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Rosco Diagnostica Gebrauchsanweisung für Staph-zym ™ Staph-zym™ Identifikations-Kit für Staphylokokken

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DBV0014G 20.04.2007 Deutsch

Hersteller ROSCO Diagnostica A/S, Taastrupgaardsvej 30, DK-2630 Taastrup, Dänemark, www.rosco.dk Verwendungszweck Für die In-vitro-Anwendung zur Identifikation von Staphylococcus-Spezies. Wirkungsprinzip Staph-zym ist ein kombiniertes enzymatisch-antimikrobielles Identifikationssystem für Staphylococcus-Spezies. •

Die Staph-zym Testhalterung kombiniert 10 enzymatische Tests unter Verwendung von Tabletten mit Farbstoff bildenden und modifizierten konventionellen Substraten, die sich in 11 fest auf einem Ständer angebrachten Miniröhrchen befinden. (Röhrchen Nr. 11 enthält keine Tablette; es könnte für einen zusätzlichen Test verwendet werden). Die in der bakteriellen Suspension vorhandenen Enzyme reagieren mit dem Substrat der Tabletten. Die Testergebnisse werden nach einer Inkubation über Nacht bei 35 bis 37 °C an Hand von Farbreaktionen (mit oder ohne Zugabe von Reagenzien) bestimmt.1 Bei der Bestimmung von Staphylococcus-Spezies können die natürlichen Empfindlichkeitsmuster hilfreich sein. Nach der Inkubation werden die Platten untersucht. Dabei werden die Durchmesser der Hemmzonen um die Tabletten herum gemessen und anhand der Zoneninterpretationstabelle (empfindlich/resistent) für die jeweilige Tablette bestimmt. Die Empfindlichkeitsprüfungen auf Mueller-Hinton-Agar werden unter Verwendung von Deferoxamine 250 µg (Diatabs), Novobiocin 5 µg (Neo-Sensitabs) und Polymyxins 150 µg (Neo-Sensitabs) durchgeführt. 2, 3

Aufbewahrung 1) Verpackung sofort nach Erhalt in einem Kühlschrank bei 2 bis 8 °C lagern. 2) Nach Durchführung des ersten Tests sollten die Patronen mit Novobiocin 5 µg und Polymyxins 150 µg sowie das Glas mit Deferoxamine 250 µg möglichst bei Zimmertemperatur gelagert werden. Im Falle einer Aufbewahrung bei 2 bis 8 °C müssen diese Präparate vor dem Öffnen auf Zimmertemperatur angewärmt werden (½ bis 1 Std.). Die Präparate sind mit Zulassungsnr. (REF), Chargennr. (LOT) und Verwendbarkeitsdatum individuell gekennzeichnet. Das auf Testhalterungen/Patronen/Gläsern angegebene Verwendbarkeitsdatum gilt nur für verschlossene Behälter bei vorschriftsmäßiger Lagerung. Reagenzien Das Staph-zym Kit besteht aus einer Staph-zym Testhalterung mit zehn verschiedenen Tabletten mit 6 mm Durchmesser in Röhrchen zur Erkennung enzymatischer Aktivität sowie drei Tabletten mit 9 mm Durchmesser, bedruckt mit einem fünfstelligen Code, zur Empfindlichkeitsprüfung auf Agar. Vorsichtsmaßnahmen Befolgen Sie die Gebrauchsanweisung. Die Zuverlässigkeit von Staph-zym ist abhängig von der Verwendung eines geeigneten Inokulums, von der Inkubationszeit und von der korrekten Interpretation der Färbung bzw. der Zonendurchmesser. Zur Handhabung der 9-mm-Tabletten eine Pinzette verwenden. Das Produkt sollte ausschließlich von fachkundigem Laborpersonal verwendet werden. Es sind geeignete Vorsichtsmaßnahmen gegen mikrobielle Gefahren zu treffen, darunter die ordnungsgemäße Sterilisation von Proben, Behältern, Medien und Testhalterungen nach dem Gebrauch. Testhalterungen und Agar-Platten mit potentiellen Pathogenen sind als mikrobiologischer Müll zu entsorgen. Untersuchungsmaterial Mikrokokken (Furazolidon-resistent) werden von Staphylokokken mit Hilfe von Neo-Sensitabs mit Furazolidone 50 µg unterschieden. Nur Furazolidon-empfindliche Stämme (Staphylokokken) sollten weiter getestet werden. Bei Beschaffung und Handhabung des zu untersuchenden Probenmaterials sollten die geltenden Empfehlungen eingehalten werden. Bei dem Untersuchungsmaterial sollte es sich um eine Reinkultur handeln, die alle für die zu bestimmende Spezies typischen Eigenschaften aufweist.

Verfahren Mitgeliefertes Material: 20 Staph-zym Testhalterungen, 1 Kartusche mit Neo-Sensitabs Novobiocin 5 µg, 1 Kartusche mit NeoSensitabs Polymyxins 150 µg, 1 Glas mit Diatabs Deferoxamine 250 µg sowie ein "Staph-zym Testbericht" und ein "Staph-zym Humanindex". Nicht mitgeliefertes Arbeitsmaterial: Kulturmedien, Aminopeptidase reagent (Rosco #92231), N,N-Dimethyl-α-Naphthylamin, Sulfanillösung, Furazolidone 50 µg (Rosco #74412), Bakterienstämme zur Kontrolle sowie die für eine Identifikation erforderliche Laborausrüstung, z. B. Draht- oder Kunststoffösen, Wattetupfer, Pipetten und Entnahmebehälter.

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Rosco Diagnostica I. Gebrauchsanweisung I.1. Gebrauchsanweisung für Empfindlichkeitstests I.1.1. Vorbereiten des Inokulums Mehrere morphologisch gleichartige Kolonien von einer 18 bis 24 Std. lang inkubierten Agar-Platte (nicht selektives Agar) in 4 bis 5 ml 0,9%ige NaCl-Lösung suspendieren, bis eine Trübung entsprechend 0,5 McFarland erreicht wird. Falls ein teilweise zusammenhängendes Wachstum erwünscht ist, den 0,5-McFarland-Trübungsstandard 1:100 verdünnen. Bei Deferoxamine keinen Blut-Agar, sondern Mueller-Hinton-Agar verwenden. Standard-Empfindlichkeitsprüfung durchführen.2, 3

I.2 Gebrauchsanweisung für die Testhalterung I.2.1. Vorbereiten des Inokulums • Wählen Sie einige morphologisch gleichartige, gut isolierte Kolonien von der Hauptplatte (TSA + Blut) aus und suspendieren Sie diese in 3 ml physiologischer Kochsalzlösung (0,9 % NaCl), bis eine Trübung von mindestens 2 McFarland entsteht. • Nur frische Kulturen (18 bis 24 Std. alt) verwenden. • Führen Sie einen Reinheitstest mittels Abstrich auf einer nicht-selektiven Agar-Platte durch. I.2.2 Inokulation und Inkubation • Öffnen Sie den Deckel der Testhalterung und geben Sie in jedes der zehn Röhrchen 0,25 ml bakterielle Suspension. • In Röhrchen Nr. 7 geben Sie 3 Tropfen steriles Paraffinöl (ADH) hinzu. Schließen Sie dann den Deckel der Testhalterung, und achten Sie darauf, dass der Deckel über jedes Röhrchen fest gepresst wird (die zwei Griffe in entgegengesetzte Richtungen). • Über Nacht (18-24 Stunden) bei 35 bis 37 °C inkubieren, z. B. unter Verwendung eines Testreihentabletts. I.2.3. Ablesen der Reaktionen Die Interpretation der Reaktionen (positiv/negativ) erfolgt anhand eines Farbvergleichs mit dem "Staph-zym Testbericht", der der Verpackung beigelegt ist. • • • •

Öffnen Sie die eine Hälfte des flexiblen Deckels. Geben Sie in Röhrchen Nr. 9 (PYR) 3 Tropfen Aminopeptidase reagent (vor dem Ablesen 5 Minuten warten). Geben Sie in Röhrchen Nr. 8 (NO3) 1 Tropfen N,N-Dimethyl-αNaphthylaminlösung sowie 1 Tropfen Sulfanillösung. Schließen Sie dann den Deckel. Lesen Sie alle Reaktionen (1–10) ab. ALK P (Nr. 10) muss eine kräftige Gelbfärbung aufweisen, um als positiv eingestuft zu werden. Einzelheiten zur Interpretation der einzelnen Reaktionen (positiv/negativ) entnehmen Sie der Interpretationstabelle.

II. Ergebnisse •

• •

Die zehn Tests sind in drei Gruppen mit je drei Tests und eine Gruppe mit einem Test unterteilt. Negative Testergebnisse werden mit 0 bezeichnet. Positive Ergebnisse werden, nach Gruppen unterteilt, beim ersten Test (β-GLU, TRE, ADH und ALK P) mit 1, beim zweiten Test (ONPG, MAL und NO3) mit 2 und beim dritten Test (PGUA, URE und PYR) mit 4 bezeichnet (siehe Interpretationstabelle). Durch Addieren der Werte für die drei bzw. den einen Test erhält man für jede der vier Gruppen eine einstellige Zahl. Diese vier Ziffern werden nun aneinander gereiht. Anschließend wird eine fünfte Ziffer angefügt, die das Ergebnis der Empfindlichkeit bzw. Resistenz gegenüber Novobiocin 5 µg (NOVO-5), Polymyxins und Deferoxamine darstellt. Resistente Ergebnisse werden als negativ oder 0 verzeichnet, empfindliche Ergebnisse als positiv wie folgt: 1 für NOVO-5, 2 für Polymyxins und 4 für Deferoxamine. Diese fünfstellige Zahl stellt das "numerische Profil" des unbekannten Mikroorganismus dar. Zum Aufzeichnen und Berechnen des numerischen Profils verwenden Sie den "Staph-zym Testbericht". STAPH-ZYM TESTBERICHT

Beispiel: Test Positiv-Werte Ergebnisse SUMME der Positiv-Werte Empfindlich Resistent SUMME

β-GLU 1 +

ONPG 2 +

PGUA 4 0

TRE 1 0

3 NOVO-5 1 0 1= S(+)

MAL 2 +

UR 4 +

ADH 1 +

6 POLYMYXINS 2 0 2= S(+)

NO3 2 +

PYR 4 0

3 DEFEROXAMINE 4 0 4= S(+)

ALK P 1 + 1

Codezahl: 3631-7 Identifikation:

Vergleichen Sie das berechnete numerische Profil mit den Profilen des Staph-zym Index, der der Packung beiliegt. Codezahl/numerisches Profil: 36317 Identifikation: Staphylococcus epidermidis. 2/4


Rosco Diagnostica Unerwartete oder nicht eindeutige Ergebnisse: Es wird eine Wiederholung der Tests sowie das Testen der Kontrollstämme empfohlen. In einigen Fällen ist die Wiederholung der Tests an neuen Proben angezeigt. Alternativ kann der Stamm auch zur weiteren Identifizierung an ein Vergleichslabor gegeben werden. INTERNE QUALITÄTSKONTROLLE Um die Wirkungsfähigkeit von Staph-zym zu überprüfen, sollte eine Qualitätskontrolle unter Verwendung von ATCC-Stämmen oder anderen bekannten positiven bzw. negativen Stämmen durchgeführt werden. Solche Qualitätskontrollen sind gemäß anerkannter Qualitätsprüfungsverfahren für die Laborpraxis auszuführen. Die negativen bzw. positiven Testergebnisse für ATCC-Stämme sind in der nachfolgenden Tabelle vermerkt. Ergibt sich für den jeweiligen ATCC-Stamm ein korrektes numerisches Profil, so bedeutet dies, dass das Testverfahren fehlerfrei durchgeführt wurde. Staph-zym Vergleichstabelle zur Qualitätskontrolle Positiv-Werte ATCC-Stämme S. aureus ATCC 25923 S. epidermidis ATCC 12228 S. haemolyticus ATCC 29970

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

1

2

4

β-GLU

ONPG

PGUA

TRE

MAL

UR

ADH

NO3

PYR

ALK P

NOVO

POLY

DEF

+ + +

0 + 0

0 0 +

+ 0 +

+ + +

0 + 0

+ + +

+ + +

+ 0 +

+ + 0

S S S

R S S

R S R

Code 1371-1 3631-7 5370-3

Die in der Staph-zym Interpretationstabelle aufgeführten ATCC-Stämme sollten als Vergleichsstämme für die Qualitätskontrolle der Empfindlichkeitstest herangezogen werden. Abweichende Ergebnisse bei der Qualitätskontrolle sollten nicht in den Patientenbericht aufgenommen werden. VERFAHRENSBESCHRÄNKUNGEN DER TESTMETHODE • Staph-zym sollte ausschließlich zur Unterscheidung verschiedener Staphylokokken-Spezies verwendet werden. • Für die Tests sollten ausschließlich Reinkulturen verwendet werden, da gemischte Populationen von Mikroorganismen zu verfälschten Ergebnissen führen. • In einigen Fällen sind zur eindeutigen Identifikation zusätzliche Tests erforderlich (siehe Staph-zym Index). • Die Anwendung von Staph-zym zur Bestimmung von Mikroorganismen und die Interpretation der Ergebnisse setzen eine gute Kenntnis der allgemeinen mikrobiologischen Methoden und Verfahren voraus. Insbesondere sollte die Person, die diese Tests durchführt, auf ihr Wissen und ihre Erfahrung zurückgreifen können sowie alle über die Proben zugänglichen Informationen und die im Labor üblichen Verfahrensweisen berücksichtigen, bevor eine endgültige Aussage über die Identität des Isolats getroffen wird. • Die endgültige Aussage über die Identität kann durch weitere Tests beeinflusst werden.

LITERATURHINWEISE 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.

Gebrauchsanweisung für Neo-Sensitabs, www.rosco.dk User's Guide Neo-Sensitabs, www.rosco.dk User's Guide Diatabs, www.rosco.dk Casals J. B., Pringler N.: Staph-zym, a rapid identification system for staphylococci. Third European Congress of Clinical Microbiology, Den Haag, Mai 1987 Casals J. B., Pringler N.: The Value of 3 Tests in the Identification of Staphylococci: Pyrrolidonyl Aminopepetidase (PYR) and Susceptibility towards Polymyxins and Furazolidone, Staphylococci Symposium, Society for Applied Bacteriology, Edinburgh, Schottland, Juli 1989 De Paulis A. et al.: Five test simple scheme for species-level identification of clinically significant coagulase-negative staphylococi. J. Clin. Microbiol., 41, 1219-1224, 2003 Heltberg O., Bruun B.: Polymyxin susceptibility in Staphylococci differentiating coagulase-positive and coagulasenegative strains. Acta path. microbiol. immunol. Scand., sect B., 91, 157-161, 1983 Ieven M., Verhoeven J., Pattyn S. R., Goossens H.: Rapid and Economical Method for Species Identification of Clinically Significant Coagulase-Negative Staphylococci. J. Clin. Microbiol., 33, 1060-1063, 1995 Kloos W. E., Schleifer K. H.: Simplified scheme for routine identification of human staphylococcus species. J. Clin. Microbiol., 1, 82-88, 1975 Lämmler C.: Evaluation of the Staph-Zym-System for Identification of Staphylococcus hyicus and Staphylococcus intermedius. J. Vet. Med. B, 36, 180-184, 1989 Leung M. J. et al.: Case of Staphylococcus schleiferi Endocarditis and a Simple Scheme To Identify Clumping FactorPositive Staphylococci. J. Clin. Microbiol., 37, 3353-3356, 1999 Refsahl K., Andersen B. M.: Coagulase-negative staphylococci. Identification and antibacterial resistance. Nord. Med., 106, 228-231, 1991 (Norwegisch mit engl. Zusammenfassung) Renneberg J., Rieneck K., Gutschik E.: Evaluation of Staph ID 32 System and Staph-Zym System for Identification of Coagulase-Negative Staphylococci. J. Clin. Microbiol., 33, 1150-1153, 1995 Watts J. L., Washburn P. J.: Evaluation of the Staph-Zym System with Staphylococci Isolated from Bovine Intramammary Infections. J. Clin. Microbiol., 29, 59-61, 1991

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Rosco Diagnostica Staph-zym Interpretationstabelle Test Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Test Nr.

11 12 13

Reaktiver Wirkstoff (Wirkstoff je Tablette) Beta-Glucosidase (p-Nitrophenyl-β-D-Glucopyranosid 0,3 mg) Beta-Galactosidase (o-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranosid 0,4 mg) Beta-Glucuronidase (p-Nitrophenyl-β-D-Glucuronsäure 0,3 mg) Trehalose (D-Trehalosedihydrat 2 mg) Maltose (Maltosemonohydrat 3 mg) Urease (Harnstoff 8 mg) Arginine Dihydrolase (L-Arginin-HCl 3 mg) Nitrate Reduction (Natriummolybdat 40 µg, Kaliumnitrat 4 mg) Pyrrolidonyl Aminopeptidase (L-Pyrrolidonyl-β-Naphthylamid 0,2 mg) Alkaline Phosphatase (p-Nitrophenylphosphat 0,1 mg)

Wirkstoff und Konzentration

Novobiocin 5 µg Polymyxins 150 µg (Colistin) Deferoxamine 250 µg (Deferoxaminmesylat)

Code auf der Testhalterung

Reagens

Wert

Positive Reaktion

Negative Reaktion

β-GLU

-

1

Gelb

Farblos

ONPG

-

2

Gelb

Farblos

PGUA

-

4

Gelb

Farblos

TRE

-

1

MAL

-

2

Gelb (Gelborange) Gelb (Gelborange)

Rot (Orangerot) Rot (Orangerot)

UR

-

4

Rot/Purpurrot

Gelb/Orange

ADH

Öl

1

Rot/Purpurrot

Gelb/Orange

NO3

I

2

Rot/Rosa

Farblos (Hellrosa)

PYR

II

4

Rot

Gelb/Grün

ALK P

-

1

Kräftiges Gelb

Farblos (Hellgelb)

Wert

Zonendurchmesser

Zonendurchmesser

NOVO5

1

0,5 McFarland E R ≥ 14 mm) ≤ 13 mm)

teilweise zusammenhängend E R ≥ 16 mm ≤ 15 mm

CO150

2

≥ 14 mm)

≥ 16 mm

DEFRX

4

Code*

≤ 13 mm)

Kontrollzonen S. aureus E.coli ATCC ATCC 25923 25922 0,5 0,5 McFarland McFarland

18-25

≤ 15 mm

19-24

9 mm 9 mm > 9 mm a > 9 mm a (jede Zone) (keine Zone) (jede Zone) (keine Zone)

* Code auf der Tablette Reagens für die Zugabe vor der Inkubation: Öl: 3 Tropfen steriles Paraffinöl in das Röhrchen geben und dann den Deckel der Testhalterung schließen. Reagenzien für die Zugabe nach der Inkubation: I. 1 Tropfen N,N-Dimethyl-α-Naphthylamin und 1 Tropfen Sulfanillösung hinzugeben. Farbreaktion innerhalb 2 Minuten bestimmen. II. 3 Tropen Aminopeptidase reagent (Rosco #92231) hinzugeben und Farbreaktion innerhalb 5 Minuten bestimmen. Anmerkungen: a) Bei Deforoxamin-empfindlichen Stämmen ist häufig ein Wachstum kleinerer Kolonien innerhalb der Hemmzone beobachtbar. Diese sollten jedoch ignoriert und die Zone bis zur Wachstumsgrenze normal großer Kolonien gemessen werden.

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http://www.rosco.dk/pdf/IFU-Staph-zym-de-200407  

http://www.rosco.dk/pdf/IFU-Staph-zym-de-200407.pdf