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Dipartimento di Scienze della Vita e dell’Ambiente Corso di Laurea in Scienze Biologiche Insegnamento di Bioetica Dott. Massimiliano Marinelli

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Gli esordi delle cellule staminali umane e la terapia genica


Insegnamento di Bioetica

A cura di

Massimiliano Marinelli Progetto grafico e impaginazione

Jacopo Sabbatinelli

Logo “Medicina Narrativa� realizzato da

Andrea Brasili

Per maggiori informazioni

http://fb.me/Marinellibioetica postamarinelli@gmail.com

v. 1.0 del 23.05.2014 ad uso esclusivo degli Studenti

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Gli esordi delle cellule staminali umane e la terapia genica

Negli scorsi anni, si era proposto un articolo che riassumeva i principali temi sulle cellule staminali proponendo una chiave di lettura per quei risultati sperimentali che facevano balenare prospettive entusiasmanti, inaugurando l’era della Medicina Rigenerativa. Seguiva un articolo che tentava di indicare i problemi etici della terapia genica abbinata o no alle cellule staminali. Attualmente gli articoli sono scientificamente datati e alcuni problemi superati, tuttavia, si ritiene che possano essere proficuamente letti come la storia dei primi lavori scientifici sulle cellule staminali e dei problemi della terapia genica.

Il dibattito sulle cellule staminali umane Premessa Il dibattito in corso sulle cellule staminali umane è del tutto singolare poichÊ riassume i principali temi scientifici ed etici della biotecnologia.

I temi scientifici In questi ultimi anni la plasticitĂ  del DNA ha reso la Biologia e la Genetica le piĂš antidogmatiche fra le scienze umane. Sembra che il DNA e, del tutto

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recentemente, anche l’RNA 1 si facciano beffe dei tentativi di essere ingabbiati in anguste costruzioni teoretiche. Si era appena digerito il fatto che il contenuto nucleare di una cellula somatica, inserito in una cellula uovo denucleata, potesse dare origine ad un embrione 2, ed ecco profilarsi con la transdifferenziazione l’eventualità che una cellula staminale adulta possa “ricombinare il suo DNA” e dare origine a cellule specializzate differenti da quelle per le quali era destinata 3. Inoltre, i Progetti Genoma, umano 4, del topo 5 e dello scimpanzé 6 proiettano nel prossimo futuro dell’umanità un enorme ed inquietante data base di DNA comparato, dove chiunque navighi in internet potrà valutare similitudini, uguaglianze e funzioni 7.

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Per alcuni genetistici negli organismi pluricellulari la maggior parte delle molecole di RNA giocano un ruolo di primo piano nella regolazione genica. CFR Dennis C., The Brave new world of RNA, Nature 418 11 luglio 2002 122-124. Wilmut L, et al viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells Nature 385, 810-813 1997 Vescovi et al The neural stem cells and their transdifferentiation capacity. Biomed Pharmacoter. 55 2001 maggio 201-205 International Human Genoma Sequencing Consortium Initial sequencing and analysis of the human genome nature 409, 860 - 921 (2001) Mouse Consortium Sequencing Genome, Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome Nature 420, 520 - 562 (2002, Olson MV Varki A., sequencing the chimpanzee genome: insights in to human evolution and disease. Nature genetics 4 gennaio 2003 20-28 Per quanto riguarda la funzione dei geni, recentemente un database completo dei geni del Caenorhabditis elegans è stato trascritto in operon: le forme di organizzazione dei geni presenti nei batteri e negli archaea dove co-regolano geni che codificano proteine che agiscono nella stessa via metabolica. CFR Blumentahal T., Gleason KS., caenorhabdtis elegans operons: form and funciotn nature genetics v 4 febbraio 2003 110-118

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Contemporaneamente agli studi che dimostrano la plasticità delle cellule staminali adulte e che renderebbero, quindi, meno importante l’utilizzo della cellula staminale embrionale derivata dalla blastocisti 8, partono due linee di ricerca antitetiche. Da una parte si salta il fossato che divide la ricerca di base da quella clinica, dando l’avvio alle prime sperimentazioni sull’utilizzo delle cellule staminali adulte del midollo osseo in soggetti affetti da infarto del miocardio 9, dall’altra emergono dei risultati che, in qualche modo, mettono in discussione il meccanismo di transdifferenziazione 10. Il dibattito scientifico è avvincente e si attende l’uscita dell’ultimo numero di Nature o di Science con quella aspettativa dolcemente ansiosa, più consona all’attesa di un giallo a puntate che di una rigorosa rivista scientifica. Tuttavia, come è caratteristica dell’età biotecnologica, il dibattito tracima dall’alveo scientifico per inondare i mezzi di comunicazione sociale, prospettando soluzioni terapeutiche innovative e occhieggiando sorridente alla nascita e ai fasti di una nuova Medicina Rigenerativa 11.

Thomson J,W et al derivation of pluripotent stem cells survive from human blastocystis. Science 282, 1145-1147 1998. 9 Bodo E. et al Repair of Infarcted Myocardium by Autologous Intracoronary Mononuclear Bone Marrow Cell Transplantation in Humans, Circulation. 2002;106:1913 10 Pearson H., articles of faith adulerated nature 420 dicembre 2002 734-735. 11 Ringe J et al Stem cells for regenerative medicine:advances in the engineering of tissue and organs. Naturwissenschaften 2002 augusto 89 (8) 338-51 Tsonis PA., regenerative biology: the emerging filed of tissue repair and restoration. Differentation 2002 ottobre 70 (8) 397-409. Le Belle JE. Et al. Stem cells for neurodegenerative disordiners: where can we go from here? BioDrugs 2002 16(6) 389-401. 8

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Il dibattito scientifico si intreccia, quindi, con la portata sociale della scoperta scientifica, con i suoi possibili ritorni economici e con gli interrogativi etici che inevitabilmente sorgono quando si fa ricerca biologica di frontiera.

I temi etici Si tratta di riflettere sull’utilizzo nell’uomo delle applicazioni provenienti dal progresso tecnologico nell’ambito della Biologia e della Genetica con i loro studi sui tessuti e sui modelli animali ingegnerizzati. La domanda è lecito fare tutto il fattibile? attende risposta. Inoltre si deve tener conto delle grandi speranze terapeutiche sollevate dagli studi che si dispongono nella coscienza a mo’ di imperativo etico, sbaragliando ogni ulteriore perplessità. Ogni titubanza deve annichilire di fronte a tali benefici per l’umanità. Di questo avviso è l’editorialista del New England Journal of Medicine che parla chiaramente di miopia legislativa nell’ambito delle cellule staminali 12. Nel breve editoriale, l’autore invoca due elementi a favore della ricerca sulle cellule staminali umane: in primo luogo, i benefici terapeutici che possono derivarne e in secondo luogo il fatto che se la ricerca non andrà avanti negli USA sarà certamente praticata in altri luoghi, relegando gli scienziati americani agli angoli del progresso scientifico e non al centro dell’azione. Inoltre si paragonano gli attuali dubbi sull’eticità della ricerca con quelli

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Drazen J.M., Legislative myopia on Stem Cells, N Eng J Med 349:3 2003 300

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scaturiti all’inizio dell’era del DNA ricombinante, dimenticando che in quel caso non si trattava di manipolare alcun embrione umano. La saga delle cellule staminali umane rivela l’intreccio inestricabile tipico dell’era biotecnologica che si genera tra i brevetti a scopo commerciale, le scoperte scientifiche e il clamore dei media. La scienza biotecnologica appare sempre più Ricerca & Sviluppo, Mercato & Spettacolo. La presenza concorrenziale di differenti strategie terapeutiche tecnologiche da utilizzare per la medesima patologia solleva la domanda: quali sono i criteri che regolano le scelte tecnologiche? L’instabilità di concetti e di archetipi, traballanti sotto le ondate del progresso biotecnologico, rende difficile trovare le parole giuste per focalizzare la riflessione etica in modo chiaro ed inequivocabile. Il pensiero etico arranca dietro i fatti biotecnologici.

La saga delle cellule staminali umane Si può far iniziare la storia delle cellule staminali nel 1965 con gli studi in vitro praticati a Cambridge dal gruppo di Edwards. Negli studi su cellule disaggregate, provenienti da embrioni di mammiferi ad uno stadio di sviluppo prima del loro impianto in utero, furono isolate linee cellulari che differivano radicalmente dalle normali cellule somatiche. Queste

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cellule embrionali possedevano larghi nuclei, distinti nucleoli e mostravano una lunga vita e una stabilità attraverso le generazioni successive 13. Nel corso di questi studi sulla fecondazione artificiale, il gruppo di Edwards successivamente sviluppò la tecnica di fecondazione in vitro (FIV) con la crescita della prima blastocisti umana in vitro 5 giorni dopo l’inseminazione (1971) e con la nascita della prima bambina concepita in vitro (1978). 14 Nel corso degli anni divenne chiaro che le cellule staminali embrionali, isolate dalla massa cellulare interna di una blastocisti di mammifero, possedevano delle caratteristiche del tutto particolari ed erano pluripotenti. Nel 1981 linee cellulari staminali del topo dimostrano la loro capacità di differenziarsi sia in vitro, sia in vivo dopo l’inoculazione in un topo; esse hanno un normale cariotipo 15. Nel 1998 sono isolate e studiate le prime cellule staminali embrionali umane (hES) 16. Le caratteristiche essenziali delle hES sono: 

pluripotenza

capacità di automantenimento (self-renewing capacity)

Cole R. Edwards RG Dev Biol 13 285-407 1967 Edwards RG IVF and the hystory of stem cells nature 413 27 settembre 2001 349 15 Evans M.J., Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 292 9 luglio 1981 154-156 16 Thompson JA et al Science 282, 1145-1147 1998 13 14

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espressione della telomerasi 17

normale cariotipo

Le cellule hES sono pluripotenti: esse possono costituire virtualmente ogni cellula del corpo. In particolare esse sono in grado di formare ognuna delle linee cellulari, includendo l'epitelio cutaneo (endoderma), il tessuto cartilagineo, l'osseo e quello muscolare liscio e striato (mesoderma), il tubo neurale, i gangli embrionali e l'epitelio squamoso stratificato (ectoderma). Le altre cellule staminali umane, appartenenti ad uno stadio più avanzato di maturazione cellulare, avrebbero 18 solo una limitata capacità di formare alcune cellule: come le cellule del tessuto sanguigno (CD34+ stem cells), il tessuto connettivo o il tessuto nervoso a seconda di quanto originariamente era deputata quella cellula staminale. Le cellule hES, sotto appropriate condizioni in vitro, sono in grado di ripopolare se stesse mentre rimangono in uno stadio indifferenziato.

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Il telomero si trova in ogni parte finale del cromosoma. I telomeri contengono ripetizioni di sequenze nucleotidiche che permettono alla parte finale del dna del cromosoma di essere duplicato, risolvendo così il problema dato dal fatto che la dna polimerasi sintetizza il dna solo nella direzione 5’  3’. La telomerasi contiene un piccolo pezzo di RNA che esprime la sequenza complementare del dna. Negli esseri umani la sequenza che si ripete è GGGGTTA. L’uso del condizionale è d’obbligo considerato il concetto di plasticità (transdifferenziazione) delle cellule staminali che vedremo successivamente e che nel lavoro del 1998 di Thomson non era ben evidenziato.

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Non è possibile mantenere a lungo questa capacità di autoripopolazione nelle colture delle altre cellule staminali umane. L'abilità delle cellule hES di propagarsi indefinitamente nello stadio indifferenziato, senza perdere la loro pluripotenza le distingue dalle altre cellule staminali multipotenti ritrovate nell'uomo. La telomerasi è una DNA polimerasi ed è l'enzima che una volta riattivato nelle cellule normali ne permette la continua proliferazione. Le cellule hES esprimono normalmente l'enzima telomerasi. La continua attività della telomerasi dà alle cellule hES la loro immortalità replicativa. Le altre cellule staminali esprimono la telomerasi a bassi livelli o solo periodicamente. I lavori sulle cellule staminali embrionali e sulle cellule staminali adulte si succedono ed oggi la cellula staminale si pone al centro di numerosi programmi scientifici di ricerca.

Le cellule staminali embrionali Tra i lavori scientifici che hanno applicato la tecnologia delle cellule staminali embrionali, spicca per importanza quello di Kim che ha sviluppato un metodo per aumentare l’efficienza delle ES nella produzione di neuroni

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dopaminergici, dimostrando che questi neuroni possono integrarsi nei tessuti dell’ospite 19. Mediante una brillante procedura a cinque stadi di sviluppo, le ES possono efficacemente generare precursori mesencefalici e neuroni dopaminergici. Una volta inseriti nel corpo striato di modelli di topi parkinsoniani, le cellule TH+ derivate dalle cellule staminali embrionali di topo rilasciano dopamina, sviluppano

sinapsi

funzionali

e

mostrano

le

tipiche

proprietà

elettrofisiologiche dei neuroni mesencefalici. Quando gli animali trattati sono stimolati con anfetamina il gruppo di topi trattato in forma simulata rivela il deficit motorio parkinsoniano, mentre il gruppo di topi trattato con le cellule provenienti dalle ES rileva un recupero della funzionalità motoria. Questo studio dimostra la possibilità che la tecnologia delle cellule staminali embrionali è fattibile e può recare benefici clinici in una patologia come quella parkinsoniana indotta nel topo. Naturalmente esistono dei problemi insoluti come quello di correlare il numero delle cellule dopaminergiche alla risposta clinica. Inoltre non può essere esclusa la possibilità che le cellule derivate dalle ES continuino a dividersi in vivo producendo tumori (per esempio teratomi).

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Kim JH et al. Dopamina neurons derived from embryonic stem cell function in an animal model of Parkinson’s disease. Nature 418 jule 2002 50-56

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Un altro problema tecnico che si presenta nel possibile uso delle hES è quello del rigetto. Le cellule derivate dalle hES una volta inserite nei tessuti dell’ospite possono causare il rigetto del trapianto. Dal punto di vista teorico, sono possibili differenti strategie per superare tale problema. In primo luogo si è visto che per quanto riguarda gli studi con animali è sufficiente una blanda terapia immunosoppressiva per impedire la reazione di rigetto. Inoltre la conoscenza della espressione antigenica sulla superfice cellulare del sistema immunitario e delle cellule staminali permette la creazione di Ac monoclonali capaci di legarsi ai recettori delle cellule immuni. 20 Infine potrebbe essere possibile ingegnerizzare le ES per renderle invisibili al sistema immune sino al trasferire l’intera sequenza MHC (complesso maggiore di istocompatibilità) dell’ospite nel genoma delle ES. 21

La clonazione terapeutica di un embrione umano Le strategie per superare la reazione di rigetto presentano tuttavia importanti effetti collaterali (terapia immunosoppressiva) e ostacoli tecnici difficili da superare in tempi brevi (Ac monoclonali, ingegneria genetica).

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Honey K. Et al H Immunol. Res. 20, 1-14 1999 Panacea or Pandora’s box Nature 408 dicembre 2000 897-898

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La clonazione terapeutica di un embrione umano intenderebbe superare tali problemi rendendo disponibile una cellula staminale pluripotente con un corredo cromosomico identico a quello del donatore-ricevente. Nel lavoro scientifico riportato da Cibeli Lanza e West 22, le cellule somatiche dei donatori sono fibroblasti adulti, isolati mediante biopsie dell’epidermide di 3mm, praticate su volontari sani consenzienti. Inoltre si sono utilizzate cellule somatiche del cumulus che circondano l’ovocita. Le cellule somatiche dopo essere state incubate, sono state enucleate mediante un dispositivo piezoelettrico capace di minimizzare i possibili danni generati dalla procedura. Il nucleo delle cellule somatiche, isolato mediante suzione, è stato immediatamente iniettato nel citoplasma dell’ovocita denucleato. 35-45 ore dopo una stimolazione esogena con hCG, gli embrioni precoci 23 sono stati stimolati mediante incubazione in alcune sostanze e messi in coltura per 72

Cibelli Lanza West The Journal of Regenerative Medicine somatic cell nuclear transfer in humans: pronuclear an early embryonic development. 25 novembre 2001. 23 Nell’articolo esiste un’ambiguità semantica che accompagna la sperimentazione non riuscendo a definire come si chiami la cellula uovo denucleata quando si è iniettato il nucleo di una cellula somatica. Gli autori parlano genericamente di ovocita e successivamente dicono che gli ovociti dopo qualche giorno assomigliano a degli embrioni. E’ chiaro che l’embrione è una cellula uovo con un corredo diploide, ma la sperimentazione intende dimostrare proprio questo e cioè che una cellula uovo con un corredo diploide può diventare un embrione. L’ambiguità semantica deve far riflettere, sia perché i fatti scientifici biotecnologici sono così nuovi da non essere compresi nei comuni vocabolari scientifici, sia perché utilizzare il termine ovocita o embrione non è moralmente indifferente. 22

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h a 37°. Al 4° giorno, “le uova che assomigliano a degli embrioni” sono state poste in un’altra cultura sino a 7 giorni dopo l’attivazione. La clonazione terapeutica di un embrione in ovuli di coniglio Nel 2003 Chen ed altri pubblicano una sperimentazione nella quale il trasferimento nucleare di una cellula somatica avviene in un ovulo di coniglio 24. Gli ovociti sono stati prelevati da coniglie della Nuova Zelanda sottoposte ad superovulazione mediante trattamento con gonadotropina corionica umana. Gli ovociti poi sono stati denucleati. Le cellule somatiche scelte sono state dei fibroblasti provenienti da 5 donatori: due bambini di 5 anni, due uomini di 42 e 52 anni e una donna di 60 anni. Ogni cellula è inserita nello spazio perivitellino del singolo oocita denucleato. Il complesso fibroblasto/oocita in seguito è sottoposto ad elettrofusione e messo in coltura. Una percentuale di tali complessi si è sviluppata sino allo stadio di blastocisti. Nel lavoro si è visto h la percentuale di unità di trasferimento nucleare che vanno verso uno sviluppo precoce è influenzata dall’età del donatore, mentre una volta sviluppatesi allo stadio di 2-4 cellule non c’è una differenza statisticamente significativa nello sviluppo della blastocisti tra i quattro gruppi di età.

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Chen Y. et al. Embryonic stem cells genrated by nuclear transfer of human somatic nuclei into rabbit oocytes, Cell research ; 13 (4) :251-264 2003

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Una valutazione del cariotipo in un complesso di due cellule in metafase ha dimostrato un cariotipo apparentemente normale umano. Per isolare le cellule staminali embrionali, la massa interna è stata isolata e posta in coltura on fibroblasti di topo. Dopo alcuni giorni di coltura sono emerse delle colonie con caratteristiche tipiche delle ntES cells. In due anni sono stati portati a termine 289 esperimenti di trasferimento nucleare ottenendo 2418 unità nt costituite dalla fusione di un oocita di coniglio fuso con un fibroblasto umano. Il 44,9% di tali unità sono sopravvissute alla elettrofusione, ottenendo una blastocisti nel 14.5% dei casi. 2 terzi delle blastocisti sono state usate per isolare le ntES cells. Analisi iniziali dimostrano che DNA mitocondriale del coniglio e dell’uomo coesistono nelle cellule embrionali. Utilizzando fattori di crescita, sembra che le ntEScells possano differenziarsi in nelle cellule dei tre foglietti ectoderma mesoderma ed endoderma. Le ntES sembrano possedere la maggior parte delle proprietà delle hES cells. Ulteriori sperimentazioni sono necessarie per provare che le ntES hanno le stesse potenzialità di sviluppo delle hES. Il lavoro scientifico si è mosso in accordo con le linee guida sulle sperimentazioni sulle cellule staminali umane del Comitato di Bioetica del Centro Cinese del Genoma Umano. Le linee guida proibiscono la clonazione umana riproduttiva, ma permettono la ricerca sul trasferimento nucleare di cellule somatiche (SCNT) negli esseri umani allo scopo di derivare cellule staminali pluripotenti dalle cellule

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somatiche. Le linee guida permettono l’utilizzo di oociti animali in SCNT umane a scopo di ricerca, ma proibiscono l’applicazione di queste cellule per uso umano. Le linee guida proibiscono la combinazione di gameti animali con quelli umani, lo sviluppo di unità nt superiore a 14 giorni e l’introduzione di unità nt nell’utero di altre specie. I tessuti usati per gli esperimenti di SNCT devono essere ottenuti con il consenso dei donatori. 25

La sperimentazione sud coreana Nel 2004 il team di ricercatori di Seul condotto dal veterinario e biologo Woo Suk Hwanera riesce a ricavare cellule staminali da un embrione umano di nemmeno una settimana. Nel 2005 26 hanno raccolto 185 cellule uovo umane da 18 donatrici volontarie. Ne hanno estratto i cromosomi e al loro posto hanno inserito il materiale genetico degli undici pazienti, prelevato da una normale cellula della pelle. La cellula uovo con il nuovo DNA ha cominciato a comportarsi come se fosse stata fecondata da uno spermatozoo. Ha dato vita a un embrione che dopo 4-6 giorni ha raggiunto lo stato di blastocisti con circa 150 cellule al suo interno, fra cui le preziose staminali. Estratte e fatte moltiplicare in laboratorio, queste cellule sono state trasformate in tessuto delle ossa, dei muscoli e della pelle. Essendo dirette eredi degli undici pazienti (contengono in toto il loro DNA) non ci si aspettano problemi di rigetto al momento del trapianto.

Chen Y. et al. Embryonic stem cells generated by nuclear transfer of human somatic nuclei into rabbit oocytes, Cell research ; 13 (4) :261, 2003 26 Gretchen Vogel, Science 20 May 2005: 1096-1097 25

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La cellula staminale adulta Per superare gli scogli etico-scientifici dell’uso di embrioni umani per isolare e coltivare cellule staminali, è stato proposto l’utilizzo delle cellule staminali adulte umane. Le cellule staminali adulte sono cellule multipotenti che non hanno completato il loro programma di differenziazione. Queste cellule assicurano una riserva autorinnovantesi il cui destino è rigenerare i tessuti nei quali risiedono in risposta sia al fisiologico turn over cellulare, sia agli eventuali danni tessutali inflitti. Le cellule staminali adulte umane sono da tempo in uso per la terapia di determinati disordini linfoproliferativi. Negli ultimissimi anni sperimentazioni su cellule staminali adulte di animali avrebbero dimostrato inaspettatamente un fenomeno denominato transdifferenziazione (o plasticità staminale). Storicamente si riteneva che le cellule staminali fetali e adulte (somatiche) fossero entità tessuto-specifiche la cui potenzialità differenziativa era limitata alla generazione delle cellule mature del tessuto nel quale risiedevano. Vescovi 27 ha dimostrato che uno dei più impressionanti attributi delle cellule staminali somatiche è la capacità di subire una transdifferenziazione e, quindi, di originare cellule differenziati di tessuti ed organi differenti da quelli nei quali esse risiedono. Nel lavoro di vescovi la cellula staminale neurale è

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Vescovi ALet al The neural stem cells and their transdifferentation capacity Biomed Pharmacoth. 2001 maggio 56(4): 179-185

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risultata capace di transdifferenziarsi in cellule che originariamente provengono dal mesoderma come le cellule ematopoietiche e quelle del sistema muscolo scheletrico. In estrema sintesi, quindi, le cellule staminali provenienti da un compartimento tessutale (per esempio quello emopoietico) possono svilupparsi nelle cellule differenziate tipiche di altri organi come il fegato, il cervello il rene 28. Risulta chiaro che la plasticitĂ  delle cellule staminali adulte si pone in diretta concorrenzialitĂ  con la tecnologia delle cellule staminali embrionali umane per la leadership della medicina rigenerativa il nuovo campo di attivitĂ  capace di riparare i tessuti, sia attraverso il trapianto, sia attraverso la costruzione di tessuti bioartificiale, sia attraverso la stimolazione in vivo del processo rigenerativo delle cellule staminali residenti 29.

Le cellule staminali adulte del cordone ombelicale Il sangue del cordone ombelicale rappresenta una importante fonte per le cellule staminali emopoietiche e per le progenitrici e trapianti di sangue del cordone ombelicale sono stati usati nella terapia per diverse patologie 30. Le

Forbes S.J. et al adult stem cell plasticity: new pathways of tissue regeneration become visible, Clin Sci. 2002 0ttobre 103 (4) 365-369 29 Stocum DL., stem cells in regenerative biology and medicine Wound Repair Reegen 2001 nov-dic; 9 (6): 429-442. 30 E. Gluckman et al., "Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling," New England Journal of Medicine, 321:1174-1178, 1989. 28

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cellule staminali possono essere recuperate anche dopo 15 anni di criopreservazione 31. Recentemente un gruppo di ricercatori del National Cardiology Research di Mosca è riuscito ad isolare elementi staminali simil mesenchimali dalla parete subendoteliale della vena del cordone ombelicale. Queste cellule che presentano alcuni marker cellulari mesenchimali potrebbero rappresentare una fonte alternativa di cellule staminali mesenchimali (MSCs) per studi sperimentali o per necessità cliniche 32. Le MSCs sono cellule staminali importanti che si trovano soprattutto nel midollo osseo, ma il loro numero si riduce di molto con l’età. Esse hanno la capacità di supportare l’emopoiesi e di differenziarsi in varie linee cellulari (osteogenica, adipogenica, condrogenica) compresso quella miogenica e cardiomiogenica. Esse inoltre presentano un profilo immunitario particolare, non inducendo una decisa risposta immunitaria.

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H.E. Broxmeyer et al., "High efficiency recovery of functional hematopoietic progenitor and stem cells from human cord blood cryopreserved for 15 years," PNAS, DOI/10.1073/pnas.0237086100, December 30, 2002. Romanov Y. et al., Searchinf for alternative sources of postnatal Human Mesenchymal Stem Cells: candidate MSC-like cells for umbilical cord., Stem cells 2003; 21:105-110.

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La cellula staminale emopoietica I lavori scientifici si sono appuntati su una cellula staminale adulta particolare, estremamente interessante per gli eventuali utilizzi terapeutici. Si tratta della cellula staminale adulta emopoietica (HSC). La conoscenza di base della biologia delle HSCs è importante sua per comprendere le origini delle varie leucemia, sia per sviluppare strategie per una efficace espressione genica in queste cellule. Le HSCs possono essere isolate nel midollo osseo, nel sangue periferico o nel sangue del cordone ombelicale. Le HSCs presentanto delle caratteristiche che le individuano operativamente: esse sono CD34+ Lin-, c-kit e Thy-1 Non esprimono CD38. Tali caratteristiche definiscono operativamente una popolazione cellulare HSCs che nell’uomo si trova in una percentuale che varia da 1:200 a 1:500 33. Si è visto che nel topo le HSCs hanno la potenzialità di generare linee cellulare non emopoietiche. In questo studio 34 è stata documentata la presenza di epatociti e il ripristino della funzione epatica in topi trapiantati con cellule con caratteristiche tipo HSCs.

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34

Verfaille CM., hemapoietic stem cells for transplantion nature immun 3 (4) aprile 2002 314 Dorshkind K. Multilienage development from adult bone marrows cells Nature Immunol 3 (4) aprile 2002 311-313

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Tali risultati modificherebbero il concetto che la differenziazione verso il tessuto specifico sia stabilita precocemente durante l’embriogenesi una volta per tutte. Tuttavia il fatto che cellule non emopoietiche possano essere generate da cellule presenti nel Midollo Osseo non indica, di per sé, che esse derivino dalla HSCs. Ciò è vero soprattutto quando si utilizza per l’infusione una frazione intera del midollo osseo. Tra le ipotesi che si possono fare, si evidenziano le seguenti: a) Eterogeneità delle popolazioni HSCs Non c’è dubbio che le varie popolazioni di HSCs arricchite siano capaci di generare sia le cellule del compartimento emopoietico, sia determinate cellule di derivazione non emopoietica. Può essere utile considerare la possibilità che nonostante il rigore del protocollo nel separare le cellule, la popolazione sia eterogenea e contenga sia HSCs, sia progenitori di altre linee cellulari. Il midollo osseo, per esempio, contiene progenitori (cellule stromali, cellule staminali mesenchimali) capaci di generare una varietà di tessuti non emopoietici: adipociti, condrociti, osteoblasti e mioblasti. Non è contradittorio pensare che il midollo osseo possa contenere anche progenitori endodermici capaci di contribuire alla differenziazione di cellule del sistema gastrointestinale.

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Se queste cellule esistono le loro proprietà fisiche e fenotipiche potrebbero risultare compatibili con quelle delle HSCs. È necessaria, quindi, una rigorosa analisi clonale delle popolazioni HSCs. b) il ruolo dell’ambiente Un’altra

ipotesi

può

essere

quella

che

le

HSCs

subiscano

la

transdifferenziazione. La cellula staminale sarebbe in grado di riprogrammare il suo genoma grazie al ruolo ambientale. L’ambiente, infatti, può giocare un ruolo critico nel determinare le linee cellulari generate da una cellula che subisce una transdifferenziazione. Le HSCs circolanti, per esempio, possono presentarsi in tessuti non emopoietici come quello muscolare o epatico. Se queste cellule esprimono recettori appropriati, i segnali microambientali proveniente da tessuti possono influire e determinare il destino della cellula staminale. Tali segnali potrebbero essere mediati da contatti tra cellule e cellule, oppure attraverso fattori solubili e la loro produzione potrebbe essere accentuata in risposta ad un danno tessutale. Il dibattito sulla reale capacità di transdifferenziazione della cellula staminale adulta è tuttora in corso 35 e le ipotesi sul tappeto consigliano prudenza prima di passare a sperimentazioni cliniche sull’uomo.

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Pearson H., articles of faith adulerated Nature 420 Dicembre 2002 734-735.

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Cellule staminali adulte e cardiologia Tuttavia la fiducia nella capacità di transdifferenziazione delle cellule staminali adulte e, in particolare, della cellula staminale emopoietica è stata tale da produrre i primi lavori scientifici sull’uomo. Dopo gli studi sul topo 36, reiterati anche dopo i primi dubbi sulla transdifferenziazione 37 la possibilità che cellule staminali emopoietiche, iniettate in un area miocardica infartuata, potessero differenziarsi in cardiomiociti e ripristinare un tessuto muscolare cardiaco funzionale 38 ha portato alla pubblicazione dei primi report e dei primi studi sull’uomo. Il primo report risale al luglio 2001 39 nel quale si annuncia che un paziente al quale erano state infuse cellule staminali emopoietiche direttamente nel muscolo cardiaco in una procedura di bypass aorto coronarico, dopo due settimane stava bene. In uno studio successivo 40 dopo la terapia standard per l’infarto acuto, dieci soggetti hanno avuto un trapianto di cellule mononucleate autologhe provenienti dal midollo osseo, introdotte mediante un catetere nella arteria lesa durante la dilatazione dell’angioplastica percutanea.

Orlic D. et al Nature 410 701-705 2001 Liu Y, Rao MS. Transdifferentation-fact or artifact., J cell Biochem 2003; 88 (1): 29-40 38 Penn MS et al, Autologous cell transplantantion for the treatment of damaged myocardium. Prog Cardiovasc Dis. 2002 luglio agosto 45(1) 21-32 39 Si tratta di una notizia di fonte Reuter da parte di Gustav Steinhoff and Mathias Freund presso la Clinica di Chirurgia cardiovascolare di Rostock, North-East Germany. 40 Bodo E. et al Repair of Infarcted Myocardium by Autologous Intracoronary Mononuclear Bone Marrow Cell Transplantation in Humans, Circulation. 2002;106:1913. 36 37

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Un secondo gruppo di 10 pazienti con infarto del miocardio è trattato solo con la terapia standard. Al follow up dopo tre mesi la regione infartuata appare più ridotta rispetto a quella dei soggetti non trattati con il trapianto cellulare. Inoltre alle indagini cardiologiche successive il gruppo del trapianto cellulare ha mostrato un significativo miglioramento negli indici di funzionalità cardiaca. Gli autori concludono affermando che i risultati dimostrano per la prima volta che il trapianto intracoronarico selettivo di cellule mononucleate autologhe del midollo osseo è sicuro e sembra essere efficace sotto condizioni cliniche. Il marcato effetto terapeutico può essere attribuito alla generazione del miocardio e alla neovascolarizzazione associate al trapianto cellulare. Il miglioramento degli indici di funzionalità cardiaca sembra avvenire anche quando si infondono cellule progenitrici circolanti come è stato dimostrato in uno studio pubblicato recentemente 41. La ricerca, iniziata nell’ottobre 2001, prevedeva il reclutamento di 20 pazienti per il gruppo di trattamento con cellule staminali, e 20 per il gruppo con cellule progenitrici. È stata fatta una analisi ad interim dei dati per i primi 20 pazienti che hanno completato il follow up di 4 mesi. I dati riportati, quindi, si riferiscono a tale numero di pazienti.

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Assmus B., et al. Transplantation of progenitor cells and regeneration enhancement in acute myocardial infarction Circolation 10 dicembre 2002 3009-30017.

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20 soggetti affetti da infarto acuto sono stati riperfusi mediante stent coronarico e randomizzati dopo 24 ore dall’infarto per ricevere infusione intracoronarica di cellule provenienti dal midollo osseo o progenitrici circolanti (CPCs). Le CPCs sono state ottenute da 250 ml di sangue venoso. Dopo 3 giorni di coltura la sospensione cellulare risultante conteneva una popolazione eterogenea di cellule progenitrici emopoietiche. Più del 90% delle cellule mostravano caratteristiche endoteliali. Anche le cellule monucleate derivate dal midollo osseo (BMCs) sono risultate una popolazione eterogenea: un valore medio di 7.35+- 7.31 x 106 di cellule CD34/CD45+ sono state infuse ad ogni paziente. Non si sono trovate differenze significative tra i due gruppi di pazienti, non ci sono stati segni di infiammazione (conta leucocitaria, PCR) e la troponina T è scesa indicando che la procedura per se stessa non ha causato ulteriore danno ischemico. La funzione del ventricolo sinistro è migliorata al follow up di 4 mesi in tutte e due gruppi, mentre è rimasta invariata in un gruppo non randomizzato di controllo. Nessun paziente ha presentato aritmie maligne che rappresentano una grande limitazione all’infusione di mioblasti scheletrici direttamente nel miocardio

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Gli autori affermano che il trapianto di cellule progenitrici mediante infusione intracoronarica è fattibile e sicura in pazienti con infarto miocardico acuto. Non esiste differenza tra l’uso di cellule staminali e cellule progenitrici. Si suggerisce che il miglioramento della funzione ventricolare sia dovuto allo stimolata neoangiogenesi che previene il rimodellamento cardiaco attraverso un miglioramento della perfusione sanguigna miocardica, limitando così la apoptosi dei miociti e riducendo il deposito di collageno e la formazione di tessuto cicatriziale. Sulla possibilità che le cellule staminali emopoietiche possano rigenerare miocardio ex novo, gli autori non escludono che anche le CPCs possano portare alla rigenerazione di miocardio dopo l’infarto. Gli autori sono consapevoli che il limite maggiore di questo studio pilota è la mancanza di un gruppo di controllo randomizzato che non riceva l’infusione intracoronarica di cellule progenitrici. La stimolazione del microambiente La linea di ricerca del Prof. Piero Anversa propone la stimolazione dell’ambiente cardiaco nel tentativo di stimolare la proliferazione e la differenziazione delle cellule staminali cardiache che potrebbero trovarsi in punti del cuore poco esposti a forti stress emodinamici come gli atri 42. Se si iniettano fattori di crescita nel cuore infartuato di un topo si crea una condizione favorevole al ripopolamento dell’area necrotica con cellule

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Cellule Staminali n. 24 13 dicembre 2002

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staminali provenienti dall’atrio. Il nuovo tessuto contiene anche vasi sanguigni. La ricerca scientifica di Piero Anversa è approdata ad altri risultati presentati nella rivista Cell del mese di settembre 2003. Nei ratti è stato possibile la determinazione e la coltura di tali cellule confermando la loro staminalità. 43 I lavori scientifici sulle cellule staminali cardiache proseguono e esistono le prime evidenze che la cessazione del funzionamento delle cellule staminali cardiache possa essere una delle cause dell’invecchiamento del cuore.

La terapia genica e le cellule staminali Tutti i vettori virali e sintetici sviluppati per la terapia genica sono stati testati nelle HSCs: la maggior parte dei dati, tuttavia, sono ottenuti utilizzando vettori virali, soprattutto onco-retrovirus murini. Questi vettori integrano permanentemente il gene trasferito nel genoma della cellula ospite che deve mantenere l’espressione genica durante la proliferazione, la differenziazione e la maturazione in tutte le linee cellulari. Poiché le HSCs immature sono naturalmente quiescenti per la trasduzione del gene è necessaria la divisione cellulare. Per superare tale ostacolo, è necessario indurre la divisione cellulare, preservando la capacità di autorinnovamento delle cellule staminali e la loro potenzialità di espandersi e di differenziarsi in tutte le linee cellulari del tessuto emopoietico.

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Cellule staminali n 44 19 settembre 2003.

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Le ricerche su modelli animali di trasferimento genico di HSCs hanno utilizzato fattori di crescita in varie combinazioni con o senza l’uso di cellule stromali per favorire l’efficienza nel trasferimento del gene, preservando le potenzialità delle cellule staminali. La terapia genica con le cellule staminali è solo agli inizi. La sola dimostrazione che la terapia genica con cellule staminali possa riparare clinicamente un difetto genico proviene dagli studi in bambini con SCID 44. Le cellule staminali che evolvono nella linea linfoide hanno dei vantaggi legati al fatto che un numero estremamente basso di cellule geneticamente modificate hanno la potenzialità di espandersi in vivo e colmare lo spazio vuoto lasciato dagli elementi patologici del sistema immune. Attualmente si pensa di utilizzare un nuovo vettore virale composto da virus lenti che sono capaci di trasdurre il materiale genetico nella cellula bersaglio sia nel momento della replicazione, sia in stato di quiescenza.

Terapia fetale e cellule staminali Le cellule staminali sono state utilizzate a livello sperimentale anche nel feto affetto da una patologia geneticamente correlata (SCID, anemia di Fanconi, Talassemia maior).

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Bordignon C., therapeutic applications for hemopoietic stem cell gene transfer. Mature Immunol 3 (4) aprile 2002 318

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Si tratta in questo caso di un trapianto di cellule staminali adulte nel feto. Il razionale si fonda sul fatto che prima delle 14 settimane il feto non viene considerato ancora immunocompetente, per questo motivo può accettare anche una donazione di cellule ematopoietiche midollari da parte di un donatore anche non HLA compatibile al 100%, bensì aploidentico come un genitore. La chiave del successo del trapianto in utero è proprio la immunodeficienza temporanea del feto, che accetta il trapianto senza produrre ancora reazione di rigetto.

La terapia genica Il termine terapia genica è usato per descrivere il trattamento di una malattia umana attraverso il trasferimento di materiale genetico (DNA o RNA) nel paziente. La terapia genica può essere applicata sia sulle cellule somatiche, sia su quelle della linea germinale. Nella terapia genica germinale, il gene terapeutico è introdotto in tutte le cellule del corpo o, comunque, in quelle germinali (cioè nelle cellule dell’ovaio e del testicolo che danno origine alle cellule uovo e agli spermatozoi). Il risultato è che il gene introdotto può essere trasmesso alle generazioni successive.

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Nella terapia genica su cellule somatiche, la manipolazione genica è ristretta esclusivamente a cellule somatiche, senza alcun effetto sulla linea germinale. Ciò significa che l’intervento terapeutico è diretto al paziente e non dovrebbe comportare la presenza di modifiche del patrimonio genetico per le generazioni successive. La terapia genica generalmente richiede l’espressione di un gene esogeno nel tessuto bersaglio dell’ospite. Per facilitare l’ingresso del gene terapeutico nel suo bersaglio, si utilizza un vettore che può essere un virus, un plasmide, una cellula modificata. Si utilizzano come vettori i virus, poiché per essi è un evento normale penetrare con il proprio materiale nucleico in una cellula ospite. Il primo sistema virale utilizzato come vettore per la terapia genica è stato quello dei retrovirus. Essi sono una famiglia virale a RNA. Dopo l’ingresso in una cellula il retrovirus è denudato e l’RNA è copiato in DNA attraverso un enzima chiamato trascrittasi inversa. Questo enzima è parte integrante del genoma del retrovirus. La copia a DNA è inserita nel genoma dell’ospite, dove può rimare quiescente o essere trascritta in copie multiple dello stesso RNA che saranno impacchettate per dare origine a successivi cicli di infezione. I retrovirus, quindi, possono entrare facilmente in una cellula bersaglio, dove il genoma a RNA è copiato in DNA da una trascrittasi inversa. Il DNA provirale

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può successivamente integrarsi stabilmente nel DNA genomico, esprimendo successivamente il gene terapeutico. Gli altri virus utilizzati come vettori per la terapia genica sono gli adenovirus, i virus adeno-associati e gli herpes virus che essendo dotati di un grande genoma virale permetterebbero l’introduzione di geni terapeutici grandi. Si possono utilizzare anche vettori non virali, impacchettando il DNA in uno strato lipidico (liposoma), iniettando direttamente nel paziente il materiale genetico così preparato. In tutti i casi in cui si introduce il vettore direttamente nel paziente attraverso l’infusione intravascolare o l’iniezione diretta in un tessuto o in un sito specifico, si parla di terapia genica in vivo. Quando le cellule sono prelevate dal paziente ed esposte al vettore in coltura e, successivamente, iniettate nel paziente si parla di terapia genica ex vivo. Un modello di terapia genica: la SCID (Severe Combined immunodeficiency) La SCID nella sua variante autosomica recessiva presenta talvolta una profonda deficienza di un enzima coinvolto nel metabolismo delle purine: la adenosina deaminasi (ADA). La SCID dovuta alla deficienza ereditaria di ADA si verifica in meno di un caso per milione di nascite e causa una gravissima deficienza dell'immunità umorale e cellulo-mediata, portando il bambino alla morte prima dell'età di due anni, se non trattato.

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Il bambino deve soggiornare in un ambiente sterile per essere protetto da ogni contatto con l'ambiente esterno (i piccoli pazienti per questo motivo sono denominati bubble babies). Il primo protocollo utilizzato per questi bambini, è stato quello di una terapia genica ex vivo: linfociti T, raccolti da due bambini con deficit di ADA, sono stati trattati in vitro con un vettore retrovirale che controlla l’espressione dell’ADA. La terapia genica ha avuto successo. Ad un recente convegno di genetica, tenuto ad Oxford è stata comunicata l’insorgenza di una rara sindrome linfoproliferativa a cellule T in un giovane paziente con SCID trattato con terapia genica in Francia. La terapia genica in oggetto prevedeva l’inserzione di un vettore retrovirale che conteneva il gene terapeutico in cellule staminali autologhe. Di fronte a questa comunicazione, si è deciso di sospendere temporaneamente l’arruolamento di nuovi casi in tutte le sperimentazioni di terapia genica in corso 45. I punti da determinare prima di avviare uno studio clinico con prodotti di terapia genica sono i seguenti 46:

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Comunicato della Commissione per l’accertamento dei requisiti dei prodotti farmaceutici di nuova istituzione riunita in data 4.10.2002. Documentazione richiesta per l’avvio degli studi clinici con prodotti per terapia genica: proposta di linee guida e richiesta di commenti. Notiziario dell’Istituto superiore di Sanità vol. 9 n. 10 ottobre 1996. Altri riferimenti normativi possono essere reperiti in Circolare Ministeriale n. 15 del 5 ottobre 2000 (pubblicata sul S.O.

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Gli esordi delle cellule staminali umane e la terapia genica

presupposti ed obiettivi della sperimentazione clinica

descrizione del costrutto genico e delle modalità di ottenimento del prodotto geneticamente modificato

metodi di produzione e purificazione

caratterizzazione della qualità del prodotto

documentazione preclinica della tollerabilità del prodotto

n. 184 alla G.U. n. 262 del 9 novembre 2000) Aggiornamento della circolare ministeriale n. 8 del 10 luglio 1997 relativa alla sperimentazione clinica dei medicinali. a) Terapia genica. Le sperimentazioni tramite prodotti per terapia genica debbono essere eseguite conformemente alle specifiche linee guida dell’Istituto superiore di sanità, pubblicate sul “Notiziario dell’Istituto superiore di sanità” vol. 9, n° 10 del mese di ottobre 1996 (e successivi aggiornamenti), ed in conformità alle norme vigenti nel settore (D.L.vo 3 marzo 1993 n° 91 “Attuazione della direttiva 90/219/CEE concernente l’impiego confinato di microrganismi geneticamente modificati”, pubblicato nel supplemento ordinario n° 34 alla gazzetta ufficiale n° 78 del 3 aprile 1993; direttiva 90/220/CEE del 23 aprile 1990, gazzetta ufficiale CEE n. L. 239 del 28 agosto 1991). Tali sperimentazioni saranno sottoposte dal Ministero al parere dell’Istituto superiore di sanità. Decreto 26 aprile 2002 “Accertamento della composizione e innocuità dei farmaci di nuova istituzione prima della sperimentazione clinica sull'uomo. Individuazione della documentazione da sottoporre all'Istituto superiore di sanità ai sensi dell'art. 4, comma 2, del decreto del Presidente della Repubblica 21 settembre 2001, n. 439.” Per i prodotti intesi per terapia genica e terapia cellulare somatica, la documentazione richiesta è indicata nelle linee guida pubblicate sul notiziario dell'Istituto superiore di sanità, consultabili anche sul sito internet (www.iss.it), alle quali si riferisce la circolare n. 8 del 10 luglio 1997 (Gazzetta Ufficiale n. 168 del 21 luglio 1997) ed eventuali successive modifiche. I centri clinici che conducono sperimentazioni tramite prodotti di terapia genica, debbono possedere le caratteristiche di cui alla normativa riportata nel precedente paragrafo 7, lettera b) e successivi aggiornamenti.

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documentazione preclinica dell’efficacia del prodotto

protocollo clinico

reclutamento e selezione dei soggetti

follow up

consenso informato

diritto alla riservatezza

considerazioni in termini di salute pubblica

qualificazione del personale coinvolto nella ricerca

strutture cliniche e loro organizzazione

Un protocollo di terapia genica, deve essere valutato analiticamente da un Comitato etico competente, tenendo in considerazione i punti suddetti. In estrema sintesi, si devono valutare gli aspetti scientifici del protocollo e la giustificazione della sperimentazione proposta, gli obiettivi della ricerca e i benefici attesi rispetto alle eventuali terapie alternative consolidate. È essenziale una descrizione accurata del materiale genetico e delle modalità con le quali sarà inserito nel paziente. Ogni modalità di terapia genica (in vivo ed ex vivo) e ogni vettore usato presenta caratteristiche particolari e problemi che devono essere

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Gli esordi delle cellule staminali umane e la terapia genica

attentamente valutati, in ogni loro processo di individuazione, produzione e somministrazione. Per quanto riguarda la tollerabilità del prodotto, dovranno essere analizzate le documentazioni di studi su sistemi animali e sulla localizzazione del prodotto somministrato e la sua presenza anche in organi o tessuto non bersaglio (in particolare, la linea germinale), la possibile mobilizzazione del materiale genetico e la sua possibile disseminazione. Per quanto riguarda l’efficacia preclinica del prodotto, è necessario valutare l’efficienza di trasferimento del vettore in cellule in vitro, il livello di espressione

del

materiale

genetico

introdotto,

caratterizzando

la

popolazione di cellule bersaglio ed eseguendo tali studi, ove possibile, in tessuti umani espiantati e mantenuti in vitro e/o in modelli animali (es animali transgenici). Il protocollo, inoltre, dovrà prendere in considerazione la possibile riattivazione nel paziente di virus latenti (virus Herpes, Epstein Barr, citomegalovirus) e la possibilità di una attivazione indesiderata del sistema immune, costituendo, inoltre, lo stato immunitario del soggetto un importante criterio di esclusione o inclusione. In questo senso sarà data particolare attenzione alla descrizione dei criteri di inclusione e di esclusione e alle modalità del follow up. Nell’ambito del consenso informato e il diritto alla riservatezza dei dati, valgono le linee guida che regolano l’ottenimento del consenso informato da parte del soggetto o del rappresentante legale. Inoltre il soggetto o il suo

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tutore deve avere l’opportunità di ottenere il parere di esperti indipendenti prima o anche dopo il rilascio del consenso. Infine le sperimentazioni di terapia genica pongono problemi di salute pubblica per la possibilità di una diffusione del costrutto nell’ambiente o ad altri individui.

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