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CULTIVO CONTINUO - SU INFLUENCIA EN LA INGENIERÍA PRACTICA

TRADUCCIÓN 2009

CULTIVO CONTINUO. SU INFLUENCIA EN LA INGENIERIA PRACTICA. Arthur E. Humprey. Dept. of Chemical Engineering. University of Pennsylvania Philadelphia, PA USA.

Comentarios: El presente artículo fue traducido para su revisión en clase como parte de los contenidos del programa de Bioingeniería, ya que aborda los conceptos de cultivo continuo – quimiostato, su aplicación en diversos procesos fermentativos ya sea para la producción de un metabolito de interés industrial o en el empleo de tratamiento de desechos. Además de ser pertinente con los objetivos de la bioingeniería que marca el programa.

RESUMEN Los sistemas de cultivo continuo han evolucionado resultando ahora más complicados que lo que era el simple sistema de quimiostato. Estos sistemas involucran procesos multietapas con reciclamiento interno y externo, además del reciclamiento de la concentración celular, presentando ventajas interesantes para los futuros tecnólogos fermentativos y para el entendimiento de su conducta.

PALABRAS CLAVE Cultivo continuo, procesos multietapas, reciclaje de células, reciclaje interno y externo, llenado y vaciado en lote automatizado, recogimiento repetido.

INTRODUCCIÓN La mayoría de las tecnologías fermentativas están involucradas con el cultivo continuo que comenzó hace 30 años con Monod (1950) y sus experimentos en el “Biógeno”, y con Novick y Szilard (1950) y sus investigaciones en el “Quimiostato”. Sin embargo, las aplicaciones del cultivo continuo van desde más antes. Un proceso continuo con levadura de pan fue descrito en una patente estadounidense por Hayduck (1923) y uno de producción alcohol fue descrito por Lebeder (1927) en los 20´s. Pero, realmente no fue hasta 1956 que la utilidad y ventaja que la fermentación en cultivo continuo fue teóricamente explicada por Hebert y col. (1956, 1961). Simultáneamente un cúmulo de conocimientos fue generado sobre los sistemas de cultivo continuo para el tratamiento de aguas de desecho. Estos sistemas han sido diseñados y empleados en muy grande escala durante las últimas dos décadas, desde antes de los experimentos clásicos de Monod. Desafortunadamente, la ingeniería del tratamiento de desechos nunca entendió completamente la verdadera conducta cinética de los sistemas de cultivo continuo. No fue hasta que investigadores de las aguas de desecho como Busby y Andrews (1975) aplicaron la cinética de Monod a sus sistemas. Parte del problema fue que estos sistemas involucran sistemas de cultivos mixtos más que sistemas puros. Además, las variadas configuraciones de los sistemas que la ingeniería del tratamiento de aguas residuales evolucionó, fue literalmente el principio de magnitudes mas complejas y sofisticadas de los sistemas de cultivo continuo a gran escala, (Humphrey, 1979).

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Como consecuencia, es claro ya que la teoría del cultivo continuo ha tenido una influencia sobre la práctica de la fermentación a gran escala, ya que ésta, no solo ha servido para explicar varios fenómenos observados en los sistemas de fermentación a gran escala, particularmente aquellos que involucran alimentación por lote, llenado y vaciado por lote automatizado, desalojo repetido y cultivo continuo con sistemas de fermentación con reciclaje. En discusión del cultivo continuo y su influencia en la práctica de la fermentación a gran escala, nos gustaría considerar el conocimiento teórico básico del cultivo continuo, entonces definimos las variadas clases de fermentaciones operadas continua o semicontinuamente que han sido practicadas a gran escala, y finalmente identificamos la influencia de las técnicas del cultivo continuo sobre la práctica de la fermentación a gran escala.

RESUMEN TEORICO DE LAS FERMENTACIONES INDUSTRIALES CONTINUAS. Tres sistemas primarios se han empleado a pequeña escala para estudiar la cinética de las fermentaciones continuas (Fig. 1). Estos son el quimiostato, el cual ha sido la herramienta básica para la obtención de la cinética de la producción de biomasa y metabolitos secundarios en un ambiente químico constante mientras crecen en un estado estacionario. El segundo sistema ha sido el quimiostato con reciclamiento. Este sistema ha permitido al investigador ver la conducta de las células microbianas a velocidades máximas de crecimiento y altas concentraciones celulares. El tercer sistema ha permitido también ver las fermentaciones a altas concentraciones de sustrato o a condiciones donde la inducción, represión por sustrato, o inducción de producto puede ocurrir.

Mientras estos sistemas han sido excelentes para estudiar la conducta celular, han tenido poco valor para el diseño práctico de sistemas de fermentación continua a gran escala. Por ejemplo, un sistema de cultivo multietapas con reciclamiento celular es el sistema a gran escala más común encontrado en el tratamiento de desechos.

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Cultivos continuos de una sola etapa no han tenido virtual influencia en su evolución. Los ingenieros del tratamiento de desechos diseñan sistemas de tratamiento continuo que involucran un sistema a escala muy diferente del quimiostato en principio para obtener los datos cinéticos necesarios. Un sistema típico es el reactor de llenado y vaciado por lote automatizado (ABFD), (Fig. 2). En este sistema, un reactor batch puede ser agitado y aireado en una forma por lote, así la aireación y agitación son detenidas y permite asegurar la biomasa. El reactor se está comportando ahora como un clarificador celular. Entonces se recoge la cantidad apropiada de líquido claro, medio fresco es adicionado, y el ciclo es repetido. Estos sistemas han sido automatizados y son usados como sistemas de escalamiento, obteniendo datos para ambos sistemas de tratamiento, de aguas residuales domésticas e industriales. (Jacobson, 1978).

La característica interesante acerca de esta técnica es que fue esencialmente propuesta hace 20 años por Fenci (1966) en uno de los primeros Simposiums de Cultivo Continuo y redescubierto solo recientemente, hace 10 años aproximadamente para el tratamiento de desechos industriales. Este sistema automatizado de llenado y vaciado es algunas veces equipado con un sensor de oxígeno disuelto el cual es localizado en el sistema ABFD primeramente para medir la Demanda Biológica de Oxígeno (BOD). En tales sistemas, el oxígeno disuelto es controlado entre dos niveles, tales como 60% y 40% de saturación. Cuando el sistema alcanza el 60% de saturación, el aire es apagado, se mantiene la agitación, y el oxígeno disuelto del sistema permite descender al 40%, tiempo en el cual el aire es encendido nuevamente. Por diferenciación en el cambio de oxígeno disuelto con el tiempo, el investigador es capaz de estimar la demanda biológica de oxígeno del sistema y, de esta forma, determinar los requerimientos de transferencia de oxígeno en un sistema de tratamiento de residuos dado. Este sistema es uno de los más comúnmente usados para obtener experimentalmente información necesaria para diseñar sistemas de aireación para sistemas continuos de tratamiento de residuos.

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SISTEMAS CONTINUOS A GRAN ESCALA – PRODUCCIÓN DE BIOMASA En general, el quimiostato o sistemas de quimiostato con reciclamiento son usados en la industria para producir proteína unicelular a gran escala. El objetivo de estos sistemas es simplemente maximizar la productividad de biomasa. En casos donde el sustrato es costoso, una segunda etapa puede ser adicionada con el objetivo adicional de maximizar simultáneamente la utilización de sustrato. En un sistema continuo de una sola etapa hay solo un grado de libertad. Como tal, uno no puede optimizar ambos, productividad celular y utilización de sustrato. Consecuentemente, es requerido un sistema de dos etapas.

SISTEMAS DE DESALOJOS REPETIDOS A GRAN ESCALA – PRODUCCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS Con respecto a la producción de metabolitos secundarios, dado que la mayoría de los sistemas celulares son altamente mutados y revierten a su forma silvestre, los sistemas de cultivo continuo han provisto generalmente una producción poco atractiva a gran escala de metabolitos secundarios. La producción de metabolitos secundarios es inducida, o el ambiente es controlado para optimizar la producción éstos, y el sistema es operado en una forma repetida de desalojos. De 4 a 10 desalojos ocurren en que del 20% al 40% del caldo es recolectado y reemplazado con medio fresco. (Fig. 3)

Esta clase de operación tiene varias ventajas. Permite controlar la viscosidad del caldo y así alcanzar una mejor transferencia de oxígeno. Además, la obstrucción de oxígeno puede ser uno de los requerimientos para iniciar un desalojo. También permite al operador aproximarse a un ambiente continuo o constante para el mantenimiento de los niveles de azúcar, concentración de sustratos nitrogenados, concentraciones de precursores a un nivel relativamente constante. Estas técnicas son comúnmente utilizadas en la industria de antibióticos, todavía es relativamente poco lo dicho en la literatura acerca de esta práctica.

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VASIJA EXTENDIDA O AIREACION MULTIETAPA CON SISTEMAS DE RECICLAJE – TRATAMIENTO DE DESECHOS En años recientes, los así llamados procesos de lodos activados han llegado a ser una forma muy popular de la remoción eficiente de la demanda biológica (DBO) de aguas residuales. Este es un sistema de cultivo continuo con un reciclaje de células o de lodos. El propósito del reciclaje es cimentar los niveles de concentración de biomasa activa tan altos, que una remoción volumétrica eficiente del DBO puede obtenerse. En un típico sistema multietapa (Fig. 4), el DBO del influente es alrededor de 100 a 200 mg de demanda de oxígeno por litro. Este es reducido a 90% -95% en el sistema. La velocidad de reciclaje es generalmente el 25% de la velocidad del influente. El clarificador opera para concentrar los lodos en un factor de aproximadamente 4. La concentración usual de lodos en la sección de aireación es de 2000 a 5000 mg de sólidos volátiles suspendidos (VSS) por litro.

Inicialmente se utilizaba una sola vasija de aireación (extendida) de una sola etapa (Fig. 5). En tales sistemas, mientras no se remuevan niveles volumétricos óptimos, es mucho menos susceptible al shock de carga o inhibición de remoción de la DBO debido a niveles altos de sustratos tóxicos. Uno de los problemas con tales sistemas es el que tienden a involucrar una biomasa que es filamentosa y no sedimenta demasiado bien.

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Hace aproximadamente 10 años, se encontró que usando oxígeno enriquecido, un mejor sedimento de los lodos se generaba, permitiendo operar a concentraciones más altas de biomasa y por tanto, velocidades de remoción de DBO volumétrico mayores. En la patente inicial de McWhirter 1970, el crédito de este comportamiento fue dado a las altas concentraciones de oxígeno. Mientras esto es correcto en parte, era descubierto más tarde por Casey y col. (1975), que no era el alto oxígeno disuelto el que estaba creando un buen sedimento de lodos, pero sí mas del que fue establecido. En particular, un corto estado primario, permitió a las células ser expuestas a altas concentraciones de sustrato. Esto minimizó la ventaja competitiva por el consumo de sustrato por mayor relación superficie / volumen de los organismos miceliales sobre la menor superficie a volumen de organismos no miceliales. Este último mostró mejores características de sedimento. Como consecuencia, más y más sistemas de lodos activados han sido diseñados como unidades multietapas. Ellas tienen de 5 a 10 etapas, con la primera etapa generalmente comprendiendo menos del 10% del volumen total del sistema. Esta práctica minimiza el volumen del clarificador requerido para una carga de DBO dada y asegura un sistema mucho más mejorado. El problema con los sistemas multietapas es que es susceptible a lo que la industria de desechos llama shock de carga, o la industria de fermentación llamaría inhibición por sustrato alto. Cuando esto es crítico, el diseño puede involucrar una vasija de retención adicional , mas el apropiado equipo de monitoreo, en principio, para reducir el shock. Una variante de la unidad multietapa ha evolucionado a lo que se llama estabilización de contacto. El reciclaje en este sistema, por ejemplo lodos concentrados, son aireados seguido de la clarificación (Fig. 6). La razón de esto es doble: 1) Los lodos reciclados que han sido expuestos a un ambiente anaeróbico en el clarificador donde la autolisis celular y el sangrado del BOD ocurrió. La reaireación es alcanzada para ayudar a activar los lodos prioritariamente mezclando con influente fresco, y 2) La reaireación minimiza lo que los lodos hacen para oxidar algo de el resangrado de DBO. Sin embargo, como la energía se hace más costosa, el costo de hacer esto se vuelve más prohibitivo. Por tanto, los sistemas de reaireación están siendo menos atractivos.

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SISTEMAS CONTINUOS MULTIETAPAS CON RECICLAJE INTERNO Y EXTERNO – DENITRIFIACCION En años recientes, ha habido presión para remover la demanda DBO nitrogenada como también, la DBO carbonada de aguas residuales extendiendo el tiempo de aireación en los sistemas. En un sistema de tratamiento de desechos propiamente diseñado, es posible remover más del 90% del DBO carbonado dentro de dos horas del tiempo de residencia. Seis o más horas de tiempo de residencia son necesarias para remover la demanda de DBO nitrogenado. En áreas donde cargas particularmente altas de DBO nitrogenado se encuentran sobre las superficies de aguas locales, los requerimientos de DBO se extienden para incluir oxidación nitrogenada, por ejemplo, la nitrificación. Sin embargo, debido a la preocupación de que los altos niveles de nitrato son dañinos para la salud, ha habido una demanda incrementada de mejorar también la desnitrificación. Esto debe ser hecho en un ambiente anóxico, en el cual el nitrato y el nitrito lleguen a ser una fuente de oxígeno para satisfacer la demanda biológica de oxígeno. Inicialmente, la remoción de BOD acoplado con la desnitrificación fue mejorada en un sistema doble con clarificación intermedia y dos biomasas diferentes. El primer sistema fue usado para nitrificar, y entonces clarificar, y el segundo sistema fue usado para remover los nitratos y nitritos en un ambiente anóxico. Esto se creyó necesario debido a que el amoníaco es un represor de la desnitrificación a niveles de 15 mg de amoníaco-nitrógeno equivalente. Este nivel excede en la mayoría de los sistemas de tratamiento de desechos. La dificultad con los dos sistemas separados es su inestabilidad y lo fácil de “lavarse”, si amplias variaciones en el flujo causan los sistemas de nitrificación para derramarse dentro de los sistemas de desnitrificación. También, los sistemas de desnitrificación requieren una fuente de energía carbonada para conducir los sistemas biológicos. Un sistema de cultivo continuo ingenioso ha evolucionado desde el trabajo de Barnard (1973), de Sudáfrica. El ha propuesto la reversión y combinación del sistema, por ejemplo, ubicando el sistema anóxico en frente del sistema aeróbico con un alto reciclaje interno del orden de 3 a 1 en principio para diluir los efectos de depresión del amoníaco (Fig. 7).

Este sistema de cultivo continuo es muy interesante desde el punto de vista del control. Hay ambos reciclajes interno y externo; debe ser un sistema multietapas; tiene ambas secciones aeróbicas y anaeróbica. En términos de estabilidad y dinámica, existe un

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número de cuestiones no resueltas en este sistema para los tecnólogos en fermentación interesados en la conducta del cultivo continuo.

REMOCION DE FOSFATO – SISTEMAS AEROBICO – ANAERÓBICO Una de las innovaciones más recientes en los sistemas de cultivo continuo es el sistema de tratamiento de desechos multietapa anaeróbico-aeróbico el cual ha sido operado en años pasados. (Fig. 9). El objetivo de este sistema no solamente es remover la DBO sino también la remoción efectiva de fosfatos. Estos sistemas fueron primeramente reportados por McLaren y Wood (1976) en Sudáfrica. Su conducta fue explicada por Spector (1977) en una patente estadounidense. Ellos operan bajo principio de selección ambiental.

Este sistema permite a aquellos organismos que pueden acumular polimetafosfato tener una ventaja selectiva sobre organismos que tienen consumo de sustrato manejado por ATP. Los organismos que acumulan polimetafosfato pueden almacenar grandes cantidades de este material el cual puede sustituirse por ATP en el transporte activo de glucosa y carbohidratos relacionados. De aquí que en la porción anaeróbica del sistema, ellos pueden tomar una gran cantidad de glucosa liberando fosfato inorgánico. Entonces, en la sección óxica, oxidan la glucosa y regeneran el polimetafosfato. La remoción del fosfato ocurre debido a que estos organismos en particular pueden acumular tanto como del 15% a 20% de su biomasa como polimetafosfato. Por lo que, el fosfato en las aguas residuales es removido vía deposición de lodos. Además para hacer el sistema más efectivo, uno tiene que controlar cuidadosamente los lodos de manera relativa a la demanda para remover el fosfato. Por control de la velocidad de aireación y al

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tamaño relativo de las secciones anaeróbica a la aeróbica, uno puede, en efecto, controlar tanto la DBO como la remoción de fosfato. El diseño de estos sistemas es difícil debido a que ellos deben operar bajo condiciones de velocidades de flujo del influente variantes y cargando DBO. Más aún, el reto de los sistemas de cultivo continuo es añadir desnitrificación a la remoción de fosfato (Fig. 10). La conducta cinética y dinámica de estos sistemas son virtualmente desconocidos y representan un tremendo reto para los tecnólogos de la fermentación industrial.

RESUMEN Los sistemas industriales de cultivo continuo han evolucionado en varios órdenes de magnitud, más complicados que el quimiostato, que es la herramienta de investigación básica de los tecnólogos de la fermentación. Los sistemas de cultivo continuo industriales a gran escala actuales involucran desalojos repetidos, sistemas multietapa, con reciclaje interno y externo, con reciclaje de concentración de células. Estos sistemas representan grandes retos para la fermentación. Debemos ser capaces de diseñarlos para mejorar satisfactoriamente bajo condiciones ambientales variantes tales como variación de las concentraciones de sustrato y velocidades de alimentación, y poder predecir la dinámica e inestabilidad de estos sistemas.

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PRODUCTO FINAL DIPLOMADO  

TRADUCCION DE UN ARTICULO USADO EN LA ASIGNATURA DE CULTIVO DE CELULAS.