Issuu on Google+

Działanie antybakteryjne szkieł bioaktywnych na istotne klinicznie bakterie beztlenowe in vitro Outi Leppäranta, Minna Vaahtio, Timo Peltola, Di Zhang, Leena Hupa, Mikko Hupa, Heimo Ylänen, Jukka I. Salonen, Matti K. Viljanen, Erkki Eerola Otrzymano: 18 października 2006r./Zaakceptowano: 27 marca 2007 / Opublikowano w internecie: 10 lipca 2007 © Springer Science+Business Media, LLC 2007

Streszczenie Zastosowanie kliniczne szkieł bioaktywnych (BAGs) zawierających różne składniki jest przedmiotem badań od dziesięcioleci, znaleziono dla nich wiele zastosowań w stomatologii i ortopedii. Wykazano również, że cząsteczkowe BAGs mają działanie antybakteryjne. Niniejsze badanie na dużą skalę udowadnia, że dwa bioaktywne szklane proszki (S53P4 oraz 13-93) oraz materiał opracowany metodą zol-żel (CaPSiO II) mają działanie antybakteryjne na 17 istotnych klinicznie gatunków bakterii beztlenowych. Wszystkie przebadane materiały wykazały działanie hamujące wzrost, chociaż ich stężenie i czas potrzebny do jego osiągnięcia różniły się w zależności od BAG. Szkło S53P4 wykazało silne działanie hamujące wzrost na wszystkie badane patogeny. Szkło 13-93 oraz materiał CaPSiO II opracowany metodą zol-żel wykazały umiarkowane właściwości antybakteryjne. Wprowadzenie Materiały bioaktywne są definiowane jako materiały wywołujące określoną biologiczną odpowiedź na powierzchni materiału i tkanki, powodującą tworzenia się wiązania pomiędzy nimi. Wiązania odzwierciedlają zdolność tych materiałów do reagowania w płynie ustrojowym oraz tworzenia kostnej, podobnej do minerału warstwy fosforanu wapnia na ich powierzchniach. Biokompatybilne, wiążące tkanki bioaktywne szkła (BAGs) zostały wprowadzone po raz pierwszy we wczesnych latach siedemdziesiątych. Podstawowymi składnikami większości szkieł bioaktywnych są SiO2, Na2O, CaO oraz P2O5, a zawartość procentowa tych tlenków jest różna w różnych szkłach. Od momentu wynalezienia bioszkła Bioglass® 45S5, prowadzone są rozległe studia nad licznymi szkłami oraz ceramiką szklaną dla określenia ich zastosowań klinicznych. Składy niektórych z nich zostały zastosowane jako materiały stałe i cząsteczkowe przy leczeniu wielu niepowiązanych ze sobą chorób klinicznych. Obecnie, BAGs znajdują zastosowanie zarówno w stomatologii, jak i w ortopedii.

Uprzednio wykazano, że szkło bioaktywne S53P4 ma działanie antybakteryjne na niektóre mikroorganizmy jamy ustnej. Niedawno, szkło S53P4 oraz inne BAGs wykazały podobne właściwości na wiele istotnych klinicznie patogenów tlenowych. Zasugerowano, że działanie antybakteryjne BAGs opiera się na kilku czynnikach, w tym, na wysokim pH oraz działaniu osmotycznym spowodowanym niefizjologicznym stężeniem jonów rozpuszczonych ze szkła., tzn., wpływ na działanie antybakteryjne szkła BAG ma jego skład chemiczny oraz warunki rozpuszczania w jego otoczeniu. W niniejszym obszernym badaniu oceniamy skuteczność antybakteryjną dwóch konwencjonalnych bioaktywnych szklanych proszków oraz materiału opracowanego metodą zol-żel na 17 istotnych klinicznie bakterii beztlenowych. W celu uzyskania wiarygodnych wyników ilość żywych bakterii wystawionych na działanie BAGs w każdej próbie był znormalizowany przez analizę zdolności przeżycia bakterii dokonywaną za pomocą metody szybkiej cytometrii. Materiały i metody Materiały Drobne proszki bioaktywnych szkieł S53P4 oraz 13-93 zostały wyprodukowane przez Process Chemistry Centre (Centrum Chemii Procesowej), Åbo Akademi University, Turku. Materiał CaPSiO II opracowany metodą zol-żel został wyprodukowany w Turku Biometerials Cetre (Centrum Biomateriałów w Turku), z zastosowaniem metody opisanej uprzednio. E-glass (obojętne szkło służące jako punkt odniesienia) uzyskano od Ahlstrӧm Glassfibre Oy (Karhula, Finlandia). Tabela 1 pokazuje składy szkieł. Szklane proszki odsiano tak, aby pozostały cząsteczki wielkości rzędu ≤ 45 μm. Mikroorganizmy i warunki kultury Zastosowane mikroorganizmy to Bacteroides fragilis (UK NEQAS, Sheffield, Zjednoczone Królestwo), Bacteroides

1


Thetaitaomicron ATCC 29741 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, Bifidobacterium adolescentis ATCC 15704, Clostridium difficile (fiński izolat kliniczny), Clostridium perfringens (fiński izolat kliniczny), Chlostridium septicum 105020 (Węgry), Eubacterium lentum AHP 6425 (zbiór kultur, Uniwersytet w Goteborgu, Szwecja), Fusobacterium nucleatum NCTC 10562 (National Collection of Type Cultures, Londyn, Zjednoczone Królestwo), Peptosctreptococcus anaerobius

AHC 5044 (zbiór kultur the National Public Health Institute (Krajowego Instytutu Zdrowia Publicznego), Finlandia), Porphyromonas gingivalis ATCC 35277, Prevotella intermedia ATCC 66563, Prevotella melaninogenica ATCC 25845, Propionibacterium acnes (fiński izolat kliniczny), Propionibacterium propionicus ATCC 14157, Staphylococcus epidermidis ATCC 14990, Veillonella parvula ATCC 10790.

Tabela 1 Skład chemiczny szkieł w Cp w/w

Szkło S53P4 13-93 CaPSiO II E-glass

Na2O 23,00 6,00 0,00 0,13

K2O 0,00 12,00 0,00 0,70

MgO 0,00 5,00 0,00 0,66

Wszystkie szczepy zostały wyhodowane w warunkach beztlenowych, tzn. w naczyniu zapewniającym warunki beztlenowe (anaerobic jar, Oxoid, Basingstoke, UK) wypełnionym mieszaniną gazów (80% N2, 10% H2 oraz 10% CO2). S. epidermidis została wyhodowana w bulionie tryptonowo-sojowym (LAB M, Bury, Zjednoczone Królestwo). Wszystkie pozostałe szczepy były hodowane w Fastitious Anaerobe Broth (bulion FAB) (LAB M). Przed użyciem, buliony zostały odtlenione w naczyniu zapewniającym warunki beztlenowe przez przynajmniej 24 godziny. Wzrost S. epidermidis został oceniony na szalkach agaru z krwią (podłoże agarowe z krwią (Pronadisa) wzbogacone 7,5% krwią owczą pozbawioną włóknika). Wzrost pozostałych szczepów oceniano na szalkach pokrytych menadionem-cysteiną (Podłoże agarowe z krwią (Pronadisa) wzbogacone 2 g/L glukozy, 5 g/L ekstraktem z drożdży (LAB M), 5% krwią owczą pozbawioną włóknika, 0,05% L-cysteiną HCl (Merck, Darmstadt, Niemcy) oraz 0,05 ppm menadionu (Merck)). Badanie zdolności przeżycia bakterii Bakterie wstępnie hodowano w odtlenionym bulionie w temperaturze 37º C przez 20-24 godziny. Zdolność przeżycia bakterii była monitorowana z pomocą metody cytometrii przepływowej poprzez barwienie za pomocą LIVE/DEAD® BacLightTM Bacterial Viability Kit (zestaw do badania zdolności przeżycia bakterii) (Molecular Probes, Eugene, OR). Pokrótce, próbka wyhodowanych wstępnie bakterii została najpierw 100-krotnie rozcieńczona w 0,9% NaCl. Następnie komórki zostały równocześnie zabarwione zielonym barwnikiem fluorescencyjnym do kwasów nukleinowych SYTO 9, który oznacza wszystkie bakterie w populacji, oraz czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym do kwasów

CaO 20,00 20,00 42,30 23,50

B2O3 0,00 0,00 0,00 6,40

P2O5 4,00 4,00 21,40 0,00

Al2O3 0,00 0,00 0,00 14,10

SiO2 53,00 53,00 36,30 53,90

nukleinowych jodkiem propidyny (PI), który wnika tylko do bakterii z naruszoną błoną komórkową. W wyniku tego, żywe bakterie zostały zabarwione na kolor zielony, a martwe - na czerwony. W celu dokładnego policzenia bakterii w próbkach zastosowano probówki TruCount® (Becton Dickinson, San Jose, CA) zawierające znaną liczbę fluorescencyjnych mikro-kulek. Badanie działania antymikrobowego Bakterie były hodowane wraz z proszkami BAG w celu oceny działania antybakteryjnego tych proszków. Rozcieńczona seria każdego szkła została przygotowana w odtlenionym bulionie w probówkach. Końcowe badane stężenia szkieł to 400, 200, 100 i 50 mg/mL bulionu. Proszki BAGs zostały najpierw wymieszane i odwirowane z bulionem, a mieszanki były odtleniane przez 2 h w naczyniu zapewniającym warunki beztlenowe. Do każdej probówki dodano 105-107 żywych bakterii. Zdolność przeżycia zawiesin bakteryjnych inkubowanych z różnymi stężeniami BAGs została oceniona przy użyciu szalek z agarem w postaci stałej. Po 24 godzinach hodowli w bulionie zawierającym BAG, na szalkach umieszczono po 10 μL zawiesin. Wzrost bakterii został oceniony po hodowli na szalkach z agarem w temperaturze +37 ºC przez 2-3 dni. Brak wzrostu na szalkach wskazywał na działanie bakteriobójcze, tzn. działanie antybakteryjne konkretnego BAG. Kultura mikroorganizmów bez dodatku proszku oraz kultura z obojętnym E-glass (400 mg/mL) zostały ujęte w każdej serii jako dodatnie próbki kontrolne. Wyniki Wszystkie trzy badane BAGs hamowały wzrost bakterii przy stężeniach wynoszących 400, 200, 100 oraz 50

2


mg/mL. Wpływ BAGs (400 mg/mL) na wzrost bakterii został przedstawiony w Tabeli 2, natomiast średni wpływ niższego stężenia BAGs (200 mg/mL) na wzrost bakterii został przedstawiony na Rys. 1. Zdolność przeżycia bakterii w hodowlach z BAGs została oceniona za pomocą naniesienia próbek na szalki zawierające agar w postaci stałej (patrz materiały i metody). Brak wzrostu na szalce () wskazywał działanie bakteriobójcze, tzn. działanie antybakteryjne konkretnego BAG. Niewielki albo umiarkowany wzrost, odpowiednio (+) oraz (++), wskazuje, że BAG ma działanie hamujące wzrost. Dobry wzrost (+++) na szalce wskazuje brak takiego działania. Działanie różniło się również w zależności od gatunku bakterii, jednak nie zauważono żadnej istotnej różnicy pomiędzy bakteriami gram-dodatnimi a gram-ujemnymi. Szkło S53P4 było najskuteczniejszym BAG, jako że wykazywało wyraźnie działanie hamujące wzrost, nawet na najbardziej odporne patogeny (Tabela 2). Jak widać w Tabeli 2, BAG S53P4 ogólnie miało najszybsze działanie bakteriobójcze oraz hamujące wzrost. Miało również właściwości antybakteryjne w mniejszych stężeniach niż pozostałe BAGs (dane niezamieszczone w publikacji). Tabela 2 pokazuje również, że podczas gdy BAG S53P4 miało wpływ na wzrost wszystkich badanych bakterii, szkła 13-93 oraz CaPSiO II wykazały umiarkowane właściwości antybakteryjne. E-glass (dodatnia próbka kontrolna) nie miała żadnego wpływu na wzrost bakterii. W obecności jakiegokolwiek BAG, nawet w najniższych stężeniach, P. intermedia oraz P. melaninogenica zginęły po 24 godzinach inkubacji, a V. parvula po 72 godzinach inkubacji. B. adolescentis straciła zdolność przeżycia w obecności BAGs przy stężeniu wynoszącym 100 mg.mL (Rys. 2a). Tabela 2 Wpływ BAGs (400 mg/mL) na wzrost bakterii w punktach czasu 1 d/3 d S53P4 13-93 CaPSiO II

B. fragilis B. thetaiotaomicron B. adolescentis C. difficile C. perfringens C. septicum E. lentum* F. necrophorum F. nucleatum P. anaerobius P. gingivalis P. intermedia P. melaninogenica P. acnes P. propionicus S. epidermidis ** V. parvula

nd/+/-/-/+/++/+ -/++/-/-/-/-/-/-/+/+/+/-

nd/+++ +++/nd +/+++/++ +++/+++ +++/++ +++/+++ +++/++ ++/+++/+++ -/-/-/+/+/+++ nd +/-

nd/+++ ++/+++ +/++/++ ++/+++ +/++ -/-/+++ +++/+++ ++/++ +/-/-/-/+/+++ +/+ +/-

-, Brak wzrostu; +, niewielki wzrost; ++ Umiarkowany wzrost; +++ Dobry wzrost; nd - nie wykonano badania *2 d/7d ** 1 d/4 d (100 mg/mL)

Średni wzrost 16 gatunków bakterii, 200 mg BAG / mL bulionu

[opis: Bacterial growth (score) - wzrost bakterii (wynik); time (days) czas (dni)] Rys. 1. Działanie BAGs na wzrost 16 patogenów, 3 = dobry wzrost (próbka dodatnia), 2 = umiarkowany wzrost, 1 = słaby wzrost, 0 = brak wzrostu

Wszystkie trzy BAGs zabiły P. acnes nawet przy najniższych stężeniach. W trakcie 7-dniowego eksperymentu, P. propionicus straciła zdolność przeżycia po wystawieniu na działanie 400 mg/mL szkła S53P4 lub 13-93. Przy takim samym stężeniu, CaPSiO II miało działanie bakteriostatyczne na tą bakterię. Clostridium sp. stanowi grupę bardzo odpornych bakterii. Szkło S53P4 miało działanie bakteriobójcze na C. perfringens, natomiast pozostałe BAGs nie miały żadnego wpływu na jej wzrost. Wszystkie BAGs miały działanie hamujące wzrost C. difficile oraz C. septicum. CaPSiO II miało działanie bakteriostatyczne na Fusobecterium sp. F. nucleatum została zabita przy inkubacji z 100 mg/mL S53P4 lub 13-93 (Rys. 2b). F. necrophorum została zabita po siedmiu dniach inkubacji w obecności 100mg/mL BAG S53P4 lub 400 mg/mL BAG 13-93. Bacteroides fragilis starciła zdolność przeżycia w obecności S53P4, natomiast pozostałe BAGs miały minimalne działanie bakteriostatyczne. B. thetaiotaomicron została zabita przez wszystkie trzy BAGs po 7 dniach inkubacji. Szkło 13-93 nie miało żadnego wpływu na wzrost P. anaerobius lub E. lentum. CaPSiO II miało działanie bakteriostatyczne, a S53P4 działanie bakteriobójcze na P. anaerobius. Przy stężeniu 400 mg/mL, wzrost E. lentum został całkowicie zahamowany zarówno przez S53P4, jak i CaPSiO II po 48 godzinach inkubacji. Wystawienie na działanie 100 mg/mL S53P4 zabiło S. epidermidis, natomiast, przy tym samym stężeniu, CaPSiO II tylko zmniejszyło liczbę jednostek tworzących kolonię (CFUs). Porphyromonas gingivalis zginęła po 24 godzinach wystawienia na działanie 50 mg/mL S53P4 lub 13-93, oraz po 48 godzinach inkubacji w obecności 400 mg/mL CaPSiO II.

3


Omówienie Przebadaliśmy bakteriobójcze właściwości dwóch konwencjonalnych szkieł bioaktywnych oraz jednego materiału opracowanego metodą zol-żel. Siedemnaście istotnych klinicznie gatunków bakterii beztlenowych hodowano wraz z czterema stężeniami BAGs. Wszystkie badane materiały hamowały wzrost bakterii. Szczepy beztlenowe wybrane na potrzeby badania zawierały najczęściej spotykane, ważne patogeny beztlenowe. Co więcej, wybrano niektóre niepatogenne bakterie (B. adolescentis, E. lentum, P. acnes oraz V. parvula) obecne w jamie ustnej, na skórze oraz w prawidłowej florze jelitowej. Gatunki te to bakterie beztlenowe, które z największym prawdopodobieństwem zostałyby wzięte pod uwagę przy opracowywania klinicznego zastosowania szkieł.

[opis: Bacterial growth (score) - wzrost bakterii (wynik); time (days) czas (dni)] Rys. 2 (a) Działanie 100 mg BAG/mL na Bifidobacterium adolescentis, (b) Działanie 100 mg BAG/mL na Fusobacterium nucleatum

Końcowe stężenia szkieł w niniejszym badaniu zostały wybrane na podstawie wcześniejszych wyników. W zastosowaniach klinicznych, można używać różnych stężeń BAGs. Na przykład, Stoor i in. naśladowali skład stosowany do leczenia nadwrażliwości zębów z płynem zawierającym 1,67 g BAG S53P4/mL, a nawet wyższe stężenia 45S5 Bioglass® zastosowano w eksperymentach Allana i in. Badanie to pokazuje, że BAGs mają właściwości antybakteryjne również przy niższych stężeniach.

W roztworach wodnych, rozpuszczanie sieci cząsteczek szkła jest szybkie aż do momentu, gdy roztwór nasyci się w stosunku do krzemu. Uwolnienie jonów modyfikujących sieć prowadzi do wzrostu pH na styku powierzchni. Rozpuszczanie zwiększa również ciśnienie osmotyczne w pobliżu BAG. Skład chemiczny szkła, a także warunki w jego otoczeniu, mają wpływ na rozpuszczanie jego sieci cząsteczek. Może to tłumaczyć przynajmniej niektóre różnice w działaniu antybakteryjnym szkieł BAG mających różny skład chemiczny. Zachowanie przy rozpuszczaniu szkieł S53P4 oraz 13-93 jest badane przez Zhanga i in. Uprzednio opublikowane zostały również wyniki badań nad uwalnianiem jonów materiału CaPSiO II opracowanego metodą zol-żel. BAG S53P4 ma wyraźne działanie hamujące wzrost na wszystkie badane patogeny. Potwierdza to wyniki uzyskane w poprzednich badaniach, które wykazały, że cząsteczkowe S53P4 ma właściwości antybakteryjne na niektóre bakterie jamy ustnej, a także na wiele innych istotnych klinicznie bakterii tlenowych. W naszym eksperymencie, mieszanki BAGs oraz bulionów były odtlenione przed badaniami określającymi ich działanie antybakteryjne. Krok ten usuwa cały tlen związany w materiałach, a te zmienione warunki mogą mieć wpływ na rozpuszczalność szkła BAG. Materiały opracowane metodą zol-żel są bardzo porowate. Z powodu porowatej struktury, w materiałach opracowanych metodą zol-żel jest więcej związanego tlenu niż w innych BAGs. W warunkach beztlenowych, CaPSiO II w minimalnym stopniu wpłynęło na wzrost pH roztworu (M. Vaahtio, nieopublikowane dane). Dokładne mechanizmy działania antybakteryjnego BAGs nie są znane. Sugerowano, że ma na nie wpływ kilka czynników, w tym wysokie pH oraz działanie osmotyczne spowodowane niefizjologicznym stężeniem jonów rozpuszczonych ze szkła. Zatem, wpływ niskiego pH CaPSiO II w warunkach beztlenowych może, przynajmniej częściowo, być przyczyną jego stosunkowo słabego działania antybakteryjnego na bakterie beztlenowe, w porównaniu z jego silnym działaniem bakteriobójczym na bakterie tlenowe. Szkło 13-93 wykazało umiarkowane działanie bakteriobójcze. Jak dotąd, jego rozpuszczalność w warunkach beztlenowych nie została przebadana. Ogólnie, działanie antybakteryjne wszystkich przebadanych szkieł BAG było wolniejsze i słabsze w warunkach beztlenowych, niż w tlenowych. Praktycznie wszystkie układy użyte przy badaniu właściwości antybakteryjnych różnych substancji były bardzo wrażliwe na działanie wszczepienia, tzn. ilość żywych bakterii wystawionych na działanie materiałów ma wpływ na wyniki. W celu zminimalizowania odchyleń,

4


zabarwiliśmy bakterie dwoma barwnikami (SYTO 9 oraz PI) i przeanalizowaliśmy zabarwione bakterie za pomocą FCM, co pomogło rozróżnić bakterie żywe od bakterii martwych. Metoda cytometryczna umożliwiła nam wyrównanie ilości bakterii zaszczepionych w każdym podejściu i w ten sposób sprawiła, że wyniki stały się bardziej wiarygodne. W niektórych wcześniejszych badaniach wykazano, że szkło BAG ma właściwości antybakteryjne wyłącznie, jeśli zawiera ono srebro. Na przykład, w badaniu przeprowadzonym przez Cauro i in. bakterie miały kontakt z BAG tylko przez bardzo krótki czas, a brak rozpuszczenia sieci cząsteczek szkła może wyjaśniać jego wyniki. Działanie antybakteryjne srebra jest szeroko znane - jest ono stosowane w medycynie jako środek antymikrobowy od wieków. Bakterie wykazują niewielką skłonność rozwijania odporności na produkty zawierające szkło, jednak istnieją informacje, że istnieją bakterie odporne na działanie szkła, a powszechne stosowanie srebra może spowodować, że więcej bakterii rozwinie odporność, podobnie jak było to w przypadku bakterii odpornych na działanie antybiotyków. Zaletą S53P4, CaPSiO II oraz 13-93 jest to, że substancje chemiczne, z których się one składają można znaleźć w ciele, co może zmniejszyć prawdopodobieństwo rozwinięcia przez bakterie odporności na te substancje. Możliwość przylegania bakterii jest istotnym problemem dotyczącym stosowania protez oraz innych elementów medycznych wprowadzanych do ciała. Kilka badań wykazało, że szkła BAG mają działanie bakteriobójcze zarówno na bakterie tlenowe, jak i beztlenowe. Dlatego też wydaje się oczywiste, że działanie antybakteryjne badanych szkieł BAG obejmuje dużą grupę klinicznie istotnych patogenów. Modyfikacje na powierzchniach protez oraz innych elementów medycznych, np., poprzez pokrywanie ich powierzchni odpowiednim szkłem BAG, może zapobiegać przyleganiu bakterii i w ten sposób zapobiegać infekcjom tkanek znajdujących się wokół. Na przykład, istnieją wstępne wyniki sugerujące, że pokrycie powierzchni warstwą szkła bioaktywnego zawierającego srebro zmniejsza przyleganie bakterii do struktur chirurgicznych.

skutecznym, hamującym wzrost wszystkich badanych patogenów. BAG 13-93 oraz materiał CaPSiO II opracowany metodą zol-żel wykazały umiarkowane działanie bakteriobójcze. Ogólnie, antybakteryjne działanie wszystkich badanych BAGs było wolniejsze i słabsze w przypadku warunków beztlenowych, niż warunków tlenowych. Mechanizm działania antybakteryjnego BAGs opera się prawdopodobnie na połączeniu kilku czynników, w tym wysokiego pH oraz działania osmotycznego spowodowanego rozpuszczaniem sieci cząsteczek szkła oraz jonów modyfikujących sieć. Dla uzyskania wiarygodnych wyników, ilość żywych bakterii wystawionych na działanie BAGs w każdej turze została znormalizowana poprzez analizę zdolności przeżycia bakterii za pomocą metody szybkiej cytometrii przepływowej. Podziękowania Niniejsze badanie było wspierane przez Krajową Agencję Technologii Finlandii (the National Technology Agency of Finland - TEKES).

Wnioski Odkryto, że dwa konwencjonalne szkła bioaktywne (S53P4 oraz 13-93) , a także materiał opracowany metodą zol-żel (CaPSiO II) hamują wzrost szerokiej grupy istotnych klinicznie patogenów beztlenowych. Działanie antybakteryjne tych materiałów było różne, w zależności od gatunku bakterii, jednak nie istniała żadna znaczna różnica pomiędzy gatunkami gram-dodatnimi a gramujemnymi. BAG S53P4 było materiałem najbardziej

5


Działanie antybakteryjne szkieł bioaktywnych na istotne kliniczniebakterie beztlenowe in vitro