Issuu on Google+

Navodila za vaje

Interakcije rastlin z drugimi organizmi Matev탑 Likar


Navodila Interakcije rastlin

Kazalo Neživi dejavniki 4 Vpliv temperature Suša

Gojišča 4

Polovično LA (Long Ashton) gojišče - 10x koncentracija 27

4

Visoka vlažnost substrata

Melin-Norkrans-Marx gojišče 27

4

Svetloba

4

PDA gojišče

Onesnaženje

5

Spirit Blue gojišče

Spremenjeno ionsko okolje

5

Vaja : Preobremenjenost tal s solmi 5

Rastline in patogeni 8 Obramba rastlin pred patogeni

8

Strukturna obramba 8 Kemična obramba

8

Inducirana obramba rastlin

8

Vaja : Vpliv čreslovin na rast gliv

Kochovi postulati

8

11

Vaja : Dokazljivost patogenosti – Kochovi postulati 11

Rastline in škodljivci 13 Ekologija in razširjenost Nadzor glist v naravi

13

13

Vaja: Izolacija nematodov iz zemlje 13

Simbioze rastlin in gliv

16

Mikoriza 16 Temni septirani endofiti (DSE) 17 Vaja: Vpliv arbuskularne mikorize in fosforja na rast koruze 17 Vaja: Barvanje arbuskularno mikoriznih gliv 21 Vaja: Določanje vsebnosti asimilacijskih barvil 24 Vaja: Encimska karakterizacija glivnih izolatov 25 2

27

27 28

Gojišče za dokazovanje amilazne aktivnosti 28 Gojišče za dokazovanje polifenol oksidazne aktivnosti 28


Navodila Interakcije raslin

Neživi dejavniki Rastline uspevajo v okolju, ki se sestavljeno iz več dejavnikov. Takšni faktorji so temperatura, vlaga, hranilne snovi, svetloba, polutanti, sestava prsti in pH. Čeprav ti faktorji vplivajo na vse rastline v naravi, imajo večji pomen pri kultiviranih rastlinah. Rastline najbolje uspevajo znotraj določenega območja (optimuma) vsakega dejavnika okolja. V primeru neoptimalnih pogojev pa se lahko (ob odsotnosti patogenov) pojavijo nenalezljive rastlinske bolezni, ki so posledica pomanjkanja ali presežke enega izmed teh dejavnikov. Nenalezljive rastlinske bolezni se lahko pojavijo v vseh obdobjih razvojnega kroga rastlin (npr. seme, odrasla rastlina ali plod) in lahko povzročijo poškodbe na polju, skladišču ali v trgovini. Simptomi se razlikujejo med vrstami in so odvisni tudi od faktorja okolja, ki jih povzroča. Pogosto pa so lahko nejasni in zelo podobni tistim, ki jih povzročajo različni patogeni.

Vpliv temperature Rastline normalno rastejo v temperaturnem razponu od 1 do 40°C, največ vrst pa najbolje uspeva med 15 in 30°C. Minimalna in maksimalna temperatura, pri kateri lahko rastline normalno rastejo, je največkrat odvisna od rastlinske vrste in faze rasti v kateri je rastlina. Trajnice in mirujoči organi (npr. semena) lahko preživijo tudi temperature, ki se gibljejo nad in pod normalnim temperaturnim razponom, mlada rastoča tkiva večine rastlin pa so pogosto bolj občutljiva. Visoke temperature povzročajo posledice na rastlinah v kombinaciji z drugimi faktorji okolja (prekomerna svetloba, suša, pomanjkanje kisika). Visoke temperature inaktivirajo določene encimske sisteme in pospešijo druge, kar vodi v nenormalne biokemijske reakcije in celično smrt. Povzročijo tudi koagulacijo in denaturacijo proteinov, raztrganje membran in sprostitev toksičnih produktov v celico. Nizke temperature povzročajo v primerjavi z visokimi več škode. Poškodba je odvisna od padca in obdobja trajanja nizke temperature. Nizke temperature poškodujejo rastline, s tem da povzročajo tvorbo ledu med celicami ali v njej. Čista voda v intercelularnem prostoru zmrzne navadno pri 0°C, medtem ko voda v celici vsebuje substance, ki znižajo zmrzovališče vode

za nekaj stopinj. Ko se intercelularna voda spremeni v led, se več vode iz celice premakne v intercelularni prostor, kjer zmrzne. Točka zmrzovanja vode v celici je odvisna od tkiva in vrste rastline. Pomembna je tudi hitrost temperaturnega padca v tkivu.

Suša Suša zmanjšujejo rast, povzročajo bolezni ali celo smrt rastline. Pomanjkanje vlage je določeno s tipom prsti, naklonom tal in sestavo substrata. Rastline, ki trpijo zaradi pomanjkanja vlage so klorotične in odmetavajo liste, cvetove ter plodove. V primeru, da se suša nadaljuje pride do venenja in propada rastline. Bolj dovzetne kot trajnice so enoletnice. Na rastlino pa lahko vpliva tudi nizka relativna vlažnost. Navadno je začasna in redkokdaj povzroča poškodbe. V kombinaciji z močnim vetrom in visoko temperaturo lahko povzroči ranitev listov, grbančenje plodov ter stalno ali začasno venenje rastlin. Pogosta je pri sobnih rastlinah med zimo, ko pade relativna vlaga na 15 do 25%, kolikor znaša v puščavi.

Visoka vlažnost substrata Prekomerna vlažnost substrata se pojavi redkeje kot suša, vendar hitreje povzroči resnejše poškodbe. Poplave med rastno sezono lahko pri zelnatih rastlinah povzročijo venenje in smrt v dveh do treh dneh. Pri drevesih se poškodbe pojavijo šele po nekaj tednih. Korenine propadejo zaradi pomanjkanja kisika. V mokrih anaerobnih pogojih dobro uspevajo mikroorganizmi, ki izločajo za rastline toksične snovi. Koreninske celice poškodovane zaradi pomanjkanja kisika izgubijo selektivno permeabilnost in črpajo v korenine tudi toksične kovine in druge škodljive snovi.

Svetloba Pomanjkanje svetlobe povzroči visoko rast z dolgimi internodiji, bledo zelene liste, zvijanje in prehitro odpadanje listov in cvetov. To stanje imenujemo etiolacija. Opazimo jo pri rastlinah, ki rastejo pretesno skupaj ali kadar rastejo pod drevesom. Prekomerna svetloba je v naravi redka in je navadno 3


Navodila Interakcije raslin

Biomasa  rastline  

Esencialni   element  

Pomanjkanje  

Prekomerne   koncentracije  

Op,mum   Naraščajoče  koncentracije  elementa  

Slika 1. Rast rastline glede naNeesencialni   koncentracijo elementa v tleh. Biomasa  rastline  

element  

povezana z visokimi temperaturami. Povzroči majhne, očitne in značilne simptome (npr. nekroze). Rastline izsušene madeže na stroku fižola, ki hitro porjavijo in tudi oslabijo in so bolj dovzetne za napade žuželk, skrčijo. Količina svetlobe je pomembnejša pri sobnih patogenov in delovanje drugih faktorjev okolja. rastlinah. Prekomerna svetloba na rastlinah, ki bolje Posebna oblike onesnaženja s plinastimi polutanti je uspevajo v senci povzroči rumeno-rjave ali srebrne kisel dež. Padavine (dež, sneg ali megla) so kot kisel dež Nestrupene   Strupene   madeže na listih. označene takrat, ko pade pH padavin pod 5,6.

koncentracije  

Onesnaženje

koncentracije  

Spremenjeno ionsko okolje

Naraščajoče  koncentracije  elementa  

V svetu se je močno povečala se je uporaba herbicidov, ki uničujejo plevele. Posledice onesnaženja tal s herbicidi pri rastlinah so deformacija ali rumenenja listov, rjavenje, sušenje, izguba listja ali celo propad rastline. Večina herbicidov se inaktivira po nekaj dneh do nekaj mesecev po uporabi, nekateri ostanejo aktivni celo več let. Poleg herbicidov so pogosti onesnaževalci tudi plini, kot so ozon, žveplov dioksid in dušikovi oksidi. Visoka koncentracija in dolgo izpostavljanje povzročajo

Rastline potrebujejo za normalno rast minerale. Tako makro kot mikroelementi so nujno potrebni, sicer lahko pride do poškodb. Simptomi, ki jih razvije pomanjkanje določenega hranila so močno odvisni od funkcije, ki jo ima element v rastlini. Če je količina esencielnih elementov pod normalno vrednostjo se to kaže v zmanjšani rasti in pridelku. Prekomerne koncentracije določenih hranil pa lahko povzročijo akutne in kronične simptome in smrt rastlin.

▌Vaja ▌ : Preobremenjenost tal s solmi Do naravno povišanih koncentracij soli v tleh prihaja na obrobju morij in slanih jezer. Povišane koncentracije soli so prisotne tudi na rastiščih, ki ležijo na sedimentih nekdanjih morij. Povišana slanost pa je lahko tudi posledica človekovega delovanja kot npr. namakanje pridelovalnih površin. Soli iz namakalne vode se ob odparevanju vode koncentrirajo v tleh in hitro dosežejo toksične koncentracije. Ocenjeno je, da je prizadetih že tretjina namakalnih površin na svetu.

4

Material kuhinjska sol, polietilen glikol (PEG 8000), kalice fižola (Phaseolus vulgaris), sončnice (Helianthus annuus), graha (Pisum sativum) in koruze (Zea mays), lonci, vermikulit, tehtnica

Izvedba Najprej pripravimo raztopine soli in polietilen glikola (PEG), s katerimi bomo dosegli ustrezen vodni potencial v substratu (Tabela 2).


Navodila Interakcije raslin Tabela 2. Priprava raztopin. ψv (bar)

Vprašanja g/l

NaCl

PEG

–1

1

110

–2,5

3

160

–5

6

240

–8

10

350

Semena poskusnih rastlin pred vajo posejemo v vermikulit, zalijemo z vodo in jih pustimo kaliti. Za vajo uporabimo kalice, ki imajo razvita 1-2 prava lista. Vsaki drugi dan dobro zalijemo z raztopino soli. Enkrat tedensko preverimo ali so se na rastlinah razvile morfološke spremembe (nekroze, spremembe barve, velikost rastlin,…) rastlin pri različnih tretmajih in jih zapišemo. Po 4 tednih rastline zmerimo in stehtamo in rezultate.

1.

Razloži termina »glikofit« in »halofit«.

2. Kateri so omejujoči dejavniki za rast in razvoj rastlin na slanih tleh?

3. Kako se razlikujeta PEG in NaCl v delovanju na rastlino?

Rezultati Vpišite vse makroskopske spremembe, ki ste jih opazili na listih rastlin v spodnjo tabelo 3.

Tabela 3. Makroskopski znaki/spremembe na kalicah. NaCl

PEG

K (0 barov)

–1 bar

– 2,5 bara

– 5 barov

– 8 barov

5


Navodila Interakcije raslin

Graf 2. Masa poganjka v odvisnosti od vodnega potenciala tal.

Graf 3. Razmerje sve탑e mase poganjka in korenine v odvisnosti od vodnega potenciala tal.

6


Navodila Interakcije raslin

Rastline in patogeni Obramba rastlin pred patogeni Rastline so pogosto v stiku s potencialno patogenimi glivami, bakterijami in virusi, vendar je rastlina le redko kolonizirana. Pri tem igrata pomembno vlogo konstitutivna in inducirana obramba.

Strukturna obramba Najpomembnejša strukturna obramba je površina rastline, ki je skoraj vedno pokrita s kutikulo in pogosto še z voskom. Debela kutikula preprečuje infekcijo s patogeni, ki vstopajo v rastlino z direktno penetracijo. Poleg tega pa predstavlja tudi vodoodporno plast, ki preprečuje zastajanje vode ob površini, v kateri se zadržujejo in razmnožujejo patogeni. Pri preprečevanju zastajanja vode na površini rastlin sodelujejo tudi trihomi. Možnost za penetracijo onemogočajo oz. zmanjšajo tudi debele in trdne stene epidermalnih celic. Pomembeno mesto vdora za patogene pa so tudi listne reže.

Kemična obramba Nekatere rastline so kljub temu, da nimajo nobene strukturne obrambe, odporne na določene patogene. Če pride do infekcije, se razmnoževanje patogena hitro omeji in kmalu popolnoma ustavi. Obstaja torej kemični obrambni mehanizem, pri katerem se rastlina brani s snovmi, ki jih sama proizvaja. Rastline sintetizirajo številne spojine z antimikrobnim delovanjem (fitoanticipini) kot so npr.: alkaloidi, flavonoidi, lignin, saponini, lektini, itd. Rastline lahko takšne snovi kopičijo ali pa izločajo v okolico. Npr. razne fungitoksične izločke listov paradižnika in sladkorne pese, ki prehajajo v roso in dežne kapljice in s tem onemogočijo kalitev spor nekaterih gliv.

Nekateri inhibitorji pa so prisotni tudi v rastlinah samih. Razdelimo jih lahko na tri skupine: terpene, fenole in snovi, ki vsebujejo dušik. Terpeni so sestavljeni iz izoprenoidnih enot. So toksični in odvračajo številen herbivore. Fenoli se sintetizirajo predvsem po šikimatni poti in opravljajo v rastlini več pomembnih nalog, med katere pa spada tudi obramba pred herbivori in patogeni. V tretjo skupino snovi pa spadajo sekundarni metaboliti, ki vsebujejo dušik. Sintetizirajo se predvsem iz aminokislin. Alkaloidi, cianogeni glikozidi, glukozinolati, neproteinske aminokisline in proteinazni inhibitorji ščitijo rastlino pred številnimi herbivori. Rastlina pa se lahko brani tudi tako, da ne tvori specifičnih prepoznavnih mest za patogena na površini ali pa ne izdeluje ene od snovi (rastni faktor), ki so nujno potrebne za preživetje obligatnih parazitov ali za razvoj patogena.

Inducirana obramba rastlin Po vzpostavitvi fizičnega kontakta med rastlino in patogenom se v rastlini aktivirajo obrambne reakcije. Patogeni sproščajo v okolico različne substance, ki delujejo kot elicitorji. Poleg molekul, ki se sproščajo iz površine patogena pa lahko kot elicitorji delujejo tudi razgradni produkti gostitelju lastnih molekul. Receptorji za elicitorje se najpogosteje nahajajo na membrani, čeprav poznamo tudi intracelularne receptorje. Med inducirano obrambo rastlin spadajo: preobčutljivostna reakcije (HR), tvorba aktivnih kisikovih spojin (AOS), lokalana in sistemska pridobljena odpornost (LAR in SAR) ter sinteza s patogenezo povezanih proteinov (PR proteinov).

▌Vaja ▌ : Vpliv čreslovin na rast gliv Fenolne snovi spadajo med obrambne antimikrobne spojine, ki se kontinuirano nalagajo v les in skorjo dreves ali pa se sintetizirajo šele ob napadu patogenov. Sposobnost glive, da raste ob prisotnost antimikrobnih snovi vpliva na njeno sposobnost, da uspešno

kolonizira potencialnega gostitelja.

Namen Prikazati razlike v agresivnosti rasti patogena in simbionta. 7


Navodila Interakcije raslin povprečno vrednost kontrole.

Material kulture micelija saprofitskih ___________________, mikoriznih ___________________ in patogenih ___________________ gliv, skorja kostanja, lij, filtrirni papir, sterilne plastične petrijevke, 10 in 25ml menzure, 1000ml čaša, steklena palčka, pipete, aluminijeva folija, avtoklav, laminarij, MelinNorkrans-Marksovo gojišče

Izvedba Pripravimo vodni ekstrakt iz drevesne skorje: 20 g skorje kuhamo 10 minut v najmanj 80 ml destilirane vode, prefiltriramo in koncentriramo do 20 ml.

Vprašanja 1. Katera gliva je bila najuspešnejša pri preraščanju substrata s čreslovinami? Kako bi to razložil?

2.

Kakšen pomen ima to za patogenezo?

Zatehtamo kemikalije za 4 x 250 ml gojišča. V destilirani vodi raztopimo minerale drugega za drugim, raztopino segrejemo do vretja in ji dodamo glukozo, slad in agar. Mešamo, dokler se tekočina ne zbistri. Nato dodamo še raztopino tiamina. Pred nalivanjem v petrijevke z 1M NaOH popravimo pH gojišča na 5,7. Gojišče nato avtoklaviramo. Po avtoklaviranju počakamo, da se nekoliko shladi, nato pa ga razlijemo v sterilne petrijevke. Pripravimo 40 petrijek, ki vsebuje ekstrakt drevesne skorje v treh različnih koncentracijah: • 10 petrijevk po 0,1 ml ekstrakta; • 10 petrijevk po 0,5 ml ekstrakta; • 10 petrijevk po 2,0 ml ekstrakta; • 10 petrijevk brez ekstrakta (kontrola). Naslednji dan na podlago nacepimo enako velike koščke micelija in petrijevke zapremo še s slojem folije za živila ali parafilmom. Po mesecu dni rasti kulture odluščimo z agarja, jih stehtamo in maso izrazimo v odstotkih glede na

Tabela 1. Mase micelijev gliv pri različnih koncentracijah čreslovin v gojišču. Količina ekstrakta (ml) 0 0,1 0,5 2,0 8

Mase micelija (g)

Povprečna masa (g)

% od kontrole


Navodila Interakcije raslin

Graf 1. Rast glive pri različnih koncentracijah čreslovin v gojišču, v primerjavi s kontrolo.

9


Navodila Interakcije raslin

Kochovi postulati Kochove postulate je postavil Robert Koch l. 1884 in definirajo pogoje, ki morajo biti izpolnjeni za potrditev patogenosti organizma. Sestavljeni so iz štirih točk: 1. Organizem najdemo le v »bolnih« predstavnikih, 2. Organizem lahko izoliramo in gojimo v čisti kulturi, 3. Organizem mora povzročiti bolezen ob okužbi

zdravega organizma in 4. Organizem, ki ga ponovno izoliramo iz inokuliranega organizma je enak tistemu, ki smo ga uporabili za inokulacijo Kasneje je bila zaradi odkritja prenašalcev bolezni, ki ne kažejo znakov bolezni (asimptomatski prenašalci), izpuščena prva točka postulatov.

▌Vaja ▌ : Dokazljivost patogenosti – Kochovi postulati Namen

Opažanja na izvornem okuženem materialu:

Na primeru gliv in njihovih gostiteljev uporabiti Kochove postulate za dokaz patogenosti.

Material okužen rastlinski material, svež rastlinski material, PDA gojišče (Potato Dextrose Agar, Difco), petrijevke (φ90), rastne komore, skalpeli, pincete, gorilnik, lupe, mikroskop, 10% varekina, sterilna voda, 95% etanol

Opazovanje okuženega material Makroskopski simptomi in znaki Naredi skico. Vključi informacije o barvi, obliki in velikosti okuženega dela. Opiši tudi spremembe v konsistenci tkiva (vodnato, kašasto, otrdelo, itd.). Lupa Preišči okuženo tkivo za znaki patogena (micelij, sporofori, spore, sporokarpi). Skiciraj tudi te strukture. Mikroskop S skalpelom odreži tanke rezine tkiva in jih postavi na objektno steklo. Poišči različne strukture patogena, ki si jih morda spregledal pod lupo.

10

Opažanja na izoliranemu materialu:


Navodila Interakcije raslin Opa탑anja na reinokuliranemu rastlinskemu materialu:

Opa탑anja na reizoliranemu materialu:

11


Navodila interakcije rastlin

Rastline in škodljivci Večina od nekaj tisoč vrst glist živi prosto v sladkih ali slanih vodah ali v zemlji, kjer se hranijo z mikroorganizmi ali mikroskopskimi rastlinami in živalmi. Drugi napadejo človeka in živali, na njih parazitirajo in povzročajo različne bolezni. Nekaj sto vrst pa se hrani na živih rastlinah, kjer črpajo hrano s stileti in tako povzročajo številne rastlinske bolezni. Mehanske poškodbe, nastale, ko se gliste hranijo, povzročajo le majhno škodo. Glavno škodo povzroči slina, ki jo gliste med hranjenjem izločajo in vbrizgajo v rastlino. Preko poškodb pa gliste omogočijo vstop tudi drugim patogenom. Proces hranjenja v rastlini povzroči reakcijo, ki se kaže v smrti ali slabljenju koreninski vršičkov in brstov, v zatekanju rastlinskih organov, v zvitih listih in steblih, itd. Večino teh sprememb je posledica razkroja tkiva okuženega z encimi glist, ki z ali brez pomoči toksičnih metabolitov povzročajo razpad tkiva in smrt celice. Druge spremembe pa povzroči nenormalno povečanje celic (hipertrofija), ki jo spremlja supresija celičnih delitev. Posledice so: povečano število lateralnih korenin ob mestu okužbe ali pa nastanek šiške, zaradi česar pride do zmanjšane zmožnosti črpanja vode in hranil iz zemlje. Letna svetovna izguba, ki jo povzročajo gliste na življenjsko pomembnih kulturah, kot so žitarice, stročnice, banane, kokos, krompir, sladkorna pesa, sladkorni trs in sladki krompir, je ocenjena na 11%, izguba ostalih ekonomsko pomembnih kultur (zelenjave, sadja...) pa je 14%, kar znaša $80 milijard letno.

Ekologija in razširjenost Večina rastlinskih parazitskih glist preživi del svojega življenja v zemlji. Nekateri živijo prosto in se hranijo na koreninah in podzemnih steblih. Jajca, preparazitski juvenilni stadiji in samci specializiranih vrst prav

tako del življenja preživijo v zemlji, nekateri pa so tam prisotni celo življenje. Temperatura zemlje, njena sestava in prezračenost vplivajo na preživetje in gibanje glist. V največjem številu se gliste nahajajo v zgornjih 15 do 30 centimetrih zemlje. Razporeditev glist v kultivirani zemlji je ponavadi neenakomerna. Največ se jih nahaja okrog korenin občutljivih rastlin, katere včasih zasledujejo tudi do 150 cm v globino zemlje. Vzrok visoke koncentracije glist okrog korenin gostiteljskih rastlin je v hitrejši reprodukciji zaradi velike količine hrane, ki je na voljo, pa tudi zaradi snovi, ki privabljajo gliste in jih rastlina izloča v rizosfero. Substance, ki jih izločajo korenine v rizosfero, pospešujejo razvoj jajc in izvalitev nekaterih vrst glist. Večina glist pa se izvali prosto v vodi brez prisotnosti posebnega dražljaja. Gliste se v zemlji gibljejo počasi. Celotna razdalja, ki jo naredijo ne presega nekaj metrov na sezono. Hitreje se gibljejo, če pore v zemlji obkroža tanek, nekaj mikrometrov debel film vode. Razširjajo se pa zlahka z vsem, kar lahko nosi delce prsti. Kmetijski stroji, namakanje, poplavne in odtočne vode, živalske tace, ptiči in peščeni viharji razširjajo gliste na kratke razdalje, medtem ko se na dolge razdalje razširjajo predvsem s kmetijskimi produkti in sadikami. Gliste, ki napadajo nadzemne dele rastlin, se ne prenašajo le s prstjo, ampak se z rastline na rastlino prenašajo tudi z dežjem. Prenašanje glist poteka tudi ob kontaktu inficiranih rastlinskih delov z novimi, zdravimi rastlinami.

Nadzor glist v naravi Poznamo veliko različnih in učinkovitih metod nadzora glist. Pri izbiri metode pa so pomembni tudi faktorji kot sta izraba in tip pridelka. Kolobarjenje se je razvili skozi prakso. Biološka kontrola temelji predvsem na uporabi antagonistov (bakterij in gliv) glist. Uporabljajo se tudi fizične metode kot je uporaba vročine in poplavljanje ter kemične metode kot so različni tipi nematicidov.

▌Vaja: ▌ Izolacija nematodov iz zemlje Za analizo bolezni, ki jih povzročajo gliste moramo poznati njihovo anatomijo, morfologijo, življenjski cikel, razširjenost in tudi načine izolacije. Večinoma 12

jih izoliramo iz korenin rastline, ki je z njimi okužena ali pa iz zemlje v bližini korenin na katerih se hranijo. Gliste, ki napadajo nadzemne dele rastline, izoliramo iz


Navodila Interakcije rastlin okuženih delov rastline. Za izolacijo glist iz zemlje poznamo dva načina: s pomočjo Baermannov lijaka ali sita. Pri obeh metodah po izolaciji gliste še dodatno očistimo tako, da jih damo v centrifugirko skupaj s raztopino sladkorja in centrifugiramo. Pri izolaciji iz nadzemnih tkiv namesto zemlje uporabimo narezan rastlinski material.

Bearmann-ov lij Material zorci zemlje iz vrta in travnika, steklen lij, gumijasta cevka, stišček, stojalo, nosilec za lij, lupe in mikroskopi Na lij namestimo gumijasto cev in jo zatesnimo s stiščkom. Lij postavimo v stojalo in v lij namestimo eno plast navlažene papirne brisače. V vsak lij v tanki plasti dodamo 50 ml prsti. Lij previdno zalijemo z vodo, dokler prst ni v celoti navlažena. Po 24-48 urah odpremo stišček in izpustimo 10 ml tekočine. V tekočini preverimo prisotnost nematodov. Migracija nematodov iz prsti v tekočino poteka več dni, vendar gliste v tekočini propadajo, če tekočine ne odstranjujemo sproti. Nematode v tekočini lahko v primeru, da bomo identifikacijo izvedli pozneje shranimo v hladilniku. Za identifikacijo si pomagamo s ključem (Slika 1).

da se ohladi), sito (325), petrijevke (Φ 90), lupe in mikroskopi Najprej speremo 250 ml prsti v vedro. Vedro mora biti napolnjeno približno do tretjine z vodo. Dobro premešamo in pustimo nekaj časa stati, da se delci usedejo. Tekočino zlijemo preko sita in vsebino sita speremo z 200 ml vode v čašo.

Flotacija v raztopini sladkorja Tekočino z izoliranimi glistami prenesemo v centrifugirke in jih steriramo. Centrifugiramo 4 minute pri 3250 vrtljajih na minuto. Supernatant odlijemo, centrifugirke napolnimo do 2/3 s sladkornim sirupom in s spatulo razdrobimo usedlino v centrifugirki. Ponovno centrifugiramo 30 s pri enakih pogojih. Supernatant zlijemo v sito in dobro speremo, da odstranimo sladkor. Vsebino sita nato speremo v petrijevke. Gliste v tekočini lahko v primeru, da bomo identifikacijo izvedli pozneje shranimo v hladilniku. Za identifikacijo si pomagamo s ključem (Slika 1).

Vprašanja 1. Kako bi razložil razlike med kultivirano zemljo in travnikom?

Izolacija s pomočjo sita Material centrifuga, centrifugirke (80 ml), sladkorni sirup (450 g sladkorja raztopimo v 1 L vroče vode in pustimo,

Tabela 5. Pogostost fitoparazitskih glist v tleh. Vzorec tal: Podvzorec: Vrsta gliste:

1

2

3

Frekvenca osebkov

13


14 črvasta

odsotni

Aphelenchus

Hoplolaimus Belonolaimus Scutellonema

vozlički ob stiletu

zaokrožena

členkovitost

oblika telesa

izrazita

stilet

prisotni

Criconemella

jasno opazna

Meloidogyne Heterodera Globodera

vrečasta

neparazitske gliste

odsoten

Hemicycliophora Ditylenchus

večji od 1 mm

oblika “repa”

neizrazita

večji od 1 mm, dolg in raven

Paratylench Pratylenchus

manjši od 1 mm

Xiphinema

prisotna

Longidorus

odsotna

razširitev na dnu stileta

velikost

odsotna

velikost organizma

koničast

manjši od 1 mm, kratek in ukrivljen

ezofagealna razširitev

parazitske gliste

prisoten

Navodila interakcije rastlin


Navodila Interakcije raslin

Simbioze rastlin in gliv Mikoriza Termin »mikoriza« je prvi uporabil Frank (1885) za opis mutualistične povezave med koreninami in glivnim micelijem. Mikorizo tvorijo predstavniki vseh glavnih taksonomskih skupin gliv: Zygomycotina, Ascomycotina, Basidiomycotina in Deuteromycotina. Navadno najdemo pri posameznih rastlinah le en tip mikorize, pri nekaterih rastlinah pa lahko najdemo tudi več tipov mikorize (Salix, Populus, Alnus in Eucalyptus).

Ektomikoriza Ektomikorize se pojavljajo pri lesnih predstavnikih subarktičnega in zmernega pasu. Največ gostiteljskih rastlin pripada družinam Pinaceae, Fagaceae, Betulaceae in Myrtaceae. Glivni partnerji pa so predvsem višje glive: bazidiomicete (rodovi Amanita, Boletes, Suillus, Russula, Lactarius, Rhizopogon,…), askomicete (npr. rod Tuber) in dve vrsti iz skupine Zygomycotina. Ektomikorizne povezave so lahko zelo specifične (gliva ima le enega gostitelja) ali pa lahko glive tvorijo mikorizo z več različnimi gostitelji. Značilne za ektomikorizo so spremembe stranskih korenin, ki so omejene v rasti odebeljene in značilno razrasle (dihotomno ali šopasto). Odstotni so tudi koreninski laski. Bolj ali manj razvit hifni plašč obdaja korenino. Plašči se razlikujejo v debelini, barvi in teksturi, glede na vrsto glive in rastline, ki tvorita ektomikorizo. V notranjosti se hife razraščajo med celicami in tvorijo Hartigovo mrežo. Hife nikoli ne prodrejo v notranjost celic ali preko endodermisa v centralni cilinder. Izven hifnega plašča vodijo ekstramatrikalne hife, ki prevzamejo vlogo manjkajočih koreninskih laskov. Ekstramatrikalne hife se lahko združijo tudi v rizomorfe, ki so vidni že s prostim očesom in služijo za transport vode in hranil na dolge razdalje.

Arbuskularna mikoriza Značilnost arbuskularne mikorize so drevesaste strukture (arbuskuli) v celicah gostitelja, ki služijo izmenjavi snovi. Ob tvorbi arbuskula pride do invaginacije v gostiteljsko celico in do tvorbe novega

kompartmenta apoplasta, preko katerega poteka vsa izmenjava snovi. Arbuskuli so funkcionalni do 15 dni. Poleg arbuskulov lahko v koreninah najdemo še druge glivne strukture. Vezikli so lipidna telesa v intercelularjih gostitelja, ki v glavnem služijo kot zaloga, lahko pa opravljajo tudi razmnoževalno funkcijo. Nespolne spore nastanejo z diferenciacijo vegetativnih hif gostitelja. Pri nekaterih vrstah (npr. Glomus intraradices) se spore dodatno zdebelijo in ločijo od preostalega dela hife v korenini, večinoma pa spore nastajajo v substratu izven korenine. Glive, ki tvorijo arbuskularno mikorizo pripadaja redu Glomales. Predstavniki so obligatni simbionti in jih ni mogoče gojiti v aseptični kulturi. Za njihovo vzgojo je ponavadi uporablja rastline dojilje.

Nekatere pri nas redkejše oblike mikorize Erikoidno mikorizo najdemo pri predstavnikih družine Ericaceae (npr. Calluna, Rhododendron, Vaccinium, itd.). Pri erikoidni mikorizi najdemo kortikalne celice napolnjene s hifami glivnega simbionta. Na površini korenine lahko najdemo preplet hif, vendar gliva nikoli ne tvori hifnega plašča. Pri mnogih predstavnikih družine Ericaceae (poddružini Arbutoideae in Pyroloidaeae) najdemo arbutoidno mikorizo. Glive pripadaj predvsem skupini bazidiomicet. Pri arbutoidni mikorizi najdemo značilnosti ekto- in endomikorize. Na kratkih koreninah najdemo debel zunanji plašč in Hartigovo mrežo. Hife prodrejo tudi v številne kortikalne celice, v katerih tvorijo zvitke. Monotropoidna mikoriza je posebna oblika mikorize. Najdemo jo pri družini Monotropaceae (Ericales). Predstavniki te družine, ki nimajo klorofila so povsem odvisni od glivnega partnerja. Parazitirajo na glivah, ki tvorijo ektomikorizo. Injiciranje radioaktivnega 14C v floem bora mikoriznega z gobanom, je pokazala, da se je radioaktivni C prenesel iz bore, preko gobana, v rastlino Monotropa hypopitys, ki je tvorila povezavo z gobanom. Tako rastlina posredno parazitira na gostitelju ektomikorizne glive. Orhideje tvorijo mikrosemena (0,3-14,0 μg), s 15


Navodila Interakcije raslin praktično nič založnih snovi, zaradi česar je za uspešno kalitev in razvoj do fotosintetsko aktivne faze nujno potreben glivni simbiont, ki rastlin preskrbi z ogljikovimi hidrati. Najpogostejši glivni simbionti orhidej so glive iz rodu Rhizoctonia (bazidijomicete). Pripadniki lahko uspešno preživijo v substratu kot saprofiti, brez gostitelja. Številni pa so tudi agresivni rastlinski patogeni. Z razvojem fotosintetskih organov se preneha preskrba orhideje z oglijkovimi hidrati in gliva rastlino oskrbuje le še z vodo in minerali.

Temni septirani endofiti (DSE) Temni septirani endofiti (dark septate endophytes, DSE) so glive, ki z rastlinami tvorijo zelo raznolike interakcije – pokrivajo ves spekter interakcij od simbiontskih, preko komenzalizma vse do parazitizma. DSE glive so skupina devteromicetnih gliv (Deuteromycota), ki jih zaradi pomanjkljivega znanja o telomorfnih (spolnih) oblikah in spolnem načinu razmnoževanja imenujemo nepopolne glive oz. »fungi imperfecti«. Večina jih pripada deblu Ascomycota. Prisotnost DSE-gliv je bila ugotovljena pri skoraj 600 rastlinskih vrstah, ki pripadajo 320 različnim rodovom in 100 družinam. Pojavljajo se v vseh klimatskih pasovih in v zelo različnih habitatih (obalni predeli Južne Afrike, nižine, tropi, zmerni pas, subalpinski in

alpinski pas, obmorska območja Arktike in Antarktike). Zanje je značilno, da nadomestijo AM glive na klimatsko ali edafsko ektremnih rastiščih. Prisotnost melanina v celični steni DSE gliv povečuje njihovo odpornost na številne stresne dejavnike in tako poveča njihovo kompetativnost na stresnih rastiščih. Morfologija DSE-gliv se med posameznimi sevi zelo razlikuje in je v nekaterih primerih odvisna od gostiteljske rastline. Značilne so temne septirane hife, ki tvorijo gost preplet v koloniziranih koreninah. Posamezna hifa lahko tvori apresorij, prodre v koreninsko tkivo in tvori tipične anatomske strukture (mikrosklerocije) v celicah ali pa preprosto raste vzporedno s prevajalnim tkivom korenine. Vplivi DSE-infekcije na gostiteljsko rastlino so slabo raziskani, rezultati dosedanjih raziskav pa nestalni in pogosto nasprotujoči si. Patogeni učinki DSE-gliv so odvisni od kombinacije glive in gostiteljske rastline in lahko zajemajo vse stopnje od nepatogenih do zelo patogenih. Čeprav je narava interakcij DSE gliv z rastlino pogosto nejasna, je bilo v laboratoriju že dokazana izboljšana prehrana rastline po inokulaciji z DSE glivami. Ugotovljeno je bilo, da so DSE-glive v določenih poskusnih razmerah sposobne povečati koncentracijo fosforja v gostiteljski rastlini.

▌Vaja: ▌ Vpliv arbuskularne mikorize in fosforja na rast koruze Arbuskularna mikoriza izboljša preskrbljenost rastline z različnimi nutrienti, predvsem s fosforjem. Mikoriza je tako favorizirana v razmerah, ko je rastlini dostopnega fosforja v naravi malo. Ob povišanju koncentracije zaradi gnojenja (NPK) lahko rastlini dostopni fosfor povsem zadosti potrebam rastline in simbioza ni več potrebna.

Namen Prikaz izboljšane rasti rastline ob vzpostavitvi mikorize v pogojih nizkih koncentracij fosforja in nižje kolonizacije rastline pri večji oskrbi s fosforjem

Material semena koruze in sončnice, komercialna raztopina natrijevega hipoklorita (varekina), lonci, substrat z nizko vsebnostjo hranil (Humko), komercialni 16

mikorizni inokulum, avtoklav, rastna komora, LA hranilna raztopina

Izvedba Substrat za izvedbo vaje steriliziramo s paro (120 kPa, 121°C) dvakrat v razmaku dveh dni. Semena rastlin 10 minut steriliziramo v raztopini varekine (varekina: voda = 9:2, V/V). Po sterilizaciji pretresemo semena v cedilo in postavimo pod tekočo vodo za približno 30 minut. V tem času se varekina spere iz semen in hkrati poteče tudi imbibicija. V lonce nasujemo do 2/3 višine steriliziran substrat, nato pa dva lonca do vrha napolnimo s plastjo inokuluma, v dva pa nasujemo avtoklaviran substrat. Posejemo semena koruze/sončnice in korita prenesemo v rastlinjak. Dva lonca (inokuliran in neinokuliran tretma) 1x


Navodila Interakcije raslin tedensko zalivamo s polovično raztopino LA gojišča, 2 pa s polovično raztopino LA gojišča, ki pa vsebuje 5x koncentracijo fosforja. Imamo torej naslednje tretmaje:

pobarvamo za oceno glivne kolonizacije (glej str 26). V rastlinah določimo vsebnost fosforja (glej str. ).

Rezultati

• inokuliran substrat brez dodanega fosforja (I),

Dodatna opažanja (morfološke značilnosti kot npr. barva listov):

• inokuliran substrat z dodanim fosforjem (IP), • neinokuliran substrat brez dodanega fosforja (N) in • neinokuliran susbstrat z dodanim fosforjem (NP) Rast nadzemnega dela koruze tedensko spremljamo (Tabela 7). Zabeležimo si tudi vse morebitne morfološke razlike med tretmaji. Po dveh mesecih poskus zaključimo. Stehtamo nadzemne dele in korenine (Tabela 8). Pri vsaki rastlini odrežemo vsaj 30 koščkov korenin (2 cm pod vršičkom korenine) in jih

Tabela 7. Višina poganjka 2-5 teden po inokulaciji. Višina poganjka (cm) N

NP

I

IP

2. teden 3. teden 4. teden 5. teden

Tabela 8. Mase poganjkov in korenin ob zaključku poskusa. N Masa poganjka

NP Masa korenin

Masa poganjka

I Masa poganjka

Masa korenin

IP Masa korenin

Masa poganjka

Masa korenin

17


Navodila Interakcije raslin

Graf 5. Višina poganjka v odvisnosti od posameznega tretmaja 2, 3, 4 in 5 teden po inokulaciji.

Analiza fosforja v rastlinskem materialu Razklop rastlinskega materiala z dušikovo in perklorno kislino Rastline operemo pod tekočo vodo in nato še z destilirano vodo. Korenine ločimo od poganjkov in jih ločeno sušimo v sušilniku na 60°C 3 dni. Suh material nato zmeljemo v analitskem mlinu ali v terilnici, da dobimo fin prah. V plastične posodice ali na povoščen papir zatehtamo po 30 mg zmletega suhega rastlinskega materiala (tehtamo na analitski tehtnici na 5 decimalnih mest), ki ga nato prenesemo v očiščene epruvete. V epruvete previdno dodamo 3,0 ml kislinske mešanice (HNO3 : HClO4 = 7:1). Vzorce nato inkubiramo čez noč, da se dobro napojijo s kislino. Po inkubaciji vzorce postopno segrevamo na aluminijastem termobloku, dokler kislina popolnoma ne izhlapi. Suhe vzorce nato raztopimo v 3,0 ml 0,2% HNO3 pripravljene z bidestilirano vodo. Pred meritvijo pripravimo mešanico amonijevega heptamolibdata in amonijevega metavanadata (MoV). Za pripravo 25 g amonijevega heptamolibdata raztopimo v 400 ml dH2O in segrevamo, dokler se 18

raztopina ne zbistri. 1,25 g amonijevega metavanadata raztopimo v 300 ml vrele vode, ohladimo in dodamo še 250 ml koncentrirane HNO3. Mešanico ohladimo na sobno temperaturo in ji prilijemo raztopino amonijevega paramolibdata. Dopolnimo do 1000 ml z dH2O.

Priprava standarda Metoda je zanesljiva (standard je linearen) v območju od 0,1-2 mg/l, zato si iz osnovne komercialne standardne raztopine (koncentracija 995 mg P/l) pripravimo 100x redčitev, ki jo uporabimo za nadaljnjo pripravo standardnih raztopin. Najbolje je da standarde pripravimo v 10 ml bučkah, ker so le tako volumni najbolj natančni. V bučke odpipetiramo ustrezne količine razredčenega standarda kot kaže spodnja tabela. Reagent MoV dodajamo s stekleno pipeto in bučke dopolnimo z 0,2% HNO3 do 10 ml. Če nimamo bučk lahko uporabljamo epruvetke.


Navodila Interakcije raslin Tabela 10. Priprava standarda. Količine so prirejene za 10 ml bučke št.

izhodna konc. (mg/l)

želena konc. P (mg/l)

standard (ml)

reagent MoV (ml)

0,2% HNO3 (ml)

1

10

0,20

0,2

2

7,8

2

10

0,40

0,4

2

7,6

3

10

0,60

0,6

2

7,4

4

10

0,80

0,8

2

7,2

5

10

1,00

1

2

7,0

6

10

1,20

1,2

2

6,8

7

10

1,40

1,4

2

6,6

8

10

1,60

1,6

2

6,4

9

10

1,80

1,8

2

6,2

10

10

2,00

2,0

2

6,0

Analiza vzorcev Iz razklopljenega vzorca vzamemo 1 ml raztopine, dodamo 2 ml MoV reagenta in 7 ml 0,2% HNO3. Standarde in vzorce merimo na spektrofotometru pri valovni dolžini 400nm. Slepa proba je MoV in 0,2% HNO3 (2ml + 8ml). Iz umeritvene krivulje (R2>0.95) odčitamo koncentracijo v izmerjenem vzorcu in preračunamo na maso in volumen vzorca (enačba 19). Volumen vzorca je pri tem enak volumnu, s katerim je bil redčen razklopljen vzorec + dodatne redčitve, če so bile potrebne (v kolikor je bila absorbanca vzorca višja od absorbance najvišjega standarda).

cfosforja vstavimo v mg/l.

Rezultati Suho maso rastlin in izračunane koncentracije ter vsebnosti fosforja v rastlinskem materialu vpišite v spodnjo tabelo:

Vprašanja 1. Ali ste opazili kakšne razlike med koncentracijami P v poganjkih koruze in detelje pri različnih tretmajih? Kako bi razložil razlike?

Tabela 11. Mase rastlin, koncentracije in vsebnosti fosforja v poganjkih koruze. Tretma

Masa poganjkov

Koncentracija fosforja (mg/ml) 1. meritev

2. meritev

Povp. konc. fosforja (mg/ml)

Vsebnost fosforja (mg)

N NP I IP

Tabela 12. Mase rastlin, koncentracije in vsebnosti fosforja v poganjkih detelje. Tretma

Masa poganjkov

Koncentracija fosforja (mg/ml) 1. meritev

2. meritev

Povp. konc. fosforja (mg/ml)

Vsebnost fosforja (mg)

N NP I IP

19


Navodila Interakcije raslin

▌Vaja: ▌ Barvanje arbuskularno mikoriznih gliv Opazovanje arbuskularno mikoriznih glivnih struktur pod svetlobnim mikroskopom nam omogoča selektivno barvanje hitina, ki je sestavina celične stene simbiontske glive. Barvila so različnih tipov, najpogosteje se uporablja tripan modro, lahko pa uporabljamo tudi kisli fuksin, sudan in celo navadno tinto (črnilo). Pri barvanju moramo biti pozorni na strukturo koreninskega sistema in čas presvetlitve in barvanja temu primerno optimizirati.

Material 10% raztopina KOH, 5% raztopina tripan modrega (0.5 g tripan blue, 500 ml glicerola, 450 ml dH2O, 50 ml HCl), epruvete, til, sušilnik, objektna in krovna stekelca, mikroskop

ki ga zatesnimo z elastiko. V sušilniku vzorce 30 min segrevamo pri 90°C, nato iz epruvet odlijemo KOH in koreninice 3-krat speremo pod tekočo vodo. V epruvete nato dolijemo barvilo in jih segrevamo v sušilniku 3 min pri 90°C. Nato barvilo odlijemo (uporabimo ga lahko večkrat!) in koreninice 3-krat speremo pod tekočo vodo. Vzorce lahko v vodi hranimo v hladilniku. Več 1-cm dolgih fragmentov korenin položimo vzporedno na objektno steklo in jih pokrijemo. Pod mikroskopom lahko dele gliv vidimo kot modro obarvane strukture. Za vsak posamezen fragment ocenimo kolonizacijo in izražunamo povprečne vrednosti parametrov F% in A%.

Izvedba Koreninski sistem rastline operemo pod tekočo in destilirano vodo, ga narežemo na ~1 cm fragmente in položimo v 16 cm široke epruvete. Fragmente prelijemo z 10% KOH, epruveto prekrijemo s tilom,

10% KOH 10% KOH

90°C 90°C30 30min min

metil modro 5% črnilo 3-5 90°C v 5% ocetni kislini 90°C min 3 min

preparatsz fragmenti obarvanimi Preparat koreninskimi fragmenti

Slika 2. Shematični prikaz barvanja in obarvanih glivnih struktur v koreninah. 20


Navodila Interakcije raslin

Skice glivnih struktur

21


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 skupaj

22

A0

a%

m%

AM parameter

A%

M%

F%

AM parameter

r0 (0%) A3

r2 (<10%) A1 A2 A3

A0

r3 (<50%) A1 A2 A3

A0

r4>50% A1 A2 A3

A0

Razlaga parametrov, ki se nanašajo na celoten koreninski sistem

A0

r5>95% A1 A2

Pri čemer je: rA3= [(95*r5A3+70*r4A3+30*r3A3+5*r2A3+r1A3)/št. mikoriznih korenin]*100/m podobno izračunamo tudi rA2 in rA1

a% = (100*rA3 + 50*rA2 + 10*rA1) / 100

gostota arbuskulov v delu korenine z mikorizno kolonizacijo

m% = M * (število vseh korenin) / (št. mikoriznih korenin) = M * 100 / F

intenziteta mikorize v koloniziranih koreninskih fragmentih

Razlaga parametrov, ki se nanašajo le na koloniziran del koreninskega sistema

A% = a * (M / 100)

gostota arbuskulov v koreninskem sistemu

M% = (95*r5 + 70*r4 + 30*r3 + 5*r2 + r1) / št. vseh korenin

splošna intenziteta mikorize – intenziteta mikorizne kolonizacije koreninskega sistema

F% = (št. mikoriznih korenin / št. vseh korenin) * 100

mikorizna frekvenca - frekvenca fragmentov z glivo

r1 (<1%) A1 A2 A3

Navodila Interakcije raslin


Navodila Interakcije raslin

▌Vaja: ▌ Določanje vsebnosti asimilacijskih barvil Material

uporabimo za izračun koncentracije pigmentov v listih.

listi sončnice in koruze, kremenčev pesek, metanol, 25% HCl, terilnica, centrifugirke, 20ml epruvete, stojalo za epruvete, merilni valj, nuča, filter papir, centrifuga, spektrofotometer

Ekstrakcija in določitev vsebnosti asimilacijskih barvil

Formule za izračun koncentracije klorofilov (mg pigmenta/g sveže mase listov):

!"#$#%&"  ! =

16,72 ∗ !665 − 9,16 ∗ !652 ∗ !!"#$%&  [!"]   !"#$%  !"#"   ! ∗ 1000

  34,09 ∗ !652 − 15,28 ∗ !665 ∗ !!"#$%&  [!"] Vzamemo 1 g sveže mase materiala in ga stremo !"#$#%&"  ! =   !"#$%  !"#"   ! ∗ 1000 v terilnici z dodatkom (za noževo konico) kremenčevega peska. Vzorce tremo najprej na   1,44 ∗ !665 + 24,93 ∗ !652 ∗ !!"#$%&  [!"] !"#$%&  !!"#"$%!! =   suho in nato v 10 ml 100% na 4 oC ohlajenega !"#$%  !"#"   ! ∗ 1000 metanola, dokler ne postanejo homogeni. Ekstrakt   nato prefiltriramo v merilni valj. Vzorce spiramo Rezultati s svežim metanolom tako dolgo, da se metanol ob dodatku v terilnico ne obarva več zeleno. Po končanem V spodnj0 tabelo vpišite rezultate analiz fotosinteznih spiranju odčitamo volumen ekstrakta v merilnem valju. pigmentov pri inokuliranih in neinokuliranih rastlinah. Ekstrakt razdelimo v dve centrifugirki (približno 10 ml) in centrifugiramo 5-10 minut pri 4200 obratih. Absorpcije ekstraktov izmerimo na spektrofotometru pri valovnih dolžinah 665 in 652 nm. Absorpcije

Tabela 13. Meritve absorpcij: 665 nm [A665]

1

652 nm [A652]

2 3 4 5 6 Povprečje

Tabela 14. Koncentracije asimilacijskih barvil (mg/g): Tretma

Koncentracij fotosinteznih pigmentov Klorofil a

Klorofil b

Skupni klorofili

N NP I IP

23


Navodila interakcije rastlin

▌Vaja: ▌ Encimska karakterizacija glivnih izolatov Glive ne glede na način življenja (saprofiti, patogeni ali simbionti) izločajo izvencelične encime, ki razgrajujejo kompleksne substrate do preprostih molekul, primernih za privzem v celico. Prisotnost oz. odsotnost posameznih encimov je pri številnih vrstah zelo uporaben znak za ločevanje med posameznimi izolati ali vrstami.

5 dneh rasti preverimo rast glivnih izolatov in število pozitivnih gojišč (opazni so znaki encimske aktivnosti): Pri vseh izolatih izmerimo premer micelija in cone, ki označuje encimsko aktivnost. Prirast micelija in cono encimske aktivnosti določimo z analizo slike. Petrijevke poslikamo z digitalnim fotoaparatom, nato pa fotografije obdelamo v programu ImageJ.

Primeri encimskih aktivnosti

Lipazna aktivnost

Amilazna aktivnost

Polfenol oksidazna aktivnost

Tabela . Znaki encimskih aktivnosti Lipazna aktivnost

razbarvana cona okrog micelija

Amilazna aktivnost

po barvanju z jodovico opazimo okrog micelija neobarvano cono

Proteinazna aktivnost

razbarvana cona okrog micelija

Polifenol oksidazna aktivnost

temna cona okrog micelija

Sinteza sideroforov

razbarvana cona okrog micelija na polovici petrijevke, na kateri se nahaja CAS gojišče

Namen Študenti uporabijo semikvalitativne teste encimskih aktivnosti za karakterizacijo glivnih izolatov.

Material glivni izolati različnih gliv (saprofiti, patogeni in simbionti), Nutrient Broth (NB), sladni ekstrakt agar, destilirana voda, gojišča za identifikacijo encimskih aktivnosti

Izvedba Po navodilih za pripravo gojišč (str. ) pripravimo gojišča za določanje lipazne, proteinazne, amilazne in polifenol oksidazne aktivnosti. Na vsako gojišče s plutovrtom nacepimo dva kosa micelija, petrijevko zavijemo s folijo in prenesemo v rastno komoro. Po 24

Analiza slike V programu ImageJ odpremo sliko in narišemo ravno črto od enega roba petrijevk do drugega, kar ustreza 9 cm (pri velikih petrijevkah). V meniju «Analyze» izberemo «Set Scale» in vpišemo pod «Known distance» ustrezno dolžino (v našem primeru 9.00). S tem smo kalibrirali sliko. Na sliki sedaj orodjem «Freehand selection» obkrožimo micelij in stisnemo Ctrl+M, s čimer opravimo meritev površine. Meritev ponovimo še za cono encimske aktivnosti in obe vrednosti zapišemo v spodnjo tabelo.

Rezultati Oznaka izolata:


Navodila Interakcije rastlin Tabela . Premer micelija: Dan

Test na prisotnost: Lipaze

Amilaze

Proteinaz

Polifenol oksidaz

Sideroforov

Polifenol oksidaz

Sideroforov

2 4 6 8 10 povp.

Tabela . Premer cone encimske aktivnosti: Dan

Test na prisotnost: Lipaze

Amilaze

Proteinaz

2 4 6 8 10 povp.

Vprašanja: 1. Kakšen je pomen testiranih encimskih aktivnosti za glivo?

2. Kakšen je pomen testiranih encimskih aktivnosti za rastlino v simbiozi z izolatom?

25


Navodila Interakcije rastlin

Gojišča Polovično LA (Long Ashton) gojišče - 10x koncentracija Zaporedoma dodamo naslednje makroelemente v 500 ml destilirane vode (g) Makroelement KNO3 Ca(NO3)2 . 4H2O NaH2PO4 . 2H2O MgSO4 . 7H2O

P 4,04 9,44 0,208 3,68

5x P 4,04 9,44 1,04 3,68

Raztopini dodamo 10 ml raztopine A: Mikroelement MnSO4 . H2O CuSO4 . 5H2O ZnSO4 . 7H2O H3BO3 NaCl

0,85 0,13 0,15 1,55 2,95

in 1 ml raztopine amonijevega molibdata (NH4)6Mo7O24 . 4H2O 0,176 /200 ml Na koncu dodamo še 0,22 Fe, Na EDTA in dopolnimo raztopino do 1 L. Za uporabo raztopino razredčimo 1:9 z destilirano vodo.

Melin-Norkrans-Marx gojišče Zaporedoma dodamo naslednje sestavine v 1 l destilirane vode (g) CaCl2 NaCl KH2PO4 (NH4)2HPO4 MgSO4 . 7H2O EDTA glukoza slad agar tiamin

0,05 0,025 0,5 0,25 0,15 0,005 10,0 5,0 10,0 10,0 μ

PDA gojišče Za 1 l gojišča zatehtamo 20 g krompirjevega dekstroznega agarja. 26


Navodila Interakcije rastlin

Spirit Blue gojišče Zaporedoma dodamo naslednje sestavine v 1 l destilirane vode (g) Tripton Kvasni ekstrakt Spirit Blue Lipazni reagent Agar

10 5 0,15 30 ml 20

Gojišče za dokazovanje amilazne aktivnosti Zaporedoma dodamo naslednje sestavine v 1 l destilirane vode (g) Mesni ekstrakt Škrob Agar

3 10 12

Gojišče za dokazovanje polifenol oksidazne aktivnosti Zamešamo raztopino A in B. Raztopina A Galna kislina Destilirana voda Destilirana voda

5g 250 ml 750 ml

Raztopina B Sladni ekstrakt Agar

5g 20 g

Raztopini steriliziramo ločeno in jih pred razlivanjem plošč zmešamo.

27


Interakcije rastlin