Page 1

Działanie antybakteryjne bioszkła cząsteczkowego na bakterie naddziąsłowe i poddziąsłowe I. Allan a,*, H. Nowemanb, M. Wilsona a

Wydział Mikrobiologii, Eastman Dental Institute, Univesrity College London, 256 Gray's Inn Road, Londyn, WC1X 8LD, Zjednoczone Królestwo b Centrum Badań Klinicznych, International Centre for Excellence in Dentistry, Londyn, UK

Pracę nadesłano 6 lipca 2000; przyjęto do druku 10 października 2000

Streszczenie Bioszkło cząsteczkowe to materiał bioaktywny stosowany do wypełnień do ubytków przyzębia. Materiał ten poddawany jest serii reakcji powierzchniowych w środowisku wodnym, co prowadzi do osseointegracji. Celem niniejszego badania było stwierdzenie, czy te reakcje mogą wykazywać działanie antybakteryjne antybakteryjne na spektrum bakterii jamy ustnej. Streptococcus sanguis, Streptococcus mutans oraz Actinomyces viscocus zostały zawieszone w pożywce bulionowej (NB), sztucznej ślinie (AS) lub modyfikowanej pożywce hodowlanej Eagla plus 10% płodowa surowica cielęca (DMEM + 10% FCS), z zastosowaniem bioszkła cząsteczkowego Bioglass® lub bez. Wszystkie bakterie wykazały zmniejszoną zdolność przeżycia po narażeniu na działanie bioszkła Bioglass ® we wszystkich środkach po 1 godzinie. Działanie antybakteryjne nasiliło się po 3 godzinach. Parphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia oraz Actinobacillus actinomycetemcomitans zostały zawieszone albo w BM broth (pożywce bulionowej) lub w 40% surowicy końskiej (HS) na podłożu RPMI. Zauważono znacznie ograniczoną zdolność przeżycia wszystkich bakterii badanych w obydwu podłożach, w porównaniu z kontrolnym próbkami szkła obojętnego. W dalszych eksperymentach odkryto, że zdolność przeżycia S. sanguis znacznie zmniejszyła się po wystawieniu na działanie NB preinkubowanej w Bioszkle®. Co więcej, odkryto, że neutralizacja tego bardzo zasadowego roztworu zlikwidowała działanie antybakteryjne. Ponadto, roztwór NB i NaOH (o takim samym pH) wywołał działanie bakteryjne o podobnym nasileniu, jak roztwór preinkubowany w Bioglass ®. Dlatego też bioszło cząsteczkowe Bioglass ® ma działanie antybakteryjne na pewne bakterie jamy ustnej, prawdopodobnie dzięki zasadowej naturze reakcji na jego powierzchni. Może to zmniejszać kolonizację jego powierzchni przez bakterie in vivo. Kluczowe słowa: Szkło bioaktywne; Implant; Przyzębie, Antybakteryjny

1. Wprowadzenie 45S5 Bioglass to bioaktywny materiał, implantowy, który stymuluje proces naprawczy kości. W środowisku wodnym materiał ten przechodzi szereg reakcji powierzchniowych, które powodują tworzenie się warstwy powierzchniowej z hydroksowęglanoapatytu (HCA). To właśnie tworzenie się tej warstwy wspólnie z uwalnianiem rozpuszczalnego dwutlenku krzemu prowadzi do przyczepiania się i rozrastania osteoblastów na powierzchni szkła oraz osseointegracji. Zapalenie przyzębia może powodować tworzenie się ubytków kostnych przyzębia. Takie ubytki są leczone

autogennymi przeszczepami kostnymi oraz alloprzeszczepami, sterowaną regeneracją tkanek oraz połączeniem sterowanej regeneracji tkanek i wszczepu allogennego kości liofilizowanej odwapnionej. Jednakże zastosowanie kości autogennej wymaga ingerencji chirurgicznej w inny miejscu ciała, okazało się, że wszczepy allogenne w niewielkim stopniu przyczyniają się do wzrostu kości, a rezultaty sterowanej regeneracji kości mogą być nieprzewidywalne. Bioglass® oraz niniejszy preparat znany jest pod nazwą handlową Perioglass®. Próby kliniczne, które trwały 1 rok, wykazały, że po zastosowaniu bioszkła cząsteczkowego Bioglass ® po chirurgicznym opracowaniu rany (wygładzanie korzenia zęba oraz usunięcie tkanki objętej długotrwałym stanem zapalnym) spowodowało większe wypełnienie ubytku przyzębia niż po zastosowaniu wyłącznie chirurgicznego opracowania rany.


2. Materiały i metody

godzin w temperaturze 37ºC. Po inkubacji, do każdej probówki dodano 950 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (phosphate buffered salina - PBS) (Oxoid), aby ułatwić liczenie żywych komórek bakterii. Następnie próbki były przez 1 minutę odwirowywane, aby obruszyć przylegające bakterie. Liczenie żywych bakterii było przeprowadzane przez wielokrotne rozcieńczane w PBS oraz nakładanie na szalki z pożywką TSA (tryptone-soja-agar) (Oxoid) z inkubacją w warunkach aerobowych na okres 48 godz. w temperaturze 37º C. Otrzymane kolonie zostały policzone, a ilość martwych bakterii została obliczona w procentach w odniesieniu do próbek zawierających bioszkło Bioglass®.

2.1. Cząsteczki stałe

2.4. Inkubacja kultur ze szkłem bioaktywnym

Do badań nad zdolnością przeżycia typowych mikroorganizmów naddziąsłowych i poddziąsłowych zastosowano bioszkła cząsteczkowe Bioglass® 45S5 o wielkości uziarnienia wynoszącej odpowiednio 90-719 μm oraz 355-500 μm (US Biomaterials, Floryda, USA). Do badań nad bakteriami poddziąsłowymi, jako dodatkową próbkę kontrolną, zastosowano cząsteczki szkła o wielkości uziarnienia wynoszącej 455-600 μm (Sigma, Poole, Zjednoczone Królestwo).

2.4.1. Eksperymenty na bakteriach poddziąsłowych

Zastosowanie implantów w ciele wiąże się z ryzykiem kolonizacji bakteryjnej tych materiałów, a następnie nieprzyjęciem się implantów. Ponadto, bakterie powiązane z chorobą przyzębia związane są również z nieprzyjęciem się implantów. Jednakże niektóre szkła bioaktywne wykazują pewne działanie antybakteryjne po wystawieniu ich na działanie bakterii. To działanie antybakteryjne może być spowodowane przez jedną z reakcji powierzchniowych, którym zostały poddane. Celem niniejszego badania było określenie działania bioszkła cząsteczkowego Bioglass ® 45S5 na zdolność przeżycia różnych bakterii jamy ustnej.

2.2. Hodowla bakterii W badaniach zastosowano typowe bakterie poddziąsłowe, S. sanguis NCTC 10904, S. mutans NCTC 10449 oraz A. viscosus NCTC 10951. Były one hodowane przez 24 godziny w warunkach aerobowych w NB (Oxoid, Basingstoke, Zjednoczone Królewstwo) w temperaturze 37º C do stężenia rzędu 106-107 CFU/ml. Następnie z wyhodowanej kultury bakterii pobrano 1 ml, odwirowano przez 10 minut, przemyto i ponownie zawieszono w 1 ml NB, AS lub DMEM (z glutaminianem sodu, bez Lglutaminy) + 10% FCS (GibcoBtl, Paisley, Zjednoczone Królestwo). W badaniach zastosowano typowe bakterie poddziąsłowych A. actinomycetemcomitans NCTC 9710, P. gingivalis W50, F. nucleatum ATCC 51190 oraz P. intermedia (izolat kliniczny, szczep DS102) Były one hodowane w pożywce bulionowej w warunkach anaerobowych w temperaturze 37º C przez 48 godzin. Kultury były następnie przez 10 minut odwirowywane, raz przemyte i ponownie zawieszone w 1 ml 40% HS (Oxoid) na podłożu RMPI (bez czerwieni fenolowej, z Lglutaminą) (Sigma). pH zawiesin było mierzone pHmetrem (pH Boy-P2, Camlab, Cambridge, Zjednoczone Królestwo). 2.3. Inkubacja kultur ze szkłem bioaktywnym 2.3.1. Eksperymenty na bakteriach poddziąsłowych Kultury w NB, AS lub DMEM + 10% FCS zostały zawieszone w 50μl w krio-probówkach zawierających 0,05g szkła cząsteczkowego Bioglass® (90710 μm). Następnie były one inkubowane przez 1-3

Kultury w BM lub 40% HS w RPMI zostały zawieszone w 50μl obj. w krio-probówkach zawierających 0,1g bioszkła cząsteczkowego Bioglass® (355-500μm), lub 0,1g szklanych kulek (455-600μm), lub nie zawierających kuleczki. Następnie kultury inkubowano w warunkach anaerobowych przez 1 godz. w temperaturze 37º C. Próbki odwirowano, jak wyżej, i wielokrotnie rozcieńczano w BM przed nałożeniem ich na szalki z agarem z krwią (Blood Agar No. 2, Oxoid, 7% końska krew pozbawiona włóknika, Oxoid). Szalki były inkubowane w warunkach beztlenowych przez 10 dni (2 dni dla A. actinomycetemcomitans) w temperaturze 37º C. Otrzymane kolonie zostały policzone, a ilość martwych bakterii została obliczona w procentach w odniesieniu do próbek zawierających bioszkło Bioglass® lub szklane kuleczki. 2.5. Właściwości antybakteryjne supernatantów z bioszkła Bioglass® Pojemniki zawierały 5 g bioszkła cząsteczkowego Bioglass® (355-500 μm), 5 g cząsteczek szkła (455-600 μm) lub nie zawierały cząsteczek. Następnie dodano sterylną NB (10 ml) a zawartość mieszano za pomocą wirówki wieloosiowej przez 1 godz. w temperaturze 37º C. Wybór 5 g i 10 ml odpowiednio dla cząsteczek i pożywek zastosowano, aby umożliwić odzyskanie odpowiednich objętości supernatantów po mieszaniu. Po okresie 1godzinnego okresu inkubacji, 950 μl supernatantu pobrano i dodano do probówek zawierających 50 μl kultur S. sanguis, które powstały w ciągu nocy. Kultury zawierające supernatanty z Bioglass® były następnie inkubowane w NB, naniesione na szalki z pożywką TSA i inkubowane w warunkach tlenowych przez 1 godz. w temperaturze 37º C. Następnie kultury były wielokrotnie rozcieńczane w NB, naniesione na szalki z pożywką TSA i inkubowane w warunkach tlenowych w 37º C przez 48 godz. Otrzymane kolonie zostały policzone i przedstawione w jednostkach tworzących kolonie (CFU)/ml.


2.6. Wpływ korekty pH na właściwości antybakteryjne supernatantów z Bioglass® Supernatanty z Bioglass® wyprodukowano za pomocą metody opisanej powyżej. pH supernatantów zmierzono, a po tym, jak odkryto, że stale wynosi ono 9,8, i zebrano je w jednym pojemniku. Następnie do plastikowych wyjałowionych pojemników odmierzono po 1 mililitrze płynu. W jednym zestawie replik zredukowano pH poprzez dodanie 35 μl 1 M HCl aby na końcu uzyskać pH wynoszące 7,2, które jest takie samo jak pH NB. Do jednego zestawu supernatantów z Bioglass® dodano 35 μl 1 M NaCl. pH pozostało na poziomie 9,8. Dodanie NaCl posłużyło jako próba kontrolna dla dodatku jonów chlorku (w postaci HCl) w supernatantach ze skorygowanym pH. Jako próbę negatywną wprowadzono NB zamiast supernatantów Bioglass®. Jako próbę pozytywną, dodano 1 M NaOH do NB do końcowego pH wynoszącego 9,8: następnie dodano 950 μl obj. roztworów do krio-probówek zawierających 50 μl kultury S. sanguis, która powstała przez noc, a eksperyment kontynuowano zgodnie z powyższym opisem. 3. Wyniki 3.1. Inkubacja kultur ze szkłem bioaktywnym 3.1.1. Eksperymenty na bakteriach naddziąsłowych S. sanguis, S. mutans oraz A. viscosus inkubowały ze szkłem cząsteczkowym Bioglass® lub bez cząsteczek w NB, DMEM + 10% FCS lub AS przez 1 lub 3 godz. Szkło cząsteczkowe Bioglass® miało działanie antybakteryjne na te trzy gatunki bakterii zawieszonych we wszystkich pożywkach. Działanie to było silniejsze po wystawieniu bakterii na działanie szkła na 3 godziny. Po 1 godz. zaobserwowano mniejsze działanie antybakteryjne na bakterie zawieszone w DMEM + 10% FCS w porównaniu z innymi pożywkami, jednak zdolność przeżycia bakterii zmniejszyła się jeszcze po 3 godzinach. Nie zaobserwowano zmniejszenia zdolności przeżycia bakterii w próbach kontrolnych bez cząsteczek po 1 ani po 3 godzinach. Tabela 1 ukazuje odsetek martwych bakterii po 1 i 3 godzinach. Po 1 godzinie średni odsetek martwych bakterii wszystkich trzech gatunków wynosił w przybliżeniu 93% w NB, 85% w AS i 65% w DMEM + 10% FCS. Po trzech godzinach, średni odsetek martwych bakterii wynosił w przybliżeniu 99% dla NB, 98% dla AS i 93% dla DME + 10% FCS.

Cząsteczki bioszkła Bioglass® miały znaczące działanie antybakteryjne na wszystkie badane bakterie poddziąsłowe, odsetek martwych bakterii Prev. Intermedia wyniósł 100%. Jednak, w niektórych przypadkach, odnotowano spadek zdolności przeżycia przy obecności cząsteczek szkła. Zjawisko to najczęściej występowało w próbach z P. gingivalis oraz Prev. intermedia. Odkryto, że zmniejszenia zdolności przeżycia w BM było większe niż to w 40% HS w RPMI. Tabela 1. Odsetek martwych bakterii naddziąsłowych po wystawieniu ich na działanie cząsteczek bioszkła Bioglass® Bakteria i pożywka

S. sanguis + NB S. sanguis + DMEM + 10% FCS S. sanguis + AS S. mutans + NB S. mutans + DMEM + 10% FCS S. mutans + AS A. viscosus + NB A. viscosus + DMEM + 10% FCS A. viscosus + AS

% martwych bakterii 1 godz. 98,0 71,1 65,8 83,1 51,5 94,4 97,3 72,7 96,2

Tabela 2. Odsetek martwych bakterii poddziąsłowych po wystawieniu ich na działanie cząsteczek bioszkła Bioglass® Bakteria

P. gingivalis F. nucleatum Prev. intermedia A. actinomycetemcomitans

% martwych bakterii BM 4-% HS w RPMI Bioglass® szkło Bioglass® szkło 91,2 62,3 Brak Brak danych danych 95,0 14,7 85,9 0,9 100 48,8 Brak Brak danych danych 98,6 8,0 87,9 4,8

3.2. Inkubacja kultur w szkle bioaktywnym 3.2.1. Eksperymenty na bakteriach poddziąsłowych Odsetki martwych bakterii P. gingivalis, F. nucleatum, Prev. intermedia oraz A. actinomycetemcomitans po wystawieniu ich na działanie szkła cząsteczkowego Bioglass®, cząsteczek szkła lub w próbce bez żadnych cząsteczek w BM ukazane zostały w Tabeli 2.

3 godz. 99,5 99,9 94,4 97,3 79,1 98,4 99,5 99,9 99,6

Tabela 3. Pomiary pH zawiesiny pożywki + Bioglass®


Pożywka NB AS BM 40% HS w RPMI DMEM + 10% FCS

Czas (godz.) 0 1 7,2 10,3 6,6 10,1 6,5 10,1 7,7 10,4 8,1 10,0

3 10,0 10,2 10,1 10,3 10,2

3.3. Pomiary pH Wartości pH w każdym odstępie czasowym zostały ukazane w Tabeli 3. Wartości dla 0 godz. przedstawiają wartości pH pożywki przed dodaniem cząsteczek. 3.4. Właściwości antybakteryjne supernatantów Bioglass® Wykres 1 przedstawia zdolność przeżycia S. sanguis po inkubacji w supernatantach pochodzących z mieszanek z bioszkła Bioglass® oraz cząsteczek szkła w NB. Zaobserwowano statystycznie istotne zmniejszenie (p < 0,01) zdolności przeżycia S. sanguis po wystawieniu ich na działanie supernatantów wyprodukowanych z bioszkła Bioglass® oraz NB, w porównaniu z próbkami kontrolnymi. Średnia liczba żywych kultur wystawionych na działanie supernatantów z Bioglass® / NB wynosiła w przybliżeniu 3,8 ± 1,6 x 104 CFU / ml. Średnia liczba żywych kultur wystawionych na działanie supernatantów ze szkła/NB wynosiła w przybliżeniu 9,9 ± 3,6 x 106 CFU / ml oraz 8,2 ± 2,8 x 106 CFU / ml. Oznacza to, że odsetek martwych bakterii S. sanguis jest większy niż 99%, kiedy są one narażone na działanie supernatantów pochodzących z Bioglass® / NB. Nie odnotowano istotnej różnicy pomiędzy cząsteczkami szkła w NB oraz samym NB.

Wpływ korekty pH supernatantów Bioglass® na zdolność przeżycia S. sanguis

Bioglass® bez korekty pH Bioglass® + HCl Bioglass® + NaCl NB + NaOH

martwe bakterie w% 91,1 31,5 91,7 97,2

3.5. Wpływ korekty pH na działanie antybakteryjne supernatantów z Bioglass® Tabela 4 ukazuje wpływ korekty pH supernatantów na zdolność przeżycia S. sanguis. Zmniejszenie pH supernatantów do takiego samego jak w przypadku NB (pH 7,2) poprzez dodanie HCl zniosło działanie antybakteryjne. Średnia liczba żywych kultur w NB wynosiła w przybliżeniu 2,6 ± 0,8 x 107 CFU / ml, natomiast średnia liczba żywych kultur z supernatantów z Bioglass® skorygowanego HCl wynosiła w przybliżeniu 1,8 ± 0,5 x 107 CFU / ml. Różnice te nie były istotne (p < 0,01). Średnia liczba żywych kultur w nieskorygowanych supernatantach Bioglass® / NB wynosiła w przybliżeniu 2,3 ± 0,6 x 106 CFU / ml. Dodanie NaCl do supernatantów z Bioglass® nie miało znaczącego wpływu na ich działanie antybakteryjne, gdzie średnia liczba żywych kultur dla tak uzyskanych supernatantów wynosiła w przybliżeniu 2,2 ± 0,4 x 106 CFU / ml. Podniesienie wartości pH NB, poprzez dodanie NaOH, do takich samych wartości, jak te odnotowane dla supernatantów z Bioglass®, spowodowało zaobserwowanie działania antybakteryjnego, gdzie średnia liczba żywych kultur wynosiła w przybliżeniu 7.4 ± 5,0 x 105 CFU / ml. Wartość ta była znacznie niższa niż w przypadku nieskorygowanych supernatantów Bioglass®. 4. Omówienie Niniejsze eksperymenty udowodniły, że szkło cząsteczkowe Bioglass® ma działanie antybakteryjne na pewne bakterie naddziąsłowe i poddziąsłowe. Działanie to może być istotną zaletą przy skutecznej osseointegracji bioszkła Bioglass® po wszczepieniu go do przyzębia, jako że sugeruje się, że bakteryjna kolonizacja implantów jest ważną przyczyną nieprzyjęcia się implantów.

[opis: Total CFU - całkowita liczba CFU; Bioglass / NB supernate -supernatant z Bioglass / NB; Glass / NB supernate – supernatant ze szkła / NB; NB - tylko NB] Wykres 1. Zdolność przeżycia S. sanguis po 1-godzinnym wystawieniu na działanie supernatantów z cząsteczek Bioglass® w NB.

Tabela 4

Eksperymenty badające działanie antybakteryjne supernatantów z Bioglass® udowodniły, że bezpośredni kontakt pomiędzy cząsteczkami Bioglass® a komórkami bakterii nie miał działania antybakteryjnego. Stąd też, uznano, że reakcje powierzchniowe Bioglass® wytwarzają roztwór, który ma właściwości pozwalające na zabicie docelowych bakterii. Może to stanowić zaletę szkła cząsteczkowego Bioglass® polegającą na zdolności wysterylizowania miejsca założenia implantu lub przynajmniej zmniejszenia liczby żywych bakterii w jego otoczeniu. Fakt, że kontakt pomiędzy granulkami a bakteriami nie był konieczny dla działania antybakteryjnego sugeruje, że bakterie mogły zostać zabite przed zetknięciem się z powierzchnią bioszkła Bioglass®.


Nie jest pewne, czy spowodowałoby to zmniejszenie nagromadzenia bakterii na powierzchni bioszkła Bioglass®. Nagromadzenie bakterii, które polega na oddziaływaniach receptor-adhezyna, jest procesem niewymagającym źródeł energii i dlatego też niezależnym od zdolności przeżycia. Wydaje się prawdopodobne, że jest to również przypadek adhezji bakteryjne do powierzchni, jako że ukazano, że odbywa się ona za pomocą oddziaływań hydrofobowych oraz oddziaływań receptor-adhezyna. Wyniki eksperymentów badających wpływ korekty pH na działanie antybakteryjne supernatantów z bioszkła Bioglass® wskazują, jest to zjawisko powiązane z pH. Jednak na podstawie tych eksperymentów nie udało się stwierdzić, czy działanie antybakteryjne wynikało z wysokiego pH jako takiego. Zmniejszenie pH supernatantów z bioszkła Bioglass® zmieniło rozpuszczalności poszczególnych jonów w nich zawartych, które, przy pH wynoszącym 9,8 również mogły mieć działanie antybakteryjne. Jednak działanie antybakteryjne zaobserwowane po dodaniu NaOH do pożywki miało podobne nasilenie do tego uzyskanego przez supernatanty z Bioglass®. Skuteczność działania antybakteryjnego wynosiła w przybliżeniu 91% dla nieskorygowanych supernatantów z Bioglass® i 97% dla NaOH w pożywce bulionowej. Jest to dowodem na to, że wyłącznie wysokie pH jest odpowiedzialne za działanie antybakteryjne. Wcześniej udowodniono, że roztwory o wysokim pH wykazują pewne działanie antybakteryjne. Środki do higieny jamy ustnej o wysokim pH również wykazują działanie antybakteryjne. Chociaż prawdopodobnie nie przeprowadzono innych badań nad bakteriobójczym działaniem 45S5 Bioglass®, prowadzono badania dotyczące podobnego materiału, S53P4 (SiO2; Na2O, 23; CaO, 20; i P2O5, 4; C p Materiał ten był stosowany w leczeniu w/w). nadwrażliwości zębów oraz zapaleniu zatok. Pracownicy ci odkryli, że działanie przeciwbakteryjne jest jeszcze większe, chociaż stosunek objętości do powierzchni szkła (SA/V) użyty w ich eksperymentach był od 10 do 20 razy większy niż w badaniach nad bakteriami naddziąsłowymi i poddziąsłowymi opisanymi w niniejszym sprawozdaniu. Bioszkło Bioglass® o wysokim stosunku objętości do powierzchni może generować szybsze tempo wzrostu pH w otaczającym roztworze oraz szybsze tempo uwalniania jonów, w porównaniu z niższym stosunkiem objętości do powierzchni szkła. Takie wyniki badań mogą wyjaśniać, dlaczego S53P4 ma większe działanie antybakteryjne w porównaniu z materiałami użytymi w niniejszym badaniu. 5. Wnioski Wykazano, że szkło cząsteczkowe Bioglass® ma znaczące działanie przeciwbakteryjne na niektóre bakterie jamy ustnej, w tym te mające związek z próchnicą i chorobą przyzębia. Działanie antybakteryjne może zmniejszać potencjał kolonizacji bakteryjnej bioszkła Bioglass® przy zastosowaniu go w przyzębiu.

Podziękowania Chcielibyśmy podziękować US Biomaterials Co. za sfinansowanie tego projektu.


Działanie antybakteryjne bioszkła cząsteczkowego na bakterie naddziąsłowe i poddziąsłowe  

Działanie antybakteryjne bioszkła cząsteczkowego na bakterie naddziąsłowe i poddziąsłowe

Advertisement
Read more
Read more
Similar to
Popular now
Just for you