Page 1

Introducci贸

1


Introducci贸

2


Introducció

1. INTRODUCCIÓ 1.1 Tècniques de transfecció Amb l’objectiu de conèixer millor la regulació gènica i la funció que desenvolupen les proteïnes a les cèl·lules s’han desenvolupat les tècniques de transfecció. Aquestes permeten introduir a la cèl·lula àcids nucleics mitjançant mètodes químics o físics. En els químics (Figura 1) les cèl·lules incorporen per endocitosis (PEI, fosfat càlcic o DEAE dextrà) o per membranes (lipofecció) complexos formats per DNA i molècules. D’altra banda, quan s’introdueix directament la molècula a la cèl·lula són mètodes físics. Un mètode químic és el de fosfat càlcic, que consisteix en la formació de complexos entre el clorur de calci i el DNA. Aquest complex protegiria el DNA de la degradació a l’interior cel·lular. També, la resina DEAE, emprada en el mètode DEAE dextrà, s’uneix a les carregues negatives del DNA i els complexos entren a les cèl·lules per xoc osmòtic. Finalment, en el mètode químic de PEI, aquesta molècula forma els complexos amb el DNA i facilita la seva endocitosi i entrada cel·lular. El mètode químic de lipofecció es basa en la formació de complexos entre lípids catiònics y DNA, així tenen afinitat per la membrana i entren al citosol com liposomes. Figura 1. Mètodes químics de transfecció: fosfat càlcic, DEAE dextrà i lipofecció.

Els mètodes físics són per: microinjecció directa, és molt efectiva però molt laboriosa; per electroporació, fent més permeable la membrana cel·lular perquè entri el DNA; i la biobalística, on es dispara contra la cèl·lula el DNA recobert per micropartícules denses d’or o tungstè per exemple.

1.2 Transfecció amb PEI Un tipus de mètodes químics es basa en la utilització de PEI (polyethylinimine) (Figura 2). Aquest forma complexos amb el plàsmid que volem introduir a la cèl·lula. El complex PEIplàsmid entra en contacte amb la membrana plasmàtica i s’inicia el procés d’endocitosi, amb la conseqüent invaginació de la membrana i entrada del complex a l’interior cel·lular. Un cop al

3


Introducció Plàsmid

citosol, la nova vesícula o endosoma es

PEI

protonitza perquè entren ions H+ i Cl- al seu

interior.

Això,

1.

augmenta

Complex PEI-DNA

l’osmolaritat i per contrarestar-ho també entra aigua. D’aquesta manera augmenta el volum d’aigua i la pressió que

Ext.

exerceix a dins de la vesícula endosomal fins que es llisa i s’allibera el complex

Int.

endocitosis

2.

endosoma

PEI-plàsmid al citosol. Finalment quan la cèl·lula es divideixi incorporarà el plàsmid al nucli i l’expressarà. H+ ClH2O

Mitjançant aquestes tècniques de transfecció es poden visualitzar

3.

5.

estructures subcel·lulars directament, 4.

sense necessitat de fixar ni matar la cèl·lula. Això s’aconsegueix perquè el plàsmid que introduïm a la cèl·lula codifica per una proteïna de l’estructura

Figura 2. Esquema del procés de transfecció amb PEI. 1. Unió i formació del polyplex PEI-DNA. 2. Invaginació de la membrana plasmàtica i formació de l’endosoma. 3. Entrada d’ions i d’aigua. 4. Llisis. 5. Complex PEI-DNA lliure al citosol.

subcel·lular que ens interessa fusionada amb una proteïna fluorescent. Quan s’expressa el plàsmid la proteïna emetrà fluorescència i es podrà veure al microscopi de fluorescència o al confocal. L’expressió del vector està regulada pel promotor que porta, i en funció del tipus d’expressió que interessi per l’estudi el promotor tindrà unes característiques determinades. Al vector també hi ha resistències a antibiòtics per seleccionar les cèl·lules o bacteris que han incorporat el plàsmid o les que no. Living Colors ® (Clontech) comercialitza una gran varietat de vectors per diferents orgànuls i

Figura 3. Orgànuls i citoesquelet diana dels vectors de Clontech.

Figura 4. Combinacions de fluorescències recomanades per Clontech.

4


Introducció

citoesquelet (Figura 3), i permet combinar els diferents colors per veure varies estructures alhora (Figura 4). Els plàsmids (Figura 5) de Clontech tenen una mida d’uns 4-6 kilobases aproximadament. L’expressió de la proteïna del plàsmid està regulada per un promotor de CMV (PCMVIE). Els vectors tenen un origen de replicació SV40 que permet transcriure una resistència a neomicina per seleccionar les cèl·lules de mamífers. Els plàsmids també es poden introduir a E.coli que produeix una resistència a kanamicina a partir de l’origen P SV40 i una monocadena de DNA (ssDNA) a partir de l’origen f1.

A

C

B

D

Figura 5. Representació esquemàtica de quatre plàsmids. A: marca la membrana de color blau. B: marca l’actina de color groc. C: marca la tubulina de color verd. D: marca reticle endoplasmàtic de color vermell.

5


Introducció

L’eficiència de la transfecció varia en funció de factors com el PEI, el plàsmid i el tipus de cèl·lula a transfectar. Hi ha una gran varietat de molècules de PEI: ramificades o lineals, i de diferents pesos moleculars; i totes amb les seves propietats. Són tòxiques per les cèl·lules, per tant és important el temps d’exposició perquè hi hagi un equilibri entre les cèl·lules transfectades i les que es moren. El PEI conté àtoms de nitrogen en la seva estructura molecular, de manera que quan es ionitzen els

Figura 6. Estructura molecular d’un tipus de polietilenimina hiperramificat.

nitrògens interaccionen amb els grups fosfat dels àcids nucleics. Així els DNA i el PEI formen complexos també coneguts com polyplex.

2. MATERIAL I MÈTODES 2.1. Cultiu cel·lular Les cèl·lules VERO són una línia cel·lular aïllada de l’epiteli renal del mico verd Africà (Cercopithecus aethiops). Són una línia cel·lular continua aneuploide. Això vol dir que poden dividir-se durant molts cicles sense entrar en senescència, i que presenten un nombre anormal de cromosomes. Aquesta línia cel·lular va ser desenvolupada per primer cop en la Universitat de Chiba (Japó) per Yasumura i Kawakita. Al descongelar les cèl·lules i posar-les al flascó, s’enganxen al fons. Per dividir-se es desenganxen del fons del flascó, adopten una morfologia més rodona, es divideixen i tornen a adherir-se al fons del flascó. Així creixen fins crear una monocapa. En aquest moment les cèl·lules no es dividiran més perquè hi haurà inhibició per contacte entre elles. El medi de cultiu emprat per mantenir les cèl·lules és MEM suplementat. 2.2. Preparació de les plaques per transfectar La monocapa de cèl·lules es tripsinitza per tenir les cèl·lules en suspensió. Així es poden contar en la cambra de Neubauer. En funció del nombre de cèl·lules que hi ha al flascó, es sembra el volum que conté el nombre de cèl·lules desitjades en plaques de Petri de 35 mil·límetres de diàmetre. Aquestes plaques s’incuben 24 o 48 hores en funció de cada protocol. El millor és que en el moment de fer la transfecció hi hagi una confluència del 60-80% perquè volem un nombre elevat de cèl·lules que resisteixin la toxicitat del PEI; però no del 100% perquè hi hauria una monocapa i inhibició del cicle cel·lular per contacte, i l’objectiu és tenir cèl·lules que estiguin en divisió per que incorporin el plàsmid. A més les cèl·lules d’una monocapa estan més juntes i normalment tenen morfologies més geomètriques (rodones,

6


Introducció

rectangulars,...); en canvi si no hi ha monocapa, les cèl·lules tenen més prolongacions perquè tenen espai al voltant per fer-ho. 2.3. Protocols de transfecció Amb l’objectiu de trobar un protocol de transfecció adient per realitzar-ho a pràctiques de Biologia Cel·lular s’han provat diversos. A més es van provar variacions d’alguns passos per veure si l’eficiència de transfecció era millor. Les explicacions detallades y per passos dels protocol originals estan adjuntades a l’annex. 2.3.1. Protocol de pràctiques Es preparen les solucions del vector i de PEI diluint DNA i PEI (els volums varien en funció de les proves) amb NaCl 150 mM. S’afegeix la solució de PEI a la del DNA, es barregen i es deixen a temperatura ambient durant 30 minuts perquè formin el complex PEI-DNA. Passat el temps s’afegeix 0,5 ml de MEM sense sèrum a la solució de transfecció (complex PEI-DNA). S’elimina el medi de la placa de Petri de 35 mil·límetres i es fa un rentat amb 1 ml de MEM sense sèrum. S’afegeix la solució de transfecció a la placa i s’incuba 3 hores a 37ºC. Després s’afegeix medi MEM amb sèrum i es torna a incubar durant 24 hores. 2.3.2. Protocol CELLNTEC Afegir a 50 microlitres de MEM sense sèrum els micrograms de DNA i microlitres de PEI corresponents, i es barreja. S’incuba 8 minuts a temperatura ambient i s’afegeix 450 microlitres de MEM amb sèrum. Les cèl·lules de les plaques es renten amb PBS dos cops abans d’afegir-hi la solució de transfecció. S’incuben a 37ºC durant 2 hores. Finalment es renten 3 cops amb PBS, s’afegeixen 2 ml de MEM amb sèrum i es deixen incubar les cèl·lules a 37ºC durant 24 hores. 2.3.3. Protocol de l’article: “Polyethylenimine strategies for plasmid delivery to brain-derived cells” [1]. La relació N/P ràtio és la proporció que hi ha de PEI i de DNA en la solució de transfecció. La relació en les proves del protocol fet és de 2,25 microlitres de PEI per microgram de DNA.

7


Introducció

Es dilueixen 2 micrograms de DNA a 25 microlitres de HSB i 4,5 microlitres de PEI en uns altres 25 microlitres de HSB. Centrifugar o fer un pols dels dos eppendorfs i deixar-los 10 minuts a temperatura ambient. Després s’afegeix el PEI al DNA i es torna a centrifugar i a incubar durant 10 minuts a temperatura ambient. El dia anterior es van sembrar 400000 cèl·lules a les plaques de transfecció. Retirar el medi de cultiu d’aquestes i afegir 100 microlitres de MEM i 50 microlitres de la solució PEIDNA. S’incuba la plaqueta a 37ºC durant 30 minuts. Passat aquest temps, es treu la solució i s’afegeixen 500 microlitres de medi fresc. Això es deixa incubar a 37ºC durant dos dies.

3. RESULTATS I DISCUSSIÓ 3.1. Posada a punt de la tècnica de transfecció: Per intentar trobar una manera de transfectar amb una eficiència elevada es van provar de modificar diferents variables. La primera va ser el tipus de protocol de transfecció. Es van provar tres protocols diferents. Com a control positiu per poder comparar els resultats dels altres, es va establir el protocol de transfecció de pràctiques de Ampliació de Biologia Cel·lular. El protocol de l’article [1] donava un marcatge molt dèbil i una eficiència de transfecció baixa. Un altre protocol provat era de CELLNTEC. Els resultats obtinguts amb aquest són similars al control positiu quan es treballava amb plàsmids de peroxisoma i reticle endoplasmàtic. Els inconvenients eren que en algunes probes la mortalitat cel·lular era superior al control positiu i que no veiem marcatge de membrana. Aquest fet podria deures a un problema que hi havia amb els filtres del microscopi de fluorescència on es miraven les proves. Els filtres que hi ha al microscopi de fluorescència per veure els marcatges de color blau i verd són DAPI i NIBA,respectivament; i el fluorocrom dels plàsmids és Cyan. Aquest s’excita amb una longitud d’ona de 458 manòmetres i emet a 489. Els filtres DAPI (blau) i NIBA (verd) s’exciten, respectivament, amb longituds d’ones de 360/40 i 480 manòmetres aproximadament. Per aquesta raó la longitud d’ona que emet el fluorocrom és captada pel filtre de NIBA (verd), tot i que realment l’estructura deuria ser blava.

Filtre DAPI

Longitud d’ona d’excitació

Longitud d’ona d’emissió

470 - 490

515 – 550

8


Introducció

Filtre NIBA Fluorocrom Cyan

340 - 360 458

450 - 460 489

Taula 1. Longituds d’ones d’emissió i d’excitació dels filtres DAPI i NIBA i del fluorocrom Cyan.

Degut al desconeixement d’això, podria ser que alguna de les proves de CELLNTEC amb membrana donés una mica de marcatge. Però tot i així hi havia una altra cosa diferent. En els controls positius de membrana es veien amb el filtre DAPI algunes cèl·lules marcades. Eren cèl·lules mortes: rodones, no enganxades al fons de la placa i amb una superfície irregular. El marcatge d’aquestes es veia amb el filtre DAPI com una taca blava intensa. En canvi amb el protocol de CELLNTEC no es veien aquestes cèl·lules. Per aquest motiu podríem pensar que protocol de CELLNTEC no seria idoni per transfectar cèl·lules VERO amb el plàsmid de membrana plasmàtica. A part de provar diferents protocols, també es van canviar alguns passos del protocol de pràctiques. Per exemple, en el pas 7 (veure el protocol detallat a l’annex) es va afegir 0,5 ml de MEM suplementat en lloc de MEM sense suplementar per veure si així el plàsmid entrava amb més facilitat a l’interior de la cèl·lula. D’aquesta manera les cèl·lules agafarien molècules del medi suplementat i això facilitaria l’entrada dels plàsmids. Una altre modificació va ser fer tres rentats amb PBS al pas 9. També es van tenir les cèl·lules dos hores abans de fer el protocol de transfecció en medi sense suplementar, així al afegir el plàsmid i medi suplementat agafarien molècules de l’exterior amb més activitat per sobreposar-se del pas pel medi sense suplement. Cap d’aquestes modificacions de pràctiques va donar una eficiència major a la del protocol normal. Una altre variable que es va modificar a les proves va ser el nombre de cèl·lules sembrades el dia anterior a la placa de 35 mil·límetres de diàmetre. Sembrar 105 cèl·lules és molt poc. El dia d’observar les transfeccions (dos dies després de sembrar les cèl·lules a les plaquetes) no hi ha monocapa. N’hi ha menys nombre de cèl·lules marcades perquè el nombre sembrat és menor que a les altres proves, però encara hi havia força cèl·lules marcades. Si sembrem 3x105 cèl·lules, dos dies després la plaqueta està massa atapeïda. Hi ha monocapa i les cèl·lules tenen una mida menor perquè estan molt juntes, atapeïdes. L’ideal és sembrar entre 1,5-2x10 5. El dia d’observar les transfeccions hi ha una confluència del 95%. És a dir, encara no hi ha inhibició per contacte a algunes regions i hi ha espai perquè creixin les cèl·lules. Això permet veure algunes cèl·lules grans i amb formes molt vistoses.

9 Figura 7. Marcatge de tubulina.


Introducció

En les dues imatges de la figura set es veuen bé aquests fets. Com no hi ha monocapa ni moltes cèl·lules, la cèl·lula de la imatge ha pogut créixer amb una morfologia més distesa. No es veu una morfologia rodona i més limitada per la presencia de cèl·lules al costat com quan hi ha monocapa. Altres proves realitzades consistien en variar les concentracions de DNA, i en conseqüència la quantitat de PEI. Com hem dit abans, el PEI és tòxic per les cèl·lules. Però tampoc podem posar poc PEI perquè les cèl·lules no incorporarien el plàsmid. Primer es va determinar la quantitat màxima de PEI, què és de 27 microlitres o 12 micrograms de DNA. En aquestes proves es veia molta mortalitat, poques cèl·lules vives i gairebé cap marcada. A partir d’aquí es van reduir les quantitats de PEI fins13,5 (o 6 micrograms de DNA) i 9 microlitres(o 4 micrograms de DNA). Amb la prova de 13,5 microlitres hi ha una mica més de mortalitat que en l’altre però les dues serien vàlides perquè hi ha marcatge. Així doncs la majoria de proves es van acabar fent amb 4 micrograms de DNA, i si s’utilitzen dos plàsmids 2 micrograms de cadascun. 3.2. Posada a punt de cada plàsmid: No tots els plàsmids tenen la mateixa eficàcia alhora de transfectar cèl·lules. Per exemple, els plàsmids de reticle endoplasmàtic, peroxisoma o mitocondri són més fàcils de transfectar que no pas el de membrana plasmàtica. A l’annex hi ha adjuntades les taules amb totes les proves realitzades i els resultats. 3.2.1. Actina. El plàsmid d’actina rep el nom de pEYFP-Actin i conté una proteïna de fusió de la proteïna groga (enhanced yellow fluorescent protein) i la βactina humana. L’estructura cel·lular que marca són els microfilaments cel·lulars. Aquest plàsmid dona bons resultats si es transfecta sol o amb un altre. L’inconvenient és que al microscopi de

10 Figura 8. Marcatge d’actina al microscopi confocal.


Introducció

fluorescència el veiem de color verd, quan realment és un marcatge groc. Això fa que no es pugui combinar amb plàsmids fluorescents verds ni blaus perquè no es diferenciarien les estructures. S’ha trobat marcatge a totes les proves fetes amb el plàsmid d’actina.

3.2.2. Endosoma. El plàsmid d’endosoma rep el nom de pEYFP-Endo. En ell hi ha una proteïna de fusió de la proteïna groga (enhanced yellow fluorescent protein) i c-Myc i RhoB. La GTPasa RhoB permet visualitzar el tràfic intracel·lular e intuir el processos d’endocitosi. Per obtenir marcatge quan transfectem sols aquest plàsmid cal que posem 6 micrograms de DNA. Al fer duets de plàsmids, dos micrograms de DNA de cada plàsmid, sols dona resultats bons quan es combina amb plàsmids vermells (mitocondri i reticle). Davant la diferència entre la quantitat de DNA utilitzat quan el transfectem sol o amb un altre plàsmid, semblaria que la presencia d’un segon plàsmid (de mitocondri o reticle) afavoriria l’entrada del plàsmid d’endosoma.

Figura 9. Marcatge d’endosoma. M. de fluorescència

3.2.3 Golgi. pECFP-Golgi és el nom que rep el plàsmid que conté una proteïna de fusió de la proteïna cyan (enhanced cyan fluorescent protein) i l’extrem N-terminal del precursor de la beta 1,4-galactosiltransferasa humana (hGT). Per això, el marcatge que veiem es localitza en la regió trans-medial de l’aparell de golgi. De les proves realitzades només hi ha una que va donar fluorescència. Va ser la barreja endosoma-golgi. Tot i que els dos es veien de color verd al microscopi de fluorescència, les cèl·lules presentaven un marcatge més o menys general per tot el citoplasma, i una regió més intensa que podria correspondre al golgi. A la barreja golgi-mitocondris semblava que el que es Figura 10. Endosoma i golgi.

veia pel filtre verd era la mateixa fluorescència vermella dels

11


Introducció

mitocondris perquè el marcatge que s’observava pels dos filtres era molt similar. A més a més, de l’aparell de golgi esperaríem un marcatge d’una regió puntual i no gaire estesa com es veia. 3.2.4 Membrana plasmàtica. El plàsmid de membrana plasmàtica, anomenat pECFP-Mem, conté una proteïna de fusió de proteïna cyan (enhanced cyan fluorescent protein) i l’extrem N-terminal de reconeixement a membrana de la neuromodulina (GAP-43). En les transfeccions d’aquest plàsmid sol, la mortalitat cel·lular era superior que amb altres plàsmids i l’eficiència de transfecció era menor, hi havia menys marcatge. Al fer els duets sembla que millora una mica l’eficiència però no la mortalitat. Pot ser al haver un segon plàsmid, aquest afavoriria l’entrada del de membrana. Als duets amb altres plàsmids no s’utilitzaven 2 micrograms de DNA de cada plàsmid; sinó que es barrejava una mica més del de membrana plasmàtica que de l’altre. Per exemple, es barrejava 4 o 3 micrograms de membrana i dos de l’altre plàsmid, o 3 de membrana i 1 de l’altre plàsmid (en total 4 micrograms de DNA) per tal de que la quantitat de PEI no fos molt elevada i hi hagués menys mortalitat. 3.2.5 Mitocondri. El pDsRed2-Mito és el plàsmid que marca els mitocondris. Concretament conté una proteïna de fusió de la proteïna vermella (Discosoma sp. Red fluoresent protein) i la seqüència de la subunitat VII del citocrom oxidasa c. Aquest plàsmid, juntament amb el de reticle endoplasmàtic, peroxisoma i nucli, és molt fàcil de transfectar. En la majoria de proves hi havia molt marcatge. 3.2.6. Nucli. El plàsmid de nucli s’anomena pECFP-Nuc i conté una proteïna de fusió de la proteïna cyan (enhanced cyan fluorescent protein) i el senyal de localització nuclear (NLS) de l’antigen SV40 T. Quan es veuen les cèl·lules amb el nucli marcat presenten dues regions marcades: una més intensa que sembla ser el nuclèol, i la regió del voltant menys intensa però que també és nucli. Totes les proves amb aquest

plàsmid

han

sortit

correctes

12 Figura 11. Marcatge de nucli. Imatge fluorescent i amb llum blanca.


Introducció

3.2.7. Peroxisoma. El plàsmid de peroxisoma, anomenat pEGFP-Peroxi, i conté una proteïna de fusió de la proteïna verda (enhanced green fluorescent protein) i peroxisomal targeting signal 1 (PTS 1) que a la vegada codifica pel tripèptid SKL que te com funció dirigir la proteïna de fusió a la matriu dels peroxisomes. Les proves realitzades amb aquest plàsmid són correctes, fins i tot duets amb altres plàsmids on s’ha posat un microgram del plàsmid de peroxisoma. L’eficiència de transfecció, al igual que amb mitocondri i reticle, és molt elevada. 3.2.8. Reticle endoplasmàtic. pDsred2-ER és el nom que rep el plàsmid que conté una proteïna de fusió de la proteïna vermella (Discosoma sp. Red fluoresent protein) i la

seqüència

de

reconeixement

de

reticle

endoplasmàtic de la calreticulina. El marcatge d’aquest plàsmid és correcte, sempre que s’ha utilitzat individual o barrejat amb un altre plàsmid ha donat marcatge. Cal remarcar però la combinació d’aquest més el plàsmid de peroxisoma. Totes les proves realitzades amb aquests dos plàsmids han donat marcatge.

Figura 12. Marcatge de reticle endoplasmàtic.

3.2.9. Tubulina. El plàsmid de tubulina, anomenat pEGFP-Tub, conté una proteïna de fusió de la proteïna verda (enhanced green fluorescent protein) i anti-alfa tubulina humana. D’aquesta manera el que és marquen són els microtúbuls en formació. Amb aquest plàsmid també s’han obtingut proves positives individualment i en duets. Per poder veure cèl·lules amb morfologies diferents i no rodones, és millor sembrar un nombre més baix de cèl·lules com hem comentat anteriorment. Així no hi haurà monocapa però tampoc veurem cèl·lules tant rodones.

13


Introducció

3.2.10. Combinació de tres plàsmids. Es van dur a terme algunes proves on a la solució de transfecció hi havia tres plàsmids. Era difícil, perquè l’entrada dels plàsmids a les cèl·lules és aleatòria, però si que es podien trobar algunes cèl·lules amb el triple marcatge. Les concentracions de DNA estan indicades a la taula adjuntada a l’annex.

Figura 13. Triple marcatge de membrana plasmàtica (verd), nucli (verd) i mitocondri (vermell). Microscopi de fluorescència.

Figura 14. Triple marcatge de membrana plasmàtica (blau), nucli (blau) i reticle endoplasmàtic (vermell). Microscopi Confocal.

3.3. Conclusions generals: De forma general i segons els resultats obtinguts, per a la majoria de plàsmids i combinacions d’aquests el millor és: sembrar el dia anterior de la transfecció 1,5-2x10 5 cèl·lules; i utilitzar 4 micrograms de DNA ( o dos de cada plàsmid al fer duets) i 9 microlitres de PEI. Amb aquestes quantitats gairebé sempre es troba marcatge.

14


Introducció

4. REFERÈNCIES: [1] C.Zhang, P. Yadava, J. Hughes; Polyethylenimine strategies for plasmid delivery to brainderived cells. Methods 33 (2004) 144-150. Altres articles consultats: -

Florea BI, Meaney C, Junginger HE, Borchard G; Transfection efficiency and toxicity of polyethylenimine in differentiated Calu-3 and nondifferentiated COS-1 cell cultures. AAPS PharmSci. 2002;4(3):E12.

-

Sharon E. Reed, Elizabeth M. Staley, John P.Mayginnes, David J. Pintel, Gregory E. Tullis; Transfection of mammalian cells using linear polyethylenimine is a simple and effective means of producing recombinant adeno-associated virus vectors. Journal of Virological Methods 138 (2006) 85-98.

Les figures 3 i 4 van ser importades de la pàgina http://www.clontech.com/ durant el més d’agost del 2007.

15


Introducció

5. VALORACIÓ PERSONAL Poques coses hi ha a dir en la valoració de les pràctiques, perquè des del meu punt de vista ha anat tot molt bé. Al començament se’m va explicar la feina que tenia que fer, i vaig començar a anar sol. Potser em va fer una mica de por, perquè tot era nou per a mi, mai havia treballat a un laboratori. Però, el fet d’estar sol alhora de treballar, també em sembla correcte perquè s’aprèn a ser més responsable, no et pots saltar cap pas perquè no hi ha ningú al darrera per recordar-t’ho. Tot i això, ràpidament vaig veure que no tenia que patir. Quan dubtava d’alguna cosa o no sabia on trobar els instruments del laboratori sempre hi havia algú a qui li podia preguntar i que m’ajudava. Els únics inconvenients els he trobat amb el software dels microscopis. Per fusionar les fotografies primer vaig utilitzar el Photoshop. Cap de les imatges m’agradava perquè quedaven els colors molt apagats i si augmentava la brillantor el fons negre es tornava grisos. Però un dia em vaig assabentar que amb el programa de capturar imatges del microscopi de fluorescència (Cell A) també es podien fusionar. Ho vaig provar i les imatges resultants eren molt més bones: el fons es mantenia negre però els colors de la fluorescència eren molt vius. Al final vaig desestimar totes les imatges fusionades al Photoshop per les fusionades al “Cell A”. L’altre inconvenient va ser amb el programa del microscopi confocal. Sabia fer anar les quatre funcions bàsiques, i intentava combinar-les perquè les imatges sortissin bé. Sempre m’ha fet cosa tocar allò que no se com funciona. Em semblaven imatges bones, fins l’últim dia. Quan vaig anar amb l’Oriol i va trobar l’opció que buscava (line average), vaig pensar que podria haver fet una mica millor la feina, haver obtingut fotografies més bones. Però desconeixia aquesta opció. Per aquest últim aspecte crec que he acabat sense una satisfacció del cent per cent. Se que podria haver aconseguit imatges millors, amb més resolució. Però això no fa que no acabi content les pràctiques. La utilitat que trauré d’aquestes pràctiques? De moment ja vaig utilitzar imatges i vídeos del confocal per fer unes explicacions a alumnes de segon de batxillerat de les pràctiques

16


Introducció

del CAP. Si acabo en la docència se que em seran útils. Si no treballo com a docent i estic a un laboratori, les pràctiques em serviran per haver estat durant un temps en un lloc on l’ambient de treball és molt bo. És a dir, al departament tothom és molt simpàtic i molt accessible; però a una feina real crec que no serà tan bo (al menys pel que he vist a on he treballat i pel que m’expliquen amics). En definitiva, estic molt satisfet de l’estada al departament. Potser durant les hores d’incubació podria haver ajudat a algú però algun cop que ho vaig preguntar em van dir que no calia. Però realment he aprés moltes coses, tot i que encara he d’aprendre a relacionar-me més amb els companys. 6. ANNEX: 6.1. Protocols dels tipus de transfeccions dutes a terme: 6.1.1. Protocol de transfecció de pràctiques: 1. Preparar la solució del vector: barrejar els microlitres de DNA amb els de NaCl 150 mM tenint en compte que per cada microgram de DNA s’han d’afegir 20 microlitres de NaCl 150 mM. 2. Preparar la solució de PEI: posar els microlitres de PEI tenint en compte que per cada microgram de DNA han d’haver-hi 2,25 microlitres de PEI. Diluir aquest PEI en els microlitres de NaCl, que venen donats tenint en compte que el volum final de la solució de PEI sigui igual al de la solució del vector. 3. Afegir la solució de PEI a la solució del vector i barrejar suaument amb la pipeta. Això serà la solució de transfecció. 4. Deixar a temperatura ambient 30 minuts perquè es formi el complex PEI/DNA. 5. Afegir 0,5 ml de medi MEM sense sèrum ni antibiòtics a la solució de transfecció. 6. Eliminar el medi de cultiu de les plaques de Petri de 35 mm sembrades el dia anterior amb 1,5-2x105 cèl·lules i fer un rentat amb 1 ml de medi Mem sense sèrum ni antibiòtic. 7. Afegir la solució de transfecció a la placa de Petri i deixar-ho incubar 3 hores a 37ºC. 8. Després de les tres hores, afegir 1,5-2 ml de Mem suplementat i incubar com a mínim un dia perquè expressin la proteïna fluorescent. 6.1.2. Protocol de transfecció de CELLNTEC: 1. A 50 microlitres de MEM sense sèrum ni antibiòtics afegir 2 micrograms de DNA i barrejar.

17


Introducció

2. Afegir 15 microlitres de PEI a una concentració de 15 micrograms per cada microlitre. 3. Incubar 8 minuts a temperatura ambient. 4. Fer dos rentats amb PBS de les plaques de Petri de 35 mm sembrades el dia anterior. 5. Afegir la barreja a la placa de Petri i incubar durant 2 hores. 6. Després de la incubació fer tres rentats amb PBS i afegir 2 ml de medi MEM suplementat. 7. Incubar tota la nit.

6.1.3. Protocol de transfecció de l’article: “Polyethylenimine strategies for plasmid delivery to brain-derived cells” [1]: 1. Preparar una solució stock de 50 mM de 25 kDa linear PEI, 50-100 kDa branched PEI i 25 kDa branched chain PEI. 2. Diluir per separat 2 µg de pGFP DNA plàsmid i PEI en 25 µl HSB (20 mM Hepes buffer, pH 7.4, 150 mM NaCl). 3. Vòrtex i centrifugar breument, i incubar a temperatura ambient durant 10 minuts. 4. La quantitat exacta de PEI depèn del ratio N/P a avaluar (IMPORTANT: a les proves fetes vam tenir en compte la mateixa relació que al protocol de pràctiques: 2,25 microlites de PEI per cada microgram de DNA). 5. En l’últim pas, afegir 25 µl de la solució de PEI a 25 µl de la solució de pGFP plàsmid inmediatament. 6. Vòrtex, centrifugar i guardar 10 minuts a temperatura ambient. 7. Treure el medi de cultiu de les plaquetes que volem transfectar. 8. Afegir 50 µl de PEI-DNA polyplex lentament als pous que contenen les cèl·lules i 100 µl de medi fresc. 9. Sacsejar per barrejar la solució i incubar a 37ºC durant 30 minuts. 10. Eliminar la solució de transfecció i afegir 500 µl de medi fresc. 11. Incubar a 37º durant dos dies abans de avaluar la eficiència de transfecció. 6.2. Taules amb els resultats: A les següents taules es recull tota la informació de totes les proves realitzades. La primera taula és un resum de les combinacions que es van dur a terme. Cal tenir en compte que al microscopi de fluorescència els plàsmids amb fluorescència groga i blava es

18


Introducció

veien pel filtre verd. Per aquesta raó moltes no s’han realitzat, perquè veuríem dos estructures del mateix color i es podrien confondre. A les altres taules hi ha les combinacions de plàsmids que es van fer, les quantitats de DNA i PEI, el protocol seguit, algunes observacions i si hi han imatges.

19

Transfecció cel·lular  

Optimització de la tècnica de transfecció cel·lular.