientos de cada

una de las cepas para probióticos con múltiples cepas son más difíciles, los resultados en las curvas y en los recuentos se determinaron como un grupo microbiano. Según lo anterior, las variaciones encontradas en los recuentos a pH ácido hasta tiempos de contacto de 120 minutos para los cuatro probióticos no fueron significativas (p≥0,086), lo cual sugiere que los cuatro poseen tolerancia a pH ácido hasta por 2 horas de contacto. Los microorganismos constituyentes de cada uno de los probióticos pertenecen a especies de los géneros Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Bacillus y Sacharomyces, y aunque existen diferencias entre géneros y especies, la gran mayoría poseen reconocida tolerancia al pH ácido. Los Lactobacillus, además de poseer una acción inhibitoria contra bacterias patógenas30,31 y de producir algunos componentes inhibitorios como peróxido de hidrógeno, bacteriocinas y reuterinas32,33, tienen una gran tolerancia al pH ácido y a la bilis, así como la habilidad de adherirse a la superficie intestinal.29 La tolerancia al pH ácido de los lactobacilos y de otros géneros de bacterias Gram positivas, como Bifidobacterium, Streptococcus y Bacillus, es causada por la acción de la ATPasa F0-F1; esta enzima protege a :: Pediatría - VOL 42 No.4 - Octubre 2009 ::


20 :: Efecto inhibitorio del pH ácido y del alcalino en la supervivencia de los probióticos ::

Tabla 3. Valores de p de tolerancia a pH alcalino

Concentración

Enterogermina

SB

LBF

VSL#3

de bilis 0,25%

0,025

0,107

0,058

0,058

0,50%

0,044

0,048*

0,048*

0,056

0,75%

0,026

0,034*

0,0 34*

0,057

1%

0,101

0,031*

0,031*

0,056

Tabla 3. Valores de p de tolerancia a pH alcalino obtenidos mediante la comparación de UFC/ml para cada punto de crecimiento de cada probiótico a diferentes concentraciones de bilis a tiempos de incubación de 15 horas para VSL#3 y de 24 horas para enterogermina, LBF y Saccharomyces boulardii. *: significativo

las bacterias contra la acidez, mediante el mantenimiento de un gradiente constante entre el pH extracelular y el citoplasmático.25 Debido a estas características, los constituyentes de estos probióticos pueden tolerar pH ácidos iguales a los producidos en el tubo digestivo.34 No obstante, se ha demostrado que una gran mayoría de las cepas de lactobacilos no sobreviven a un pH de 2,5 por 4 horas.35 Estudios similares en bacterias acidolácticas. como L. acidophilus y Bifidobacterium Bb-12, con pruebas de tolerancia entre pH de 1 y de 4, muestran mayores diferencias entre un pH de 2 y uno de 3.36 Sin embargo, se ha sugerido que los alimentos ejercen un efecto protector sobre los microorganismos en cuanto a su tolerancia o resistencia al pH ácido o alcalino, lo cual puede mejorar las características de un probiótico para ejercer su potencial ideal. No obstante, este efecto protector varía en función del número de células viables en una población microbiana.37 De hecho, se ha demostrado que la adición de glucosa mejora la resistencia de bacterias acidófilas, como L. rhamnosus, en HCl a un pH de 2,0.38 :: Pediatría - VOL 42 No.4 - Octubre 2009 ::

Para S. boulardii, cuyo constituyente es una levadura que ha sido efectiva para la prevención de la diarrea aguda, especialmente la producida por Clostridium difficile, Escherichia coli o Candida albicans, posee mecanismos de actividad probiótica demostrada mediante estudios clínicos; además de secretar proteasas, estimular la producción de IgA, eliminar toxinas y modificar la mucosa intestinal, posee una resistencia intrínseca a pH ácido.22,26,39-41 De hecho, se ha demostrado que en las cepas de S. boulardii, a medida que disminuye el pH a 2,0, la viabilidad de las células permanece igual, contrario a lo observado con otro tipo de levaduras similares, como S. cerevisiae Σ1278b y BY3, las cuales reducen su capacidad de tolerancia hasta un poco más de 50%.26 Sin embargo, en este mismo estudio ninguna de las cepas analizadas, incluso S. boulardii, sobrevivió a un pH de 1,0.26 En cuanto al pH alcalino, las concentraciones de bilis produjeron una reducción significativa (p≤0,05) en los recuentos para S. boulardii y LBF. Para la enterogermina, las variaciones estuvieron más asociadas a un incremento que


:: Efecto inhibitorio del pH ácido y del alcalino en la supervivencia de los probióticos :: 21

Figura 3. Prueba de tolerancia a pH alcalino

Figura 3. Prueba de tolerancia a pH alcalino determinada en UFC/ ml a concentraciones de 0,25%, 0,50%, 0,75% y 1% de bilis en medio de cultivo enriquecido por 24 horas de incubación para los probióticos enterogermina, LBF y Saccharomyces boulardii.

a una disminución en el recuento de colonias, a concentraciones de 0,75% y 1% (p≤0,02). Para VSL#3, las variaciones sugieren una disminución en sus recuentos a concentraciones superiores a 0,25%, pero no demostraron diferencias significativas (p≥0,05). La disminución en los recuentos para S. boulardii, LBF y VSL#3, sugiere un efecto bacteriostático mas no bactericida de la bilis. Los estudios realizados han demostrado que el efecto bactericida de las sales biliares en varias especies ácido-lácticas27, incluso en estudios in vivo, puede llegar a reducir la viabilidad de dichas bacterias hasta 70% y 90% en el duodeno.37 No obstante, existen cepas que son resistentes a las sales biliares, en las que sólo se observa un retardo en el crecimiento, es decir, que las cepas que evidencian crecimiento en 1 hora, se pueden demorar 4 horas en bilis.35 En este mismo estudio también se demuestra un efecto bacteriostático de la bilis, así como

la capacidad de tolerancia de las cepas al pH alcalino. De hecho, los autores informan que una de las cepas analizadas exhibió tolerancia a la bilis a concentraciones de 3%, por 4 horas.35 En nuestro estudio, los microorganismos constituyentes de enterogermina, LBF y S. boulardii, tuvieron tiempos de tolerancia en medios de cultivo con concentraciones de bilis hasta de 1% en 24 horas de incubación y, los de VSL#3, de 15 horas, lo cual sugiere una gran capacidad de adaptación sin producir la muerte celular. Es importante resaltar el papel de la levadura S. boulardii que, a pesar de ser eucariota y filogenéticamente diferente a las bacterias e incluso entre especies del mismo género26, es capaz de tolerar el pH ácido y el alcalino, de igual manera como lo hacen las bacterias ácido-lácticas, lo cual sugiere la presencia de mecanismos bioquímicos y moleculares aún no conocidos que le confiere tolerarancia a pH extremos y la convierten en un modelo interesante de estudio para entender los mecanismos que regulan su tolerancia. Los rangos de tolerancia a diferentes concentraciones de bilis, así como a la pepsina con pH de 2,18, sugieren la gran capacidad de los microorganismos que constituyen los probióticos estudiados, para tolerar pH similares al del jugo gástrico y al de las sales biliares del tubo digestivo. Por lo tanto, poseen una característica fisiológica importante porque pueden sobrevivir al atravesar el estómago y el duodeno, y llevar a cabo la actividad bioterapeútica deseada.

:: Pediatría - VOL 42 No.4 - Octubre 2009 ::


22 :: Efecto inhibitorio del pH ácido y del alcalino en la supervivencia de los probióticos ::

AGRADECIMIENTOS Este proyecto fue financiado por la compañía Merck, en colaboración con el Laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología de la Universidad de Santander, UDES, Bucaramanga. Agradecemos la colaboración de Barbarita Mantilla Cardozo, quien inició la determinación de las curvas de crecimiento para cada probiótico.

Figura 4. Prueba de tolerancia a pH alcalino para VSL#3

Figura 4. Prueba de tolerancia a pH alcalino determinada en UFC/ml a concentraciones de 0,25%, 0,50%, 0,75% y 1% de bilis en medio de cultivo enriquecido por 15 horas de incubación para VSL#3

BIBLIOGRAFÍA

1.

Saavedra JM. Use of probiotics in pediatrics: rationale, mechanisms of action, and practical aspects. Nutr Clin Pract. 2007;22:351-65.

2.

Szajewska H, Mrukowicz JZ. Probiotics in the treatment and prevention of acute infectious diarrhea in infants and children: a systematic review of published randomized, double-blind, placebo-controlled trials. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2001;33(Suppl.2):S17-25.

3.

de Vrese M, Marteau PR. Probiotics and prebiotics: effects on diarrhea. J Nutr. 2007;137(Suppl.2):803S-11S.

4.

Johnston BC, Supina AL, Ospina M, Vohra S. Probiotics for the prevention of pediatric antibiotic-associated diarrhea. Cochrane Database Syst Rev. 2007(2): CD004827.

5.

Snelling AM. Effects of probiotics on the gastrointestinal tract. Curr Opin Infect Dis. 2005;18:420-6.

6.

Fabia R, Ar’Rajab A, Johansson ML, Andersson R, Willen R, Jeppsson B, et al. Impairment of bacterial flora in human ulcerative colitis and experimental colitis in the rat. Digestion. 1993;54:248-55.

7.

Sartor R. Microbial factors in the pathogenesis of Crohn’s disease, ulcerative colitis and experimental intestinal inflamation. En: Kirsner J, editor. Inflamatory bowel diseases. 5th. edition. Philadelphia: Saunders; 1999. p. 153-78.

8.

Cindoruk M, Erkan G, Karakan T, Dursun A, Unal S. Efficacy and safety of Saccharomyces boulardii in the 14-day triple anti-Helicobacter pylori therapy: a prospective randomized placebo-controlled double-blind study. Helicobacter. 2007;12:309-16.

9.

Lorca GL, Wadstrom T, Valdez GF, Ljungh A. Lactobacillus acidophilus autolysins inhibit Helicobacter pylori in vitro. Curr Microbiol. 2001;42:39-44.

:: Pediatría - VOL 42 No.4 - Octubre 2009 ::


:: Efecto inhibitorio del pH ácido y del alcalino en la supervivencia de los probióticos :: 23

10.

Vandenplas Y, Salvatore S, Viera M, Devreker T, Hauser B. Probiotics in infectious diarrhoea in children: are they indicated? Eur J Pediatr. 2007;166:1211-8.

11.

Prescott SL, Bjorksten B. Probiotics for the prevention or treatment of allergic diseases. J Allergy Clin Immunol. 2007;120:255-62.

12.

Yoo J, Tcheurekdjian H, Lynch SV, Cabana M, Boushey HA. Microbial manipulation of immune function for asthma prevention: inferences from clinical trials. Proc Am Thorac Soc. 2007;4:277-82.

13.

Brawley RL, Weber DJ, Samsa GP, Rutala WA. Multiple nosocomial infections. An incidence study. Am J Epidemiol. 1989;130:769-80.

14.

Trois L, Cardoso EM, Miura E. Use of probiotics in HIV-infected children: a randomized double-blind controlled study. J Trop Pediatr. 2007;54:19-24.

15.

Weber DJ, Raasch R, Rutala WA. Nosocomial infections in the ICU: the growing importance of antibiotic-resistant pathogens. Chest. 1999;115(Suppl.):34S-41S.

16.

Bengmark S. Pre-, pro- and symbiotics. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 2001;4:571-9.

17.

Woodmansey EJ. Intestinal bacteria and ageing. J Appl Microbiol. 2007;102:1178-86.

18.

Moore WE, Holdeman LV. Human fecal flora: the normal of 20 Japanese-Hawaiians. Appl Environ Microbiol. 1974;27:96179.

19.

Simon GL, Gorbach SL. Intestinal flora in health and disease. Gastroenterology. 1984;86:174-93.

20.

Bowen JM, Stringer AM, Gibson RJ, Yeoh AS, Hannam S, Keefe DM. VSL#3 Probiotic treatment reduces chemotherapyinduced diarrhea and weight loss. Cancer Biol Ther. 2007;6:1449-1454

21.

Hove H, Norgaard H, Brobech Mortensen PB. Lactic acid bacteria and human gastrointestinal tract. Eur J Clin Nutr. 1999;53:339-50.

22.

Czerucka D, Piche T, Rampal P. Review article: yeast as probiotics -- Saccharomyces boulardii. Aliment Pharmacol Ther. 2007;26:767-78.

23.

Hatcher GE, Lambrecht RS. Augmentation of macrophage phagocytic activity by cell-free extracts of selected lactic acid-producing bacteria. J Dairy Sci. 1993;76:2485-92.

24.

Reid G. Probiotics in the treatment of diarrheal diseases. Curr Infect Dis. 2000;2:78-83.

25.

Cotter PD, Hill C. Surviving the acid test: responses of Gram-positive bacteria to low pH. Microbiol Mol Biol Rev. 2003;67:429-53.

26.

Edwards-Ingram L, Gitsham P, Burton N, Warhurst G, Clarke I, Hoyle D, et al. Genotypic and physiological characterization of Saccharomyces boulardii, the probiotic strain of Saccharomyces cerevisiae. Appl Environ Microbiol. 2007;73:245867.

27.

Jin LZ, Ho YW, Abdullah N, Jalaludin S. Acid and bile tolerance of Lactobacillus isolated from chicken intestine. Lett Appl Microbiol. 1998;27:183-5.

28.

Ronka E, Malinen E, Saarela M, Rinta-Koski M, Aarnikunnas J, Palva A. Probiotic and milk technological properties of Lactobacillus brevis. Int J Food Microbiol. 2003;83:63-74.

29.

Kirjavainen PV, Ouwehand AC, Isolauri E, Salminen SJ. The ability of probiotic bacteria to bind to human intestinal mucus. FEMS Microbiol Lett. 1998;167:185-9.

30.

Drago L, Gismondo MR, Lombardi A, de Haen C, Gozzini L. Inhibition of in vitro growth of enteropathogens by new Lactobacillus isolates of human intestinal origin. FEMS Microbiol Lett. 1997;153:455-63.

31.

Schillinger U, Lucke FK. Antibacterial activity of Lactobacillus sake isolated from meat. Appl Environ Microbiol. 1989;55:1901-6.

32.

Axelsson LT, Chung W, Dobrogosz G, Lindgren SE. Production of a broad spectrum antimicrobial substance by Lacto:: Pediatría - VOL 42 No.4 - Octubre 2009 ::


24

bacillus reuteri. Microb Ecol Health. 1989;2:131-6.

33.

Juven BJ, Schved F, Lindner P. Antagonist compounds produced by a chicken intestinal strain of Lactobacillus acidophilus. J Food Prot. 1992;55:157-61.

34.

Conway PL, Gorbach SL, Goldin BR. Survival of lactic acid bacteria in the human stomach and adhesion to intestinal cells. J Dairy Sci. 1987;70:1-12.

35.

Jacobsen CN, Rosenfeldt Nielsen V, Hayford AE, Moller PL, Michaelsen KF, Paerregaard A, et al. Screening of probiotic activities of forty-seven strains of Lactobacillus spp. by in vitro techniques and evaluation of the colonization ability of five selected strains in humans. Appl Environ Microbiol. 1999;65:4949-56.

36.

Hoier E. Saure- und gallentoleranz von Lactobacillus acidophilus und Bifidobacterium. Lebensmittelind Milchwirtsh. 1992;26:769-72.

37.

Drouault S, Corthier G, Ehrlich SD, Renault P. Survival, physiology, and lysis of Lactococcus lactis in the digestive tract. Appl Environ Microbiol. 1999;65:4881-6.

38.

Corcoran BM, Stanton C, Fitzgerald GF, Ross RP. Survival of probiotic lactobacilli in acidic environments is enhanced in the presence of metabolizable sugars. Appl Environ Microbiol. 2005;71:3060-7.

39.

Jawhara S, Poulain D. Saccharomyces boulardii decreases inflammation and intestinal colonization by Candida albicans in a mouse model of chemically-induced colitis. Med Mycol, 2007;45:1-10.

40.

Ozkan TB, Sahin E, Erdemir G, Budak F. Effect of Saccharomyces boulardii in children with acute gastroenteritis and its relationship to the immune response. J Int Med Res. 2007;35:201-12.

41.

Villarruel G, Rubio DM, L贸pez F, Cintioni J, Gurevech R, Romero G, et al. Saccharomyces boulardii in acute childhood diarrhoea: a randomized, placebo-controlled study. Acta Paediatr. 2007;96:538-41.

:: Pediatr铆a - VOL 42 No.4 - Octubre 2009 ::


Efecto inhibitorio del pH ácido y del alcalino en la