Page 1

Matevž Likar Katarina Vogel-Mikuš

Navodila za laboratorijske vaje pri predmetu Fiziologija rastlin za študente biologije

2011


Praktikum fiziologije rastlin

Kazalo Temperaturna odvisnost encimov 6 Lipaza 6 Temperaturna odvisnost aktivnosti lipaze

6

Polifenol oksidaze 8 Aktivnost katehol oksidaze pri razliÄ?nih okoljskih pogojih

Semena in kalitev 11 Dihanje semen

11

Semena in kalitev 15 Testiranje viabilnost semen – tetrazolijev test Vaja 1: Viabilnost in kaljivost semen

15

15

Dormanca semen 19 Primarna (endogena) dormanca semen

19

Sekundarna (inducirana) dormanca semen 20 Mehanizmi prekinitve dormance

20

Zaznavanje kvalitete svetlobe

20

Vpliv svetlobe na kalitev 21 Vaja: Vpliv kvalitete svetlobe na kalitev solate

Mineralna prehrana rastlin 25 Vaja: Simptomi pomanjkanja nutrientov

Mikoriza 30 2

26

22

9


Praktikum fiziologije rastlin

Arbuskularna mikoriza

30

Vaja: Barvanje arbuskularno mikoriznih gliv s tinto

Asimilacijska barvila Klorofili

30

33

33

Karotenoidi 34 Fikobilini

34

Vaja: Absorpcijski spektri asimilacijskih barvil

Fotosinteza

34

36

Difuzija CO2 36 Asimilacija CO2 36 C-3

36

C-4

36

CAM – kisli metabolizem soÄ?nic 37 Omejitve mehanizmov za koncentriranje CO2 37 Vaja: Poraba CO2 pri fotosintezi

38

Vaja: Diurnalni kislinski cikel pri sukulentnih rastlinah Vaja: Kranz anatomija

39

Vaja: Hillova reakcija

41

39

Herbicidi 43 Obseg delovanja herbicidov

43

Mesto in mehanizmi delovanja herbicidov 43 Vaja: Vpliv herbicidov na rast rastlin

44

Vaja: DoloÄ?anje vsebnosti asimilacijskih barvil

45 3


Praktikum fiziologije rastlin

Flavonoidi Antociani

48 48

Flavoni in flavonoli 49 Vaja: Antociani

50

Vaja: Ločitev flavonolov in antocianov s tankoplastno kromatografijo

50

Askorbinska kislina 52 Vaja: Določanje vsebnosti askorbinske kisline Vodni potencial celice

52

54

Vaja: Vodni potencial celice

56

Transpiracija 58 Vaja: Merjenje intenzivnosti transpiracije

59

Vpliv rastnih regulatorjev na α-amilazno aktivnost

60

Model delovanja giberelinov: mobilizacija rezerv endosperma 60 Vaja: Vpliv giberelinov in abscizinske kisline na kalitev semen ječmena 61

Avksini in celična rast 63 Vpliv avksinov na podaljševanje izrezanih segmentov poganjkov graha 64

Vpliv avksinov in citokininov na regeneracijo korenin paradižnika 66 Vaja: Tkivna kultura paradižnika

Statistična obdelava podatkov t-test 78 4

66

78


Praktikum fiziologije rastlin

Korelacije in linearna regresija 80

Navodila avtorjem 90 Znanstveni članek 90 Oblikovanje strani in oblika članka

90

Naslov prispevka 90 Izvleček

90

Ključne besede

91

Uvod 91 Materiali in metode 91 Rezultati

91

Diskusija

92

Zaključki

92

Literatura

93

5


Praktikum fiziologije rastlin

Temperaturna odvisnost encimov Lipaza Mirujoča semena kloščevca (Ricinus communis) ne vsebujejo skoraj nič sladkorjev. Manjka tudi založni škrob. Namesto ogljikovih hidratov so v endospermu velike količine lipidov. Razpad lipidov na glicerol in proste maščobne kisline katalizira encim lipaza. Lipaza se v kloščevcu nahaja na membranah oleosomov (podobno kot v koruzi in bombažu), medtem ko se v arašidih, soji in bučkah nahaja na membranah glioksisomov. V obeh primerih so oleosomi in glioksisomi tesno drug poleg drugega. Proste maščobne kisline se naprej razgrajujejo z β-oksidacijo. Končni produkt je acetil-CoA. V glioksilatnem ciklu se acetil-CoA pretvori v sukcinat, ki se transportira iz oleosoma v mitohondrij. Tam se sukcinat preko fumarata pretvori v malat, ta pa v citosolu v oksalacetat in naprej v fosfoenolpiruvat, po poti glukoneogeneze. Sladkorji se skladiščijo v kotiledonih in osnih organih kalice. Proces pretvorbe maščob v sladkorje je zelo učinkovit: 1g maščob se pretvori v 1g ogljikovih hidratov ob 40% ohranitvi energije (v obliki ogljikovih vezi). Povprečno seme kloščevca vsebuje približno 260 mg lipidov (70 % suhe mase) in 15 mg ogljikovih hidratov. Po osmih dneh kalitve v temi (pri 25°C) je v njem samo še 50 mg lipidov. Količina ogljikovih hidratov lahko v tem času naraste na 230 mg.

▌Temperaturna ▌ odvisnost aktivnosti lipaze Material semena kloščevca (Ricinus communis), sončnice (Helianthus annuus), buče (Cucurbita sp.) in fižola (Phaseolus vulgaris), terilnice, 100ml erlenmajerice, 250ml čaše, 10 in 25ml menzure, bireta, skalpel, tehtnica, termometer, termostatirana vodna kopel, led, acetatni pufer pH 4,7 (v 200ml bučko dodamo 50 ml 1N ocetne kisline in 50 ml 1N amonacetata ter dopolnimo do oznake z destilirano vodo), dietileter, 96% etanol, 1M NaOH, fenolftalein, merilec pH, merilec pretoka, vmesnik LoggerPro, računalniški program LogerPro Hitrost delovanja lipaze merimo pri štirih različnih temperaturah. Prva delovna skupina pripravi z ledom hlajeno vodno kopel (v litrski čaši), ki naj ima 0°C. Druga skupina dela pri 15°C. Tretja inkubira pri sobnih pogojih, četrta in peta skupina si že pred začetkom dela pripravita vodne kopeli s 30 oz. 50°C. Semenom odstranimo testo in jih za vsako temperaturo odtehtamo štirikrat po 1 g. Vzorce stremo v terilnici z 10 ml pufra pH 4,7 in jih prenesemo v erlenmajerico. Inkubiramo jih 30 minut pri določeni temperaturi. Po tem času reakcijo ustavimo s 7 ml etra in 15 ml etanola. Količino prostih maščobnih kislin določimo tako, da celotni vzorec titriramo z 1M NaOH, ki ga natočimo v plastično bireto. Na pH meter namestimo magnetno mešalo. Merilec pH in merilec pretoka povežemo z vmesnikom LabPro in zaženemo program LoggerPro. Izberemo prednastavitve za titracijo s števcem kapljic. Zeženemo zajemanje podatkov, odpremo bireto in uravnamo pretok na 3-4 kapljic/min ter spremljamo spreminjanje pH. Ko pH preide nevtralno območje (pH 7.0), ustavimo pretok in zaključimo zajemanje 6


Praktikum fiziologije rastlin podatkov. Na diagramu preberemo količino porabljenega 1M NaOH do točke, ko je prišlo do preskoka pH. En vzorec uporabimo kot kontrolo; obdelamo ga enako, le da ne izvedemo inkubacije, temveč takoj po homogenizaciji poleg pufra dodamo tudi eter in etanol. Izračunamo povprečni titer ter izračunamo razliko med inkubiranimi in slepimi vzorci - ta nam posredno podaja aktivnost lipaze v ml porabljenega 1M NaOH.

Slika 1. Titracija s programom Logger Pro.

Graf 1. Aktivnost lipaze v semenih ______________ v odvisnosti od temperature.

Vprašanja 1.

Pri kateri temperaturi je bil encim najbolj aktiven?

7


Praktikum fiziologije rastlin 2.

Kakšen vpliv ima temperaturna odvisnost lipaze na kalitev semen?

3.

V katerih organelih v zelenih delih rastline še poteka β-oksidacija maščobnih kislin?

Polifenol oksidaze Polifenol oksidaze (katehol oksidaze, kresolaze) so encimi, ki so odgovorni za porjavitev tkiv sadja ali zelenjave ob ranitvi. So metaloproteini, saj sta v molekuli vezana dva bakrova iona, katalizirajo pa reakcijo, kjer se o-difenoli (npr. brezbarven do rahlo rumen katehol) spremenijo v o-kinone. Le-ti pa nato v prisotnosti kisika polimerizirajo v rjavo-črn melanin.

Slika 2. Pretvorba katehola v O-kinon. Fenoli (npr. katehol) se v majhnih količinah nahajajo v celičnih vakuolah, katehol oksidaze pa v citoplazmi. Ko se tkivo poškoduje, se fenoli sprostijo iz vakuol, katehol oksidaze pa jih pretvorijo v reaktivne kinone, ki delujejo kot naravni antiseptik, saj preprečuje rast in razvoj bakterij in gliv na poškodovanem rastlinskem tkivu. Poleg tega se kinoni vežejo tudi z nekaterimi nukleofilnimi aminokislinami, kar zavira rast določenih herbivornih žuželk. Oksidacija fenolov v tkivih je s komercialnega vidika nezaželena, saj skoraj polovica svetovnega pridelka sadja in zelenjave izgubi na vrednosti zaradi procesov rjavenja. Aktivnost katehol oksidaz določamo spektrofotometrično preko spremembe v absorpciji substrata (katehol) pri 440 nm.

8


Praktikum fiziologije rastlin

▌Aktivnost ▌ katehol oksidaze pri različnih okoljskih pogojih Material zrela banana ali jabolko, destilirana voda, terilnica, čaše, til, filtrirni papir No. 6, epruvete, rokavice, 1% raztopina katehola, puferska raztopina, pH = 7: 200 ml 0,1M citronske kisline, 680 ml 0,2M K2HPO4, 200 ml destilirane vode, vodne kopeli z različnimi temperaturami

Vpliv temperature na aktivnost katehol oksidaze Tretjino banane zmečkamo v terilnici ob dodatku 25 ml destilirane vode. Zmes prefiltriramo preko tila, nato pa še preko filtrirnega papirja (No. 6) v čašo, da dobimo cca. 10 ml filtrata, kjer se nahaja encim katehol oksidaza. V epruvete nalijemo po 1 ml 1% raztopine katehola (substrat) in 9 ml pufra pH=7. Dodamo 1 ml bananinega ekstrakta (encim) in postavimo epruvete na naslednje temperaturae: 0, 10, 20, 30, 50, 70 in 100°C.

Slika 3. Merjenje absorpcije s programom Logger Pro.

Inkubiramo 1-1,5 ure. Vmes epruvete večkrat premešamo, da pospešimo tvorbo melanina. Ob koncu poskusa izmerimo absorpcijo reakcijske mešanice pri 440 nm. Kjer bo aktivnost encima večja, bo tvorba melanina pospešena. Izmerjena absorpcija reakcijske mešanice je tako sorazmerna aktivnosti katehol oksidaze.

Pred meritvijo absorpcije po potrebi ekstrakte centrifugiramo. Po 3 ml ekstrakta nalijemo v kiveto in izmerimo absorpcijo z Vernierjevim spektrofotometrom. Zabeležimo rezultate in narišemo grafe odvisnosti absorpcije (aktivnosti) katehol oksidaze od temperature.

9


Praktikum fiziologije rastlin

Tabela 1. Absorpcija (AU) reakcijske mešanice v odvisnosti od temperature Temperatura (°C) 0 10 20 30 50 70 100

AU

AU

Graf 2. Aktivnost katehol oksidaze v odvisnosti od temperature.

Vprašanja 1.

Pri kateri temperaturi je bil encim najbolj aktiven?

2.

Zakaj se temperaturni odvisnosti lipaze in katehol oksidate razlikujeta?

10

povprečna AU


Praktikum fiziologije rastlin

Semena in kalitev Seme je razmnoževalna struktura rastlin, ki vsebuje rastlinski embrio in hranilne snovi, obdane z zaščitnimi ovojnicami. Ob kalitvi pride do aktivacije hidrolitičnih encimov in razgradnje založnih hranilnih snovi, ki rastočemu kalčku služijo kot vir energije in gradnikov. endosperm kotiledon koleoptila

semenska ovojnica

epikotil koleoptila

prvi list

epikotil hipokotil radikula semenska ovojnica zlita s steno ovarija

epikotil hipokotil

radikula hipokotil

semen. ovojnica hipokotil radikula

korenina

prva lista

kotiledon

semen. ovojnica kotiledona

radikula

korenina

Slika 3. Struktura semen koruze in fižola in potek kalitve.

Dihanje semen Mirujoča semena že vsebujejo večino encimov, ki so potrebni za začetek življenja mlade rastline. Mitohondriji so še nerazviti – v morfološkem in biokemičnem smislu. Metabolizem in izmenjava plinov sta izredno nizka, kar je posledica nizke vsebnosti vode (okrog 10 %). Med imbibicijo semena dihanje hitro naraste in je merljivo tudi s preprostimi metodami. Pri semenih večine rastlinskih vrst ob kalitvi opazimo značilno krivuljo porabe kisika. Med imbibicijo poraba kisika strmo narašča. Aktivirajo se encimi, uskladiščeni v semenu. Najprej se porabijo primarne zaloge hranil v embriu, ki jih predstavljajo v glavnem nižji sladkorji. V teh procesih se porablja tudi kisik, ki je bil skladiščen v različnih tkivih semena. Mitohondriji se razvijejo, poveča se njihovo število, naraste pa tudi količina nekaterih encimov v njih. 11


Praktikum fiziologije rastlin Pri nekaterih vrstah rastlin začne po nekaj urah poraba kisika stagnirati ali celo rahlo upade. Ta faza stagnacije navadno sovpade s koncem imbibicije. Vzrok zanjo pa je verjetno slaba prepustnost teste za kisik, ki je v imbibiranem stanju še manjša. Kisik, ki prehaja skoznjo prestrezajo tudi fenolne substance, ki so v njej navadno prisotne v visokih koncentracijah. Metabolizem je v tem času delno anaerobni, kljub temu pa v semenu poteka intenzivna sinteza encimov. Ponoven porast porabe kisika navadno opazimo ko se pojavi s prostim očesom vidni znak kalitve – prodor koreničice. Embrio intenzivno izkorišča rezerve iz sekundarnega endosperma ali kotiledonov (redko so rezerve skladiščene drugje, npr. v hipokotilu pri arašidih). Mlada rastlinica hitro raste. Na svetlobi lahko pri kalici opazimo pozitivno fototropično reakcijo. Razvije se tudi fotosintezni aparat in kalica preide na avtotrofni način življenja. Pri kalitvi semen v temi dihanje upade približno ob istem času, kot na svetlobi, ko kalica začne avtotrofni del življenja, zaradi pomanjkanja substrata (npr. pri ovsu peti do sedmi dan). Kalica v temi zato počasi odmre.

Vaja: Dihanje semen Material semena ovsa (suha, imbibirana, 2 in 4 dni kaleča), steklenico za meritve izmenjave plinov, merilec ogljikovega dioksida, vodne kopeli, led

Izvedba V steklenico položimo vlažno vato in nanjo 30 kalečih semen, nato pa na odprtine namestimo merilec ogljikovega dioksida. Čas meritve v programu naravnamo na 15 min, gostoto zajemanja podatkov pa nastavimo na 2 podatka/minuto (Slika 4).

Slika 4. ▲ nastavitve za meritve izmenjave dihalnih plinov v programu LoggerPro. ►odčitavanje spremembe dihalnih plinov ob zaključku meritve. 12


Praktikum fiziologije rastlin Zeženemo zajemanje podatkov in spremljamo spreminjanje koncentracij dihalnih plinov v steklenici. Po 30 minutah poskus ponovimo z naslednjo starostjo semen. Na enak način izvedemo tudi meritve pri različnih temperaturah. Po zaključeni meritvi odčitamo spremembo koncentracije O2 oz. CO2 (Slika 4) tako, da kliknemo na ikono za linearno regresijo ( ). Na grafu se bo pojavila linearna krivulja in ustrezni podatki, iz katerih je razviden koeficient korelacije (R) in naklon premice (=sprememba koncentracije v časovni enoti). S premikanjem oglatih oklepajev na grafu lahko popravimo del krivulje, ki bo uporabljen za računanje (odstranimo začetne dele, ko se je v sistemu šele vzpostavljalo ravnovesje). Odčitamo spremembo dihalnih plinov in jo vpišemo v spodnjo tabelo.

Rezultati: V spodnjo tabelo vpišite spremembe koncentracije CO2 v sistemu. Tabela 2. Sproščanje CO2 pri suhih, imbibiranih ter 2 in 4 dni kalečih semenih ječmena oz

semenih izpostavljenih različnim temperaturam. Starost Suha Imbibirana 2 dni kaleča 4 dni kaleča

Izdihani CO2 (ppm min-1)

T (°C) 0 10 20 40

Izdihani CO2 (ppm min-1)

Graf 3. Sproščanje CO2 pri suhih, imbibiranih ter 2 in 4 dni kalečih semenih ječmena. 13


Praktikum fiziologije rastlin

Graf 4. Sproščanje CO2 pri semenih ječmena pri 0, 10, 20, 40°C.

Vprašanja 1. Ali si opazil kakšne razlike v intenziteti dihanja med imbibiranimi in neimbibiranimi semeni? Zakaj?

2.

14

Ali si opazil kakšne razlike v intenziteti dihanja pri različno starih kalečih semenih? Zakaj?


Praktikum fiziologije rastlin

Semena in kalitev Testiranje viabilnost semen – tetrazolijev test Mirujoča semena izgledajo na prvi pogled kot mrtva, saj je stopnja metabolizma, zaradi nizke vsebnosti vode, izredno nizka. Ob privzemu vode (imbibicija) metabolna aktivnost naraste, kar se kaže predvsem v porastu dihanja v živih tkivih semena. Tetrazolijev test temelji na obarvanju semenskih tkiv z dehidrogenazno aktivnostjo. Dehidrogenaze sodelujejo v procesu dihanja, pri čemer se v semenih založne snovi ob prisotnosti kisika pretvarjajo v energijo, vodo in CO2. Ob reakciji dehidrogenaz s substratom se sproščajo vodikovi ioni, ki reducirajo trifenil tetrazolijev klorid (TTK), pri čemer nastane rdeče obarvan, v vodi netopen formazan. Tetrazolijev test viabilnosti se uporablja predvsem, kadar hočemo v kratkem času določiti odstotek viabilnih semen. V komercialne namene se uporablja tudi dolgotrajnejši način določanja viabilnosti semen, in sicer test kaljivosti.

▌Vaja ▌ 1: Viabilnost in kaljivost semen Za določanje viabilnosti semen s tetrazolijevim testom, moramo najprej poznati morfologijo semen, ki jih testiramo. S TTK se obarvajo le tkiva z dehidrogenazno aktivnostjo, neživa tkiva kot so npr. semenske ovojnice, pa se ne obarvajo. Namen vaje je primerjati obarvanje semenskih tkiv s TTK pri različnih pri enokaličnicah in dvokaličnicah.

Material imbibirana semena različnih rastlinskih vrst (enokaličnice in dvokaličnice), raztopina 1% trifenil tetrazolijevega klorida (TTK), pripravljena v temni steklenici, filtrirni papir, petrijevke, skalpel, rokavice, lupa

Navodila Po 10 namočenih semen prerežemo vzdolžno, da izpostavimo embrionalna tkiva. Eno polovico semena položimo s prerezano stranjo navzdol na filtrirni papir, ki smo ga prej namestili v petrijevke, drugo polovico pa zavržemo. Polovice semen nato prelijemo z 1% raztopino TTK, tako, da so prerezana semena do polovice v raztopini. Petrijevke zapremo, ustrezno označimo, zložimo v škatle (v temo) in inkubiramo 2 uri pri sobni temperaturi. V temi inkubiramo zato, ker TTK na svetlobi razpade. Po končani inkubaciji semena poberemo iz petrijevk in si jih ogledamo pod lupo.

OPOZORILO: S TTK delajte previdno, da ga ne polijete po koži ali obleki! Vedno uporabljajte rokavice! 15


Praktikum fiziologije rastlin

Rezultati Skiciraj in primerjaj morfologijo semen enokaličnic in dvokaličnic! Enokaličnica

Dvokaličnica

Vprašanja 1. Katere strukture so se obarvale s TTK pri enokaličnicah in katere pri dvokaličnicah, razloži zakaj?

16


Praktikum fiziologije rastlin

Vaja 2: Vpliv okoljskih dejavnikov na viabilnost semen Dolžina viabilnosti semen je odvisna od posamezne rastlinske vrste (od nekaj tednov pa do nekaj desetletij) pa tudi od okoljskih pogojev. Namen vaje je ugotoviti, kakšen je vpliv temperature na viabilnost mirujočih (suhih) semen koruze.

Material Semena koruze, sušilnik, zamrzovalnik, kuhalnik, raztopina 1% trifenil tetrazolijevega klorida (TTK), pripravljena v temni steklenici, filtrirni papir, petrijevke, skalpel, rokavice, lupa Suha semena koruze tretiramo kot kaže Tabela 1. Po končanem tretiranju semena namočimo za en dan (imbibicija). Tabela 3. Tretiranje semen Št. tretmaja 1 2 3 4

Tretma Zmrznemo pri -10ºC Pustimo na sobni temperaturi (20 ºC) Za 60 min v sušilniku segrevamo na 50 ºC Za 60 min v sušilniku segrevamo na 100 ºC

Test viabilnosti Po 10 semen prerežemo vzdolžno, da izpostavimo embrionalna tkiva, zložimo v dve petrijevki in preverimo viabilnost tretiranih semen kot pri vaji 1! Po končani inkubaciji preštejemo število homogeno obarvanih semen v obeh petrijevkah in izračunamo % viabilnosti. Povprečje % viabilnosti vnesemo v Tabelo 2.

Test kaljivosti Viabilnosti semen lahko primerjamo tudi z njihovo kaljivostjo. Dvakrat po 10 neprerezanih semen posameznega tretmaja položimo v petrijevke na omočen filtrirni papir, petrijevke zapremo, ustrezno označimo in pustimo na svetlobi (na pultu, pri sobni tempeaturi). Čez en teden preštejemo kaleča semena in izračunano % kalečih semen v obeh petrijevkah. Povprečje % kaljivosti vnesemo v Tabelo 2.

Rezultati Tabela 4. Primerjava odstotkov viabilnosti in kaljivosti semen. Št. tretmaja -10°C 20°C 50°C 100°C

Viabilnost (%)

Kaljivost (%)

17


Praktikum fiziologije rastlin

Graf 5. Odvisnost viabilnosti semen od temperature.

Vprašanja 1. Ali meniš, da je tetrazolijev test dober pokazatelj kaljivosti semen?

2. Ali so rezultati testa kaljivosti v skladu s testom viabilnosti? Komentiraj podobnosti oz. razlike v rezultatih!

18


Praktikum fiziologije rastlin

Dormanca semen Primarna (endogena) dormanca semen Dormanca je fenomen, ko viabilna semena kljub ugodnim razmeram v okolju ne kalijo. S tem je omogočen določen časovni zamik med sproščanjem semen in njihovo kalitvijo, ki omogoči boljše razširjanje semen in kalitev v ugodnem letnem času. Poznamo dva tipa dormance semen: dormanca zaradi semenskih ovojnic in dormanca embriev.

Dormanca zaradi semenskih ovojnic Poznanih je pet osnovnih mehanizmov tega tipa dormance: • preprečevanje sprejema vode je najpogostejši mehanizem pri predstavnikih, ki rastejo v sušnih predelih (še posebej je pogost pri metuljnicah kot je npr. detelja, itd.). Strukture, ki preprečujejo privzem vode, so kutikula, suberinizirani sloji in lignificirane sklereide. • ovojnica kot mehanska prepreka: semena so lahko obdana s trdimi lupinami, ki preprečujejo prodor radikule in s tem preprečujejo kalitev. Poleg lupin lahko prodor radikule preprečujejo tudi celice endosperma kot npr. pri solati. Njihove celične stene se morajo delno razgraditi z encimi. • motnje v menjavi dihalnih plinov: v tem primeru naj bi prihajalo do preprečevanja vdora kisika v seme, kar zavre kalitev. • zadrževanje inhibitorjev: semenske ovojnice zadržujejo inhibitorje kalitve v semenu. Kalitev povzročijo šele poškodbe ovojnic, ki omogočijo difuzijo inhibitorjev iz semena. • sinteza inhibitorjev kalitv: semenske ovojnice in perikarpi lahko vsebujejo velike količine inhibitorjev kalitve (npr. abscizinska kislina). Večkratno izpiranje semen lahko zniža nivo inhibitorjev do takšne vrednosti, da kalitev ni več zavirana.

Dormanca embrija • diferencirani embrio: dormaca embria je tip dormance, na katero ne vplivajo semenske ovojnice in druga tkiva. Takšen tip dormance je značilen za semena, ki vsebujejo le rudimentarne embrie (večino semena napolnjuje endosperm – embrio lahko predstavlja le 1 % celotnega semena). Embrii pri teh semenih so diferencirani, vendar je pred kalitvijo potrebna še dodatna rast embria, da lahko seme kali. • nediferencirani embrio: takšni embrii obstajajo pri pritlikavih semenih (embrio je velik 0,2–3,0 mm) in mikrosemenih (embrio manjši od 0,2 mm). Embrii mikrosemen lahko vsebujejo tudi le dve celici.

19


Praktikum fiziologije rastlin

Sekundarna (inducirana) dormanca semen Za semena, sproščena iz rastlin v dormantnem stanju pravimo, da so v stanju primarne dormance. Za semena, ki so končala primarno dormanco ali pa so bila sproščena v nedormatnem stanju oz. so bila sposobna takojšnje kalitve velja, da lahko ponovno zapadejo v dormantno stanje pod vplivom nekaterih dejavnikov okolja. Takšna dormanca preprečuje kalitev v neugodnih življenjskih razmerah v okolju. Vzroki zanjo so lahko: fizikalni, kemijski ali mehanski.

Mehanizmi prekinitve dormance Prekinitev dormance lahko povzročijo številni zunanji dejavniki. Mednje spadajo skarifikacija (poškodba vrhnjih tkiv), imbibicija, izsušitev, razgradnja delov semen z encimi, kislinami,…, osvetlitev, nizke temperature, delovanje mikroorganizmov … V nekaterih semenih nastopi prekinitev dormance v primeru, če vsebnost vlage pade pod določen nivo (Avena sp.). Pri vrsti Salvia officinalis je ob visoki vlagi kalitev inhibirana (seme je obdano z ovojnico, ki zadržuje vlago, kar lahko vodi tudi v pomanjkanje kisika). Pri nekaterih vrstah pa je za kalitev potrebna izmenjava sušnih in vlažnih obdobij, čeprav je lahko dormanca prekinjena že ob imbibiciji (npr. Rumex acetosella). Dormanco semen lahko prekinejo tudi nizke temperature (semena predstavnikov rodov Malus, Pyrus, Polygonum, Prunus, itd.). Številna semena morajo biti izpostavljena temperaturam 0-10 oC (stratifikacija) daljšem času v namočenem stanju (imbibirana semena). Pri teh semenih lahko pride tako do kalitve šele spomladi (semena jeseni tudi v ugodnih razmerah ne kalijo) po prekinitvi dormance v zimskem času. Tretji dejavnik, ki igra pomembno vlogo pri prekinitvi dormance, je svetloba. Glavni senzor za ustrezen dražljaj je v tem primeru fitokrom.

Zaznavanje kvalitete svetlobe Kalitev semen in njihov nadaljnji razvoj sta odvisna od dejavnikov, ki prekinejo dormanco, eden od teh je svetloba. Rastline svetlobo zaznavajo svetlobo s fotoreceptorji, predvsem s fitokromi, kriptokromi in fototropini. Fitokromi zaznavajo prisotnost kratkovalovne rdeče (660 nm) in dolgovalovne rdeče (730 nm) svetlobe. Odgovori fitokromov so odvisni tudi od intenzitete svetlobe. Modri del vidnega spektra svetlobe se zaznava s kriptokromi in fototropini. Zaznavanje modre svetlobe z omenjenimi fotoreceptorji sproži fototropizem, regulira izmenjavo plinov preko rež in zavre elongacijo stebla. Zaznavanje zelene svetlobe še ni povsem razjasnjeno. Zelena svetloba v rastlinah, podobno kot modra, vpliva na delovanje listnih rež in podaljševanje stebla. V splošnem je za nadaljnji razvoj semen najbolj učinkovita dnevna svetloba. 20


Praktikum fiziologije rastlin

Vpliv svetlobe na kalitev Fitokrom Kratkovalovna rdeča svetloba sproži pretvorbo neaktivne oblike (Pfr) v aktivno obliko (Pr), ki vpliva na številne procese v rastlini, vključno s sintezo klorofila in elongacijo stebla. Absorpcija dolgovalovne rdeče svetlobe pretvori Pr obliko nazaj v neaktivno Pfr obliko fitokroma.

Slika 5. Absorpcijska spektra fitokroma.

Novejše raziskave kažejo, da odgovore semen na svetlobo regulirajo različni tipi fitokroma v odvisnosti od svetlobnih intenzitet. Glede na odzive semen na osvetljevanje z svetlobo ločimo:

Pozitivni fotoblastična semena Pozitivno fotoblastična semena potrebujejo za kalitev svetlobo. Zadošča tudi kratkotrajno osvetljevanje s kratkovalovno rdečo svetlobo (660 nm). Takšna semena ob dozorenju nimajo dovolj Pfr za indukcijo kalitve, z osvetljevanjem pa se vsebnost Pfr v njih poveča. Semena so pogosto drobna, imajo tanko testo in malo rezervne hrane, kar pomeni, da morajo kaliti blizu površine tal, da lahko kmalu začnejo fotosintetizirati. Pojavu, da seme ne more kaliti, ker ni osvetljeno, pravimo fotodormanca.

Negativno fotoblastična semena Negativno fotoblastična semena kalijo samo v temi. Ta semena imajo že uskladiščenega dovolj Pfr, da lahko kalijo. Svetloba njihovo kalitev prepreči. Ta pojav lahko vsaj pri nekaterih semenih razlagamo s selektivno prepustnostjo teste za svetlobo (prepušča predvsem dolgovalovno rdečo svetlobo, ki zmanjša količino Pfr). Takšna semena so redka, navadno pa so relativno velika in imajo trdo semensko lupino. Direktna indukcija sekundarne dormance z dolgovalovno rdečo svetlobo je zelo 21


Praktikum fiziologije rastlin redek pojav. Ponavadi postanejo semena ob obsvetljevanju s takšno svetlobo le bolj občutljiva za druge dejavnike, ki lahko vplivajo na kalitev (npr. vlaga …). Sistem fitokroma s svojim vplivom zagotavlja, da so semena dobro zakopana in s tem dobro imbibirana, ko začnejo kaliti.

Nefotoblastična semena Nefotoblastična semena na svetlobo ne reagirajo. Kalijo lahko na svetlobi ali v temi. Lahko imajo dovolj Pfr za kalitev in osvetljevanje na njegovo vsebnost ne vpliva, ali pa kalitev regulirajo predvsem (ali celo samo) drugi mehanizmi.

▌Vaja: ▌ Vpliv kvalitete svetlobe na kalitev solate Material semena solate, petrijevke, filtrirni papir, pincete, škarje, filtri znamke Lee: zeleni (prepušča svetlobo 460 – 570 nm), rdeči (prepušča svetlobo >560 nm), modri (prepušča svetlobo 308 –570 nm), dolgovalovni rdeči (modri preko rdečega, prepušča svetlobo >640 nm).

Izvedba V 12 petrijevk damo po dva sloja filtrirnega papirja in ga omočimo z destilirano vodo. Posebej v pokrove petrijevk naštejemo po 25 semen in pazimo, da ostanejo suha. V temnici semena razporedimo v petrijevke, jih zalijemo in postavimo pod posamezne tretmaje: rdeča, dolgovalovna rdeča, zelena, modra, bela svetloba in tema. Po enem tednu preštejemo število kalečih semen. Rezultate vpišite v spodnjo tabelo.

Rezultati Tabela 5. Kalitev semen solate pri različnih kvalitetah svetlobe. Kvaliteta svetlobe Kratkovalovna rdeča Dolgovalovna rdeča Zelena Modra Tema Bela svetloba

Petrijevka 1

Petrijevka 2

Povprečje

Vprašanja 1. Kako bi označil semena solate - kot pozitivno/negativno fotoblastična ali nefotoblastična?

22


Praktikum fiziologije rastlin

Vaja: Vpliv dostopnosti vode na kalitev solate in vrtne kreše Na kaljivost semen lahko vpliva mnogo dejavnikov, med drugimi tudi temperatura in dostopnost vode. Voda je zelo pomembna za prvo stopnjo kalitve – imbibicijo, kjer pride do vdora vode v suho seme. To med drugim aktivira encime, ki začnejo razgrajevati kompleksne založne snovi in s tem omogočijo rast kalčku. Če je vode premalo ali preveč, je kalitev zavrta.

Slika 5. Vsebnost vode v semenu pri različnih vodnih potencialih.

Material Semena vrtne kreše in solate, petrijevke, filtrirni papir, pincete, škarje, merilce, polietilen glikol (PEG, Mr = 6000)

Izvedba V 16 petrijevk (=2 petrijevki/rastlino/koncentracijo) damo po dva sloja filtrirnega papirja. V pokrove petrijevk naštejemo po 25 semen in pazimo, da ostanejo suha. Filtrirni papir sedaj namočimo z raztopinami PEG iz spodnje tabele. Tabela 3. Vodni potencial različnih raztopin PEG. Koncentracija PEG (g/100 ml vode) 0,0 0,1 0,3 0,5

Vodni potencial (bar) 0,0 -2,0 -10,0 -30,0

Po tednu dni preštejemo kaleča semena in izmerimo dolžino radikule. Kot kalečo označimo seme, pri katerem opazimo rast radikule. Pri merjenju dolžine radikule, nekaleča semena in radikule dolžine pod 1 mm označimo z 0 mm.

23


Praktikum fiziologije rastlin

Rezultati Tabela 4. Kalitev solate in vodne kreše pri različnih vodnih potencialih. Vodni potencial % kalitve

Vrtna kreša dolžina radikule (mm)

% kalitve

Solata dolžine radikule (mm)

0 bara -2 bara -10 barov -30 barov

Graf 5. Odvisnost kalitve semen vrtne kreše in solate od vodnega potenciala.

Vprašanja 1. Pri katerem vodnem potencialu si opazil najboljšo kalitev solate/vrtne kreše?

2. Ali si opazil kakšno razliko med občutljivostjo kalitve in podaljševanja radikule na sušo?

24


Praktikum fiziologije rastlin

Mineralna prehrana rastlin Rastlina potrebuje za normalno rast in razvoj številne elemente. Elementi brez katerih ne more skleniti življenjskega kroga, so označeni kot esencialni. Klasifikacija elementov glede na biokemično funkcijo v rastlini: 1. Skupina Nutrienti, ki tvorijo organsko komponento rastline N Prisoten je v aminokislinah, amidih, proteinih, NK, nukleotidih, koencimih, heksoaminih … S Komponenta cisteina, cistina, metionina, proteinov, koencima A … 2. Skupina Nutrienti, ki so pomembni za shranjevanje energije in za strukturno integriteto P Je komponenta sladkornih fosfatov, NK, nukleotidov, koencimov, fosfolipidov. Pomembna funkcija povsod, kjer sodeluje ATP. B Tvori komplekse z manitolom, polimanuronično kislino in drugimi komponentami celične stene. Sodeluje pri elongaciji in metabolizmu NK. Si V amorfni obliki obstaja v celični steni. Določa mehanske lastnosti celične stene, vključno z rigidnostjo in elastičnostjo. 3. Skupina Nutrienti, ki ostanejo v ionski obliki K Je kofaktor za okrog 40 encimov in poglavitni kation v ustvarjanju celičenega turgorja in vzdrževanju elektronevtralnosti celične stene. Na Sodeluje pri regeneraciji fosfoenolpiruvata pri C-4 in CAM-rastlinah. Mg Potreben je pri številnih encimih, ki sodelujejo v transportu fosfatov. Je tudi sestavni del klorofilnih molekul. Ca Najdemo ga v osrednji lameli celične stene. Potreben je kot kofaktor pri nekaterih encimih, ki so vpleteni v hidrolizo ATP in fosfolipidov. V celici opravlja funkcijo sekundarnega sporočevalca. Mn Potreben je za aktivnost nekaterih dehidrogenaz, dekarboksilaz, kinaz, oksidaz in peroksidaz. Sodeluje pri fotosintetskem sproščanju kisika. Cl Potreben je za fotosintetske reakcije, v katerih se sprošča kisik.

25


Praktikum fiziologije rastlin 4. Skupina Nutrienti, ki so vpleteni v transport elektronov Fe Je sestavni del citokromov in različnih proteinov, vpletenih v fotosintezo, fiksacijo atmosferskega dušika in celično dihanje. Cu Je komponenta oksidaze askorbinske kisline, tironaze, monamin oksidaze, citokrom oksidaze, fenolaze … Zn Je komponenta alkohol-dehidrogenaze … Mo Je komponenta nitrogenaze, nitrat-reduktaze in ksantin-dehidrogenaze. Ni Je sestavni del ureaze.

Rast kot % maksimalne rasti

Rastlina za normalno delovanje potrebuje določene vsebnosti hranil; ob pomanjkanju kakšnega elementa lahko upade nivo tistih procesov, pri katerih ta element sodeluje. Podobno lahko previsoke koncentracije elementov v rastlini učinkujejo toksično.

100

0

Območje pomanjkanja

Območje optimuma

Območje strupenosti

Koncentracija elementa v tleh

Slika 4. Rast rastline glede na koncentracije elementov v tleh.

▌Vaja: ▌ Simptomi pomanjkanja nutrientov Material Za izvedvo vaje potrebujemo nekaj dni stare kalice koruze (Zea mays) in sončnic (Helianthus annuus), 1000ml čaše, pokrovčki za čaše (4 luknje za kalice), zračna črpalka, cevi, deionizirana voda, popolna hranilna raztopina, pH meter

26


Praktikum fiziologije rastlin

Priprava raztopin Najprej pripravimo raztopino mikroelementov. Tabela 19. Raztopina mikroelementov Mikroelementi KCl H3BO3 MnSO4 . H2O ZnSO4 . 7H2O CuSO4 . 5H2O Na2MoO4

Molek. masa 74.55 61.83 169.01 287.54 249.68 241.95

Založna razt. (mm) 25 12.5 1 1 0.25 0.25

Založna razt. (g l–1) 1.864 0.773 0.169 0.288 0.062 0.06

Nato pripravimo hranilne raztopine s padajočo koncentracijo fosforja. Tabela 23. Sestava raztopin z različnimi koncentracijami fosforja. Založna raztopina 100 ml 0,5M Ca(NO3)2 100 ml 0,5 M KNO3 100 ml 0,5 M MgSO4 100 ml 0,5 M KH2PO4 40 ml FeNaEDTA Mikroelementi 100 ml 0,5 M KCl

Volumen založne raztopine, ki jo dodamo 800 ml H2O (ml) 100% 75% 50% 25% 0% 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0 0,2 0,4 0,6 0,8

Analiza fosforja v rastlinskem materialu Razklop rastlinskega materiala z dušikovo in perklorno kislino Rastline operemo pod tekočo vodo in nato še z destilirano vodo. Korenine ločimo od poganjkov in jih ločeno sušimo v sušilniku na 60°C 3 dni. Suh material nato zmeljemo v analitskem mlinu ali v terilnici, da dobimo fin prah. V plastične posodice ali na povoščen papir zatehtamo po 30 mg zmletega suhega rastlinskega materiala (tehtamo na analitski tehtnici na 5 decimalnih mest), ki ga nato prenesemo v očiščene epruvete. V epruvete previdno dodamo 3,0 ml kislinske mešanice (HNO3 : HClO4 = 7:1). Vzorce nato inkubiramo čez noč, da se dobro napojijo s kislino. Po inkubaciji vzorce postopno segrevamo na aluminijastem termobloku, dokler kislina popolnoma ne izhlapi. Suhe vzorce nato raztopimo v 3,0 ml 0,2% HNO3 pripravljene z bidestilirano vodo. Pred meritvijo pripravimo mešanico amonijevega heptamolibdata in amonijevega metavanadata (MoV). Za pripravo 25 g amonijevega heptamolibdata raztopimo v 400 ml dH2O in segrevamo, dokler se raztopina ne zbistri. 1,25 g amonijevega metavanadata raztopimo v 300 ml vrele vode, ohladimo in dodamo še 250 ml koncentrirane HNO3. Mešanico ohladimo na sobno temperaturo in ji prilijemo 27


Praktikum fiziologije rastlin raztopino amonijevega paramolibdata. Dopolnimo do 1000 ml z dH2O.

Priprava standarda Metoda je zanesljiva (standard je linearen) v območju od 0,1-2 mg/l, zato si iz osnovne komercialne standardne raztopine (koncentracija 995 mg P/l) pripravimo 100x redčitev, ki jo uporabimo za nadaljnjo pripravo standardnih raztopin. Najbolje je da standarde pripravimo v 10 ml bučkah, ker so le tako volumni najbolj natančni. V bučke odpipetiramo ustrezne količine razredčenega standarda kot kaže spodnja tabela. Reagent MoV dodajamo s stekleno pipeto in bučke dopolnimo z 0,2% HNO3 do 10 ml. Če nimamo bučk lahko uporabljamo epruvetke. Tabela 24. Priprava standarda. Količine so prirejene za 10 ml bučke št. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

izhodna konc. (mg/l) 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

želena konc. P (mg/l) 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60 1,80 2,00

standard (ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0

reagent MoV (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

0,2% HNO3 (ml) 7,8 7,6 7,4 7,2 7,0 6,8 6,6 6,4 6,2 6,0

Analiza vzorcev Iz razklopljenega vzorca vzamemo 1 ml raztopine, dodamo 2 ml MoV reagenta in 7 ml 0,2% HNO3. Standarde in vzorce merimo na spektrofotometru pri valovni dolžini 400nm. Slepa proba je MoV in 0,2% HNO3 (2ml + 8ml). Iz umeritvene krivulje (R2>0.95) odčitamo koncentracijo v izmerjenem vzorcu in preračunamo na maso in volumen vzorca (enačba 19). Volumen vzorca je pri tem enak volumnu, s katerim je bil redčen razklopljen vzorec + dodatne redčitve, če so bile potrebne (je bila absorbanca višja od najvišjega standarda).

cfosforja vstavimo v mg/l.

28


Praktikum fiziologije rastlin

Rezultati

Graf 8. Umeritvena krivulja za fosfor. Suho maso rastlin in izračunane koncentracije ter vsebnosti fosforja v rastlinskem materialu vpišite v spodnjo tabelo: Tabela 25. Mase rastlin, koncentracije in vsebnosti fosforja v rastlinah. Tretma

Masa poganjkov

Koncentracija fosforja (mg/ml)

Koncentracija fosforja (mg/g)

Vsebnost fosforja (mg)

100% P 75% P 50% P 25% P 0% P

Vprašanja 1. Ali ste opazili kakšne razlike med simptomi pomanjkanja nutrientov med koruzo in sončnico? Zakaj?

2.

Kakšna je krivulja mase rastlin v odvisnosti od vsebnosti fosforja v hranilni raztopini? Razloži.

29


Praktikum fiziologije rastlin

Mikoriza Termin »mikoriza« je prvi uporabil Frank (1885) za opis mutualistične povezave med koreninami in glivnim micelijem. Mikorizo tvorijo predstavniki vseh glavnih taksonomskih skupin gliv: Zygomycotina, Ascomycotina, Basidiomycotina in Deuteromycotina. Navadno najdemo pri posameznih rastlinah le en tip mikorize, pri nekaterih rastlinah pa lahko najdemo tudi več tipov mikorize (Salix, Populus, Alnus in Eucalyptus).

Arbuskularna mikoriza Značilnost arbuskularne mikorize so drevesaste strukture (arbuskuli) v celicah gostitelja, ki služijo izmenjavi snovi. Ob tvorbi arbuskula pride do invaginacije v gostiteljsko celico in do tvorbe novega kompartmenta apoplasta, preko katerega poteka vsa izmenjava snovi. Arbuskuli so funkcionalni do 15 dni. Poleg arbuskulov lahko v koreninah najdemo še druge glivne strukture. Vezikli so lipidna telesa v intercelularjih gostitelja, ki v glavnem služijo kot zaloga, lahko pa opravljajo tudi razmnoževalno funkcijo. Nespolne spore nastanejo z diferenciacijo vegetativnih hif gostitelja. Pri nekaterih vrstah (npr. Glomus intraradices) se spore dodatno zdebelijo in ločijo od preostalega dela hife v korenini, večinoma pa spore nastajajo v substratu izven korenine. Glive, ki tvorijo arbuskularno mikorizo pripadaja redu Glomales. Predstavniki so obligatni simbionti in jih ni mogoče gojiti v aseptični kulturi. Za njihovo vzgojo je ponavadi uporablja rastline dojilje. Arbuskularna mikoriza izboljša preskrbljenost rastline z različnimi nutrienti, predvsem s fosforjem. Mikoriza je tako favorizirana v razmerah, ko je rastlini dostopnega fosforja v naravi malo. Ob povišanju koncentracije zaradi gnojenja (NPK) lahko rastlini dostopni fosfor povsem zadosti potrebam rastline in simbioza ni več potrebna.

▌Vaja: ▌ Barvanje arbuskularno mikoriznih gliv s tinto Opazovanje arbuskularno mikoriznih glivnih struktur pod svetlobnim mikroskopom nam omogoča selektivno barvanje hitina, ki je sestavina celične stene simbiontske glive. Barvila so različnih tipov, najpogosteje se uporablja tripan modro, lahko pa uporabljamo tudi kisli fuksin, sudan in celo navadno tinto (črnilo). Pri barvanju moramo biti pozorni na strukturo koreninskega sistema in čas presvetlitve in barvanja temu primerno optimizirati.

Material 6% raztopina kisa ali 10% raztopina KOH, 5% raztopina črnila v 5% raztopini ocetne kisline, epruvete, til, sušilnik, objektna in krovna stekelca, mikroskop Koreninski sistem rastline operemo pod tekočo in destilirano vodo, ga narežemo na ~1 cm fragmente in položimo v 16 cm široke epruvete. Fragmente prelijemo s 6% kisom (lahko uporabimo tudi 10% KOH), 30


Praktikum fiziologije rastlin epruveto prekrijemo s tilom, ki ga zatesnimo z elastiko. V sušilniku vzorce 30 min segrevamo pri 90°C, nato iz epruvet kis odlijemo in koreninice 3-krat speremo pod tekočo vodo. V epruvete nato dolijemo 5% črnilo (modre, rdeče ali črne barve pripravljeno v 5% ocetni kislini) in jih segrevamo v sušilniku 3 min pri 90°C. Nato črnilo odlijemo (uporabimo ga lahko večkrat!) in koreninice 3-krat speremo pod tekočo vodo. Vzorce lahko v vodi hranimo v hladilniku.

10% KOH

90°C 30 min

5% črnilo v 5% ocetni kislini

90°C 3 min

Preparat s fragmenti

Slika 4. Shematični prikaz barvanja in obarvanih glivnih struktur v koreninah. Več 1-cm dolgih fragmentov korenin položimo vzporedno na objektno steklo in jih pokrijemo. Pod mikroskopom lahko dele gliv vidimo kot modro obarvane strukture.

Skice glivnih struktur

31


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 skupaj

32

A0

a%

m%

AM parameter

A%

M%

F%

AM parameter

r0 (0%) A3

r2 (<10%) A1 A2 A3

A0

r3 (<50%) A1 A2 A3

A0

r4>50% A1 A2 A3

A0

Razlaga parametrov, ki se nanašajo na celoten koreninski sistem

A0

r5>95% A1 A2

Pri čemer je: rA3= [(95*r5A3+70*r4A3+30*r3A3+5*r2A3+r1A3)/št. mikoriznih korenin]*100/m podobno izračunamo tudi rA2 in rA1

a% = (100*rA3 + 50*rA2 + 10*rA1) / 100

gostota arbuskulov v delu korenine z mikorizno kolonizacijo

m% = M * (število vseh korenin) / (št. mikoriznih korenin) = M * 100 / F

intenziteta mikorize v koloniziranih koreninskih fragmentih

Razlaga parametrov, ki se nanašajo le na koloniziran del koreninskega sistema

A% = a * (M / 100)

gostota arbuskulov v koreninskem sistemu

M% = (95*r5 + 70*r4 + 30*r3 + 5*r2 + r1) / št. vseh korenin

splošna intenziteta mikorize – intenziteta mikorizne kolonizacije koreninskega sistema

F% = (št. mikoriznih korenin / št. vseh korenin) * 100

mikorizna frekvenca - frekvenca fragmentov z glivo

r1 (<1%) A1 A2 A3

Praktikum fiziologije rastlin


Praktikum fiziologije rastlin

Asimilacijska barvila V tilakoidnih membranah kloroplastov višjih rastlin lahko najdemo dve skupini asimilacijskih pigmentov: klorofile in karotenoide. Glede na funkcijo pri fotosintezi in izrabi svetlobe pa bi jih lahko razdelili na glavni asimilacijski pigment v reakcijskem centru (klorofil a) in antenske asimilacijske pigmente (preostali klorofili in karotenoidi). Pri nekaterih algah in cianobakterijah pa obstajajo še dodatni pigmenti – fikobiliproteidi.

Klorofili Sestavljeni so iz tetrapirolovega obroča na katerem je zaestren fitol. V obroč je vezan atom magnezija. Klorofili absorbirajo v rdečem in modrem delu vidnega spektra: klorofil a pri 430 in 660 nm, klorofil b pa pri 460 in 640 nm. Klorofil a je modrozelen, klorofil b pa rumenozelen. Podobna klorofiloma sta feofitin a in b, ki se od klorofila a in b razlikujeta le po manjkajočem magnezijevem atomu. Poznamo še klorofil c in d. Pri klorofilu c ni fitolnega dela molekule in pri klorofilu d je vinilna skupina v porfirinskem obroču nadomeščena s formilno skupino.

Slika 8. Absorpcijski spektri nekaterih asimilacijskih pigmentov višjih rastlin

33


Praktikum fiziologije rastlin

Karotenoidi Karotenoidi so kemično tetraterpeni, ki absorbirajo v modrem delu sprektra med 400 in 520 nm (imajo tipičen trojni vrh). Ločimo dve skupini: karotene (čisti ogljikovodiki) in ksantofile (derivati karotenov, ki vsebujejo kisik). Karoteni so rumene do rdeče barve. Med karoteni sta najpogostejša α- in β-karoten. Ksantofili so oksidacijski produkti karotenov in so najpogosteje rumenkasti. Najpogostejši ksantofili so zeaksantin, lutein, violaksantin, likopen, neoksantin, kriptoksantin,… Karotenoidi lahko sprejemajo energijo svetlobe in jo po mehanizmu induktivne resonance prenesejo na klorofil a. Poleg tega imajo tudi zaščitno funkcijo v primeru visokih intenzitet svetlobe. Takrat preko ksantofilnega cikla odvajajo odvečni NADPH2 iz fotosistema. V ciklu se violaksantina preko anteraksantina pretvori do zeaksantina z deepoksidacijo. Reakcija se aktivira, kadar pride do večjega zakisanja lumna tilakoid, zaradi porušenega razmerja med porabo ATP in možnostjo njegove sinteze. Poznamo štiri načine porabe eksitacijske energije, ki jo sprejmejo asimilacijski pigmenti: a) vezava energije v končne produkte fotosinteze, b) poraba v metabolnih procesih, ki onemogočijo kopičenje energije, c) emisija svetlobe (fluorescenca) in d) pretvorba svetlobne energije v toploto. V tilakoidni membrani, kjer so pigmentne molekule nameščene tesno ena zraven druge, se energije z antenskih molekul prenese na klorofil a v reakcijskem centru, pri čemer se vzbudi elektron. Vzbujeni elektroni preidejo na akceptorje, ki so nameščeni ob reakcijskem centru. Če stika med klorofilom a in akceptorskimi molekulami ni, klorofil odda vsaj del energije (3–4 %) preko fluorescence (670 nm pri klorofilu a in 650 nm pri klorofilu b) in vzbujeni elektron se vrne v osnovno stanje.

Fikobilini Po kemični naravi imajo fikobilini 4 linearno razporejene pirolove obroče. V celicah so vezani na proteinski del in tvorijo fikobiliproteide. Fikocianin je moder, fikoeritrin pa rdeč. Absorbirajo v zelenem in rumenem delu sprektra. Vsi so vodotopni. Vsebujejo jih cianobakterije in rdeče alge.

▌Vaja: ▌ Absorpcijski spektri asimilacijskih barvil Material listi različnih rastlin, terilnica, 250ml erlenmajerica, 250ml čaša, presesalna erlenmajerica z Büchnerjevim lijem, filtrirni papir, 4 5ml pipete, 10 in 100ml menzure, plošča za tankoplastno kromatografijo (Silikagel G 250), komora za razvijanje, sušilnik za plošče, priprava za nanašanje gela, eksikator, rotavapor, centrifuga, centrifugirke, stojalo za centrifugirke, lopatica za odstranjevanje gela s plošče, UV-svetilka, spektrofotometer

Priprava plošč za tankoplastno kromatografijo 30 g silikagela zmešamo s 60 ml destilirane vode v 250 ml erlenmajerici in ga nanesemo na plošče v 34


Praktikum fiziologije rastlin 250μm plast. Plošče aktiviramo 30 minut v komori in jih do uporabe shranimo v eksikatorju.

Priprava ekstrakta 2 g listov stremo v terilnici in jih ekstrahiramo s 25 ml hladnega (4 oC) acetona. Ko se ekstrakt obarva temnozeleno, mu dodamo malo Na2SO4, da odstranimo vodo. Filtriramo skozi Büchnerjev lij. Filtrat evaporiramo na rotavaporju in suhe pigmente raztopimo v 1 ml kloroforma.

Ločitev asimilacijskih pigmentov in meritev njihovih absorpcijskih spektrov Na kromatografski plošči označimo začetek 3 cm od roba, 10 cm od starta zarežemo v silikagel in tako označimo fronto. Enako naredimo na obeh straneh plošče 1,5 cm od roba. Z 0.1ml pipeto nanjo nanesemo 0,5 ml ekstrakta v ravni črti. Ploščo razvijemo v mešanici heksan : dieter : aceton (6 : 3 : 2). Izračunamo retenzijski faktor (Rf) posameznih pigmentov in pogledamo flourescenco pod UV-svetlobo. S plošče odstranimo gel, ki vsebuje posamezno barvilo, v centrifugirko in mu dolijemo 5 ml metanola. Centrifugiramo 3 minute pri 1000 obratih na minuto. Odpipetiramo supernatant in izmerimo absorpcijo na spektrofotometru v območju med 400 in 700 nm. Izračun retenzijskega faktorja:

d … razdalja, ki jo je prepotoval posamezen pigment F … fronta topila

Rezultati Kromatogram: Barva pigmenta (vidna svetl.)

Barva pigmenta (UV-luč)

Rf

35


Praktikum fiziologije rastlin

Fotosinteza Fotosintetsko aktivnost lahko merimo posredno preko izmenjave plinov (produkcije O2 ali porabe CO2).

Difuzija CO2 CO2 mora z difuzijo pripotovati v kloroplaste. Na poti se pojavljajo štiri ključne točke, ki jim pravimo točke upornosti. To so upornost mejne plasti zraka, stomatarna upornost, upornost intercelularnih prostorov in mezofilno upornost. Upornosti mejne plasti, intercelularnih prostorov in mezofilna upornost so precej majhne v primerjavi s stomatarno upornostjo (upornost intercelularnih prostorov povzroči padec parcialnega tlaka CO2 za 0,5 Pa – v primerjavi s 36 Pa izven lista).

Asimilacija CO2 Pri različnih predstavnikih rastlin obstaja nekaj razlik v asimilaciji CO2, vendar pri vseh poteka vezava CO2 preko Calvinovega cikla. Glede na razlike pa ločimo C-3, C-4 in CAM rastline.

C-3 Kalvinov cikel poteka v treh stopnjah: karboksilaciji, redukciji in regeneraciji. V prvi stopnji se CO2 veže na ribulozo-1,5-bisfosfat. Ob vezavi molekula razpade na dve molekuli s 3 C-atomi: 5-fosfoglicerat. V drugi stopnji nastopi redukcija do gliceraldehid-3-fosfata, ki se porablja za regeneracijo ribuloze-1,5-bisfosfat in tvorbo saharoze oz. škroba. Najpomembnejši encim pri asimilaciji CO2 je RuBiSCO, ki katalizira vezavo CO2 na ribulozo-1,5bisfosfat.

C-4 Ogljikov C-4 cikel predstavlja mehanizem za koncentriranje CO2. Proces poteka v dveh tipih celic in v štirih stopnjah. CO2 vstopa v mezofilne celice, kjer se veže na fosfoenolpiruvata (PEP) (reakcijo katalizira PEP-karboksilaza). Nastane kislina s 4 C-atomi, ki se transportira v celice žilnega ovoja. V teh celicah poteče dekarboksilacija in CO2 vstopi v Calvinov cikel. C-3 spojina pa se vrne v mezofilne celice, kjer se regenerira PEP. Obstajajo tri različice ogljikovega C-4 cikla, ki se razlikujejo po spojinah, ki se transportirajo med celicami (C-4: malat ali aspartat, C-3: piruvat ali alanin), in po encimu, ki katalizira dekarboksilacijo C-4 spojine. Tako ločimo NADP-malatni encimski tip (najdemo pri koruzi in sladkornem trsu), NADmalatni encimski tip in še PEP-karboksikinazni tip. Ogljikov C-4 cikel se pojavlja pri eno- in dvokaličnicah v 16 družinah (predvsem v družinah Poaceae, 36


Praktikum fiziologije rastlin Chenopodiaceae in Cyperaceae).

Slika 9. Shematična primerjava asimilacije CO2 pri C-3, C-4 in CAM rastlinah.

CAM – kisli metabolizem sočnic CAM je zelo podoben C-4 metabolizmu, vendar v njem posamezne stopnje med seboj niso ločene prostorsko, temveč časovno. Tako se ponoči CO2 veže na PEP, pri čemer nastane, preko oksalacetata, malat. Reakcijo vezave CO2 katalizira PEP-karboksilaza. Malat se skladišči v vakuoli v obliki jabolčne kisline. Na svetlobi se sprošča malata iz vakuole in iz malata CO2. CO2 vstopa v Calvinov cikel, preostanek malata (piruvat) pa se pretvori v škrob. CAM ne najdemo samo v rastlinah družine Crassulaceae, temveč tudi pri kaktejah, mlečkih, agavi in ananasu. V rastlini Mesembryanthemum crystallinum v nestresnih razmerah poteka C-3 metabolizem, če pa je rastlina izpostavljena vročini, suši in visokim koncentracijam soli pa preide na CAM metabolizem.

Omejitve mehanizmov za koncentriranje CO2 V C-4 in CAM rastlinah karboksilacija pogosto poteka pri saturacijskih koncentracijah CO2. Poleg tega takšni mehanizmi omogočajo visoko intenziteto fotosinteze tudi v razmerah nizkih parcialnih tlakov CO2 v listu, zaradi česar se znižuje izguba vode skozi odprte listne reže. C-4 metabolizem torej pomeni tudi učinkovitejšo izrabo vode in dušika (manj encima RuBiSCO) v primerjavi s C-3 metabolizmom. 37


Praktikum fiziologije rastlin Na drugi strani pa nastajajo dodatni energijski stroški v obliki transportnih procesov, kar pomeni slabšo učinkovitost v izrabi svetlobe pri C-4. Odpiranje listnih rež pri CAM-rastlinah le v nočnem času pomeni manjšo izgubo vode, v primerjavi s C-3 metabolizmom. Pojavi pa se problem omejenih možnosti skladiščenja jabolčne kisline v vakuoli.

▌Vaja: ▌ Poraba CO2 pri fotosintezi Material rastline vodne leče, steklenico za meritve izmenjave plinov, merilec ogljikovega dioksida, vmesnik LoggerPro, računalniški program LogerPro V steklenico natočimo 60 ml vode in dodamo 6 g vodne leče (vodne rastline stehtamo). Na odprtine namestimo merilec ogljikovega dioksida. Čas meritve v programu naravnamo na 15 min, gostoto zajemanja podatkov pa nastavimo na dva podatka/minuto. Zaženemo zajemanje podatkov in spremljamo spreminjanje koncentracije CO2 v steklenici. Steklenice osvetlimo z lučjo iz svetilke, pri tem namestimo med luč in steklenico rdeč, zelen filter ali moder filter. Eno meritev izvedemo z nefiltrirano svetlobo (bela svetloba).

Rezultati V spodnjo tabelo vpišemo spremembo koncentracije ogljikovega dioksida na enoto časa.

Tabela 8. Sprememba koncentracije CO2 Kvaliteta svetlobe Bela Rdeča Zelena Modra

Sprememba konc. CO2

Vprašanja 1.

38

Kako si razlagaš razlike v porabi CO2 pri uporabi različnih kvalitet svetlobe?


Praktikum fiziologije rastlin

▌Vaja: ▌ Diurnalni kislinski cikel pri sukulentnih rastlinah MATERIAL: listi sukulentnih rastlin (Bryophyllum sp., Kalanchoe sp., Sedum sp.), 0,01N KOH, pHmeter, fenolftalein, birete, stojalo za bireto, filtrirni papir, vodna črpalka, Büchnerjev lij, terilnica, vmesnik LoggerPro, računalniški program LogerPro, merilec pretoka, merilec pH Iz rastline odstranimo 8 približno enako velikih listov. 4 liste postavimo v temo, 4 pa pod stalen vir svetlobe. Čez 24 urah liste stehtamo, razrežemo na majhne koščke in kuhamo 10 minut v 40 ml destilirane vode. Ekstrakt ohladimo in liste homogeniziramo v terilnici. Homogenatu dodamo 10 ml destilirane vode. Dobro premešamo in prefiltriramo. Sedaj določimo pH filtrata in s titracijo določimo vsebnost kisline. Po meritvi pH razredčimo filtrat z 20 ml destilirane vode. Merilec pH in merilec pretoka povežemo z vmesnikom LabPro in zaženemo program LoggerPro. Gostoto zajemanja podatkov pa nastavimo na »nepretrgoma« (za pomoč pri nastavitvah gl. str. 15). Zeženemo zajemanje podatkov, odpremo bireto in uravnamo pretok na 2-3 kapljic/10 s ter spremljamo spreminjanje pH. Ko pH preide nevtralno območje (pH 7.0), ustavimo pretok in zaključimo zajemanje podatkov. Na diagramu preberemo količino porabljenega KOH do točke, ko je prišlo do preskoka pH.

Rezultati Tabela 9. Rezultati meritev pH in vsebnost jabolčne kisline. Listi na svetlobi v temi

Masa (g)

Vrednost pH

Kislina (ml/mg)

Vprašanja: 1.

Vsebnost katere kisline smo določali pri tej vaji?

2. Ali misliš, se zaradi višanja koncentracije CO2 v ozračju lahko izenačile kompetativne sposobnosti C-3, C-4 in CAM-rastlin, ali so prisotni tudi drugi kompetativni pritiski?

▌Vaja: ▌ Kranz anatomija MATERIAL: prezi listov enokaličnic s C4 in C4 metabolizmom, miskroskop Preglejte preparate in locirajte položaj prevajalnih tkiv. Analizirajte celike, ki obdajajo prevajalna tkiva (c. žilnega ovoja) in jih primerjajte z mezofilnimi celicami. Zapišite si tudi vse opažene razlike med kloroplasti, ki jih opazite med obema preparatoma. Preparate razporedite gled na metabolizem. 39


Praktikum fiziologije rastlin Prerezi listov:

C4 enokaliÄ?nica

Skice

40

C3 enokaliÄ?nica


Praktikum fiziologije rastlin

▌Vaja: ▌ Hillova reakcija Material listi špinače, 0,5 M raztopina saharoze, raztopina DCPIP (1 mg/ml), 1 mM K-fosfatni pufer (pH 8,0), 10 mM raztopina DCMU (naprej raztopimo v etanolu, nato pa pripravimo suspenzijo v vodi)

Priprava suspenzije kloroplastov Pripravimo si led, s katerim bomo hladili terilnico. Prav tako na led postavimo 100 ml centrifugirko in merilne valje, ki jih bomo potrebovali med izolacijo kloroplastov. Listom špinače odstranimo osrednjo listno žilo in natehtamo 10 g materiala. Liste nato narežemo na majhne koščke in jih stremo ob dodatku 20 ml hladne 0,5 M raztopine saharoze. Homogenat prefiltriramo preko dveh plasti gaze in ga prenesemo v ohlajen 100-ml merilni valj. Prefiltriran ekstrakt razdelimo med dve centrifugirke in ga 1 min centrifugiramo pri 500 g pri 2-4°C. Supernatant previdno prenesmo v sveže centrifugirke in ponovno centrifugiramo (10 min, 1000 g). Supernatant odlijemo, usedlino pa resuspendiramo v 10 ml 0,5 M raztopine saharoze in prenesemo na led.

Kvantitativna Hillova reakcija Za meritev poteka hitrosti elektronskega transporta prenesemo 1 ml suspenzije kloroplastov v epruveto z 9 ml 0,5 M saharoze in 0,5 ml raztopine DCPIP. Pripravimo pet epruvet in jih označimo kot: bela, rdeča, modra, zelena in tema. Epruvete potem prenesemo na ustrezne osvetlitve oz. v temo. Naslednjih 15 min v razmiku po 3 min merimo absorpcijo pri 600 nm in vrednosti vpišemo v spodnjo tabelo.

Rezultati Tabela 10. Absorpcija reakcijske mešanice glede na osvetlitev. Osvetlitev 3 min

6 min

Absorpcija 9 min

12 min

15 min

Bela Rdeča Modra Zelena Tema

41


Praktikum fiziologije rastlin

Graf 6. Odvisnost absorpcije reakcijske mešanice od kvalitete in časa osvetlitve.

Vprašanja 1. Kako bi rezultate zgornje vaje povezal s porabo CO2 pri različnih kvalitetah svetlobe?

42


Praktikum fiziologije rastlin

Herbicidi Pesticidi so snovi, s katerimi človek zatira škodljivce. Ena izmed skupin pesticidov so tudi herbicidi, ki jih uporabljamo za zatiranje plevela. Druge skupine so še baktericidi, fungicidi, insekticidi, rodenticidi, itd. Z uvajanjem monokultur je človek močno pripomogel k širjenju in razmahu plevelov, bolezni in škodljivcev, kar je seveda vodilo do potrebe po razvoju sredstev za njihovo zatiranje. Prvi pesticidi so bile anorganske snovi, ki so jih prvič uporabili sredi 19. stoletja, ko sta evropske vinograde napadli pepelasta plesen in peronospora. Herbicidi so snovi, ki v rastlinah povzročajo različne fiziološke in morfološke spremembe, ki zavirajo rast in razvoj rastline ali pa vodijo celo v smrt.

Obseg delovanja herbicidov Po obsegu delovanja delimo herbicide na totalne in selektivne: • totalni herbicidi uničijo vse rastline ali vsaj zelo veliko število rastlinskih vrst; • selektivni herbicidi pa uničijo le nekatere rastlinske vrste. Selektivnost temelji na morfoloških in fizioloških razlikah med vrstami rastlin: debelina in struktura kutikule in epidermisa, velikost listov, tarčne molekule (nanje se herbicid veže), sprejem in transport herbicida po rastlini, razgradnja herbicida. Pomembna za delovanje herbicida je tudi njegov odmerek herbicida, ki deluje na rastlino (herbicidi lahko v manjših količinah delujejo kot selektivni, pri večjih pa kot totalni).

Mesto in mehanizmi delovanja herbicidov Po mestu delovanja pa lahko herbicide razdelimo na kontaktne in sistemske: • kontaktni herbicidi delujejo le na mestu nanosa • sistemski herbicidi pa delujejo po celotni rastlini Mehanizmi delovanja herbicidov: • zaviranje fotosintetskega elektronskega transporta (večinoma med PS II in plastokininom); • motnje v sistemu fotofosforilacije (herbicid veže protone in jih prenaša skozi tilakoidno membrano – protonski gradient se poruši; blokada ATPaze - zavre transport elektronov); • motnje v biosintezi lipidov; • inhibicija sinteze karotenoidov (sledi fotodesktrukcija klorofila); • fizikalno-kemični vpliv na membrane (povečevanje prepustnosti); • zaviranje mitoze (blokada mikrotubulov delitvenega vretena); 43


Praktikum fiziologije rastlin • hormonski herbicidi.

Inhibitorji fotosinteze Med inhibitorje fotosinteze spadata dve skupini herbicidov. Prvo skupino predstavljajo triazini, urea herbicidi in uracili, ki jih rastlina absorbira preko korenin. Tarčno mesto te skupine herbicidov je D1 protein v fotosistemu II. V drugo skupino herbicidov spadajo bipirilidijski herbicidi, med katerimi je najbolj znan parakvat. V rastlino pridejo preko listov, kjer se vežejo v elektronsko verigo blizu ferodoksina v fotosistemu I. Obe skupini inhibitorjev fotosinteze povzročita nastanek reaktivnih kisikovih radikalov (fotooksidativen stres) in tako povzročita propad rastline.

Hormonski herbicidi Hormonske herbicide predstavljajo snovi, ki v fizioloških koncentracijah delujejo podobno kot avksini. V povišanih koncentracijah pa so ti učinki še bolj pudarjeni oz. pretirani. Posledice so lahko: abnormalno pospeševanje sinteze DNA, RNA, proteinov, sledijo lahko pretirane celične delitve v meristemih, nepravilne celične delitve, itd. Pod vplivom herbicida se močno poveča produkcija etilena, kar povzroča motnje polarnosti, odebeljevanje in venenje poganjkov, abscizijo listov. Pomembna skupina hormonskih herbicidov so derivati fenoksikarboksilnih kislin, med katere štejemo 2,4-D (2,4-diklorfenoksiocetna kislina), 2,4,5-T (2,4,5-triklorfenoksiocetna kislina) in MCPA (4-kloro-tolil oksiocetna kislina). 2,4-D je sistemski herbicid, ki v zmernih koncentracijah povzroča močno sintezo etilena v dvokaličnicah, v visokih koncentracijah pa je toksičen tudi za enokaličnice.

▌Vaja: ▌ Vpliv herbicidov na rast rastlin Material mlade rastline sončnice, epruvete, pipete, destilirana voda, herbicid: ____________________________ ________, pršilka Rastline pregledamo in odstranimo slabše rastoče rastline. Sestavimo 6 skupin rastlin. Ena skupina je kontrolna, druge pa bomo tretirali z naslednjimi koncentracijami herbicidov: • s priporočeno koncentracijo, • z 10-kratno koncentracijo priporočene, • z 0,1-kratno koncentracijo priporočene, • z 0,01-kratno koncentracijo priporočene, • z 0,001-kratno koncentracijo priporočene. OBVEZNO UPORABLJAJTE ROKAVICE!! Herbicid raztopimo v vodi tako, da dobimo navedene koncentracije. Rastline tretiramo s herbicidom in jih prenesemo v rastne komore. Po tretiranju v razmiku dni in tednov opazujemo pojavljanje simptomov in smrtnost med rastlinami. Po treh tednih preštejemo 44


Praktikum fiziologije rastlin število preživelih rastlin in jih vzamemo polovico rastlin iz lončkov, odstranimo zemljo ter jih stehtamo. Na podlagi dobljenih ocen smrtnosti v posameznih skupinah poskusimo določiti 50% letalno koncentracijo (LC50) in ugotoviti razlike v priraščanju biomase na podlagi primerjave svežih.

Rezultati

Graf 7. Smrtnosti kalic sončnice glede na koncentracijo uporabljenega herbicida. Vriši LC50.

▌Vaja: ▌ Določanje vsebnosti asimilacijskih barvil Material zeleni listi različnih rastlin (C-3, C-4 in CAM); kalice koruze kaleče v temi in na svetlobi, kremenčev pesek, aceton, 25% HCl, terilnica, centrifugirke, 20ml epruvete, stojalo za epruvete, merilni valj, nuča, filter papir, centrifuga, spektrofotometer

Ekstrakcija in določitev vsebnosti asimilacijskih barvil Vzamemo 1 g sveže mase materiala in ga stremo v terilnici z dodatkom (za noževo konico) kremenčevega peska. Vzorce tremo najprej na suho in nato v 10 ml 100% na 4 oC ohlajenega metanola, dokler ne postanejo homogeni. Ekstrakt nato prefiltriramo v merilni valj. Vzorce spiramo s svežim metanolom tako dolgo, da se metanol ob dodatku v terilnico ne obarva več zeleno. Po končanem spiranju odčitamo volumen ekstrakta v merilnem valju. Ekstrakt razdelimo v dve centrifugirki (približno 10 ml) in centrifugiramo 20 minut pri 4200 obratih. Absorpcije ekstraktov izmerimo na spektrofotometru pri valovnih dolžinah 665, 652 in 470 nm. 45


Praktikum fiziologije rastlin Formule za izračunavanje koncentracije pigmentov:

Rezultati Tabela 11. Meritve absorpcij: 665 nm

652 nm

470 nm

1 2 3 4 5 6 Tabela 12. Koncentracije asimilacijskih barvil (material:___________________): Asimilacijsko barvilo klorofil a klorofil b skupni klorofili karotenoidi razmerje klorofil a/b razmerje klorofili/karotenoidi

vsebnost (mg/g)

Vprašanja 1.

46

Kakšne razlike ste opazili med različnimi vzorci?


Praktikum fiziologije rastlin

2.

Bi te razlike lahko razloĹžili s starostjo/osvetljenostjo/metabolizmom?

3. Ali bi lahko enake formule uporabili za izraÄ?un vsebnosti pigmentov v vzorcu, Ä?e bi uporabili uporabe drugega topila za ekstrakcijo?

47


Praktikum fiziologije rastlin

Flavonoidi Flavonoidi so barvila, ki rastlinske cvetove in plodove obarvajo rdeče, modro, rožnato, vijolično ali rumeno. Prisotni so tudi v listih. Večinoma se skladiščijo v vakuolah. Kemično spadajo v veliko skupino vodotopnih polifenolov, nastopajo pa večinoma kot glikozidi. Osnova za aglikon je flavanova struktura, nanjo pa se veže različno število hidroksilnih (lahko pa tudi metoksi-) skupin. Sintetizirajo se po šikimatni (most iz treh ogljikovih atomov in en aromatski obroč) in malonatni poti (drugi aromatski obroč). Slika 10. Flavonoidni skelet Flavonoidi so pomembni za opraševalce cvetov in raznašalce semen. Flavonoli ob obsevanju z UV-svetlobo fluorescirajo vijolično do modro. Antociani imajo poleg tega tudi zaščitno funkcijo: absorpcija svetlobe v antocianskih molekulah in odvajanje odvečne energije iz sistema pomeni za občutljivejše organske molekule zaščito pred fotodestrukcijo. Učinek je še posebej opazen pri kalicah in mladih delih rastlin.

Antociani So modra do rdeča barvila, aglikon je antocianidin. Barva spojine je odvisna od: osnovne strukture antocianidina, to je od števila in položaja hidroksilnih skupin na B-obroču (gl. sliko 7); pH: v kislem okolju so rdeči, v bazičnem se njihova barva pomakne proti modri; kelacije s kovinskimi ioni: kelati so modri; kopigmentacije z drugimi flavonoidi in galotanini; števila vezanih sladkornih molekul: vpliva večinoma le na barvni odtenek. Slika 11. Struktura antocianov

Nekateri predstavniki (imenovan je le aglikon): cianidin: cvetovi pri rodovih Rosa, Pulmonaria, Centaurea; plodovi – jabolka, češnje, maline, rdeči ribez; v listih (tudi v rdečem zelju) obstaja cianidin-3-glukozid; 48


Praktikum fiziologije rastlin pelargonidin: jagode; cvetovi pri rodovih Pelargonia, Papaver, Dahlia; delfinidin: cvetovi pri rodovih Delphinium, Malva; plod jajčevca.

pelargonidin

cianidin

delfinidin

Slika 12. Odvisnost barve antocianov od njihove strukture.

Flavoni in flavonoli So večinoma brezbarvni; če so metilirani, so rumeni. Prisotni so tudi v plodovih, v vsakem primeru pa prispevajo le malo barve (ponavadi absorbirajo pri krajših valovnih dolžinah svetlobe). Opazneje so prisotni v cvetovih vrst Lathyrus pratensis, Antirrhinum spp., Tagetes spp., Calendula officinalis (v zadnjem primeru večino barve dajejo karotenoidi). Opazna je šibka reakcija na pH – v bazičnem se obarvajo intenzivneje rumeno. Njihovi funkciji sta predvsem tvorba medokazov (opraševanje) in absorpcija UV-B svetlobe (zaščita).

Slika 13. Struktura flavononov (levo) in flavonolov (desno).

49


Praktikum fiziologije rastlin

▌Vaja: ▌ Antociani Material »rdeča« čebula (Allium cepa), listi rdečega zelja (Brassica oleracea var. capitata), plodovi navadne kaline (Ligustrum vulgare), rdeče in modro cvetje (Cyclamen, Iris, Rosa, Dianthus, Hydrangea, Pulmonaria, ...), rdeča pesa (Beta vulgaris), 6 epruvet, 100ml čaša, skalpel, petrijevke, mikroskop s priborom, HCl, NH3, 10% FeCl3, pufri pH 2, 4, 6, 8, 10

Izvedba S kuhanjem rastlinskega material pripravimo vodni ekstrakt, ki je zaradi visoke vsebnosti rastlinskih barvil intenzivno obarvan. Ekstrakt razdelimo v 10 epruvet. V posamezne erpuvete dolijemo pufre in druge reagente iz spodnje tabele. Opazujemo spreminjanje barve in zapišemo opažanja.

Rezultati Tabela 13. Sprememba barve ekstraktov ob dodatku pufrom in FeCl3. Tretma Dodamo pufer s pH

Sprememba barve 2 4 6 8 10

Dodamo FeCl3

Vprašanja 1. Ali se ekstrakti barvil razlikujejo med seboj glede na spremembo barve ob dodatku pufrov in reagentov? Zakaj?

▌Vaja: ▌ Ločitev flavonolov in antocianov s tankoplastno kromatografijo Material modri in rumeni cvetovi (Dianthus, Antirrhinum, Rosa, Iris, Lysianthus ...), terilnica, petrijevka Φ 15–25 cm, petrijevka Φ 4 cm, filtrirni papir, spatula, centrifuga, centrifugirke, UV-svetilka, 1% HCl v etanolu, 1% HCl v metanolu, n-butanol, ocetna kislina, kivete, spektrofotometer, celuloza za kromatografijo, silikagel G 250, plošče za kromatografijo 50


Praktikum fiziologije rastlin

Priprava plošč za tankoplastno kromatografijo Zmešamo 10 g celuloze in 4 g silikagela H v 80 ml destilirane vode. Mešanica zadostuje za pripravo 5 plošč (20 x 20 cm) za tankoplastno kromatografijo debeline 250 μm. Plošče aktiviramo pri 40 °C preko noči.

Priprava ekstrakta pigmentov 1 g svežega rastlinskega materiala stremo v terilnici ob dodatku 3 ml 1% HCl v 95% etanolu. Homogenat prefiltriramo skozi Büchnerjev lij in skoncentriramo na rotavaporju. Filtrat lahko do uporabe shranimo v hladilniku.

Ločitev flavonoidov in meritev njihovih absorpcijskih spektrov Na kromatografski plošči označimo začetek 3 cm od roba, 10 cm od začetka zarežemo v silikagel in tako označimo fronto. Enako naredimo na obeh straneh plošče 1,5 cm od roba. Z 0,1ml pipeto nanesemo 0,1 ml ekstrakta (točkovno). Ploščo razvijemo v mešanici n-butanol : ocetna kislina : voda (5 : 1 : 4). Izračunamo vrednosti Rf posameznih pigmentov in si ogledamo flourescenco pod UV-svetlobo. S pomočjo spodnje tabele določimo prisotnost in Rf posamezne skupine antocianov. Tabela 14. Barve in absorpcijski vrhovi nekaterih flavonoidov

51


Praktikum fiziologije rastlin S plošče odstranimo gel, ki vsebuje posamezen pigment, v centrifugirko in mu dolijemo 5 ml 1% HCl v metanolu. Centrifugiramo 3 minute pri 1000 obratih na minuto. Odpipetiramo supernatant in s spektrofotometrom izmerimo absorpcijo v območju med 400 in 700 nm.

Rezultati Izpolnimo spodnjo skico kromatograma in opise pigmentov. Objekt:

Kromatogram:

Barva pigmenta (vidna svetl.) Barva pigmenta (UV-luč) Rf

Askorbinska kislina Askorbinska kislina je ogljikovim hidratom sorodna spojina, ki se sintetizira iz glukuronske kisline. Zaradi dveh hidroksilnih skupin ob dvojni vezi je reducent – eden od najmočnejših v celici. V celični presnovi deluje v oksidoredukcijskih procesih kot donor H (pri sintezi nekaterih aminokislin, v askorbinsko-glutationski dihalni verigi, v katalizi fotofosforilacije; pospeševanje delovanja vitamina B9), pri čemer se reverzibilno oksidira v dehidroaskorbinsko kislino. Lahko je vezana na proteine kot askorbigen. Askorbinska kislina je v vsaki rastlinski celici, v posebej visokih koncentracijah je prisotna v zelenih delih rastline in v plodovih. Koncentracije so višje v sončnih delih rastline (listi na prisojni strani drevesa, plodovi na zunanji, proti soncu obrnjeni strani oz. tik pod povrhnjico). Kot močan reducent je askorbinska kislina občutljiva za kisik, na svetlobi in pri visoki temperaturi hitro oksidira. Ekstrahiramo jo s kislino, ker je spojina v kislem okolju obstojneša, poleg tega pa z nizkim pH izključimo naravne oksidaze ter imobiliziramo druge reducente, ki bi vplivali na poznejšo titracijo.

▌Vaja: ▌ Določanje vsebnosti askorbinske kisline Material etiolirane in neetiolirane rastline fižola (Phaseolus vulgaris), različno sadje in zelenjava, različno stare kalice koruze (Zea mays), terilnica, skalpel, 2 in 10ml pipete, 25 in 50ml erlenmajerice, 10, 50 in 100ml menzure, 50ml čaša, lij, vata, bireta, tehtnica, 2,6-diklorfenol indofenol (100 mg barvila raztopimo v 52


Praktikum fiziologije rastlin 500 ml vode, zavremo in še vročo raztopino prefiltriramo v temno steklenico; do 1 tedna jo hranimo v hladilniku.), 2% metafosforna kislina, 0,05% askorbinska kislina v metafosforni kislini

Izvedba Askorbinsko kislino določamo s titracijo z barvilom 2,6-diklorindofenol, ki askorbinsko kislino oksidira in se pri tem razbarva. Barvilo 2,6-diklorfenol indofenol je v raztopini neobstojna spojina, zato uporabljamo čim bolj svežega. Vodna raztopina je temno modre barve; pri titraciji se (zaradi kislega pH) obarva rdeče, nato pa se zaradi redukcije z askorbinsko kislino takoj razbarva. Takoj ko začne rožnata barva zastajati, nehamo titrirati; počasno razbarvanje je posledica reakcije z drugimi snovmi. Ločimo dele rastline (listi, steblo, korenine). Vsaka skupina rastlinskih organov naj tehta 15 g. Rastlinski material s skalpelom razrežemo in stremo v terilnici. Odmerimo 60 ml 2% metafosforne kisline in jo dodajamo vzorcu. Homogenat skozi tankega sloja vate prefiltriramo v 100ml merilni valj, ostanek na vati pa speremo z 2% metafosforno kislino tako, da filtrat dopolnimo do 100 ml. Nato določimo titer barvila 2,6-diklorfenol indofenol. 2 ml standardne raztopine askorbinske kisline v metafosforni kislini (vsebuje natanko 1 mg askorbinske kisline) titriramo z barvilom. Barvilo se zaradi nizkega pH vzorca najprej obarva rdeče, nato pa se zaradi redukcije razbarva. Ko začne rožnata barva zastajati, titracijo končamo. Titriramo trikrat in izračunamo srednjo vrednost. Nato titriramo še 10 ml vzorca. Titracijo ponovimo najmanj trikrat, pred vsakim odvzemom pa vzorec vsakokrat dobro premešamo. S pomočjo titra barvila izračunamo vsebnost askorbinske kisline v titriranem vzorcu. To preračunamo na začetnih 100 ml ekstrakta ter na maso rastlinskega materiala:

x = vsebnost askorbinske kisline v rastlinskem materialu (mg/g) a = srednji titer barvila (ml/mg) b = srednji titer 10 ml vzorca (ml) m = masa rastlinskega vzorca (g)

Objekt: masa (g): titri barvila (ml/mg): 53


Praktikum fiziologije rastlin titri 10 ml ekstrakta (ml):

Vsebnost askorbinske kisline (mg/g): Material

Vsebnost askorbinske kisline etiolirani neetiolirani

listi steblo sadje: zelenjava:

Celica Vodni potencial celice Vodni potencial nam pove, koliko je sistem (celica, vakuola, tla, raztopina, itd.) nasičen z vodo. Merimo ga v barih oz. MPa. Vrednost 0 barov je dogovorjena za vodo pri standardnih pogojih (298 K in 0,1013 MPa). Vodni potencial v drugih vodnih sistemih tako definiramo kot kvocient razlike med kemijskimi potenciali čiste vode in našega sistema ter parcialnim molskim volumnom vode v sistemu.

Nižje vrednosti vodnega potenciala pomenijo večjo afiniteto sistema do privzemanja vode. Iz definicije je razvidno, da imajo rastlinske celice in tkiva lahko le negativen vodni potencial oz. vodni potencial kvečjemu enak 0 barov. Če dva sistema ločimo s polprepustno membrano, voda prehaja iz sistema z višjim vodnim potencialom v tistega z nižjim. Vodni potencial je sestavljen iz treh komponent: osmotskega potenciala, potenciala matriksa in potenciala tlaka.

54


Praktikum fiziologije rastlin Osmotski potencial pove, kakšen je učinek topljencev na vodni potencial sistema. Po definiciji je vodni potencial čiste vode enak 0, torej bo v raztopini osmotski potencial negativen.

V idealni (zelo razredčeni raztopini) raztopini neelektrolita lahko vodni potencial kar enačimo z osmotskim, medtem ko moramo v raztopini elektrolita upoštevati tudi disociacijo topljenca, ki osmotski potencial poveča za faktor i (izosmotska konstanta).

Rastline oz. celice lahko svoj vodni potencial spreminjajo s pomočjo spreminjanja koncentracij raztopljenih snovi v vakouli (sladkorji, aminokisline …). Potencial matriksa je posledica vezave vode na makromolekule. Makromolekule v celici in izven nje (celična stena) lahko vežejo hidratacijsko in kapilarno vodo. Potencial matriksa se uporablja za izražanje zmanjševanja proste energije vode, če se ta nahaja v izredno tankem sloju (1–2 molekuli), adsorbiranem na delce suhe prsti, celične stene … Njegov vpliv na vodni potencial celice je majhen, zato se pri opisu vodnega potenciala ponavadi opušča. Velik pa je njegov pomen v celičnih stenah in pri nabrekanju suhih semen (to je povsem fizikalen pojav).

Potencial tlaka predstavlja hidrostatski tlak tekočine. Pozitivni tlak poviša vodni potencial, negativni pa ga znižuje. V primeru rastlinske celice je ponavadi mišljen pozitivni potencial znotraj celice, ki ga imenujemo stenski tlak ali turgor. Negativni potencial tlaka se lahko pojavi v ksilemu ali med celičnimi stenami. Imenujemo ga tenzija. Negativni potencial tlaka je zelo pomemben za transport vode po rastlini (na velike razdalje). Za celico v izoosmotski raztopini velja, da je vodni potencial celice enak potencialu raztopine (celica je turgescentna). Iz poenostavljene oblike zapisa enačbe vodnega potenciala sledi, da sta si potencial tlaka in osmotski potencial nasprotno enaka … Če celico postavimo v hipotonično raztopino, bo voda vdrla v celico in naprej v vakoulo. Posledica je povečanje mase celice. Če pa celico postavimo v hipertonično okolje, bo prišlo do oddajanja vode iz celice v okolje. Posledica je krčenje vakoule in izguba mase celice oz. njenega volumna. Omenjene pojave lahko uporabimo za merjenja vodnega in osmotskega potenciala celic. Za merjenje vodnega potenciala celic ali tkiv postavimo celice v serijo raztopin z različnimi koncentracijami. V raztopini, v kateri se masa celic ne spremeni, sta vodna potenciala izenačena. Osmotski potencial celice pa merimo tako, da opazujemo, v kateri raztopini nastopila mejna plazmoliza. Ta se pojavi, ko celica izgubi ravno tolikšno količino vode, da plazmalema odstopi od celične stene. Ob nastopu mejne plazmolize je potencial tlaka v celici skoraj enak 0, ker protoplast že odstopa od stene, in iz enačbe 55


Praktikum fiziologije rastlin sledi, da je vodni potencial celice tedaj enak osmotskemu potencialu celice oz. osmotskemu potencialu raztopine.

▌Vaja: ▌ Vodni potencial celice Material gomolji krompirja in repe, plutovrt premera 5 mm, skalpel, milimetrsko merilo, tehtnica, epruvete, papirnate brisače, raztopine KNO3 ali saharoze 0,00, 0,05, 0,10, 0,15, 0,20, 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,45, 0,50, 0,60 m

Izvedba V epruvete nalijemo serijo koncentracij raztopin KNO3 ali saharoze. S plutovrtom izrežemo iz gomolja natanko 4 cm dolge valje. Natančno jih stehtamo in potopimo v raztopine. Po eni do dveh urah inkubacije raztopine odlijemo, koščke narahlo obrišemo s papirnato brisačo in jih stehtamo. Za vsako koncentracijo raztopine izračunamo odstotek spremembe v masi (s):

mz = masa na začetku; mk = masa na koncu Rezultate vnesemo v graf in odčitamo točko, pri kateri je sprememba mase enaka 0. Pri tej koncentraciji osmotika sta vodna potenciala tkiva in raztopine enaka. Vodni potencial raztopine, ki je v tem primeru enak njenemu osmotskemu potencialu, izračunamo po formuli za ozmotski potencial, pri čemer uporabi za saharozo i = 1, za KNO3 i = 1.69 in za R (splošna plinska konstanta) = 0,083 bar l mol–1 K–1 Vajo lahko izvedemo tudi tako, da namesto mase merimo volumen tkiva. Pomagamo si s potapljanjem valjev tkiva v menzuro. Rezultati Objekt: Ozmotik:

56


Praktikum fiziologije rastlin

Tabela 15. Sprememba mase tkiva. Koncentracija plazmolitika (m) 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 0,60

Začetna masa (g)

Končna masa (g)

Sprememba (g)

% spremembe

Koncentracija osmotika, v kateri se masa ne spremeni: Vodni potencial Ψ =

Tabela 16. Rezulati vseh skupin Objekt Repa Krompir

Ozmolitik KNO3 saharoza KNO3 saharoza

Ψ

Vprašanja 1. Osmotski potencial je odvisen od števila delcev, ki jih topljenec tvori v raztopini. Kako bo uporaba KNO3 in saharoze vplivala na izračun osmotskega potenciala?

2. Od katerih faktorjev je odvisen transport (tok) vode skozi plazmaleme v celico in iz nje? Ali bi znal zapisati enačbo?

3. Če opazuješ stolpce vode v ksilemskem tkivu, kateri dodatni faktor (poleg navedenih v teoriji) še vpliva na transport vode? Kaj to pomeni za rastlino? 57


Praktikum fiziologije rastlin 4. Predpostavi, da sta osmotski potencial celice A –1,6 MPa in potencial tlaka +1,0 MPa. Ozmotski potencial celice in potecial tlaka celice B pa –1,0 in +0,6 MPa. Odgovori na naslednja vprašanja: • Kakšen je vodni potencial celice A? • Kakšen je vodni potencial celice B? • Če bi se obe celici stikali, kam bi se premikala voda? • Kakšen bo vodni potencial obeh celic, ko bosta dosegli ravnovesje? • Predpostavi, da v nobeni izmed obeh celic ne bo prišlo do premikanja raztopljenih snovi. Kakšen bo potencial tlaka v obeh celicah?

Transpiracija Rastline lahko sprejemajo vodo na dva načina: z nabrekanjem in z osmozo. Pri višjih rastlinah je, za razliko od steljčnic, ki lahko vodo sprejemajo s celotno površino, privzem vode omejen na specializirane organe – korenine. Rastlina lahko sprejme vodo,če je vodni potencial korenine nižji od vodnega potenciala tal. Rastlina aktivno včrpava ione v korenine, kar znižuje osmotski potencial korenine in omogoči pasivno vstopanje vode vanjo. Voda vstopa v korenine skozi koreninske laske. Transpiracija je izparevanje vode iz listov skozi listne reže. Nastopa vedno, kadar zrak ni nasičen z vodno paro (potreben je torej neki saturacijski deficit). Voda pride v list s ksilemskim tokom, difundira v intercelularje in skozi listne reže ali površino lista (evaporacija!) v atmosfero. Razlika med vodnima potencialoma intercelularjev in atmosfere lahko znaša celo 100 MPa. Večji del vode rastlina izgubi skozi listne reže. Izgubo vode preko listnih rež lahko rastlina regulira. Če so odprte vse listne reže, znaša njihova skupna površina približno 1–2 % listne površine. Listne reže so lahko različno razporejene. Pri mnogih rastlinah so nameščene samo spodaj (listopadno drevje), lahko pa so tudi samo na zgornji strani (plavajoči listi) ali pa na obeh straneh lista. Rastlina pa lahko vodo izgublja tudi skozi listno površino, ki nima listnih rež (kutikularna transpiracija). Tega dela izgube vode rastlina ne more nadzorovati. Veliko rastlin je razvilo strukture, ki omejujejo evaporacijo (trihomi, voščene prevleke,…). Dejavniki, ki tudi vplivajo na transpiracijo in evaporacijo, so: • transpiracijska/evaporacijska površina; • temperatura zraka (odvisnost absolutne nasičenosti zraka od temperature); • temperatura lista; • veter (vpliva na debelino robne plasti zraka). 58


Praktikum fiziologije rastlin

▌Vaja: ▌ Merjenje intenzivnosti transpiracije Material listi ali mladi poganjki različnih rastlin, plastična cev, merilec pritiska, vmesnik LoggerPro, računalniški program LogerPro, digitalni fotoaparat ali optični čitalec, program ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/)

Izvedba Poganjke ali liste odrežemo pod vodo, da v žile ne vdre zrak in jih vtaknemo v plastično napolnjeno z vodo. Cev na delu z rastlino zatesnimo z zažemko, drug konec pa pritrdimo na merilec pritiska. Pri tem pazimo, da voda ne vdre v merilec. Čas meritve v programu naravnamo na 30 min, gostoto zajemanja podatkov pa nastavimo na 1 podatek/min. Zaženemo zajemanje podatkov in spremljamo spreminjanje tlak v cevki (negativna sprememba tlaka je posledic transpiracije). Po zaključeni meritvi odčitamo spremembo tlaka v eni uri. Meritve izvedemo v zaprti posodi s povečano vlažnostjo, pri sobnih pogojih in ob prepihavanju. Za izmero transpiracijske površine liste položimo na milimetrski papir in fotografiramo z digitalnim fotoaparatom (postavljenim vzporedno s podlago!) ali skeniramo z optičnim čitalcem. Slike odpremo v programu ImageJ in jih umerimo tako, da z orodjem za črte označimo razdaljo 1 cm. Izberemo meni »Analyze > Set Scale« in pod »Known distance« vstavimo 1.0 (= označeni razdalji). Sedaj z orodjem za prostoročno risanje obkrožimo listne lamine in izberemo »Analyze > Measure«. Intenzivnost trasnpiracije podamo kot spremembo tlaka na min na transpiracijsko površino (MPa min-1 cm-2). Tabela 17. Meritve transpiracije. Sobni

Pogoji Prepihavanje

Visoka vlaga

sprememba tlaka listna površina transpiracija

Vprašanja 1.

Kakšen je bil vpliv zračne vlažnosti na intenzivnost transpiracije? Razloži.

2.

Kakšen je bil vpliv prepihavanja (vetra) na intenzivnost transpiracije? Razloži.

59


Praktikum fiziologije rastlin

Vpliv rastnih regulatorjev na α-amilazno aktivnost Giberelini so pomembni kot hormoni rjavih in zelenih alg, praproti in semenk. Sintetizirajo jih tudi nekatere glive (Gibberella fujikuroi) in bakterije. Predstavlja jih velika skupina diterpenskih kislin, ki se sintetizirajo po terpenoidni poti. Za gibereline je značilen giberelanski skelet, pri čemer imajo nekateri giberelini vseh 20 C-atomov, nekateri pa le 19. Označeni so kot GAx, pri čemer x pomeni zaporedno številko odkritja (sosednje številke ne nakazujejo strukturne podobnosti med molekulami). Sinteza giberelinov poteka v treh stopnjah: 1.

ciklizacijske reakcije

2.

oksidacija (tvorba GA12-aldehida)

3.

tvorba vseh ostalih giberelinov iz GA12-aldehida

Sinteza giberelinov poteka v razvijajočih se delih rastline: zelo visoke koncentracije so v razvijajočih se semenih, plodovih, aktivno rastočih brstih, listih in zgornjih internodijih,… Gibereline sintetizirajo v poganjkih, v preostale dele rastline se lahko transportirajo po floemu. Zelo verjetno je, da sinteza giberelinov poteka na enem mestu, nadaljnji metabolizem pa na drugem – mezofilne celice listov ne morejo izvesti prve stopnje v sintezi giberelinov, lahko pa tretjo. Neaktivne skladiščne oblike verjetno predstavljajo tudi konjugati GA s sladkorji: preko karboksilne ali hidroksline skupine sladkorjev. V nekaterih vrstah rastlin (trave, pritlikave rastline in rozetaste rastline) giberelini povzročajo zelo intenzivno podaljševanje internodijev. Drugi učinki njihovega delovanja so: pospeševanje cvetenja, rast brstov, indukcija kalitve in mobilizacija hranil v semenu. Komercialna uporaba giberelinov: v proizvodnji sadja (grozdje), proizvodnja pijač (razgradnja škroba), za povečevanje pridelka sladkornega trsa (giberelini in benziladenin), v pridelavi dreves (iglavci). V nekaterih primerih se uporabljajo tudi inhibitorji sinteze giberelinov na primer za preprečevanje poleganja rastlin zaradi rose.

Model delovanja giberelinov: mobilizacija rezerv endosperma Giberelini se sintetizirajo v skutelumu in kariopsi ter difundirajo v alevronsko plast, kjer sprožijo sproščanje številnih hidrolitičnih encimov. Za razliko od ribonukleaz in β-1,3-glukanaz, ki se pod vplivom giberelinov le sproščajo (sinteza poteka tudi v odsotnosti giberelinov), je pri α-amilazi pod nadzorom giberelinov tudi njena sinteza.

60


Praktikum fiziologije rastlin

▌Vaja: ▌ Vpliv giberelinov in abscizinske kisline na kalitev semen ječmena Material semena ječmena (Hordeum vulgare), skalpel, 100ml erlenmajerica, sterilni papir, petrijevke Φ 35 mm ali 25ml erlenmajerice, 1 in 5ml pipete, 10ml menzure, 4 večje čaše, 10 × 160 mm epruvete, tehtnica, spektrofotometer, koncentrirani H2O2, bidestilirana voda, osnovna raztopina giberelinske kisline v pufru (20mM NaH2PO4, pH 6,9, popravljen z NaOH; 6mM NaCl), raztopina giberelinske kisline, raztopina abscizinske kisline in raztopina cikloheksimida Raztopina delno razgrajenega škroba Založno raztopino pripravimo z raztapljanjem 0,5 g topnega škroba v 500 ml destilirane vode z 3,0 g KH2PO4 in 0,02 g CaCl2.2H2O (ali 0,015 g CaCl2). Raztopino zavremo in nato do uporabe shranimo v hladilniku.

Zakisana raztopina joda Raztopino joda pripravimo z raztapljanjem 6 g KI in 0,6 g I2 v 100 ml destilirane vode. Končno raztopino reagenta pripravimo iz 1 ml raztopine joda, ki jo dopolnimo do 100 ml z 0,05 N HCl.

Izvedba Priprava ječmenovih semen za tretiranje 35 ječmenovih semen olupimo in jih za 15 minut namočimo v koncentriran H2O2 (30%). Nato jih

štirikrat speremo s sterilno bidestilirano vodo in ponovno dolijemo vodo. Erlenmajerice čez noč shranimo v hladilniku. Tretiranje semen in inkubacija

Semena stehtamo in prerežemo na pol (prečno). V nadaljnji vaji uporabimo le dele brez embria. Deset polovičk semen stehtamo skupaj, nato pa jih prenesemo v sterilne petrijevke, ki vsebujejo 4 ml raztopine giberelinske kisline v pufru. Tabela 18. Priprava tretmajev Konc. 0 = 0,00 μM GA konc. 0,01 = 0,01 μM GA konc. 0,1 = 0,1 μM GA konc. 1 = 1 μM GA konc. 10 = 10 μM GA konc. 10 C = 10 μM GA konc. 0,1 A = 0,1 μM GA konc. 1,0 A = 1 μM GA

+ 10 μg/ml cikloheksimida + 10 μM ABA + 10 μM ABA 61


Praktikum fiziologije rastlin Celotna skupina pripravi še dve kontrolni petrijevki. Vanju damo bidestilirano vodo. Inkubiramo 48 ur pri 30 °C. Po inkubaciji iz vsake petrijevke odvzamemo 1 ml raztopine v epruveto in kolorimetrično določimo aktivnost α-amilaze. Določanje aktivnosti α-amilaze Pripravimo škrobno raztopino: 6,7 g škroba in 8,16 g KH2PO4 raztopimo v 1000 ml bidestilirane vode. Pripravimo tudi jodovo raztopino: 0,6 KI in 60 mg I2 raztopimo v 1000 ml 50mM HCl. Po koncu inkubacije iz vsake petrijevke odvzamemo 0,1 ml raztopine in jo zmešamo z 1 ml škrobove Tabela 19. Absorpcije škrobno-jodovega kompleksa pri 620 nm raztopine in 0,9 ml bidestilirane Konc GA Masa semen (mg) Absorpcija vode. Čez 10 minut dodamo 1 (g/ml) ml jodove raztopine in izmerimo 0 absorpcijo pri 620 nm. Narišemo graf odvisnosti relativne absorpcije 0,01 0,1 glede na tretma. 1 Od vzorcev, inkubiranih v 10 10 C giberelinski kislini, odštejemo 0,1 A vrednosti kontrolnih vzorcev in 1A rezultate vnesemo v graf. Pri tem naj bo y-os v linearnem merilu, x-os pa v logaritemskem merilu.

Graf 8. Absorpcija škrobno-jodovega kompleksa pri 620 nm v odvisnosti od tretmaja. 62


Praktikum fiziologije rastlin

Vprašanja: 1.

Zakaj smo morali semena prerezati v sterilnih pogojih?

2.

Zakaj smo pri tretmaju 10 C dodali cikloheksimid?

3.

Kaj pomeni zmanjšanje absorpcije pri meritvah aktivnosti α-amilaze?

4.

Kakšen vpliv je imela prisotnost ABA v inkubacijski raztopini na rezultat poskusa?

Avksini in celična rast Za avksine je dokazano, da stimulirajo podaljševanje izrezanih segmentov poganjkov dvokaličnic in koleoptil enokaličnic. Podaljševanje segmentov poganjkov oz. koleoptil je posledica podaljševanja celic, ki ga stimulirajo avksini. Izrezani segmenti poganjkov in koleoptil so pogosto služili za testiranje in študij vplivov avksinov na rast rastlinskih celic. Spoznanja teh študij so bila vključena v teoriji kislinske rasti rastlinskih celic. Slednja pravi, da avksini v celicah spodbudijo sekrecijo protonov v celično steno, kar posledično zniža pH celične stene. Znižanje pH povzroči prekinjanje kovalentnih povezav med komponentami celične stene. Proces katalizirajo ekspanzini, ki so proteinske komponente in predvidoma povezujejo celulozo in hemiceluloze. Z rahlanjem povezav med komponentami celične stene se poveča njena plastičnost, kar omogoči rast celice.

63


Praktikum fiziologije rastlin

▌Vpliv ▌ avksinov na podaljševanje izrezanih segmentov poganjkov graha Material Potrebujemo: osem dni stare etiolirane kalice graha, raztopine indol ocetne kisline (IAA, koncentracije: 0,02 μM, 0,2 μM, 2 μM, 20 μM in 200 μM), pufer (20 mM KH2PO4, pH popravljen s KOH na 6,5) z 2 % saharoze (m/V), petrijevke, 10ml pipete, skalpel, pincete

Izvedba Vsaka skupina pripravi šest petrijevk in vanje doda 10 ml fosfatnega pufra. Petrijevke pokrijte in jih ustrezno označite. Nato v posamezno petrijevko dodajte 10 ml založne raztopine avksinov. Za kontrolo uporabite destilirano vodo. S skalpelom ali britvico odrežite cm dolge segmente poganjkov graha in jih prenesite v raztopine v petrijevkah. V vsako petrijevko dodajte tri takšne segmente. Pri tem odrežite del, ki je približno 3 mm pod zavitim delom poganjka. Zalo pomembno je, da so vsi segmenti iz enakega dela poganjka, saj se občutljivost na avksine spreminja s pomikanjem po poganjku. Vse rezen napravite na mokri papirnati brisači in poganjek hitro prenesite v ustrezno raztopino. Poganjke položite v tekočino s pinceto. Po 48 urah odstranite poganjke iz raztopine. Izmerite dolžino posameznih poganjkov iz vsakega izmed tretmajev. Poganjke odstranjujte iz raztopin enega za drugim, da med meritvami ne pride do sušenja. Za vsak tretma izračunajte povprečno dolžino poganjkov po 48 h namakanja v raztopini avksinov in izračunajte standardno napako. Rezultate vrišite v graf (SV +SN), pri čemer naj bo y-os v linearnem, x-os pa v logaritemskem merilu.

Tabela 20. Dolžine segmentov po 48 h inkubaciji v raztopini indolocetne kisline. Tretma

Dolžina segmenta (mm) 1.

Kontrola 0,01 μM IAA 0,1 μM IAA 1 μM IAA 10 μM IAA 100 μM IAA

64

2.

3.

Povprečna dolžina (mm)

Standarna napaka (mm)


Praktikum fiziologije rastlin

Graf 9. Dolžine segmentov po 48 h inkubaciji v raztopini indolocetne kisline.

Vprašanja in naloge 1. Kako bi preveril, če so učinki indolocetne kisline posledica avksinske aktivnosti te snovi in ne kakšne druge lastnosti testirane spojine?

2. Zakaj smo v pufer dodali saharozo?

3. Avksini so organske kisline. Koliko testiranega avksina bi lahko dodali v inkubacijski medij, ne da bi opazili večjo spremembo pH?

65


Praktikum fiziologije rastlin

Vpliv avksinov in citokininov na regeneracijo korenin paradižnika Rastlinski rastni regulatorji so poleg genetske zasnove glavni morfogenetski faktorji rasti in razvoja rastlin v tkivnih kulturah. Z uravnavanjem razmerij med različnimi rastnimi regulatorji uravnavamo tudi rast kultur in njihovo diferenciacijo. Tako lahko s spreminjanem njihovih koncentracij in razmerij vodimo razvoj rastlin v različne smeri: • kalusiranje: gojišče mora vsebovati avksine in citokinine (kalus je tkivo hitrorastočih večinoma dediferenciranih celic); • indukcijo brstov: gojišče mora vsebovati citokinine, lahko pa je tudi brez hormonov; • indukcijo korenin: gojišče mora vsebovati avksini, lahko pa je tudi brez hormonov, dodatek citokininov zavira rast korenin • indukcijo embriogeneze: v prvi subkulturi mora gojišče vsebovati avksine, v drugi pa uporabimo gojišče brez hormonov Rast kalusa induciramo z dodatkom avksinov in citokininov v ustreznem razmerju. Visok nivo avksinov glede na citokinine zagotavlja rast kalusnih celic. Tvorbo poganjkov oziroma korenin imenujemo organogeneza. • Če se zniža nivo citokininov, se v kulturah tvorijo korenine, če se zniža nivo avksinov, se tvorijo brsti. Brsti so lahko aksilarni ali adventivini. • S primernim hormonalnim razmerjem med avksini in citokinini pa lahko induciramo tudi tvorbo somatskih embriev, to je tvorbo embriev iz somatskih celic. Pojav imenujemo somatska embriogeneza. Približno 75 % rastlin tvori poganjke ob dodatku kinetina ali BA v koncentraciji 0,05–46 μM, avksini kot IAA in NAA pa se uporabljajo v koncentracijah 0,06–27 μM. Številne trave potrebujejo manj citokininov kot ostale rastlinske vrste. Vendar obstajajo tudi izjeme. Za indukcijo tvorbe brstov pri iglavcih je dovolj le dodatek citokinina. Vendar je bistveno ravnovesje med endogenimi vsebnostmi avksinov in citokininov.

▌Vaja: ▌ Tkivna kultura paradižnika Material Seme paradižnika (Lycopersicon esculentum), 24 x 160epruvete, erlenmajerice, 2ml pipete, 10ml menzure, stojala za epruvete, aluminijasto folija, nalepke, pinceta, skalpel, Na-hipoklorit (3 % aktivnega klora), Murashige-Skoogovo gojišče, osnovne raztopine zeatina, BAP in NAA

66


Praktikum fiziologije rastlin

Izvedba 1. teden Paradižnikova semena steriliziramo v raztopini Na-hipoklorit : voda = 3 : 10 (v/v) dve uri, nato jih speremo s sterilno bidestilirano vodo in jih sterilno kalimo na Knoppovem gojišču. Po treh tednih sterilno ločimo listke, kotiledone in vršičke ter jih gojimo na hranilni podlagi za deferenciacijo paradižnika (MS gojišče), ki mu dodajamo različne kombinacije hormonov: Segrejemo 300 ml MS-gojišča in mu pred vretjem dodamo 2 g agarja in 5 g agaroze. Mešamo in počakamo, da se agar raztopi. Nato jih razdelimo na 3 dele: • 100 ml dodamo 1,1 ml osnovne raztopine zeatina in 2 ml osnovne raztopine BAP; • 100 ml dodamo 1,1 ml osnovne raztopine NAA; • 100 ml pustimo brez hormonov. Gojišča shladimo na 50 °C in pH uravnamo na 5,7 z 0,1M HCl ali NaOH. Po 10 ml gojišča nalijemo v epruveto, jih pokrijemo s pokrovčki ali aluminjasto folijo in avtoklaviramo 15 minut.

2. teden Za poskus smo semena paradižnika površinsko sterilizirali in vzkalili na MS gojišču. Rastline previdno povlečemo iz epruvet in jih položimo na sterilen papir. S skalpelom odrežemo korenine in poganjek razdelimo na več segmentov. Posamezen segment poganjka nato prenesemo na pripravljena gojišča. Čez tri tedne opazujemo vpliv kombinacij rastnih regulatorjev na organogenezo paradižnika.

67


Praktikum fiziologije rastlin

68


Praktikum fiziologije rastlin

69


Praktikum fiziologije rastlin

70


Praktikum fiziologije rastlin

71


Praktikum fiziologije rastlin

72


Praktikum fiziologije rastlin

73


Praktikum fiziologije rastlin

74


Praktikum fiziologije rastlin

75


Praktikum fiziologije rastlin

76


Praktikum fiziologije rastlin

77


Praktikum fiziologije rastlin

Statistična obdelava podatkov Poleg kopice komercialnih ali odprtno kodnih programov, ki omogočajo statistično obdelavo podatkov, sta uporabnikom MS Office na voljo tudi dva paketa orodij, ki si jih brezplačno namestijo v MS Excel. Tukaj so zbrana kratka navodila za izvedbo statističnih analiz s temi orodji, čeprav enake predpostavke in tolmačenje rezultatov veljajo tudi za druge statistične programe.

t-test Za izvedbo t-testa zaženite Excelov paket orodij za analizo podatkov (Data analysis), ki ga najdete pod menujem Data. Podatki naj bodo organizirani v dveh stolpcih, ki predstavljata različna tretmaja. V meniju izberite ustrezen t-test.

1

V naslednjem koraku izberete ustrezne stolpce (1) in mesto izvoza rezultatov (2) (najbolje nov delovni list) ter pritisnite OK.

2

Enosmerna analize variance (ANOVA) Če želite ugotoviti, ali obstajajo pomembne razlike med tremi ali več skupinami podatkov, lahko izvedete analizo variance (ANOVA).

Vnos podatkov Za razliko od mnogih statističnih paketov, XL Toolbox podpira vnos podatkov v različnih postavitvah. 78


Praktikum fiziologije rastlin Skupina podatkov je lahko organizirana v stolpcih (gl. spodaj levo) ali v vrstici (gl. spodaj desno).

Predpostavka o homogenosti variance Z dodatkom XL Toolbox lahko preverite, ali podatki ustrezajo osnovni predpostavki homogenosti variance (homoscedasticity). Dodatek uporablja spremenjeno različico Levenovega test, ki je opisana v knjigi “Primer of Applied Regression & Analysis of Variance”. V kolikor so variance skupin podatkov statistično značilno različne (p <0,05), je potrebno rezultate analize variance razlagati z izjemno previdnostjo.

Multiple primerjave / “Post-hoc” testiranje Rezultat analize variance nam pove, ali obstajajo med skupinami statistično pomembne razlike, ali ne. Šele post hoc testi pa nam povedo, med katerimi skupinami obstajajo statistično značilne razlike.

V dodatku XL toolbox so na voljo naslednji post hoc testi: • Bonferroni-Holm: Na splošno najbolj konzervativen med ponujenimi testi. S tem testom se lahko zgodi, da ne med skupinami podatkov ne bomo našli statistično značilnih razlik (kljub statistično temu, da je analiza variance pokazala statistično značilno razliko med njimi). • Holm-Šidak: Načeloma isti algoritem kot Bonferroni-Holm, vendar nekoliko manj konzervativen. Če ni dogovorjeno drugače izberite ta post hoc test. •

Tukey: najmanj konzervativen od vseh treh.

79


Praktikum fiziologije rastlin

Poročila Rezultati testov, ki jih XL Toolbox pokaže v oknu so kratki in brez določenih podrobnosti. Za celotno poročilo, kliknite na “Produce Report”. V datoteko bo vstavljen nov zavihek s popolnim poročilom analiz.

Omejitev Pomembno je vedeti, da XL Toolbox ANOVA trenutno ne opravlja testa za eno izmed predpostavk analize variance tj. normalnost podatkov. Če želite izvedeti, ali so podatki normalno porazdeljeni, je potrebno uporabiti iz specializirane programske pakete, kot so R ali SPSS ®.

Korelacije in linearna regresija Linearna regresija Linearna regresija je odnos med dvema spremenljivkama, pri katerem je ena spremenljivka (odvisna) logično odvisna od druge (neodvisna spremenljivka). Nasprotno pri korelacijah te odvisnosti nimamo, temveč gre za sočasno spreminjanje dveh neodvisnih spremenljivk. Za izvedbo analize linearne regresije podatke organizirajte v dva stolpca. Prvi naj vsebuje podatke neodvisne, drugi pa podatke odvisne spremenljivke. V Excelovem dodatku XL Toolbox izberite “Linear Regression” in odprlo se vam bo spodnje okno:

Izberite vaše podatke (odvisna spremenljivka je Y, neodvisna pa X) in kliknite na “Compute”. Oprlo se vam bo novo okno, ki bo že vsebovalo vse podatke analize. Kliknite “Create Report” in pojavila se vam nova stran z rezultati analize. Na tej strani lahko razberete vrednosti R in p. V kolikor je test statistično značilen, bo vrednost p označena tudi z zvezdicami. V vsakem primeru pa vam test doda tudi tekstovni povzetek rezultatov. 80


Praktikum fiziologije rastlin Za izris linearne regresije, s podatku ustvarite XY graf (Scatter graph). Nato z denim gumbom na miški kliknite na točke in izberite “Add trendline”. Preverite, da je izbrana linearna krivulja, nato pa odkljukajte “Display Equation on chart” in “Display R-squared value on chart”. Na vaš graf je Excel dodal premico in njeno enačbo ter vrednost R2 (% razložene variance). 30 y = 1,3149x + 2,1383 R² = 0,9449 25

20

Series1 15

Linear (Series1) Linear (Series1)

10

5

0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

81


Praktikum fiziologije rastlin

82


Praktikum fiziologije rastlin

83


Praktikum fiziologije rastlin

84


Praktikum fiziologije rastlin

85


Praktikum fiziologije rastlin

86


Praktikum fiziologije rastlin

87


Praktikum fiziologije rastlin

88


Praktikum fiziologije rastlin

89


Praktikum fiziologije rastlin

Navodila avtorjem Znanstveni članek Znanstveni članek je celovit opis originalne raziskave in vključuje teoretični pregled tematike, predstavitev rezultatov z diskusijo in sklepe ter literaturni pregled po poglavjih (Izvleček, Uvod, Materiali in metode, Rezultati, Diskusija, Zaključki). Namen: seznanitev s strokovnimi, tehničnimi in oblikovnimi zahtevami pri pisanju znanstvenih člankov.

Oblikovanje strani in oblika članka Strani naj bodo A5 in pokončno z robom 1,5 cm (levo in desno), 2,5 (zgoraj) in 2,0 (spodaj). Razmak med vrsticami je natančno (exactly) 13 pt, razen kjer je določeno drugače. Teksti naj bodo pisani v slovenskem jeziku, v Times New Roman pisavi, velikost črk 9 pt. Naslovi poglavij so pisani debelo in imajo 9 pt presledka pred vrstico. Dolžina članka vključno s tabelami, grafi in slikami, ne sme presegati 4 strani

Naslov prispevka Naslov mora biti kratek, informativen in razumljiv. Velikost črk je 12 pt. Za naslovom sledijo imena avtorjev, njihovi naslovi (npr. Biotehniška fakulteta, Študij biologije/biotehnologije, Večna pot 111, SI1000 Ljubljana), velikost črk naj bo 9 pt, poravnava središčna. Namen: kratko in jasno povabilo k branju članka

Izvleček Podati mora jedrnato informacijo o • namenu, • uporabljenih metodah, • dobljenih rezultatih in • zaključkih In je pisan po omenjenih točkah. Primerna dolžina je do 100 besed, velikost črk je 9 pt, razmik vrstic enojen. Namen: kratka predstavitev raziskave naključnemu iskalcu informacij.

90


Praktikum fiziologije rastlin

Ključne besede Število naj ne presega 5 besed, predstaviti morajo področje(a) raziskave predstavljene v članku, ločene so z vejico. Namen: članek naj bi v poizvedbah opazilo kar največ raziskovalcev iz obravnavanega(ih) področja(ij).

Uvod Nanašati se mora le na tematiko, ki je predstavljena v članku. Iz uvoda naj bodo razvidne hipoteze in postavljeni cilji s katerimi te hipoteze testiramo ter pregled literature. Vsako od podanih področij naj bo predstavljeno v 2-3 stavkih, organiziranih v smiselne odstavke. Namen: predstavitev informacij pomembnih za razumevanje problema in njegove rešitve s področja oz. področij na katero posega raziskava.

Materiali in metode V njih navedemo najnujnejše podatke potrebne za ponovitev poskusa. Sem sodijo izvor rastlinskega materiala, viri po katerih so povzeti eksperimenti, pogoji vzgoje rastlinskega materiala (npr. v rastni komori, 16/8 h dnevno/nočna ritmika, 20°C), itn... Namen: kratek in jedrnat opis najpomembnejših informacij, ki definirajo izid poskusa

Rezultati Predstavljeni naj bodo najpomembnejši podatki za podporo trditev v članku. Pri citiranju tabele in slike v besedilu pišemo poudarjeno (Tab. 1 ali Sl.1). Namen: organizacija rezultatov v preproste in jasne sklope

Oblikovanje tabel Tabele naj vsebujejo samo horizontalne linije, informacije v njih naj bodo organizirane v stolpiče. Pri podajanju rezultatov (SV-srednja vrednost) podamo tudi mere variabilnosti (SN-standardna napaka). Naslove tabel pišemo nad njimi, naslove slik pa pod njimi, velikost črk naj bo 8 pt, presledek enojen.

91


Praktikum fiziologije rastlin

Oblikovanje grafov Grafi naj bodo oblikovani z orodjem za grafe v Excelovem dodatku XL Toolbox. Pri tem uporabite naslednje nastavitve: 10

Linijski grafi: • debelina linije: 1,5 pt,

9

8

7

• font: Arial, 10 pt, • velikost simbolov: 8 pt in • linije naj bodo črne barve.

6

5

4

3

2

1

0 0

10

20

30

40

50

12

a

Stolpični grafi: 10

• debelina linije: 1,5 pt, 8

• font: Arial, 10 pt, • prekrivanje: 0, • razmik: 50,

6

b

4

c

• stolpiči naj bodo svetlo sive, okvirji pa črne barve.

2

0 A

B

C

Diskusija Je podpora rezultatov z literaturnimi podatki iz obravnavanega področja. Diskutiramo rezultate, ki raziskavo podpirajo ali so v nasprotju z njimi. Namen: kritično ovrednotenje rezultatov

Zaključki Članek zaključimo z zaključki, ki jih podamo po točkah. Iz njih je razvidna: • potrditev ali • zavrnitev postavljenih hipotez. Uporabite enojen presledek. Namen: oblikovanje jasnih sklepov o pravilnosti oziroma napačnosti postavljenih hipotez. 92

60


Praktikum fiziologije rastlin

Literatura Kadar sta avtorja dva literaturo v tekstu citiramo kot (Smith in Read 1997), če so avtorji trije ali več pa (Joner s sod. 1997). Pri oblikovanju literature na koncu članka bodite pozorni na odsotnost pik za imeni avtorjev, postavite letnice objave, itd. Periodično literaturo citiramo: Joner EJ, Briones R, Leyval C, 2000. Metal-binding capacity of arbuscular mycorrhizal mycelium. Plant and Soil 226: 227-234

Knjige in poglavja citiramo: Smith SE, Read DJ, 1997. Mycorrhizal symbiosis. 2nd edition, Academic Press, San Diego, UK. Olsen SR, Sommers LE, 1982. Phosphorus. V: Page s sod (ur.). Methods of Soil Analysis, Part 2. Chemical and Microbiological Properties, American Society of Agronomy, Madison, WI.

Elektronske vire citiramo: Hesketh JE, Vasconcelos MH, Bermano G, 1998. Regulatory signals in messenger RNA: determinants of nutrient “gene interaction and metabolic compartmentation. http:// nutrition.cabweb.org/BJN/journals/FULLTEXT/OCT98/Bjn80307 (12. nov. 1998)

Velikost črk naj bo 7, formatiranje viseče (hanging 0,3), z enojnim presledkom.

93

Navodila za vaje  

Navodila za vaje pri predmetu Fiziologija rastlin za študente biologije.

Read more
Read more
Similar to
Popular now
Just for you