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LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO (LCR) Ponentes: Maritza González-Hoyuela Mª Eugenia Barbero López


I-GENERALIDADES DEL LCR II-PROTEINAS DEL LCR Y SU IMPORTANCIA III-ANALISIS MICROBIOLÓGICO DEL LCR IV-CASO CLÍNICO


ANATOMÍA Y FISIOLOGÍA ™ Formación: Plexos coroideos, a través de procesos de

ultrafiltración y secreción activa.

™ Volumen: o o

Adultos: 90 – 150 mL Neonatos: 10 – 60 mL

™ Funciones: o o o

Colchón protector para el tejido nervioso central Recogida de productos de desecho Circulación de nutrientes

™ BHE: o o

Epitelio de plexos coroideos Endotelio de los capilares en contacto con el LCR


INTERES CLINICO DEL LCR

• Infecciones del SNC • Procesos vasculares • Enfermedades desmielinizantes • Tumores del Sistema Nervioso Central • Identificar la naturaleza del líquido en fístulas nasales u óticas


OBTENCIÓN DE LA MUESTRA

La Presión normal del LCR es: ¾ Adultos:

90 a 180 mm Hg ¾ Niños:

10 -100 mm Hg


OBTENCIÓN DE LA MUESTRA ¾ Con presiones normales, pueden extraerse hasta 20 mL de LCR sin ningún peligro. ¾ Si la presión inicial es >200 mm Hg, no deben extraerse más de 2 mL. ¾ Alícuotas Tubo 1: estudios bioquímicos e inmunológicos Tubo 2: exámen microbiológico Tubo 3: recuento de leucocitos y su contaje diferencial.


EXAMEN MACROSCÓPICO DEL LCR ¾

El LCR es claro y sin color.

¾

En presencia de alteraciones, el líquido puede adquirir diferentes aspectos: o TURBIDEZ ƒ ƒ ƒ ƒ

Presencia de gérmenes: > 10 5 UFC Pleocitosis: más de 200 leucocitos / µL Existencia de hematíes: más de 400 / µL Nivel elevado de proteínas


EXAMEN MACROSCÓPICO DEL LCR o Coágulos por fibrinógeno: Punción traumática o meningitis

purulenta. No aparece en Hemorragia Subaracnoidea

o Viscosidad aumentada: Meningitis criptococcica o

metástasis meníngea

o Existencia de glóbulos de grasa de diversos tamaños en el

LCR: o embolismo graso en el cerebro

o Color : Rojizo: hematíes

Verdoso: liberación de mieloperoxidasa Amarillo: liberación de bilirrubina


XANTOCROMIA Color amarillo, naranja o rosáceo del LCR tras su centrifugación

?

Lisis de hematíes 4-6 horas

?

Hemorragia subaracnoidea 12 h

6-10 días


DIFERENCIAS ENTRE HSA Y PUNCIÓN TRAUMÁTICA Determinaciones Aspecto tubo 1,2,3

Punción traumática Desigual

Hemorragia subaracnoidea Igual

Coágulos

A menudo

No se observa

Sobrenadante

Incoloro

Xantocrómico

Espectrofotometría Entre 370 y 530 nm

Negativo

Pico a 415(oxiHb). Pico a 450-460 nm (Bb)


EXAMEN MICROSCÓPICO DEL LCR Células: Escasas, de tipo monocítico. Lisis de 40% en 2 horas a temperatura ambiente. Neonatos: Hasta 20-30 células. Niños y adultos: Hasta 5-10 células. Punción traumática: Corregir en número de células restando un leucocito por cada 700 hematíes. La cifra total de hematíes tiene escaso valor. Su principal aplicación es corregir el recuento leucocitario o la concentración de proteínas (1mg por cada 1000 hematíes)


PLEOCITOSIS PLEOCITOSIS POR NEUTRÓFILOS

PLEOCITOSIS POR LINFOCITOS

Sugiere diagnóstico de meningitis bacteriana. Comienzo de las meningitis víricas Hemorragia cerebral Fármacos intratecales

Se asocia a meningitis vírica Micobacteria Tb o micótica Neurosífilis Meningitis por Listeria Esclerosis múltiple

PLEOCITOSIS POR EOSINOFILOS

PLEOCITOSIS POR CÉLULAS TUMORALES

Se observa rara vez con recuentos Tumor primario o metástasis discretos en procesos Diseminación meníngea de inflamatorios sistémicos o Leucemia o linfomas asociados a infecciones parasitarias, fúngicas o alergias


ANALISIS BIOQUÍMICO DEL LCR GLUCOSA Procede de la glucosa sanguínea por mecanismos de transporte activo y difusión por gradiente de concentración. Glucorraquia: 60 % de la concentración plasmática. Neonatos: Cociente: LCR/Sangre 0.4 y 2.5 Hiperglucorraquia: Por hiperglucemia. Hipoglucorraquia: Por meningitis bacteriana cociente < 0.4 LACTATO Es independiente de la concentración plasmática. (Valores: 1-3 mM/L). Refleja el metabolismo cerebral anaerobio por hipoxia. Aumenta: Infarto cerebral,edema, trauma o meningitis.


ESTUDIO DE LAS PROTEÍNAS DEL LCR

“Diagnóstico

y seguimiento de las distintas enfermedades neurológicas que cursan con alteraciones de la concentración y de la composición proteica en el LCR” 1) Evaluación del grado de afectación de la BHE consecutivo a inflamación. 2) Detección de procesos que impliquen una RI en el SNC. 3) En procesos degenerativo-destructivos del SNC.


PROTEÍNAS DEL LCR

O R I G E N

¾ Plasma → LCR: ~ 80% Mecanismos: difusión pasiva, transporte activo. Características de paso: o Constantes físico-químicas o Concentración en el plasma o Estado funcional BHE

¾ Síntesis intratecal: ~ 20%

FISIOPATOLOGÍA Alteraciones en la Concentración de proteínas en el LCR : 1) Aumento del paso de las proteínas del plasma al LCR por : • Alteración de la BHE. • Obstrucción a la libre circulación del LCR

2) Aumento de la síntesis o liberación de proteínas in situ.


PROTEÍNA TOTAL

g/L

Según origen

Valores de referencia

Ventricular

0,050 – 0,150

Cisternal

0,150 – 0,250

Lumbar

0,150 – 0,450

Según la edad 1 – 30 días

0,200 – 1,500

1 – 90 días

0,200 – 1,000

3 – 6 meses

0,150 – 0,500

0,5 – 10 años

0,100 – 0,300

10 – 40 años

0,150 – 0,450

40 – 50 años

0,200 – 0,500

50 – 60 años

0,250 – 0,550

en el

>60 años

0,300 – 0,600

LCR

Modificación del Biuret (36)

0,140 – 0,620

Turbidimetría (TCA)

0,150 – 0,300

Lowry

0,250 – 0,450

de la Concentración de proteína

Según el método


CAUSAS DEL AUMENTO DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA EN LCR POR AUMENTO DEL PASO DE PROTEÍNAS DESDE EL PLASMA Hemorragia Hemorragia cerebral

g/L 0,3 - 1,5

Alteración de la BHE Meningitis bacterianas

0,8 – 5,0

Meningitis víricas

0,3 – 1,0

Obstrucción a la libre circulación del LCR Tumor espinal

1,0 – 20,0

POR AUMENTO DE SÍNTESIS INTRATECAL Neurolúes

0,5 – 1,5

Esclerosis múltiple

0,25 – 0,5

POR COMBINACIÓN DE LAS DOS SITUACIONES ANTERIORES Meningitis tuberculosas

0,5 – 3,0

Síndrome Guillain-barré

1,0 – 4,0


PROTEÍNAS DEL LCR ALBÚMINA ¾ Buen

marcador del intercambio entre el LCR y el plasma ¾ Cuantificable por métodos específicos y con buena calidad metrológica. ¾ VR: 120-320 mg/L ¾ Síntesis hepática ¾Integridad de la BHE:

¾

Alb LCR ( mg / l ) QAlb = Albs ( g / l )

¾

PREALBÚMINA ¾

¾

Origen: Origen plasma y ss. en los plexos coroideos ventriculares. Concentración relativa mayor en el LCR que en plasma u otros líquidos biológicos. Confirmar las pérdidas de LCR Desplazada por la transferrina-τ.


INMUNOGLOBULINAS ORIGEN o Plasma o Ss. intratecal muy baja CONCENTRACIÓN o IgG < 40 mg/L o Otras Ig muy inferior Aumento CIg en LCR o Aumento Ig en suero o Alteración de la BHE o Aumento de ss. local

PROCEDENCIA : Razón de IgG y diversos índices o Permiten conocer si existe un ↑ss. Intratecal de las Ig. o IgG: IgG presencia y actividad de LB locales (E. desmielinizantes). o IgM: IgM aparición más precoz en la RI: diagnóstico y seguimiento de procesos infecciosos e inflamatorios del SNC. o IgA: ofrece poco valor clínico en enfermedades neurológicas.


TRANSFERRINA DESIALIZADA ¾ TRF nativa: isoforma tetrasializada mayoritaria en suero y en LCR. ¾ TRF- τ: isoforma desializada presente en LCR (C ≈ 15 - 20% del total). ¾ Separación por electroforesis o β1 TRF: nativa o β2 TRF: TRF- τ ¾ Secreción: TRF-τ » posible contaminación por LCR. ¾ Concentración elevada en ciertas E. neurológicas.


PROTEÍNA BÁSICA DE LA MIELINA ORIGEN: degradación de las vainas de mielina. Es liberada al espacio extracelular ⇒ LCR: CUANTIFICACIÓN 1) Seguir la actividad de la EM 2) Ayudar en el diagnóstico de la EM 3) Asistir en el diagnóstico de la EM en el 5-10% pacientes en los cuales las bandas oligoclonales no aparecen nunca.


OTRAS PROTEÍNAS ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾

Proteína β-traza: traza diagnóstico diferencial de rinorreas y otorreas Proteína C reactiva: reactiva diagnóstico diferencial de meningitis bacterianas y víricas Cistatina (proteína γ-traza) β2-microglobulina: microglobulina situaciones asociadas con activación o proliferación de linfocitos en SNC (linfoma metastásico) Astroproteína: na tumores gliales Fibronectina Ferritina Proteína precursora del amiloide- β Péptidos


ESPÉCIMEN ™ La medición debe realizarse de manera inmediata después de la recepción de la muestra. ™ Si se emplea electroforesis convencional para el estudio cualitativo, el LCR debe concentrarse entre 50 y 100 veces (ultrafiltración) hasta C≈25–40 g/L. ™ Conservación: hasta 3 días a 2 – 8 ºC ™ Obtención de muestras simultáneas de suero y LCR : • Investigar la presencia de bandas oligoclonales • Para calcular los distintos índices


RELACIÓN ENTRE LAS PROTEÍNAS ESPECÍFICAS DE LCR Y DEL SUERO ™

Existen varias fórmulas que permiten evaluar el estado de la BHE y la ss. intratecal de Ig: o

o o o

™

Cociente de albúmina. Razón de IgG Indice de Link o de IgG Indice de Tourtellotte

Máxima utilidad cuando no queda demostrada la presencia de bandas oligoclonales en el LCR mediante estudios electroforéticos.


RECOMENDACIONES Y CONCLUSIONES ™Medición de la Cp en LCR: o Escasamente útil para establecer un diagnóstico

diferencial entre E. neurológicas. o Diagnóstico diferencial situaciones que conducen a inflamación meníngea o a alteraciones del libre flujo de LCR. o Diagnóstico diferencial Meningitis • M.Bacterianas: Cproteína >1,5 g/L (LCR) • M.Víricas: sólo 1% Cproteína >1,7 g/L (LCR) • La Cproteína (LCR) puede no estar elevada al inicio de distintos tipos de meningitis.


™ La detección de B. Oligoclonales en LCR: o Imprescindible para confirmar la ss. intratecal de Ig que se producen en la EM (método separación proteica) o La EEF convencional del LCR concentrado: detección de b. oligoclonales. o Inmunofijación: confirmación de B.oligoclonales e identificación de Ig. ™ Para confirmar la ss.intratecal de Ig: o Estudio electroforético o Análisis cuantitativos de Ig : - específicos

- calidad metrológica


MÉTODOS DE SEPARACIÓN PROTEICA. ¾ Finalidad: detección de bandas oligoclonales. ¾ Procedimientos más utilizados para su fraccionamiento: • Electroforesis en acetato de celulosa o el gel de agarosa –seguida de inmunofijación- o en gel de poliacrilamida. • Isoelectroenfoque en gel de agarosa o en gel de poliacrilamida. • Electoctroforesis capilar


ELECTROFORESIS Fracción Prealbúmina Albúmina

Proteinograma LCR

% respecto a proteína total 2-7 56 - 76

α1-globulina α2-globulina

2-7 4 - 12

β-globulina

8 - 18

γ-globulina

3 - 12

Intervalos de referencia electroforesis de proteínas en LCR.


ELECTROFORESIS

Proteinograma normal en LCR

Proteinograma patol贸gico en LCR


INMUNOFIJACIÓN Inmunonefelometría / Inmunoturbidimetría Gammapatías monoclonales: Un solo clon de células. lulas de plasma produce elevados niveles de Ig de una sola clase o tipo: o Benignas o Malignas: mieloma múltiple, macroglobulinemia Waldeström Gammapatías policlonales: Debido a desórdenes clínicos (E. crónica del hígado, desórdenes de colágenos, artritis reumatoide e infecciones crónicas).


™ En la Esclerosis múltiple: 9El patrón de B. Oligoclonales en el LCR, es característico de cada paciente y permanece inalterable en el tiempo. tiempo 9 La concentración de Ig en el LCR, puede afectarse por efectos del tratamiento. ™Pérdida de LCR en rinorreas u otorreas: 9 Demostrar presencia de transferrina-τ : m.separación proteica. 9 Procesamiento en paralelo del LCR y del suero del paciente. ™Electroforesis bidimensional: 9 Péptidos (LCR) ≈ cuadros neuropsiquiátricos. 9Etiología 9Mejoran dignóstico y seguimiento.


MICROBIOLOGÍA DEL LCR Causas de meningitis más frecuentes según la edad 40 35

S. agalactiae.

30

S. Pneumoniae

25

N. Meningitidis

20

E. coli.

15

H. influenzae

10

L. monocytogenes

5 0 Neonatos

1mes - 5años

5 - 19 años

<= 65 años

> 65 años


ANALISIS MICROBIOLÓGICO TINCIONES: -Tinción de GRAM: 60-80 % sensibilidad

Neisseria meningitidis

Neumococos


¾ OTRAS TINCIONES: - Ziehl-Nielsen o Auramina para Mycobacterium Tb - Tinta China para criptococo. ¾ CULTIVOS EN MEDIOS ADECUADOS: Permite un uso adecuado de antibióticos y de determinar su patrón de sensibilidad. (AGS, AG Chocolate y Schaedler) ¾ PRUEBAS SEROLOGICAS: - No dependen de bacterias viables para resultados positivos - Son especialmente útiles cuando el GRAM es negativo - Test simples con gran disponibilidad en los laboratorios. - Latex o pruebas de aglutinación: Ej. Cripto-Latex en LCR, VDRL en LCR para neurosífilis, Latex para Brucella, etc


¾PRUEBAS MOLECULARES: ™Pruebas de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para la detección de: o Virus: Herpes: Simplex, V. Zoster, Epstein Barr; enterovirus, adenovirus, citomegalovirus o Bacterias: N. meningitidis, H influenzae, Micobacterium Tb, o de MO de recuperación difícil con los métodos convencionales VENTAJAS vs DESVENTAJAS: ™Sensibilidad y Especificidad mayor de 90%. ™Posibilidad de detectar varios MO por una PCR múltiple ™Métodos comerciales ™Métodos de extracción no automatizados ™Dificultades para la estandarización y cuantificación ™Ausencia de gran disponibilidad debido a su coste.


LCR en diversas patologías Patología

Aspecto

Células

Proteína

Glucosa

Meningitis bacteriana

Turbio

500 10000*

80-500

<40

*90% Polis

Meningitis vírica

Claro o ligeramente turbio

5-300 Monos

30-100

Normal

24 a 36h predominio Polis

Meningitis tuberculosa

Claro

100-600

50-300

<45

Meningitis fúngica

Ligeramente turbio

40-400

50-300

<45

Polis

25-1000

Aumenta

Normal o Aumenta

Espectrofotometría

Hemorragia XantoSubaracnoi- crómico dea


ANÁLISIS BÁSICO DEL LCR Relación al diagnóstico patológico en las demencias Robinson-Agramonte MA, Hernández Díaz E, Robinson Agramonte J, Macías Betancourt R, Galvizo R. (Rev Mex Neuroci 2003)


RESUMEN ¾ La RI humoral (SNC) muestra patrones de respuesta de síntesis intratecal de Ig: – Causa de la enfermedad – Fisiopatología de la enfermedad – Localización de la enfermedad

¾ Patrones de respuesta para las 3 clases de Ig en 15 pacientes con distintos tipos de demencia. ¾ Análisis: – Estimación cuantitativa Ig y albúmina en suero y LCR – Reibergrama: razón albúmina y síntesis intratecal

¾ Utilidad del análisis básico del LCR en diagnóstico patológico de E. neurológicas.


ENFERMEDAD DE ALZHEIMER (EA) ¾

Es la más común y devastadora enfermedad neurodegenerativa

¾ Características: –Demencia progresiva entre quinta y sexta décadas de la vida –Historia familiar de HAD –EA esporádica de comienzo tardío

¾ Diagnóstico clínico: –Exclusión de otras enfermedades demenciales –Marcadores neuroquímicos: estadíos tempranos, información. –Vías que facilitan el análisis de marcadores neuroquímicos.


ENFERMEDAD DE ALZHEIMER (EA) Vías que facilitan el análisis de marcadores neuroquímicos 1.

Neuroimagen

2.

Marcadores sistémicos (sangre o células sanguíneas)

3. Líquido cefalorraquídeo: exclusión diagnóstica de otras demencias – Evaluación en la funcionalidad de BHE – Síntesis intratecal de Inmunoglobulina: • incremento del índice de IgG e IgM • presencia de bandas oligoclonales específicas en LCR


MATERIALES Y MÉTODOS Evaluación de LCR y suero de 15 pacientes con dignóstico de demencia PACIENTES ¾ ¾ ¾ ¾

8 E.Alzheimer (EA) (4 M, 59-70 a; 4 H, 62-71 a) 6 Demencia vascular (DV) (5 M, 52-65 a; 1 H, 59 a) 1 Demencia 2ª neurosífilis (DSNS) (47 a) 8 Sujetos controles (4 M, 56-61 a; 4 H, 58-67 a) (sometidos a intervención quirúrgica por enfermedades no neurológicas)

“En todos los casos se obtuvo el consentimiento informado para su inclusión en el estudio”


MATERIALES Y MÉTODOS Criterios Diagnóstico ¾ ¾ ¾

Diagnóstico “EA probable”: criterios internacionalmente aceptados de la NICDS-ADRDA Work Group Diagnóstico ”D.Vascular probable”: criterios internacionalmente aceptados Diagnóstico DSNS: estudios serológicos y del LCR (serología reactiva 1:128 y VDRL LCR 1:512) Criterios de exclusión

¾ Pacientes o controles excluídos: excluídos historia de trastornos cognitivos o enfermedad orgánica crónica con repercusión sobre el SNC o niveles elevados de PCR


PROCEDIMIENTO ANALITICO CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS ¾ Determinación de la concentración de albúmina, IgG, IgA e IgM en LCR y suero (Inmunonefelometría). ¾ Detección de bandas oligoclonales (Focalización isoeléctrica en agarosa). ¾ Síntesis intratecal IgA, IgG, IgM: – Incremento fracción intratecal de Ig sintetizada en SNC (Reibergrama) – Detección de bandas oligoclonales restringida al LCR: indicativo de síntesis intratecal (criterios “Grupo de Expertos de Europa”)


REIBERGRAMA “Formulación más integral para la determinación cuantitativa de Ig localmente sintetizadas en SNC” ¾ ¾ ¾

QIgG (IgG LCR/Suero) QAlb (Albúmina LCR/Suero) Evaluación de la función de la barrera LCR/sangre QAlb

EDAD

5,0x10-3

4meses-15años

6,5x10 -3

15-40 años

8,0x10 -3

40-60 años

¾Diferencia la fracción de IgG del cerebro de la IgG presente en el LCR de la sangre. ¾ Síntesis intratecal: FI>10%


REIBERGRAMA En el diagrama se representan 5 rangos 1. Rango normal 2. Disfunción pura de la barrera 3. Disfunción de la barrera sangre/LCR más síntesis de IgG en SNC 4. Síntesis intratecal IgG en SNC sin disfunción de la barrera sangre LCR Valores en el área 5 indican error metodológico


RESULTADOS Respuesta para las diferentes clases de inmunoglobulinas ¾E.A. y D.V no mostraron ss. intratecal Ig; sí DSNS ¾ Incremento de la razón albúmina en D.V. (QAlb = 12.6 x10-3) en ausencia de ss. Intratecal ¾ D. 2ª Neurosífilis (DSNS): o Ss. intratecal IgG: 63% o Ss. intratecal IgM: 90% o Presencia B.O.de IgG en LCR. o Patrón de comportamiento de la forma parenquimatosa de la enfermedad

E.A

D.V.

DSNS

Patrón del Reibergrama para cada tipo de demencia


DISCUSION Patrones de ss. Ig Dependen de causa, fisiopatología y localización enfermedad ™ Asocian patrón de respuesta con fisiopatología, y no con curso agudo o crónico de la enfermedad ™ Reciente herramienta adicional para el diagnóstico de E. neurológicas, incluídas las demencias. ™ El patrón de respuesta observado en este trabajo concuerda con reportes de otros autores. ™


“Análisis inmunológico del LCR útil en diagnóstico de exclusión en el síndrome demencial complementario al estudio “ in vivo” de otros marcadores más específicos detectables en este fluído


Gracias


VALORES DE REFERENCIA PARA EL LCR


liquido cefaloraquideo