In questo modo, mescolando frammenti di restrizione, anche provenienti da DNA diverso, tagliati con la medesima endonucleasi, i frammenti aderiscono spontaneamente con le loro estremità coesive per un tempo sufficientemente lungo da rendere efficace l’azione di saldatura (formazione dei legami fosfo-diestere) della DNA-ligasi. L’enzima di restrizione EcoRI (leggi “Eco erre primo”), ad esempio, si lega a sequenze specifiche di DNA in doppia elica GAATTC. Taglia (idrolizza) in modo sfalsato i legami fosfodiestere tra Guanina ed Adenina su entrambi i filamenti (il taglio produce gruppi 3’-OH e 5’-fosfato), generando frammenti di DNA che hanno quattro basi sporgenti in singolo filamento alle estremità 5’ (estremità 5’ sporgenti).
La nomenclatura degli enzimi di restrizione prevede: 1. Le prime tre lettere, scritte in corsivo, sono prese dalla nomenclatura binomiale del batterio di origine. 2. Sierotipi differenti dello stesso organismo sono identificati da una quarta lettera minuscola (Es. Hind, Hinf). 3. Segue una lettera maiuscola o un numero, che identificano un ceppo particolare di quel batterio, ove fosse necessario. 4. Un numero romano indica l’ordine di scoperta, qualora dallo stesso batterio vengano isolati enzimi diversi. Ad esempio: Pst I Providencia stuarti (I enzima isolato) Eco RI Escherichia coli Ry13 (I enzima isolato) Eco RII Escherichia coli R245 (II enzima isolato)
8.2
cDNA (DNA complementare)
Gli enzimi di restrizione non sono l’unico modo per ottenere un inserto genico da inserire in un vettore. Attraverso l’enzima trascrittasi inversa (o retrotrascrittasi) è possibile catalizzare la trascrizione dell’mRNA in DNA. Dopo che è avvenuta la sintesi di un filamento singolo di DNA si assembla il secondo filamento di DNA, usando il primo come stampo. Il DNA che si forma in questo modo è detto cDNA (DNA complementare). Questa tecnica è utile quando si vuole far esprimere un gene umano ad un batterio. I geni umani sono infatti costituiti di sequenze codificanti (esoni) e sequenze non codificanti (introni) ed i batteri non possiedono le strutture adatte per eliminare gli introni prima di sintetizzare la proteina corrispondente. La molecola di mRNA che si è formata a partire dal gene ha già eliminato gli introni (splicing). Ricostruendo quindi il gene a partire dall’mRNA si ottiene una sequenza genica ‘pulita’ che i batteri potranno poi trasformare nella proteina corrispondente.
8.3
Vettori genici
I vettori genici sono delle sequenze di DNA di diversa natura nelle quali sia possibile inserire delle altre sequenze nucleotidiche (gene esogeno) e che siano in grado di integrarsi con il DNAbersaglio introducendovi il gene esogeno. Attualmente sono disponibili diversi tipi di vettori genici, la cui scelta dipende dalla natura (animale, vegetale, procariote) della cellula bersaglio che deve ricombinare il suo DNA e dalle dimensioni dell’inserto genico che devono ospitare.
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