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République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université Mohamed khider-Biskra Faculté des Sciences Exactes et des Sciences de la Nature et de la Vie

Mémoire En vue de l’obtention du diplôme de Master en Biologie Option : Biochimie et biologie moléculaire Thème:

Le Profil De Résistance Aux Β-lactamines Des Souches De Pseudomonas aeruginosa D’origine Hospitalière Réalisé par :

Barir ouafa Ghilani Malika Devant le Jury : M. AGOUNI M.

Maitre assistante U.M.K Biskra

Président

M. BOUBENDIR A.

Maitre assistant U.M.K Biskra

Examinateur

M. me FERROUDJ S.

Maitre assistant U.M.K Biskra

Promoteur

Année universitaire : 2010/2011


Remerciements Louange à Dieu le tout puissant pour ce qu’Il nous a donné comme volonté, santé et surtout patience pour pouvoir achever ce modeste travail.

Tout d’abord, nos profonds remerciements vont à nos chers parents qui sacrifient leur vie pour rendre la notre heureuse.

Ensuite, je tiens à remercier particulièrement Madame Ferroudj Sana, Sana notre encadreure, pour avoir accepté de diriger ce travail et nous avoir prodigué conseils et encouragement chaque fois que cela s'est avéré nécessaire.

Par ailleurs, nous remercions les docteurs,, Tilichine leurs Tilichine Aicha, Aicha Zid Saliha,pour Saliha aides, leurs précieux conseils et encouragements.

Enfin, je tiens à exprimer mes remerciements infinis aux membres de jury de leurs remarques précieuses.


Table Des Matières Liste des abréviations ………………………………………………………………….....

i

Liste des figures ………………………………………………………………………….

iv

Liste des tableaux ………………………………………………………………………...

v

Liste des photos…………………………………………………………………………...

vi

Introduction ………………………………………………………………………………

1

PREMIERE PARTIE : Etude bibliographique CHAPITRE I: Pseudomonas aeruginosa 1. morphologie et structure………………………………………………………………..

4

2. Caractères culturaux……………………………………………………………………

5

3. Caractères biochimiques………………………………………………………………..

6

3.1. Métabolisme…………………………………………………………………………..

6

3.2. Production de pigments………………………………………………………………

6

4. Caractères génomiques…………………………………………………………………

6

5. Lysotypie……………………………………………………………………………….

7

6. Facteurs de virulence …………………………………………………………………..

7

6. 1.Facteurs de virulence de surface………………………………………………….......

8

6.2. Facteurs de virulence secrétés………………………………………………………...

9

6.3. Facteurs de virulence secrétés via le système de sécrétion de type III……………...

11

7. Pouvoir pathogène……………………………………………………………………...

13

CHAPITRE II: Les β-lactamines 1. Les β-lactamines……………………………………………………………………......

16

2. Classification…………………………………………………………………………...

16

2.1. Les pénames ou pénicillines………………………………………………………….

16

2.2. Les céphemes ou céphalosporines……………………………………………………

18

2.3. Les pénèmes ou carbapénémes………………………………………………………

21

2.4. Monobactame………………………………………………………………………… 22 2.5. Les inhibiteurs des bêtalactamases…………………………………………………..

23

5. Mécanisme d’action des β-lactamines………………………………………………….

24


5.1. Pénétration des β-lactamines à travers la membrane externe et peptidoglycane……..

26

5.2. Traversée de l’espace périplasmique………………………………………………....

27

5.3. Fixation et action sur les protéines de liaison à la pénicilline……………………......

28

5.4. Lyse bactérienne sous l’effet des β-lactamines………………………………………. 28

CHAPITRE III: Résistance de Pseudomonas aeruginosa aux βlactamines 1. L’antibiorésistance……………………………………………………………………... 30 2. Différents types de la résistance bactérienne…………………………………………...

30

2.1. Résistance naturelle………………………………………………………………......

30

2.2. Résistance acquise……..…………………………………………………………….

30

3. Origine génétique de la résistance acquise…………………………………………......

31

3.1. La résistance chromosomique………………………………………………………... 31 3.2. La résistance extra-chromosomique………………………………………………….

31

5. Différents mécanismes de résistance de P.aeruginosa aux β-lactamines……………… 32 5.1. Mécanismes enzymatiques…………………………………………………………...

33

5.1.1. β-lactamases de la classe A………………………………………………………… 36 5.1.2. β-lactamases de la Classe B : métallo-β-lactamases (MBL)……………………….

36

5.1.3. β-lactamases de la a classe C (AmpC)……………………………………………... 36 5.1.4. β-lactamases de la classe D (Oxacillinase)………………………………………...

38

5.1.5. β-lactamases à spectre élargi ou étendu (BLSE)…………………………………...

38

5.2. Mécanismes non enzymatiques…………………………………………………….

39

5.2.1. Le système d’efflux actif…………………………………………………………

39

5.2.2. Diminution de la perméabilité…………………………………………………….

41

5.2.3. Modification de la cible « protéine de liaison à la pénicilline » (PLP)…………..

41

DEUXIEME PARTIE : Partie pratique I. Matériels et méthodes…………………………………………………………………... 44 1. Matériels biologie………………………………………………………………………

44

2. Réactif et petit matériel………………………………………………………………… 44 3. Méthodes……………………………………………………………………………….. 44 3.1. Isolement……………………………………………………………………………... 44 3.2. Identification………………………………………………………………………….

45


3.2.1. Identification microscopique……………………………………………………….

45

3.2.2. Identification biochimique………………………………………………………….

46

3.3. Culture……………………………………………………………………………......

47

3.4. Antibiogramme……………………………………………………………………….

47

3.4.1. Réalisation d’une suspension………………………………………………………. 48 3.4.2. Ensemencement…………………………………………………………………….

48

3.4.3. L’application des disques…………………………………………………………... 49 3.4.4. Incubation et lecture ……………………………………………………………….. 51 II. Résultats et discussion………………………………………………………………..

52

1. Isolement……………………………………………………………………………….. 52 2. Identification……………………………………………………………………………

53

3. Antibiogramme…………………………………………………………………………

54

Conclusion Références bibliographique Annexe


Liste des abréviations - : négatif. + : positif. µm : micro mètre. ABC : La famille ABC transporteur. ACT: AmpC type. Agl : aminoglycosides. Atm : aztréonam. ATB : antibiotique. Azl : azlocilline. BIL: le prénom de premier patient, découvre chez lui « Bilal ». BMR : Bactérie multirésistance. BLSE : β-lactamases à spectre étendu. C1G : Céphalosporine de première génération CARB : Active sur carbénicilline. Carb : carbénicilline. CMI : concentrations minimales inhibitrices CMY: Active sur cephamycins. Cpm : cefepime. Cpr : cefpirome. CTX-M: Active sur cefotaxime le premier isolés en Munich. Czid : ceftazidime. i


EDTA : acide éthylène diamine tétracétrique. EF : facteurs d’élongation. FOX: Active sur céfoxitine. Fq : fluoroquinolone. G+C : Guanine + Cytosine. GIM : German imipenemase. I : intermédiaire. Imi : imipénème. IMP : Active sur imipénème. LPS : lipoplysaccharide. MATE : expulsion de multidrugue et de composés toxique. MBL : Métallo-β-lactamase. MDR : multidrug resistance. Mero : méropénème. Mex : multiple efflux. MFR : membrane fusion protein. MIR: Hôpital de Miriam MOX: Active sur moxalactam. NAG: N-acétyglycosamine NAM: N-acide acétylmuramique Nmc : Not metalloenzyme carbapenemase. Opr : outre membrane protein. OXA : Active sur oxacilline. ii


P.aeruginosa : Pseudomonas aeruginosa. PER: Pseudomonas extended resistant Pip : pipéracilline. PL : phospholipides. PLP : ou protéine liant la pénicilline. Pm : polymyxines. R : résistante. RND : résistance-nodulaire-division cellulaire. S : sensible. SHV : Sulfhydryl reagent variable. SHV : Sulfhydryl reagent variable. SMR : résistance multiple des staphylocoques. SPM : Sao Paulo métallo-β-lactamase. TEM : Temoneira. Tic : ticarcilline. UDP-NAG : uridine diphosphate-N-acétyglycosamine UDP-NAM : uridine diphosphate-acide acétylmuramique. VEB : Vietnam extended-spectrum β-lactamase. VIM : Verona integron-encoded métallo-β-lactamase. Zn: Zinc.

iii


Liste des figures

Fig .1 : P. aeruginosa en microscope électrique……………………………………….

05

Fig.2: génome de Pseudomonas aeruginosa AP01……………………………………....

07

Fig.3 : Facteurs de virulence de surface cellulaire de P.aeruginosa……………………..

08

Fig.4 : Facteurs de virulence secrétée de P.aeruginosa…………………………………

10

Fig. 5 : Schéma représentant l’organisation du système de sécrétion de type III chez

12

P.aeruginosa……………………………………………………………………………… Fig. 6 : noyau de béta- lactame…………………………………………………………...

16

Fig. 7 : les pénicillines……………………………..........................................................

17

Fig.8 : Les céphalosporines…….…………………………………………………………

19

Fig.9 : structure chimique de carbapénèmes……………………………………………...

22

Fig.10: la structure d’arztréome…………………………………………………………..

23

Fig.11 : Les inhibiteurs de bêtalactamases …………………………………………….....

24

Fig.12: Mode d’action des antibiotiques inhibant la synthèse de la paroi………………..

25

Fig.13 : Enveloppe d’une bactérie à Gram négative……………………………………...

26

Fig. 14 : Mécanisme d'action de β-lactamine (pénicilline)……………………………….

28

Fig.15 : Représentation schématique des principaux mécanismes de résistance aux βlactamines chez bactérie à Gram négative………………………………………………..

33

Fig.16 : hydrolyse du noyau β-lactame par une β-lactamase………………………….....

34

Fig. 17 : Induction de l'expression ampC par β-lactamine…............................................

37

-

Fig.18: Dérépression associés à AmpD …………...........................................................

38

Fig.19: Structure et fonction de pompes d’efflux RND chez P. aeruginosa…………......

40

iv


Liste des tableaux Tableau 01: Taxonomie de P. aeruginosa..............................................................................

4

Tableau 02 : Principales pathologies causées par P. aeruginosa et classées selon le site d’infection ………………………………………………………………………………….

14

Tableau 03 : Classification selon Ambler des principales β-lactamases ……………..

35

Tableau 04: La résistance aux antibiotiques due de mutations dans les gènes régulatrices des systèmes d’efflux chez P.aeruginosa……………………………………………………. 41 Tableau 05 : les petits matériels et les réactifs utilisés………………………………….

44

Tableau 06 : Profil de résistance aux β-lactamines de 12 souches de P. aeruginosa……….

55

v


Liste des photos

Photo 1: Inhibition de la synthèse de la paroi bactérienne……………………………..

29

Photo 2: Isolement par la méthode de stries……………………………………………

45

Photo 3 : l’ensemencement des strié à surface des milieux King A et B ………………

47

Photo 4 : la préparation d’une suspension de l’antibiogramme………………………..

48

Photo 5 :préparation de l’antibiogramme…………………………………………….

49

Photo 6: le dépôt des disques d’antibiotique sur le Muller-Hinton…………………….

50

Photo 7 : Position de disque…………………………………………………………….

50

Photo 8 : La lecture de l’antibiogramme à l’aide d’un pied de coulisse ……………….

51

Photo 9 : l’aspect des colonies de P.aeruginosa dans une boite de pétrie……………..

52

Photo 10 : test catalase ……………………………………………………….………..

53

Photo 11 : test oxydase…………………………………………………………………

53

Photo 12: la mise en évidence des pigments dans le King A et B………………………

54

Photo 13: Les zones d’inhibition des antibiotiques testés………………………………

55

Photo 14 : profils de BLSE « bouchon de champagne » ……………………………….

56

Photo 15 : profils de résistance à haut niveau ………………………………………….

56

vi


Introduction


Introduction

Le phénomène de résistance aux antibiotiques est connu depuis l'utilisation de ces molécules. Cette résistance concernait essentiellement le milieu hospitalier et certains germes. Mais on assiste à l'heure actuelle à une dissémination des bactéries résistantes voire multirésistantes et à l'apparition de résistance chez des bactéries connues jusqu'alors pour leur sensibilité aux antibiotiques. De plus, de nouveaux mécanismes de résistance sont actuellement décrits comme les protéines d’efflux, la résistance aux glycopeptides des staphylocoques, les céphalosporinases plasmidiques…

L'accroissement du nombre des infections provoquées par des bactéries multirésistantes et l'acquisition de nouveaux mécanismes de résistances par les bactéries posent un problème de plus en plus préoccupant dans nos hôpitaux. En effet, les infections nosocomiales ont une incidence sur le coût des soins, en allongeant la durée de séjour et en augmentant le coût du traitement. P. aeruginosa est un germe d'origine environnementale présentant des profils de multirésistance souvent accusés et dont l'implication croissante dans les infections nosocomiales exige la connaissance de leur sensibilité aux antibiotiques. Les β-lactamines représentent la principale famille d'antibiotiques utilisée pour le traitement des infections sévères à Pseudomonas aeruginosa. Du fait de résistances naturelles et acquises nombreuses le choix de la β-lactamine à utiliser en thérapeutique est restreint et doit être guidé par l'antibiogramme. Notre travail réalisé dans le cadre de la préparation du mémoire de Master repose sur l’étude de certains profils de résistance acquise des souches de Pseudomonas aeruginosa isolées à partir de l’hôpital HAKIM SAADANE et ceci par la réalisation d'un antibiogramme spécifique.


Etude Bibliographique


Chapitre 1 : Pseudomonas aeruginosa


Etude bibliographique

Chapitre I

P. aeruginosa, autrement

connus sous le nom de bacille pyocyanique, est une

bactérie versatile et ubiquitaire dans l’environnement. Elle est communément trouvée dans le sol et d’eau (eaux douces et marines) et sur les surfaces en contact avec ces milieux. Etymologiquement, le mot issu du grec pseudo (= simili ou imitation) et monas (= unité) désignait les « germes » du début de la microbiologie. Le mot aeruginosa, qui signifie vert-degris en latin, fait référence au pigment contenu par la bactérie, qui donne à la colonie sa couleur caractéristique. P.aeruginosa est l’espèce type du groupe Pseudomonas, également composé de 12 autre membres (Yétérian, 2010). Sa taxonomie est présentée dans le tableau 1

Tableau (1) : Taxonomie de P. aeruginosa (Benabid, 2009). Règne

Bacteria

Embranchement

Prokaryota

Division

Proteobacteria

Classe

Gammaproteobacteria

Ordre

Pseudomonadales

Famille

Pseudomonadaceae

Genre

Pseudomonas

Espèce

aeruginosa

1. Morphologie et structure P. aeruginosa, un bacille Gram-négatif en forme de bâtonnet, de 0,5 à 0,8µm de diamètre sur 1 à 3µm de long, mobile grâce à un flagelle polaire généralement unique (Fig.1), dépourvu de spores et de capsules (Hafiane et Ravaoarinoro, 2008). La paroi du bacille pyocyanique est caractéristique de celle des bactéries à Gram négatif (Sadoff et Artenstein, 1974). Elle est constituée d’une membrane externe et d’un espace périplasmique et du peptidoglycane. La membrane externe est une bicouche asymétrique constituée du lipopolysaccharide (LPS) et de phospholipides (PL) où se trouvent de nombreuses protéines telle que les porines qui assurent la diffusion de divers types de molécules à travers la membrane externe (Pagés, 2004). Chez le P. aeruginosa on distingue plusieurs types de porines OprD (D1 et D2), OprE (E1 et E2), OprH (H1 et H2), OprG et OprF qui présente la majorité de porines non spécifique dans cette organisme (Nikaido et al., 1991). 4


Etude bibliographique

Chapitre I

Fig.1 : P. aeruginosa en microscope électronique (Carip, 2008). La membrane de P.aeruginosa est aussi caractérisé par l’existante de nombreuses pompes d’efflux tel que MexA–MexB–OprM, MexC–MexD–OprJ, qui jouent un rôle important dans l’injection des agents antimicrobiens (Xavier et al., 2010). 2. Caractères culturaux Le bacille pyocyanique est une bactérie à des besoins très limités, croissant sur des milieux synthétiques simples. Elle pousse facilement en 24 heures à 37 °C. Elle peut croître entre 5 et 42°C avec un optimum de 30 °C. Par contre, elle supporte de moindres variations de pH (6,5 à 7,5) avec un pH optimal de 7,2. P.aeruginosa est une bactérie aérobie stricte mais capable d’utiliser les nitrates en condition anaérobies (Souley lie, 2002). P.aeruginosa est caractérisé par une odeur florale (Flandrois, 1997). Un milieu sélectif à base cétrimide (ammonium quaternaire) permet la recherche et l’isolement de P.aeruginosa à partir de produit biologiques (selles, urines, pus, liquide céphalo-rachidien…) en bactériologie médicale (Delarras, 2007). Selon Denis (2007) trois types de colonies peuvent être observés simultanément ou de manière isolée sur milieux solides : •

Colonies larges « la » de 2 à 3 mm de diamètre, à bord irrégulier, rugueuses une partie centrale bombée présentant des reflets métallique.

Colonie plus petites lisses « S » bombées à bord régulier.

Colonies muqueuses « M » bombées, coalescentes, filantes rencontrées chez les souches produisant un slime composé d’un polymère d’alginate. 5


Etude bibliographique

Chapitre I

3. Caractères biochimiques 3.1. Métabolisme Pseudomonas aeruginosa possède : -une oxydase - une nitrate - réductase (réduction des nitrates pouvant aller jusqu' au stade de N gazeux) - un métabolisme oxydatif des sucres, appréciable sur milieu MEVAG (Milieu pour l' Étude de la Voie d' Attaque des Glucides) - une arginine - dihydrolase - une lécithinase (qui ne peut être révélée qu'en milieu liquide) 3.2. Production de pigments D’après (Delarras, 2007) le P.aeruginosa produit deux types de pigments (fluorescent ou non) qui servent à son identification, ils peuvent être mis en évidence dans le milieu de King B et King A Pyoverdine : pigment jaune-vert fluorescent, soluble dans l’eau, insoluble dans le chloroforme. Pyocyanine (phénazinique) : pigment bleu-vert non fluorescence soluble dans l’eau et le chloroforme, cette espèce est la seule à le produire. 4. Caractères génomiques Le génome de la souche PA01 de P.aeruginosa a été complètement séquencé en 2000 (fig.3), il est plus grand génome bactérien qui comprend 6,3 millions de paires de bases. Ce génome contenant 5570 gènes, la plupart sont riches en Guanine et Cytosine (G+C) (66,6%), seuls 6.7 % de ses gènes ont une fonction bien connue. Le pourcentage de séquences régulatrices est plus important dans le génome entier de P.aeruginosa (8,4%) (Stover et al., 2000). Le chromosome de P. aeruginosa code notamment pour la plupart des facteurs de pathogénicité de cette bactérie, environ 200 à 300 gènes ce qui représente 5% du génome (Kohler et Delden, 2009). Le bacille pyocyanique contient plusieurs plasmides donnant différents caractères phénotypiques (résistance aux antiseptiques, aux antibiotique, modification du taux de croissance, acquisition d’activités catabolique sur certains substrats) ceux-ci peut compliquer la reconnaissance de cette espèce (Flandrois, 1997).

6


Etude bibliographique

Chapitre I

Fig.2: génome de Pseudomonas aeruginosa AP01 (Stover et al., 2000).

5. Lysotypie Pseudomonas aeruginosa est très facilement lysé par des bactériophages et la sensibilité des souches à l'effet lytique d'une batterie de ces phages permet de distinguer des lysotypes. Elle est employée pour classer les différentes variétés de P.aeruginosa dans les laboratoires spécialisés (Souley lie, 2002). 6. Facteurs de virulence de surface P.aeruginosa est invasif et toxigene, en raison de la production de facteurs de virulence de surface (qui lui permettent de s’attacher, de coloniser, et d’envahir les tissus), et secrétés (qui endommagent les tissus et déclenchent des processus inflammatoires). Il est souvent difficile de distinguer entre colonisation et invasion pathogène en l’absence d’outil diagnostic adéquat. (Mesaros et al., 2007).

7


Etude bibliographique

Chapitre I

6.1. Facteurs de virulence de surface Les facteurs de virulence de surface incluent le flagelle, le pili, le LPS et l’alginate (fig. 3).  Flagelle Unique et polaire chez P. aeruginosa, le flagelle lui confère sa mobilité (Fox et al., 2007). Son rôle dans le pouvoir pathogène est attesté par le fait que les souches non flagellées sont beaucoup moins virulentes. Le flagelle participe également aux phénomènes d’adhésion aux cellules épithéliales (Fledman et al., 1998).  Pili de type IV P. aeruginosa exprime un nombre limité de pili polaires. Le pilus est une petite structure filamenteuse d’environ 6 nm de diamètre constituée d’empilements de monomères de la protéine appelée piline. Les pili de P. aeruginosa sont parmi les rares pili procaryotes impliqués dans la motilité bactérienne. bactérienne Les pili de type IV, par leurs propriétés rétractiles, permettent à P. aeruginosa d’envahir les surfaces hydratées et de coloniser rapidement les voies respiratoires. (Benabid, 2009)

Fig.3 : Facteurs de virulence de surface cellulaire de P.aeruginosa (Kipnis Kipnis et al., 2006). 8


Etude bibliographique

Chapitre I

 Lipopolysaccharide (LPS) Le LPS, localisé dans la membrane externe des bactéries à Gram négatif, est d'une part connu pour son rôle protecteur contre la lyse provoquée par le sérum et d'autre part pour son activité endotoxique. Il est également impliqué dans la stimulation de la réponse inflammatoire et dans les interactions avec les tissus hôtes. l'endotoxine est responsable d'une stimulation excessive du système immunitaire pouvant provoquer un choc septique et conduire à la mort (Bricha et al., 2009).  Alginate L'alginate est un exopolysaccharide mucoïde composé de polymères de l’acide mannuronique associé avec l'acide glucuronique. P.aeruginosa produit l’alginate pour adapter dans certaines situations environnementales inappropriées au développement bactérien. C’est le cas des infections pulmonaires chroniques des patients atteints de mucoviscidose (Carpentier et al., 2003). La production d’alginate par ces souches permet de la formation d’un biofilm qui favorise l’adhésion aux cellules épithéliales (Fox et al., 2007) et protège la bactérie de la phagocytose, des anticorps, l’action des antibiotiques et des désinfectants (Ruimy et Andremont, 2004). 6. 2. Facteurs de virulence secrétés Au cours de la phase d’adhésion P.aeruginosa capable de produire un grand nombre des facteurs de virulence pour provoquer une lésion tissulaire (fig.4) (Guery et al., 2009).  Sidérophores Le fer est un élément essentiel à la croissance bactérienne. Ainsi, la bactérie entre en compétition avec l’eucaryote qui l’héberge et notamment avec des molécules comme la transferrine (Singleton, 2005). Les sidérophores, dont les principaux sont la pyoverdine et la pyochéline, se comportent comme de véritables chélateurs du fer. Ils sont excrétés dans le milieu environnant, puis récupérés sous leur forme complexée avec le fer ferrique grâce à certaines protéines de la membrane externe (Carpentier et al., 2003). La pyoverdine, pigment jaune fluorescent, responsable pour partie de la couleur caractéristique des colonies de P. aeruginosa, est le plus puissant de ces deux sidérophores. La pyochéline a une activité moindre, et deux molécules sont nécessaires pour chélater le fer ferrique (Bricha et al., 2009).

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Etude bibliographique

Chapitre I

 Pyocyanine La pyocyanine est un pigment bleu sécrété par la bactérie et impliqué dans de nombreux mécanismes de pathogénicité. Elle réprime la réponse immunitaire de la cellule hôte, induit l’apoptose des neutrophiles et induit la production d’IL-8 d’IL 8 (Khalilzadeh, 2009).  Protéase alcaline La protéase alcaline peut dégrader les l interférons et les composants du complément. Son rôle a surtout été décrit dans les lésions du tissu cornéen, il est moins clair dans les autres types d’infection (Kipnis Kipnis et al., 2006).  Exotoxine A Elle est secrétée par le système sécrétoire de type II (Alouf et Popoff, 2006). 2006) L’exotoxine A agit, comme la toxine diphtérique, en inactivant le facteur d’élongation des chaînes peptidiques EF2 des eucaryotes. Elle est inactive sur la synthèse protéique des d procaryotes (Ramos, 2004).

Fig.4 : Facteurs de virulence secrété de P.aeruginosa (Kipnis et al., al. 2006). 10


Etude bibliographique

Chapitre I

 Phospholipase C Egalement sécrétées par le système de sécrétion de type II, elles présentent différentes spécificités de substrats et ont particulièrement pour cible la partie lipidique de la membrane des cellules eucaryotes. L’action des phospholipases est facilitée par les rhamnolipides bactériens. (Khalilzadeh, 2009).  Rhamnolipides Ce sont des glycolipides extracellulaires, qui peuvent émulsionner les phosphates membranaires grâce à leur activité détergente, les rendre plus accessibles au clivage par phospholipase C (Delden et Iglewski, 1998).  Elastase L’élastase B joue le rôle principal. Son activité est particulièrement importante sur le tissu pulmonaire. Elle détruit les jonctions entre les cellules épithéliales, dégrade la fibronectine (Kipnis et al., 2006), stimule la sécrétion muqueuse et inactive l’inhibiteur ߙ1 des protéases qui régule l’activité de l’élastase des polynucléaires neutrophiles humains. À côté de cette activité, l’élastase B a un spectre de substrats étendu qui touche la fibrine et les composants des lames basales des épithéliums (laminine, collagènes de types II et IV, protéoglycanes) (Carpentier et al., 2003). 6. 3. Facteurs de virulence secrétés via le système de sécrétion de type III Le système de sécrétion de type III, est certainement le système le plus étudié (fig.5), il est composé d’une vingtaine de protéines qui rassemblent de celles de flagelle (Foulongne et al., 2002). P. aeruginosa utilise un système de sécrétion de type III qui est un déterminant majeur de la virulence et permet à la bactérie d’injecter ses toxines dans la cellule hôte (Shaver et Hauser, 2004).

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Etude bibliographique

Chapitre I

Figure. 5 : Schéma représentant l’organisation du système de sécrétion de type III chez P.aeruginosa (Buyck, 2008). P. aeruginosa secrète quatre exotoxines à travers le système de sécrétion de type III : L’exoenzyme S : leur cible est le cytosquelette. Elle dépolymérise les filaments d’actine et de vimentine. Cette activité se manifeste en particulier sur les macrophages. elle aussi interfère avec plusieurs échelons de la défense immunitaire (Carpentier et al., 2003). L’exoenzyme T : est impliqué dans l’infection pulmonaire. Cette exotoxine semble interférer avec l’organisation des filaments d’actine et empêche l’exocytose, la progression du cycle cellulaire et la phagocytose. L’exoenzyme Y : est une adénylate cyclase, augmentant la concentration d’AMP cyclique dans les cellules intoxiquées de l’hôte (Bricha et al., 2009). L’exoenzyme U : toxine possède une activité phospholipase détruisant la membrane cellulaire, Il pourrait contribuer à la mort de la cellule par nécrose, perméabilité des cellules et la dissémination rapide des souches produisant (Ramos, 2004).

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Etude bibliographique

Chapitre I

7. Pouvoir pathogène Pseudomonas aeruginosa est une bactérie opportuniste qui provoque rarement des infections chez les sujets en bonne santé. Il s'agit alors : - d'infestations massives par exemple chez les nageurs de piscines contaminées - ou d'inoculations traumatiques directes dans un tissu ou une cavité (méningites ou ostéomyélite d'inoculation). En fait, il est de règle que les infections à pyocyanique surviennent chez les malades fragilisés en milieu hospitalier. L'antibiothérapie favorise l'implantation des bactéries sur la peau ou les muqueuses de ces malades. Le concept d'immunodépression inclut l'état consécutif aux stress, à des traumatismes divers (brûlures, fractures, interventions chirurgicales, injections intraveineuses d' héroïne, manœuvres instrumentales), à des chimiothérapies neutropéniantes utilisées par le traitement des cancers ou des leucémies mais aussi les tares (diabète, mucoviscidose,....), la malnutrition (kwashiorkor), l' âge (prématurité) ou le délabrement physiologique (vieillesse) (Souley lie, 2002). Les principales pathologies causées par P. aeruginosa sont résumé dans le tableau (1).

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Etude bibliographique

Chapitre I

Tableau 1 : Principales pathologies causées par P. aeruginosa et classées selon le site d’infection (Mesaros, 2007). Site d’infection

Pathologie spécifique

Fréquence (dans une population à risque)

Tractus respiratoire

pneumonie aiguë infections chroniques de l’arbre bronchique

fréquent (hôpital ; soins intensifs) mucoviscidose

bactériémie et septicémie

Fréquent

infections aiguës infections chroniques

relativement fréquent (complications suite à la présence de corps

Sang

Tractus urinaire

étrangers) otite externe (« oreille du nageur ») otite externe maligne otite moyenne chronique suppurative

Fréquent

dermatite infections de plaie infections de brûlures

relativement fréquent

ecthyma gangrenosa pyodermite folliculiteacne vulgaris résistant

patients neutropéniques

kératite (ulcère cornéen) enophtalmie ophtalmie néonatale

rare (traumatisme)

central

méningite abcès cérébral

rare (secondaire à une neurochirurgie ou à un traumatisme)

Cœur

Endocardite

Os et articulations

pyoarthrose sténo-articulaire ostéomyélite vertébrale infection de la symphyse pubienne ostéochondrite du pied ostéomyélite

rare

entérocolite nécrosante infections périrectales

rare

Oreille

Peau et tissus mous

Œil Système nerveux

Tractus gastrointestinal

(traumatismes)

(abus de drogues intraveineuses)

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Chapitre 2 : β-lactamines


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Chapitre II

Les antibiotiques sont des composées antimicrobiennes naturelles ou de synthèse. Ils sont produits par les microorganismes fongiques ou bactériens, capables de tuer ou inhiber d’autres microorganismes (Madigan et Martinko, 2007). Généralement ce terme est réservé aux molécules dont l’action antibactérienne. Les antibiotiques soit des bactéricides (ils détruisent directement les microorganismes), soit des bactériostatiques (ils empêchent leurs croissance) (Faure et al., 2007) 1. Les β- lactamines Les β-lactamines constituent la plus vaste famille d’antibiotique (50%). Cette famille comprend un grand nombre de molécules qui contiennent toutes un noyau β-lactame dans leur structure moléculaire (fig.6), ce noyau confère à la molécule son activité antibiotique (Casamajor et Descroix, 2009).

Fig. 6 : noyau de béta- lactame (Cohen et Jacquot, 2008).

2. Classification de β- lactamines D’après Lecontrre et Libbrue (1999) la classification des β-lactamines dépend de leur structure chimique et leur activité antibactérienne, on distingue cinq groupes : 2.1. Les pénames ou pénicillines Le noyau de base des pénicillines, l'acide 6-aminopénicillanique, est constituée d’un cycle thiazolidine lié au cycle β-lactame. Le noyau β -lactame peut être substitué par acylation sur la fonction aminée pour donner naissance à des dérivés qui se différencient par leur stabilité, leur pharmacocinétique, leur spectre d’activité et leur résistance aux β-lactamases. Selon la nature des substituant et de leurs conséquences pour l'activité antibiotique, on distingue plusieurs types de pénicillines (fig. 7) (Zitouni Imounachen, 2010).

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Chapitre II

 Pénicilline G (naturelle) La pénicilline G ou benzylpénicilline est extraite des produits de fermentation de Pénicillium chrysogenums (Cohen et Jacquot, 2008). Elle ne passe pas la barrière digestive car elle est rapidement détruite par les sucs gastriques et ne peut donc pas être utilisée par voie orale. La modification de leur structure

aboutit à des composés plus stables qui sont

partiellement absorbés comme les phénoxyméthylpénicillines (pénicillines V) et qui peuvent être utilisés par voie orale (Cavallo et al., 2004). Le spectre de pénicilline G est étroit, elle active sur les bacilles à Gram positif (Corynebacterium diphteriae), cocci à Gram positif (Treptocoque, souche de Pneumocoque de sensibilité non diminuée à la pénicilline), cocci à Gram négative (Méningocoque, souche de Gonocoque non productrices de pénicilline), anaérobies à Gram positif et Treponema pallidum. Les dérives de pénicilline G sont : procaïne pénicilline, benzathine pénicilline (Boulahbal et al., 2009).

Fig. 7 : les pénicillines (Prescott et al., 2007).

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Chapitre II

 Pénicilline M Pénicillines M, découverte suite à l’apparition des souches de Staphylococcus aureus productrice de pénicillinase. Les pénicillines M sont : méticilline, oxacilline, cloxacilline et cloxypen. Ce sont des pénicillines à spectre étroit, en les utilisé contre les Staphylococcus (Boulahbal et al., 2009).  Pénicilline A ou aminopénicilline Les pénicillines A comprend : ampicilline, amoxicilline, bacampicilline, proampicilline, pivampicillines. (Gaudy et Buxeraud, 2005). Leur spectre d’activité est large : cocci à Gram positif et à Gram négatif, bacilles à Gram positif et les anaérobies à Gram négatif de façon variable (Casamajor et Descroix, 2009).  Carboxypénicillines et acyluréidopénicillines Les dérivés de ce groupe sont : ticarcilline, pipéracilline, mezlocilline. Ils sont caractérisés par un spectre large sur les bacilles à Gram négatives naturellement résistants à amoxicilline (entérobactéries, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, bacilles à Gram négatif aérobies stricts tels que Pseudomonas aeruginosa), Mais ils sont inactifs si ces bacilles ont acquis une résistance par production de pénicillinase (Perronne ,1999).  Amidopénicillines Mécillinam est la seul amidopénicilline actuellement disponible, son spectre d’activité est étroit, actif sur les cocci à Gram négatif (Boulahbal et al., 2009). 2.2. Les céphemes ou céphalosporines La famille des céphalosporines constitue indubitablement l’un des principaux groupes d’antibiotique utilisés en milieu hospitalier. Ce choix est principalement attribuable au fait quelle associent une puissante activité antimicrobienne et une très faible toxicité (Yernault et Demedts, 1997). Les céphalosporines se distinguent chimiquement des pénicillines par le remplacement du cycle thiazolidine par un cycle dihydrothiazine. Cette structure donne une partie commune à tous les membres du groupe, l’acide 7-aminocéphalosporanique et une partie variable (Fig.8) (Faure, 2009).

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Chapitre II

On classe les céphalosporines en quatre générations essentielles, correspondant à des différences de stabilité aux β-lactamases. La progression «historique» a effectivement évolué vers une meilleure résistance aux β-lactamases, essentiellement des bacilles à Gram négatif (Bégué et Astrue, 1999).

Fig.8 : Les céphalosporines. Ces sont dérivés de l’acide 7-aminocéphalosporanique contenant un cycle β-lactamine (Prescott et al., 2007).  Céphalosporines de 1ére génération Selon Bustany et Chaumet-Riffand (1993), les Céphalosporines de 1ér génération sont représentés par 11 dérivés : le céfalothine, la céfalexine, la céfaloridine, la céfadroxil, la céfradine, le céfaclor, le céfacétrile, la céfatrizine, le céfazoline, la céfapirine, céfaprozil. Leur résistance aux pénicillinases est variable. La céfalothine est le chef de file de ce groupe d’antibiotique et son spectre moyen est commun à toutes les céphalosporines « de première génération » (Moulin et Coquerel, 2002). Les céphalosporines de première génération sont plus efficaces contre les bactéries pathogène Gram-positives que conter les Gram-négatives (Prescott et al., 2007).

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Chapitre II

Le spectre couvre les cocci Gram (+) et quelques bactérie Gram (-).Les CS1 n’offrent pas plus d’intérêt que les pénicillines envers les cocci. Le céfaclor et le céfadroxil sont actifs envers les souches d’Haemophilus influenzoe β-lactamase (+). Cependant, les CS1 n’atteignent par le bacille pyocyanique (Bustany et Chaumet-Riffand, 1993). Le céfadroxil, la céfalexine et la céfradine sont similaires en ce qui concerne le spectre, une activité satisfaisante contre les germes à Gram (+) (notamment Streptococcus, pneumoniae), mais une activité nulle ou nettement insuffisante contre Haemophilus influenzoe (Yernault et Demedts, 1993).  Céphalosporine de 2éme génération Leurs propriétés sont très proches de celles des céphalosporines de première génération ; elles en différent cependant par leur plus grande activité vis-à-vis d’un certain nombre de souche de germes à Gram (-), mais avec une efficacité amoindrie vis-à-vis des germes à Gram (+), D’une façon générale, elles sont inactives sur les germes fortement sécréteurs de βlactamases ; elles sont sans action sur Pseudomonas. Ainsi le « chef de file » le céfamandole est une céphalosporine sensible aux β-lactamases (Vincent, 2009). Céfoxitine et céfétan ne sont pas des céphalosporines stricto sensu, mais des céphamycines. Cependant, leurs propriétés les font rattacher à cette famille. Elles sont activent sur les Klebsiella produisant une β-lactamase à spectre élargi, sur les germes anaérobies à Gram négatif. Le Céfotétan et la Céfoxitine possèdent une activité sur les anaérobie à Gram négatif (type bactéroides fragilis) (Mouton, 1997).  Céphalosporine de 3éme génération Sont des molécules de grande activité intrinsèque, et de bonne stabilité vis-à-vis de nombreuses β-lactamases. Bon nombre de bactéries d’hôpitaux, y compris les P.aeruginosa sont sensibles à ces molécules (Gregory et al., 2008). Sont inactives sur Listeria, Staphylocoques, Bactéroides fragilis (Mouton, 1997). De point de vue de Vincent (2009), Cette famille est comprend, trois principaux éléments : le céfotaxime, la céftoriaxone et la céftazidime.

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Chapitre II

Céfotaxime : il est la molécule de référence de cette famille, son spectre est particulièrement intéressent pour ; les Entérobactéries, l’Haemophilus influenzae, les Streptocoque, le Méningocoque. Céftoriaxone : cet antibiotique a un spectre sensiblement équivalent à celui du céfotaxime Ceftazidime : son spectre est proche du céfotaxime et est remarquable par son excellente activité sur le Pyocyanique, qui est nettement supérieure à toutes les autres céphalosporines actives sur ce germe (Bégué et Astrue, 1999). En plus de ces trois en trouve Cefsulodine, céfopérazone : sont caractérisés par un spectre actif sur P.aeruginosa (Boulahbal et al., 2009).  Les céphalosporines de 4éme génération (céfépime, céfpirome), cumulent une bonne activité sur les Pneumocoques et sur de nombreux bacilles à Gram négatif d’hôpitaux (Gregory et al., 2008). 2.3. Les pénèmes ou carbapénèmes Les carbapénèmes contiennent en plus du cycle β-lactame, un cycle dérivé du cycle thiazolidine des pénicillines, son spectre est plus large. Elles sont actives sur les cocci à Gram positif (y inclut Entérocoque et Staphylocoques), les cocci à Gram négatif, les bacilles à Gram positif et sur la quasi-totalité des bacilles à Gram négatif (y inclut Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter) même ceux sécrètent des β-lactamases (Anglaret et Mortier, 2003). La figure (8) illustre les différentes carbapénèmes qui dérivent de la thiénamycine, antibiotique produit par Streptomyce cattleya (Khan, 2009).

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Chapitre II

Fig.9 : structure chimique de carbapénèmes (Khan, 2009).

2.4. Monobactame L’aztréonam est le premier produit disponible de la famille des monobactame, qui sont des b-lactamines monocycliques. Leur mécanisme d’action est identique à celui des autres blactamines, mais la substance se caractérise par une forte résistance aux b-lactamases d’origine plasmidique et chromosomique. Cependant, les b-lactamases plasmidique hydrolysent le céfotaxime détruisent également l’aztréonam, ce qui explique la résistance croisée fréquente avec les céphalosporines de troisième génération. D’autre part, on a confirmé une résistance provoquée par des troubles de la pénétration de l’aztréonam dans la membrane la plus externe, ainsi que par une liaison défaillante aux PLP (Yernault et Demedts, 1997) Son activité vis-à-vis des bacilles à Gram négatif, y compris Pseudomonas aeruginosa est très proche de celles des C3G. Mais il est totalement inactif sur les bactéries à Gram positifs (Perron, 1999 ; Mouton, 1997).

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Chapitre II

Fig.10: la structure d’arztréome (Harlos, 2010).

2.5. Les inhibiteurs des bêtalactamases Sur le plan biochimique les inhibiteurs sont des β-lactamines. Cependant, n’ont qu’une faible activité antibactérienne. Leur rôle est de fixer de manière irréversible aux β-lactamases et d’inhiber les effets destructeurs des antibiotiques, donc ils sont utilisées toujours en association avec une β-lactamine (Lecontrre et Libbrue, 1999). Les principales molécules des inhibiteurs de β-lactamases sont l’acide clavulanique, le sulbactam et le tazobactam (Fig.11). L’acide clavulanique inhibe seulement les pénicillinases alors que le tazobactam et le sulbactam peuvent inhiber les pénicillinases mais surtout les céphalosporinases. Ces inhibiteurs de β-lactamases ont été associés à l’amoxicilline, à la ticarcilline et aux ureïdopénicillines. L’association amoxicilline + acide clavulanique commercialisée en 1984 est la mieux connue et la plus utilisée. Son spectre d’activité associe à celui de l’amoxicilline, les bactéries productrices des pénicillinases soit d’origine chromosomique (Klebsiella, Bactéroïdes fragilis) soit d’origine plasmidique (Staphylococcus aureus, Haemophilusi nflenzae, certaines entérobactéries : Escherichia coli) (Hammami, 1991). L’association ticarcilline + acide clavulanique active sur P.aeruginosa (Boulahbal et al., 2009).

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Chapitre II

Fig.11 : Les inhibiteurs de bêtalactamases (Jollés, 2000).

3. Mécanisme d’action des β-lactamines Les β-lactamines agissent en se fixant sur des enzymes présentes dans la membrane cytoplasmique bactérienne appelées protéines de liaison à la pénicilline (PLP). L’inactivation de ces enzymes entraine à l’inhibition de la synthèse du peptidoglycane, constituant majeur de la paroi des bactéries à Gram positif et à Gram négatif (Perronne, 1999). Le peptidoglycane ou la muréine formés d’acide N-acide acétylmuramique (NAM) lié avec de N-acétyglycosamine (NAG). Des pentapeptides sont liés aux NAM. Grace à des ponts interpeptidique, les pentapeptide sont reliés entre eux pour former d’un réseau bi-dimension autour de la cellule (Perry et al., 2004). La synthèse du peptidoglycane est complexe et très sensible aux antibiotiques (Fig.12), l’inhibition de n’importe quelle étape de la synthèse aboutit à l’altération de la paroi donc la lyse osmotique de la cellule. Elle comporte plusieurs étapes : (1) Synthèse les précurseurs du peptidoglycane l’uridine diphosphate-acide acétylmuramique UDP-NAM et l’uridine diphosphate-N-acétyglycosamine UDP-NAG dans le cytoplasme. (2) Les acides amines sont ajoutées séquentiellement à l’UDP-NAM pour former la chaine pentapeptidique (les 2 Dalanines sont ajoutées sous forme de dipeptide). (3) Transfère l’UDP-NAM dans la membrane cytoplasmique grâce à le bactoprénol transporteur membranaire où NAM-pentapeptide vas lier avec l’UDG-NAG pour former le disaccharide peptide, l’unité de base du peptidoglycane (Prescott et al., 2007). (4) L’étape finale extra -cytoplasmique de la synthèse constitue une polymérisation par transpeptidation (liaison peptidique entre acides aminés) et par

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Chapitre II

transglycosylation (liaison glucidique) grâce à une transpeptidase et une transglycosylase membranaire (Faure, 2009). D’après Jehl et al. (2003) l’action de β-lactamines nécessite quatre étapes : (1) pénétration des β-lactamines à travers la membrane externe et peptidoglycane, (2) traversée de l’espace périplasmique, (3) Fixation et action sur les protéines de liaison à la pénicilline, (4) lyse bactérienne sous l’effet des β-lactamines.

Fig.8: Mode d’action des antibiotiques inhibant la synthèse de la paroi (Bambeke et al., 2010).

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Chapitre II

3.1. Pénétration des β-lactamines à travers la membrane externe et peptidoglycane Chez les bactéries à Gram positif les molécules de β-lactamines traversent facilement le peptidoglycane, qui est perméable aux petites molécules (Moulin et Coquerl, 2002). La membrane externe constituée une barrière hydrophobe chez les bactéries à Gram négatives. A cause de sa nature lipidique, on pourrait s’attendre à ce que la membrane externe exclut les composants hydrophiles également. Normalement, rien ne devrait traverser la membrane externe. En fait, les bactéries à Gram négative, semblent avoir crée un nouveau système de transport différent de celui de la membrane cytoplasmique et compatible avec le rôle protecteur de la membrane externe (Schaecheter et al., 1993).Les β-lactamines qui sont les plus souvent des molécules hydrophiles, doivent traverser la membrane externe pour atteindre les PLP cibles par voie des porines (fig.13) (Gaudy et Buxeraud, 2005).

Fig.13 : Enveloppe d’une bactérie à Gram négative. la membrane interne(MI), membrane externe (ME), périplasme(PE), lipopolysaccharide (LPS), phospholipides (PL), la porine OmpF. P: protéines; PG: peptidoglycane; PLP:protéine de liaison aux pénicillines (Pagés, 2004).

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Chapitre II

Les porines sont des protéines de transport. Ces molécules ont portés le nom : protéines associées à des peptidoglycanes ou protéines de la matrice. Les porines généralement forment des pores non spécifique à travers la membrane externe et filtrent les molécules en fonction de leur taille, alors que les porines spécifique contiennent des sites spécifiques pour des substrats particuliers (Reginald et al., 2000). Leur regroupement en trimères pour former des canaux transmembranaires avec une structure en tonneau et un canal central hydrophile rempli d’eau permet la diffusion au travers de la membrane de divers solutés hydrophiles, dont les βlactamines hydrophile (Cavallo et al., 2004). Pour les bactéries non fermentaires comme P. aeruginosa, il existe également des porines, mais dont la fonctionnalité est moins clairement élucidée que chez les entérobactéries. Chez P. aeruginosa, deux porines semblent jouer une fonction importante pour permettre le passage des β-lactamines, les porines OprF et OprD. La porine OprD laisse passer spécifiquement les carbapénèmes, alors qu’OprF est la porine majeure qui laisse passer les autres β-lactamines anti-Pseudomonas (Cavallo et al., 2004). 3.2. Traversée de l’espace périplasmique Le système de double membrane de bactérie à Gram négatives crée un compartiment appelé espace périplasmique ou périplasme autour de la membrane cytoplasmique. Ce compartiment contient des enzymes, les β-lactamases, qui inactivent les β-lactamines (Pénicillines ou céphalosporines). Les bactéries Gram positives ne possèdent pas de compartiment périplasmique, mais elles sécrètent des enzymes similaires dans le milieu (Schaecheter et al., 1993). La membrane externe n’empêche pas, mais ralentis l’entrés des β-lactamines, qui être par la suit hydrolysé par les β-lactamases périplasmique, cette étape est les plus importantes dans la protection des bactéries contre les antibiotique. chez E-coli une modélisation d’interaction entre le niveau de perméabilité et l’hydrolyse par la β-lactamase constitutive a pu être proposée pour prédire les concentrations minimales inhibitrices (CMI).ce modèle s’applique toutefois mal à certaines espèces pour lesquelles l’action naturelle des pompes d’efflux est importante, comme P.aeruginosa (Cavallo et al., 2004).

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Chapitre II

3.3. Fixation et action sur les protéines de liaison à la pénicilline Les β-lactamines présentent une analogie structurale du substrat naturel dipeptide (D-AlaD-Ala) (fig.10), qui termine les polypeptidique des précurseurs du peptidoglycane. Après la pénétration dans l’espace périplasmique, les β-lactamines fixent sur différentes protéines de liaison à la pénicilline (PLP) en particulier les transpeptidases (Nicolas et al., 2002). Ces protéines sont des enzymes impliqués dans la phase finale de la synthèse du peptidoglycane. L’affinité des β-lactamines pour les PLP peut varier selon les β-lactamines et selon les PLP (Nauciel et Vildé, 2005). La fixation de β-lactamines sur les PLP ploque la synthèse du peptidoglycane (Fig.14) et de ce fit la croissance bactérienne (Pourriat et Martin, 2005).

Fig. 14 : Mécanisme d'action de β-lactamine (pénicilline) (Zitouni Imounachen, 2010). 3.4. Lyse bactérienne sous l’effet des β-lactamines L’arrêt de la synthèse du peptidoglycane, qui résulte de la fixation sur les PLP, va entraîner un arrêt de la croissance bactérienne qui correspond à l’effet bactériostatique de l’antibiotique (Moulin et Coquerl, 2002).

L’action bactéricide des β-lactamines sur les

bactéries sensibles est lié à une dégradation du peptidoglycane qui conduit à une lyse de la bactérie. Si la lyse bactérienne peut théoriquement survenir par l’action des forces osmotiques sur une paroi altérée, le processus de lyse bactérienne résulte surtout de la mise en jeu d’un système faisant intervenir des autolysines. Ces autolysines sont des hydrolases endogènes présentes chez toutes les bactéries qui, sous le contrôle strict de mécanismes de régulation, 28


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Chapitre II

peuvent dégrader à plusieurs niveaux la structure du peptidoglycane bactérien. Elles sont actives au cours de la phase de croissance bactérienne, ce qui explique que les β-lactamines n’ont en règle générale pas d’action bactéricide sur les bactéries en phase stationnaire, mais uniquement sur celles en phase de croissance (Cavallo et al., 2004). Les β-lactamines activeraient des protéines bactériennes appelées des holines et inactiveraient également des inhibiteurs endogènes des hydrolases bactériennes. Le système de régulation des enzymes lytiques alors perturbé, les holines forment activement des canaux transmembranaires, permettant ainsi des fuites membranaires, le passage des hydrolases du peptidoglycane et la lyse de la bactérie (photo.1) (Faure, 2009).

A)

B)

Photo. 1: Inhibition de la synthèse de la paroi bactérienne (A) : Bacilles avant le traitement à la pénicilline. (B) : Lyse de la bactérie à la suite d’un affaiblissement de la paroi bactérienne imputable à la pénicilline (Tortora et al., 2003).

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Chapitre 3 : RÊsistance de Pseudomonas aeruginosa aux β-lactamines


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Chapitre III

1. L’antibiorésistance La résistance bactérienne à un antibiotique est définie comme la capacité d’une bactérie à survivre à une concentration bien déterminée de cette molécule (Bousseboua, 2002). En pratique, cette résistance se traduit de différentes façons. Pour le clinicien, c’est la présence d’échec clinique d’antibiothérapie après un traitement adapté et mené selon un bon protocole (Weiss, 2002). Pour le bactériologiste, c’est l’acquisition par une bactérie de mécanismes lui permettant de résister à la concentration minimale inhibitrice déterminée pour des souches sensibles. Pour l’épidémiologiste, il s’agit des groupes de souches se distinguant du reste de la population par une concentration minimale inhibitrice plus élevée que la moyenne (Faure, 2009). 2. Différents types de la résistance bactérienne 2.1. Résistance naturelle La résistance naturelle ou intrinsèque est un caractère d’espèce qui touche toutes les souches de l’espèce considérée (phénotype sauvage) (Mesaros et al., 2005). Elle est stable, transmise à la descendance lors de la division cellulaire (elle a pour support génétique le chromosome bactérien) mais elle n'est pas transmissible sur un mode horizontal (d’une bactérie à l’autre au sein d’une même espèce ou entre espèces différentes) (Carle, 2009). 2.2. Résistance acquise A côté de la résistance naturelle existe aussi la résistance acquise. Cette résistance ne concerne que quelques ou de nombreuses souches d’une espèce donnée, ces souches dérivent de bactéries initialement sensibles (phénotype résistance) (Bousseboua, 2002). Elle résulte de changements dans le génome bactérien par une mutation soit l’acquisition des informations génétiques étrangères (Mulvey et Simor, 2009). Les bactéries sont dites multirésistantes lorsqu’à la suite d’une accumulation de résistances naturelles et acquises, elles ne sont sensibles qu’a un petit nombre d’antibiotiques. Elles sont alors résistantes à plusieurs antibiotiques (Boulahbal et al., 2009).

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Chapitre III

2.2.1. Origine génétique de la résistance acquise Une bactérie peut acquérir une résistance aux antibiotiques par deux grands mécanismes génétiques. L’un a pour support le chromosome (mutation spontané) et il définit une résistance chromosomique, l'autre a pour support les plasmides ou les éléments transposables et il définit une résistance extra-chromosomique (Carle, 2009). 2.2.2. La résistance chromosomique Elle résulte d’une mutation. C’est un phénomène rare et spontané. Il n’est pas provoqué par la présence de l’antibiotique mais l’antibiotique révèle la mutation de résistance en sélectionnant les bactéries mutantes résistante (ou plus exactement, en éliminant les autres bactéries de l’espèce, celles restées sensibles à l’action de l’antibiotique). Le taux de mutation varie de 1.10-7 à 1.10-10 (Meyer et al., 2006). La résistance par mutation se transmet héréditairement aux cellules filles (Bockstael et Aerschot, 2009). Toutes les mutation ayant un rôle dans la modification ou la perte d’un gène et pouvant entraîner : (1) une modification de la cible de l’antibiotique qui peut êtres pariétale (cas de la PLP ou protéine liant la pénicilline) ou intracellulaire (ou de l’ADN gyrase pour les quinolones, ARN polymérase, ribosome), (2) modification de perméabilité un ou plusieurs antibiotiques (Vaubourdolle, 2007), Par exemple, la résistance de P.aeruginosa a l’imipèneme due à la perte d’une porine à la suite d’une mutation dans la porine OprD (Mesaros et al., 2007). 3.1.2. La résistance extra-chromosomique C’est le mécanisme le plus fréquent. La bactérie capable d’acquérir des gènes exogènes qui la rendent la résistante par la synthèse de protéines additionnelles et non à une modification des constituants normaux de la bactérie. Ces protéines modifient la perméabilité à un antibiotique ou inactivent l’antibiotique lui-même (cas des enzymes types β-lactamases). Les gènes sont portés par un plasmide ou un transposable (Boulahbal et al., 2009).  Plasmide et transposable Le plasmide R (facteur de résistance) a été découvert en 1959. C’est une molécule d’ADN extra-chromosomique circulaire de taille environ 1 à 400 kb. Il capable de autorépliquer et de transférer d’une bactérie à une autre même entre les bactéries d’espèces différents (Pourriat et Martin, 2005). Beaucoup de plasmide R contiennent deux types de gènes l’un est appelé facteurs de transfert de résistance ; code les gènes nécessaire au transfert 31


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Chapitre III

par la conjugaison (plasmide conjugatif). L’autre type appelé déterminants-r est groupes des gènes de résistance aux antibiotiques (ampicilline, sulfamide,…) (Klug et al., 2006). Parfois le plasmide R ne contient pas le RTF (plasmide non conjugatif) il peut être transféré à une autre cellule par mobilisation d’un plasmide conjugatif dans la cellule (Bennett, 2008). Les plasmides de résistance sont susceptibles d’évoluer par acquisition ou pertes successives de déterminants de résistance portés par des éléments génétiques transposables (Bergogne-Bérézin et Dellamonica, 1999). Les transposons sont des molécules d’ADN capables de déplacer d’un site à un autre (mouvement intra et inter-moléculaire) grâce à des gènes spécifiques lui permet de transférer d’un plasmide vers un autre ou d’un plasmide vers un chromosome et l’inverse (Bennett, 2008). 4. Différents mécanismes de résistance de P.aeruginosa aux β-lactamines Le phénotype sensibles de P. aeruginosa (que l'on appelle de type sauvage), comprend la sensibilité aux carboxypénicillines (ticarcilline), aux uréidopénicillines (mezlocilline, pipéracilline), à monobactame (aztréonam), aux carbapénèmes (imipénème) et à certain céphalosporines de troisième génération (céfsulodine, ceftazidime céfopérazone, céfépime, cefpirome) (Eyquem et Montagnier, 2000). La résistance naturelle de P.aeruginosa lie à faible perméable de membrane externe et l’intervention d’autres mécanismes, comme la production des β-lactamases chromosomiques inductible et l’existence d’un système d’efflux (Lahlou et al., 2008). P.aeruginosa est caractérisé par son aptitude d’acquérir différents mécanismes de résistance aux β-lactamines (fig.15). Ces mécanismes peuvent être

enzymatique par la

production de différents types de β-lactamases ou non enzymatique :(i) diminution de la perméabilité des β-lactamines, (ii) excrétion des β lactamines par les systèmes d’efflux et (iii) modification de la cible des β-lactamines (PLP) (Arsalane et al., 2010).

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Chapitre III

Fig.15 : Représentation schématique des principaux mécanismes de résistance aux βlactamines chez bactérie à Gram négative (Thomson et Bonomo, 2005).

4.1. Mécanismes enzymatiques de résistance aux β-lactamines A l’heure actuelle, la production d’enzymes hydrolytiques appelées β-lactamases est le mécanisme de résistance prédominant des bactéries à Gram négatif vis-à-vis des β-lactamines. Au début des années 1980, seules quelques enzymes de type plasmidique comme TEM-1, TEM-2 et SHV-1 étaient connues, mais rapidement après l’introduction d’antibiotiques à large spectre tels que les céphalosporines de troisième génération, sont apparues des βlactamases à spectre étendu ou BLSE. Depuis, les β-lactamases ne cessent de se diversifier, d’élargir leur spectre d’activité et leur diffusion parmi de nombreuses espèces d’entérobactéries et de bacilles non fermentant tels que Pseudomonas spp. et Actinobacter spp (Faure, 2009).

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Chapitre III

Les β-lactamases Les β-lactamases sont des enzymes bactériennes qui hydrolysent la liaison amide du cycle β-lactame des β-lactamines pour donner un acyl-enzyme qui sera ensuite dégradé en acide inactif (fig.16). L’hydrolyse irréversible du noyau β-lactame entraîne alors l’inactivation de l’antibiotique et la perte totale de son activité antibactérienne. Chez les bactéries à Gram positif les β-lactamases sont sécrétées dans le milieu extérieur tandis que chez les bactéries à Gram négatif ces enzymes se retrouvent dans l’espace périplasmique (Van Bambeke et al., 2010).

Fig.16 : hydrolyse du noyau β-lactame par une β-lactamase (Dale-Skinner et Bonev, 2009).

Sur la base de leur mécanisme catalytique, les β-lactamases sont divisées en deux types : les sérines-β-lactamases, utilisant un site actif à sérine pour hydrolyser le noyau βlactame et les métallo-β-lactamases nécessitant des ions Zn2+. Selon la classification de Ambler, utilisée en pratique médicale, il est possible de définir phylogénétiquement quatre classes de β-lactamases : les classes A, B, C ou D. Au sein de chacune de ces classes, il existe des sous-groupes en fonction du support génétique des gènes de résistance, chromosomique ou plasmidique (Muller et Frcpc, 2004) (tableau 2). P.aeruginosa peut produire un nombre important de β-lactamases des quatre classes moléculaires, mais aussi les β-lactamases à spectre élargi ou étendu appartiennent de ces classes (Thomson et Bonomo, 2005).

34


Etude bibliographique

Chapitre III

Tableau 2 : Classification selon Ambler des principales β-lactamases d’après Faure, 2009. Classe

Localisation

Spectre d’activité

Types d’enzymes

Organisme

Chromosome

Spectre restreint

TEM-1,2 et SHV-1

Enterobacteriaceae P.aeruginosa

Plasmide

β-lactamases à spectre étendu (BLSE)

TEM-3-29, 42, 43, SHV-2-9 PER-1,2 CTX-M, CTX-M2, MEN-1, VEB-1, TOHO-1

Enterobacteriaceae Klebsiella peunomoniae ++

Plasmide

β-lactamases résistantes aux inhibiteurs

TEM-30-41, 44 et Enterobacteriaceae 45 E. coli ++

Plasmide

β-lactamases résistantes aux inhibiteurs et à large spectre

SHV-10, TEM-33 E. coli et 15

Chromosome

Carbapénémases

Nmc A, IMP-1

Chromosome Plasmide

Carbapénémases

IMP-1

Enterobacteriaceae P .aeruginosa

Plasmide

Céphalosporinases

Enterobacteriaceae Klebsiella peunomoniae ++

Chromosome

MIR-1, MOX-1, CMY-1, 2 1.AT-1, BIL-1, FOX1, ACT-1 AmpC

Chromosome Plasmide

OXA-2426, 40, 51, 58, 72

A

B

C

D

P. aeruginosa

35

Sine-1, Enterobacter cloacae Serratia marcescens

Bacille Gram négative Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa


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Chapitre III

5.1.1. β-lactamases de la classe A La classe A constituée principalement par les pénicillinases qui sont sensibles aux inhibiteurs de β-lactamase (acide clavulanique, sulbactam et tazobactam) (Bibal, 2008). Quatre enzymes d’origine plasmidique ont été signalés chez P. aeruginosa: PSE-1 (CARB-2), PSE-4 (CARB-1), CARB-3 et CARB-4. Leur profil de substrat comprend les carboxypénicillines, les uréidopénicillines et non pas la ceftazidime (Bert et al., 2002). 5.1.2. β-lactamases de la Classe B : métallo-β-lactamases (MBL). L’importance clinique des métallo-bêta-lactamases est liée au fait qu’elles hydrolysent les carbapénèmes, composés qui échappent à l’activité des β-lactamases à sérine active. La plupart des métallo-bêta-lactamases dégradent toutes les classes des β-lactamines, sauf monobactame. Les MBL ne sont pas inhibés par l’acide clavulanique ou la tazobactam. Au lieu de cela, ils sont inhibés par les chélateurs d'ions tels que l'EDTA (Bush et Jacoby, 2010). Plusieurs types MBL ont été décrits chez P.aeruginosa : IMP, VIM, GIM, et SPM (Pitout et al., 2005). 5.1.3. β-lactamases de la classe C (AmpC) P.aeruginosa possède un gène AmpC inductible (céphalosporinase) entraînant une résistance naturelle aux pénicillines A et G et aux céphalosporines de première et deuxième génération (Pourriat et Martin, 2005). Mais ce gène peut subir une mutation génétique (au niveau des gènes régulatrices), elle aboutit à une hyperproduction de céphalosporinase indépendamment de la présence de β-lactamines. La céphalosporinase est dite alors déréprimée. Ce phénomène donne un phénotype de résistance aux céphalosporines de troisième génération et tous les autres β-lactamines l’imipenème (Vaubourdolle, 2007). Ce type de β-lactamase ne détruit pas l’antibiotique mais inhibe l’accès à son site d’action (Carle, 2009) et n’est pas inhibée par les inhibiteurs de β-lactamase commercialisés : l'acide clavulanique, le sulbactam et tazobactam (Muller et Frcpc, 2004). Le système de régulation d’expression de gène ampC est très complexe et nécessite de l’intervenir de plusieurs protéines régulatrices (AmpG, AmpR, AmpD). Le gène ampR, situé en amont du gène ampC et transcrit en sens inverse, code un régulateur transcriptionnel pouvant réprimer ou induire l’expression du gène ampC. En absence d’antibiotique inducteur (imipénème), la protéine AmpR réprime l’expression de ampC en se liant à la région promotrice du gène (Lister et al., 2009). En revanche, en présence d’antibiotique inducteur, la dégradation du peptidoglycane libère dans l’espace périplasmique des molécules de 1, 6anhydromuropeptides (Fig. 17). Ces derniers, une fois transportés dans cytoplasme grâce à la 36


Etude bibliographique

Chapitre III

Fig. 17 : Induction de l'expression ampC par β-lactamine

perméase AmpG, jouent le rôle de molécules inductrices transformant le répresseur en activateur transcriptionnel. Les molécules inductrices peuvent toutefois être dégradées par une N-acéttyl-anhydromuramyl-L-alanine amidase codée par le gène ampD. Cette enzyme permet donc, d’une part, de prévenir l’induction du gène ampC et, d’autre part, de recycler les éléments provenant de la dégradation du peptidoglycane. La cause la plus connue d’haut niveau d'expression d’ampC ou dérépression chez les isolats cliniques est une mutation dans l’ampD. Cette mutation conduit à une hyperinductibilité d’ampC donc à une hyperproduction constitutive de céphalosporinase (Fig.18) (Jacoby, 2009).

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Etude bibliographique

Chapitre III

Fig.18 : Dérépression associés à AmpD- (Lister et al., 2009). 5.1.4. β-lactamases de la classe D (Oxacillinase) Les enzymes de ce groupe caractérisent par leur capacité d'hydrolyser la cloxacilline ou oxacilline et donc sont appelé oxacillinases ou OXA. Les oxacillinases sont faiblement inhibées par l’acide clavulanique mais peuvent être inhibées par NaCl (Bush et Jacoby, 2010). Les principes enzymes produites par le P.aeruginosa sont : OXA-1, OXA-2 et OXA-10 qui déterminent la résistance aux carboxypénicillines et uréidopénicillines mais pas à la ceftazidime. La résistance à la ticarcilline et pipéracilline résultant de la production d'enzymes OXA-2 est inférieure à la résistance qui se développe lorsque les oxacillinases OXA-10 et OXA-1 sont produites (Strateva et Yordanov, 2009). 5.1.5. β-lactamases à spectre élargi ou étendu (BLSE) Depuis 1983 des β-lactamases ayant un spectre très large sont apparues : ce sont les β lactamases à spectre élargi (BLSE). Elles sont présentes initialement chez Klebsiella pneumoniae et peuvent trouver au sein de nombreuses autres espèces bactériennes, entérobactéries et bacilles non fermentant (tels que P.aeruginosa et Acinetobacter baumannii) (Zahar et al., 2009). Les BLSE proviennent de mutations de pénicillinases tells que TEM,

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Etude bibliographique

Chapitre III

SHV de classe A et OXA de la classe D (Cattoir, 2008), leurs gènes portés habituellement par des plasmides, et donc transférables (Al-Jasser, 2006). Les mutations génétiques à l’origine des BLSE élargissent le spectre de ces enzymes et touchent également les céphalosporines de troisième génération (ceftazidime et céfotaxime) et la monobactame (aztréonam) (Vora et Auckenthaler, 2009). Les BLSE sont donc définis comme des β-lactamases capables d’hydrolyser les pénicillines et les céphalosporines de première, deuxième et troisième génération et la monobactame et n’hydrolysent pas les céphamycines (céfoxitine) ni les carbapénèmes et elles sont inhibées par les inhibiteurs classiques de β-lactamases (Paterson et Bonomo, 2005). Différents types de BLSE ont été identifiés chez P.aeruginosa, qui peuvent être, soit des β-lactamases de classe A tel que TEM, SHV, PER, VEB-1 et VEB-2… etc, soit des oxacillinases de spectre élargi (classe D) tel que OXA-11, -14, -16, -17, -19, et -28 (Tanaz et al., 2010). 5.2. Mécanismes non enzymatiques 5.2.1. Le système d’efflux actif Le système d’efflux actif est efficace grâce aux protéines transmembranaires ancrées dans la membrane plasmique mais également dans la membrane externe des bactéries Gram négatif. Ces protéines sont spécifiques d’une classe d’antibiotiques ou au contraire responsables de « multidrug resistance » (MDR). Pour fonctionner, les pompes à efflux utilisent l’énergie fournie par dissipation d’un gradient de protons (familles MFS, RND et SMR) ou d’ions sodium (famille MATE) ou encore par hydrolyse d’ATP (famille ABC) (Poole, 2004). Chez les bactéries à Gram négatif, les systèmes d’efflux sont souvent des complexes protéiques ternaires avec une pompe transmembranaire, une protéine périplasmique de jonction et une porine de la membrane externe (fig.19) (Lister et al., 2009).

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Etude bibliographique

Chapitre III

Fig.19: Structure et fonction de pompes d’efflux RND chez P. aeruginosa (Lister et al., 2009).

Les systèmes les plus fréquemment rencontrées chez P.aeruginosa sont de type RND (Li et Nikaido, 2009). Quatre systèmes de ce type peuvent conférer une résistance aux βlactamines: MexA–MexB–OprM, MexC–MexD–OprJ, MexE–MexF–OprN et MexX–MexY– OprM. Ces système sont codés par des opérons distinct sur le chromosome bactérien, comprenant de 2 à 3 gènes de structure, le contrôle négatif ou positif de leur expression est assuré par un gène régulation situé en amont (Poole, 2004). Les systèmes MexAB-OprM et MexXY-OprM sont exprimés de manière constitutive et de contribuer à la résistance intrinsèque de P. aeruginosa. Bien que les systèmes d'efflux MexCD-OprJ et MexEF-OprN sont au repos dans le type sauvage de P. aeruginosa (Xavier et al., 2010).Tous ces systèmes peuvent être surproduits par cette bactérie sous l’effet de mutation touchant des gènes régulateurs (tableau 3), et engendre une multirésistance acquise vis-à-vis de nombreuse antibiotiques dont les β-lactamines (Livermore, 2002).

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Etude bibliographique

Chapitre III

Tableau.3 : La résistance aux antibiotiques due de mutations dans les gènes régulatrices des systèmes d’efflux chez P.aeruginosa (Livermore, 2002).

Système d’efflux

Agents antipseudomonas Site de mutation Fq

Carb Tic

PipAzl

CzidAtm

CpmCpr

Imi

Mero

Agl

Pm

MexAB-OprM

nalB, mexR, nalC, autres

R/R

R

r/R

r/R

r/R

-

r

-

-

MexCD-OprJ

NfxB

r/R

r/R

r/R

r/R

R

-

r

-

-

MexEF-OprN

nfxC, mexT

r/R

r/R

r/R

r/R

r/R

r

r

-

-

r/R

r/R

r/R

r/R

r/R

-

r

r/R

-

MexXY-OprM

Agl, aminoglycosides; Azl, azlocilline; Atm, aztréonam; Carb, carbénicilline, Czid, ceftazidime, Cpm, cefepime; Cpr, cefpirome; Fq, fluoroquinolone; Imi, imipénème; Mero, méropénème; Pip, pipéracilline; Tic, ticarcilline ; Pm, polymyxine; r, susceptibilité réduit; R, résistance. 5.2.2. Diminution de la perméabilité Le déficit en porine OprD, protéine de la membrane externe empruntée spécifiquement par l’imipénème pour franchir la membrane externe de P.aeruginosa, se traduit par une imperméabilité membranaire. La réduction de l’expression de cette porine conduit à une baisse modérée de l’activité de tous les carbapénémes. Ainsi, seule la résistance à l’imipénème est exclusivement dépendante du niveau de production d’OprD (Cholley, 2010). 5.2.3. Modification de la cible « protéine de liaison à la pénicilline » (PLP) L’efficacité de la fixation de β-lactamines sur leurs cibles PLPs peut être diminuée à la suite des mutations dans les gènes chromosomiques qui codent pour des PLPs normales ou à l’acquisition de gènes étrangers codant pour des PLPs nouvelles. Ces mutations peuvent aboutir à des altérations quantitatives et qualitatives des PLPs, avec diminution d’affinité pour les β-lactamines, ou à une substitution dans leurs fonctions des PLP cibles par une autre PLP moins affine (Cavello et al., 2004). Chez le P.aeruginosa le nombre de PLPs est six à sept types, mais ces derniers ne sont pas aussi bien étudiés comme ceux qui sont en Escherichia coli et leurs gènes n'ont pas été caractérisés (Liao et Hancock, 1995). En 1997 Lia et Hancock ont été montrés que la surproduction de type PLP3 chez les isolats de P.aeruginosa confère une résistance à 41


Etude bibliographique

Chapitre III

cefsulodine, la ceftazidime, céfépime, et à l'aztréonam. L’altération de PLP peut être observée chez les souches de mucoviscidose ou la modification de PLP4 avec une faible affinité a été rapportée après le traitement par l’imipénème et la pipéracilline. Cependant, ce type de mécanisme reste très rare chez cette bactérie (Strateva et Yordanov, 2009).

42


Partie pratique


Partie pratique

Matériels et méthodes

Partie pratique Notre étude vise à identifier des profils de résistance acquise tel que les β-lactamases à spectre élargi (BLSE). I-Matériels et méthodes 1. Matériels biologie Cette étude consiste en la recherche des souches de Pseudomonas aeruginosa isolées à partir des différents produits pathogènes (urines, pus, cathéthère…….) provenant de malades hospitalisées dans les différents services de l’hôpital HAKIM SAADAINE. Une souche de référence de P.aeruginosa ATCC 27853 a été utilisée. 2. Réactif et petits matériels Tableau 05 : les petits matériels et les réactifs utilisés.

petit matériel 

Boite de pétrie ;



Pipette pasteurs ;



Tube à essais ;



Lame et lamelle ;



Microscope optique



Gélose nutritive et

Réactif

de Muller Hinton 

Ecouvillons



Anse de platine



Bec benzène



Eau physiologie



Lugol



L'alcool



Violet de gentiane



Safranine



l'huile de cèdre



King A et King B



Disque d’oxydase

3. Méthodes 3.1. Isolement L’isolement est une méthode qui permet d’obtenir des souches bactériennes pures à partir d’un échantillon. La technique la plus utilisé pour l’isolement est la technique des stries, qui consiste à étaler sur la surface d’un milieu gélosé (préalablement coulée dans une boite de Pétri), un inoculum sous forme de stries à l’aide d’une pipette Pasteur boutonnée. L’isolement est réalisé selon le protocole expérimental décrit par Delarras, 2007 : -Diviser la surface en 4 quadrants sur le fond du biote de Pétri et les numéroter 1 à 4 ; 44


Partie pratique

Matériels et méthodes

-Déposer l’inoculum (urine, pus) sur le bord de la boite dans le quadrant 1 ; -L’étaler en large strie ; -Effectuer à l’aide d’une pipette Pasteur des stries serrées sur les quadrants 1 et 2 ; -Recommencer des stries perpendiculairement aux précédentes sur les quadrants 2 et 3, puis encore perpendiculairement aux dernières sur les quadrants 3 et 4. Après l’incubation des boites à 37°C pendant 24 h, chaque colonie bien individualisée, est prélevée et remise en suspension dans de l’eau physiologie stérile puis repiquée dans les mêmes conditions que précédemment.

Photo (2): Isolement par la méthode de stries 3.2. Identification 3.2. 1. Identification microscopique  L’examen à l’état frais L'état frais est une technique qui permet l’observation des bactéries vivantes entre la lame et lamelle à l’objectif 40. Le but de cette étape est de déterminer la forme des bactéries ainsi le type de leur mobilité (Joffin et Leyral, 2006). L’observation est réalisée comme suit : une petite goutte d’eau physiologie stérile est déposée avec la pipette Pasteur au centre d’une lame stérile. On prélève une partie d’une colonie bactérienne pure à l’aide de pipette Pasteur boutonnée et dissociée dans la goutte. Une lamelle stérile est ensuite appliquée sur la goutte en évitant la formation de bulles d’air. Puis l’observation au microscope optique à l’objectif 40.

45


Partie pratique

Matériels et méthodes

 Coloration de Gram La coloration de Gram est une coloration différentielle permettant de classer les bactéries en deux groupes selon la structure de leur paroi : Gram positif et Gram négatif (Denis, 2007). En effet quant les bactéries est mise au contact du violet de gentiane et ensuite soumises à l'action du lugol, il se forme un complexe colorant qui colore en violet tout le cytoplasme des bactéries. Cependant lorsque ces bactéries colorées sont lavées à l’alcool, seules celles à Gram négatif (présence membrane externe et couche mince de peptidoglycane), qui perdent leur coloration et prennent la colore rose après la coloration par la safranine. Les bactéries à Gram positif possède une couche épaisse de peptidoglycane qui empêche la pénétration de l’alcool et donc restent en colore violet (Tortora et al., 2003). • A l'aide d'une pipette Pasteur stérile on déposer une goutte d‘eau physiologique stérile sur une lame bien propre. • En suite on prélève une colonie bien isolée avec la pipette de Pasteur boutonnée et dissociée dans la goutte. Le frottis obtenu est séché dans l’étuve. • Puis il est recouvert totalement de violet de gentiane pendant 1 min .On rince ensuite à l'eau de robinet. Le frottis est ensuite recouvert de lugol pendant 1 min. • Puis on décolore par l'alcool. On lave rapidement à l'eau de robinet. Le frottis est enfin recouvert de safranine pendant 30 s, puis lavé à l'eau et séché à température ambiante. • Ensuite le frottis est examiné au microscope optique à l'objectif 100 et à l'immersion à l'huile de cèdre. 3.2.2. Identification biochimique  Recherche de l’oxydase L’activité oxydase a été déterminée par la méthode des disques et selon le protocole décrit par Guenoune, 2009. A l’aide d’une pipette pasteur boutonnée, une colonie est déposée sur un disque oxydase placé sur un milieu solide. La réaction positive est révélée par l’apparition d’une tache violette.  Recherche de catalase Cette activité a été réalisée selon le protocole expérimental décrit par Prescott et al., 2003. Ce test consiste à mettre une colonie prélevée du milieu gélosé à l’aide d‘une pipette Pasteur boutonné dans de l‘eau oxygénée.

46


Partie pratique

Matériels et méthodes

 Mise en évidence des pigments Les milieux King A et King B sont utilisé pour mettre en évidence successivement la pyocyanine et la pyoverdine de P. aeruginosa. En effet la pyocyanine verdit le milieu King A et la pyoverdine jaunit le milieu King B (Joffin et Leyral, 2006). A l’aide d’une pipette Pasteur boutonnée stérile des colonies bien isolées sont prélevés et ensemencé en stries médiane à la surface de chaque milieu. Ces tubes sont placés dans l'étuve à 37°C pendant 1jours. La production de la pyocyanine est maximale sur le milieu King A et celle de la pyoverdine sur le milieu King B.

Photo 3 : l’ensemencement des strié à surface des milieux King A et B 3.3. Culture A l’aide d’une pipette Pasteur boutonnée on prend un clone bien isolé pour faire un repiquage. 3.4. Antibiogramme L’antibiogramme est réalisé pour déterminer la sensibilité d’une souche bactérienne visà-vis un ou plusieurs antibiogramme in vitro. • Principe Les méthodes de diffusion ou antibiogrammes standards sont les plus utilisées par les laboratoires de diagnostic. Des disques de papier buvard, imprégnés d’antibiotiques à tester, sont déposés à l’aide d’une pinces stériles à la surface d’un Mueller-Hinton, préalablement ensemencé avec une culture pure de la souche à étudier (Boulahbal et al., 2009).

47


Partie pratique

Matériels et méthodes

• Technique : 3. 4.1. Réalisation d’une suspension : A l’aide d’une pipette Pasteur stérile, on prélève une colonie bien isolée d’une culture de 18h à 24 h, puis nous déchargeons la pipette dans un tube contient de l’eau physiologique qui est bien homogénéisée. Il et nécessaire de conférmer que la densité de la suspension est équivalente à 0,5 Mc Farland.

Photo 4 : la préparation d’une suspension de l’antibiogramme. 3.4.2. Ensemencement : L’ensemencement doit se faire dans les 15 min qui suivent la préparation de l’inoculum, il est réalisé par le trempage d’un écouvillon stérile dans la suspension bactérienne ensuite nous l’essorons en le pressant fermement sur la paroi interne de tube afin de le décharger au maximum. Enfin l’ensemencement est réalisé par le frottage de l’écouvillon sur la totalité de la surface gélosée de boite de pétrie. Cette opération se répète deux fois en tournant la boite de 60° à chaque fois sans oublier de faire pivoter l’écouvillon sur lui-même. Nous finissons l’ensemencement en passant l’écouvillon sur le périphérique de la gélose.

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Partie pratique

Matériels et méthodes

a)le trempage d’un écouvillon dans la

b) le frottage de l’écouvillon sur la surface

suspension bactérienne

gélosé

Photo 5 :Les étapes de l’ensemensement 3.4.3. L’application des disques : Au bout de 15 mn de séchage, les disques choisis sont posés à l’aide d’une paire de pinces stériles. Les disques doivent être parfaitement appliqués à plat sans glissement, une distance de 15 mm doit séparer un disque périphérique au bord de la boîte et deux disques doivent être éloignés au moins de 30 m entre en centre de sorte que les zones d’inhibition ne se chevauchent pas. •

Le choix des antibiotiques

Le choix s’effectue selon l’état d’étude, dans notre travail les antibiotiques testé sont : Ticarcilline (Tic), la pipéracilline (Pip), la ceftazidime (Caz), L’imipénème (Ipm), Ticarcilline + acide clavulanique (TCC).

49


Partie pratique

Matériels et méthodes

Photo 6: le dépôt des disques d’antibiotique sur le Muller-Hinton  Recherche de β-lactamase à spectre élargie La recherche de la β-lactamase à spectre élargi se fait dans les conditions standards de l’antibiogramme en déposant un disque de ticarcilline + acide clavulanique (TCC) à 30mm (centre à centre) d’un disque de céphalosporine de 3ème génération ceftazidime (CAZ). Le test est positif s’il y a apparition d’une image de synergie ou « bouchon de champagne » entre les disques : Ticarcilline+ acide clavulanique et la ceftazidime

Photo 7 : Position de disque

50


Partie pratique

Matériels et méthodes

3.4.4. Incubation et lecture : Avant l’incubation à 37°C pendant 18-24 heures, Il est important d’observer une prédiffusion des antibiotiques de 30 minutes à température ambiante avant de porter les boîtes à l’étuve. La lecture s’effectue en mesurant le diamètre de la zone d’inhibition de chaque disque d’antibiotique à l’aide du pied à coulisse, puis comparée aux valeurs critique (annexe) La mesure de ses diamètres permet de classer la bactérie en 3 catégories : sensible (S) intermédiaire (I), résistant (R).

Photo 8 : La lecture de l’antibiogramme à l’aide d’un pied de coulisse

51


Partie pratique

Résultats et discussion

II-Résultat et discussion 1. Isolement A partir des cultures les différents prélèvements, plusieurs souches bactériennes d’aspects morphologiques différents ont été isolées et purifiées par le repiquage. L’une des souches produit une pigmentation verte, diffusant dans toute la boite de Pétri. De plus, une odeur caractéristique de la fleur de seringa s'exhale de ses cultures. La forme des colonies isolées sont de grande taille avec un aspect bombé au centre présentant de reflet métallique et au contour irrégulier (colonies la « large »). Les caractères culturaux observés après l’isolement orienté l’identification vers le groupe de Pseudomonas aeruginosa. Ces bactérie isolés caractérisent par une odeur aromatique de seringa due à la production d’ortho-amino-acétophénone, intermédiaire du métabolisme de tryptophane; leurs colonie plus souvent large et bombé au centre (œufs sur le plat) avec un conteur irrégulier et un reflet métallique qui résulte de la production des protéolytiques ; production une pigmentation verte de pyocyanine (Eyquem et Montagnier, 2000).

Photo 9 : l’aspect des colonies de P.aeruginosa dans une boite de pétrie

52


Partie pratique

Résultats et discussion

2. Identification  L’examen à l’état frais L’examen à l’état frais montre que les souches bactériennes de Pseudomonas aeruginosa

sont des bacilles mobiles grâce à un flagelle polaire généralement unique

(Hafiane et Ravaoarinoro, 2008).  Coloration de Gram Après la coloration de Gram les souches purifiées sont apparue sous forme des bacilles rose. Elles

possèdent des parois à Gram négative. Chez les bactéries à Gram négatif :

l’éthanol mis au contact des cellules colorés, solubilise les lipides de leur paroi, avant de pénétrer leur cytoplasme et de dissoudre les complexes formé par le violet de gentiane le lugol. Ces derniers sont alors perdus, à travers la paroi devenue poreuse. Les cellules ainsi décolorées deviennent accessibles et absorbent la fuschine qui les recolore en rose (Bousseboua, 2002).  Recherche de l’oxydase La zone réactionnelle sur le disque oxydase est colorée en bleu ou bleu-violette. Ce qui suggère la présence du cytochrome oxydase (Joffin et Leyral, 2006).  Recherche de catalase Le dégagement de bulles de gaz signifie qu’il y a production de l’enzyme catalase et que le test est positif. La catalase est une enzyme contenant du fer, qui catalyse la décomposition du peroxyde d’hydrogène (H2O2) en eau et en oxygène. Synthétisée par la plupart de bactéries aérobies (Delarras, 2007).

Photo.10: test catalase

Photo. 11: test oxydase 53


Partie pratique

Résultats et discussion

 Mise en évidence des pigments Le milieu King B est coloré en jaune et King A en vert, ce qui signifie la présence de pyocyanine dans le King A et la pyoverdine dans le King B. (Le Minor et Veron, 1989).

King A

King B

Photo 12: la mise en évidence des pigments dans le King A et B.

3. Antibiogramme Après incubation, les disques s’entourent de zones d’inhibition circulaires correspondant à une absence de culture (photo.13). Lorsque la technique est parfaitement standardisée, les diamètres des zones d’inhibition dépendent uniquement de la sensibilité du germe. La lecture de l’antibiogramme consiste à déduire à partir de la mesure de ces diamètres, le caractère sensible, résistance ou intermédiaire. Les résultats des antibiogrammes réalisés sont résumés dans le tableau 6.

54


Partie pratique

Résultats et discussion

Photo.13: Les zones d’inhibition des antibiotiques testés.

Tableau 06 : Profil de résistance aux β-lactamines de 12 souches de P. aeruginosa.

BLSE

ATB souches

TIC PIP

CAZ TCC IMP

1 2

S R

S R

S R

S I

S S

-

3 4

S R

S R

S R

S R

S S

+

5

R

R

R

I

S

-

6 7

S R

S R

S R

S R

S S

+

8

S

S

S

S

S

-

9 10 11

R S R

R S R

R S R

R S R

S S S

+ +

12

S

S

S

S

S

-

Antibiotique (ATB), Ticarcilline (Tic), la pipéracilline (Pip), la ceftazidime (Caz), l’imipénème (Ipm), Ticarcilline + acide clavulanique (TC), cefsulodine (Cfs), ceftazidime. (R) résistance, (S) sensible, (-) négative, (+) positif, (I) intermédiaire, (BLSE) beta-lactamase à spectre élargie.

55


Partie pratique

Résultats et discussion

Sur les douze souches de Pseudomonas aeruginosa isolées quatre (4, 7, 9, 11) ont présentaient un profils BLSE qui se traduit sur l’antibiogramme par un bouchon de champagne (test de synergie) due à l’inhibition d’une céphalosporine de troisième génération (CAZ) par l’acide clavulanique (Lahlou et al., 2007). Deux souches (2, 5) présentant un profil de résistance à haut niveau correspondant à la production de céphalosporinase à haut niveau (résistance à céphalosporine de troisième génération (CAZ)). (Arsalane et al., 2010)

CAZ

TCC

CAZ

TCC

Photo.14 : profils de BLSE « bouchon de champagne »

Photo.15 : profils de résistance à haut niveau

56


Conclusion


Conclusion Les infections à bacille pyocyanique occupent une place importante au sein des infections nosocomiales avec une fréquence estimée entre 20 et 30 % et possèdent un pronostic sévère. Depuis l'avènement des antibiotiques, les bactéries ont acquis des mécanismes de résistance. Tous les antibiotiques peuvent sélectionner des BMR et favoriser leur persistance. Ainsi, l'émergence des bactéries multirésistantes est étroitement liée à la consommation des antibiotiques en médecine libérale comme dans les établissements de santé. Le non respect des précautions d'hygiène lors des soins facilite la transmission des BMR d'une personne à l'autre ou par contacts avec son environnement contaminé. Les bactéries, résistantes ou non, se transmettent très facilement par manuportage.

Une infection par une bactérie multirésistante implique des traitements plus longs avec des antibiotiques plus onéreux et d'utilisation plus complexe. Les malades infectés par une bactérie multirésistante sont hospitalisés plus longtemps. Être porteur d'une bactérie multirésistante

ne signifie pas forcément être atteint d'une infection nosocomiale et

inversement, les infections nosocomiales ne sont pas toutes des infections à bactéries multirésistantes. Dans les établissements de santé comme en médecine libérale, les soignants et les patients peuvent être simplement porteurs pour une durée de quelques mois ou plus.


Références bibliographiques


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Annexes


Table de lecture 3* : Valeurs critiques des diamètres des zones d’inhibition et des CMI pour Pseudomonas aeruginosa Conditions du test : Milieu : Gélose Mueller- Hinton Contrôle de qualité : Inoculum : Colonies en suspension, 0,5 Mc Farland Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Incubation : 35°C, atmosphère ordinaire ; 18h. Charge des disques

Diamètres critiques (mm)

CMI critiques (µg/ml)

Antibiotiques testés Résistant

Intermédiaire

Sensible

Résistant

Sensible

≤14

---

≥15

≥128

≤64

75 µg 75/10 µg

≤14

---

≥15

≥128/2

≤64/2

Pipéracilline

100 µg

≤17

---

≥18

≥128

≤64

Ceftazidime

30 µg

≤14

15-17

≥18

≥32

≤8

Aztréonam

30 µg

≤15

16-21

≥22

≥32

≤8

Imipenème

10 µg

≤13

14-15

≥16

≥16

≤4

Amikacine

30 µg

≤14

15-16

≥17

≥32

≤16

Gentamicine

10 µg

≤12

13-14

≥15

≥8

≤4

Netilmicine

30 µg

≤12

13-14

≥15

≥32

≤12

Tobramycine

10 µg

≤12

13-14

≥15

≥8

≤4

5µg

≤15

16-20

≥21

≥4

≤1

-lactamines : Ticarcilline Ticarcilline + ac.clavulanique

Aminosides

Quinolones Ciprofloxacine


La composition chimique des milieux de cultures  Milieux d’isolement Les milieux d’isolements sont des milieux qui permettent d’effectuent les testes d’identification ou d’étudier la sensibilité aux antibiotique des bactéries d’intérêts médicale. Seules les géloses les plus couramment utilisées seront abordées.  Gélose nutritive Sa composition est la suivante -

Extrait de viande de bœuf : 1 g /l

-

Extrait de levure : 2g/l

-

Peptone : 5g/l

-

Chlorure de sodium.

-

Agar :15g/l

-

PH : 7,4-+ 0,2

 Gélose de Muller- Hinton L’utilisation de cette gélose est recommandée par le comité de l’antibiogramme de la société française de microbiologie. Ce milieu utilisé pour tester la sensibilité des bactéries aux antibiotiques : sa composition est la suivante : -

Infusion de viande de bœuf : 30 g/l

-

Hydrolysat de caséine : 17,5 g /l

-

Amidon 1,5 g/l

-

Agar 17 g/l

-

PH : 7,4 -+ 0,2

 King A Mise en évidence de la pyocyanine de pseudomonas aeruginosa. -

Peptone : 20 g

-

Glycérol 10 g

-

Sulfate de potassium 10 g

-

Chlorure de magnésium 1,4 g


-

Agar purifié 12 g

-

PH =7,2

 King B Mise en évidence de la pyoverdine de pseudomonas aeruginosa. -

Polypeptone 20 g

-

Glycérol 10

-

Hydrogénophosphate de potassium 1,5 g

-

Sulfate de magnésium heptahydrate 1,5 g

-

Agar purifié 12 g

-

PH 7,2


RÊsumÊ Pseudomonas aeruginosa est l’un des principaux agents pathogènes incriminÊ dans les infections nosocomiales. Les infections nosocomiales causÊes par cet organisme sont souvent difficiles à traiter du fait de la rÊsistance intrinsèque à la fois de l’espèce et sa remarquable capacitÊ à acquÊrir d'autres mÊcanismes de rÊsistance à plusieurs groupes d'agents antimicrobiens, y compris les β-lactamines. La dÊtection des profils de rÊsistance acquise des souches de Pseudomonas aeruginosa isolÊes au niveau des hôpitaux permet une prise en charge efficace et la mise en place des . prÊcautions de prÊvention. Mots clÊs : Pseudomonas aeruginosa, β-lactamines, rÊsistance, BLSE

Abstract Pseudomonas aeruginosa is o major pathogene implicated in nosocomial infections. Nosocomial infections caused by this organisme are often difficult to treat because of the intrinsic resistance of both the species and its remerkable ability to acquire additional resistance mechanisms to several groups of antimicrobial agents,including Ă&#x;- lactam antibiotics. Detection of acquired resistance profiles of Pseudomonas aeruginosa strains isolated in hospitals enebles effective management and implementation of preventive care. Keywords : Pseudomonas aeruginosa, Ă&#x;- lactam, resistance, ESBL

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 ا   ا Řą  Ů&#x2C6;Ů&#x2030; ا ŘŞâ&#x20AC;ŹPseudomonas aeruginosa â&#x20AC;ŤŘšâ&#x20AC;Ź# â&#x20AC;Ť( '&ا اâ&#x20AC;Ź+ â&#x20AC;ŤŮ&#x2C6; اâ&#x20AC;Ź, â&#x20AC;Ť اâ&#x20AC;Ź-( â&#x20AC;ŤŘŹ ďş?â&#x20AC;Ź0 â&#x20AC;Ť( اâ&#x20AC;Ź1 â&#x20AC;ŤŮ&#x2020;â&#x20AC;Ź$â&#x20AC;Ť (  ďş&#x2022;â&#x20AC;Ź3Ř&#x152; â&#x20AC;ŤŘŞâ&#x20AC;Ź#$ â&#x20AC;Ť اâ&#x20AC;Ź%&â&#x20AC;ŤŮ&#x2C6;Ů&#x2030; ا ŘŞ ا  ďş&#x2022; ((' Ů&#x2021;â&#x20AC;Ź β- 4 â&#x20AC;Ť ďş?   Ř°â&#x20AC;ŹŘ&#x152;â&#x20AC;ŤŰ&#x152;â&#x20AC;Ź7 â&#x20AC;Ťدات اâ&#x20AC;Ź9 â&#x20AC;ŤŮ&#x2C6; ŘŠ أاؚ  اâ&#x20AC;Ź, â&#x20AC;Ť @? اآ ب < ŘŞ اâ&#x20AC;Ź7â&#x20AC;Ťع؊ ا اâ&#x20AC;ŹA -( â&#x20AC;ŤŮ&#x2C6;ďş?â&#x20AC;Ź  â&#x20AC;ŤŘ°ŘŠâ&#x20AC;ŹFG â&#x20AC;Ť اâ&#x20AC;ŹPseudomonas aeruginosa â&#x20AC;ŤŘŞâ&#x20AC;ŹB0 @ ( $ â&#x20AC;ŤŮ&#x2C6; اâ&#x20AC;Ź, â&#x20AC;Ť اâ&#x20AC;ŹC0 D E$ â&#x20AC;ŤŘ§â&#x20AC;Ź.lactamines A â&#x20AC;Ť& ا Ű&#x152; اâ&#x20AC;Ź#â&#x20AC;ŤŘŻŘ§ŘąŘŠ Ů&#x2C6;ďş&#x2022;â&#x20AC;ŹHâ&#x20AC;Ť اâ&#x20AC;ŹCâ&#x20AC;ŤŘ§ ŘŞ ďş&#x2022;â&#x20AC;Ź BLSE Ř&#x152;â&#x20AC;ŤŮ&#x2C6;â&#x20AC;Ź, â&#x20AC;Ť اâ&#x20AC;ŹŘ&#x152;β-lactamines Ř&#x152;Pseudomonas aeruginosa : â&#x20AC;Ť@ ŘŞ اâ&#x20AC;Ź$ â&#x20AC;ŤŘ§â&#x20AC;Ź

mémoire de fin d'étude master BBM  

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