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LABORATÓRIO WIDAL PACHECO

INFORMATIVO 01

METODOLOGIAS RT-PCR E TESTES RÁPIDOS (IMUNOLÓGICOS) PARA COVID-19

CORONAVÍRUS

23.04.2020


INTRODUÇÃO O novo corona vírus (SARS-CoV-2) é uma pandemia mundial que vem assombrando todos os setores da área da saúde. Os laboratórios de análises clínicas possuem ferramentas de diagnóstico importantes para a detecção do SARS-CoV-2. Dentro das unidades do Laboratório Widal Pacheco trabalhamos com o compromisso de auxiliar profissionais da saúde e pacientes com exames da sua rotina laboratorial. Diante do momento queremos neste informativo apresentar duas metodologias para detecção do SARS-CoV-2, a Reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) e os Teste Imunocromatográficos e/ou Teste imunobiológicos (Testes Rápidos).


1. Metodologias 1.1. Reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) É um teste de biologia molecular e sua execução é complexa. Os resultados obtidos por essa técnica apresentam alta taxa de sensibilidade e especificidade. A RT-PCR busca detectar três fração do RNA viral que sempre estão presente no SARS-COV-2. Essas porções foram testadas e averiguadas e não possuem reação cruzada com outros vírus respiratórios e membros da família do Corona vírus. A amostra é coletada na Nasofaringe e Orofaringe, detectando diretamente o vírus em concentrações baixas, podendo obter resultados positivo na fase assintomática da doença. Todos os testes são realizados em triplicata, sendo utilizado um marcador de validação da corrida do teste, certificando assim que a amostra não sofreu degradação A coleta e transporte das amostras são pontos fundamentais na realização dos testes RT-PCR. É sabido que em nossas mucosas encontram-se enzimas que tem a capacidade degradação da amostra coletada. Assim sendo não devem ficar exposta a temperatura ambiente ou por mais de 72 horas congeladas, para assim evitar a degradação do RNA viral. A equipe do Laboratório Widal Pacheco foi capacitada na realização dos testes, recebendo treinamentos para garantir este processo de qualidade em nossas amostras. O controle do material ocorre desde a coleta do paciente, até o transporte da amostra ao setor de biologia molecular.

1.2. Testes Rápidos (Imunológicos) A partir da infecção do paciente, o vírus SARS-CoV-2 começa a se replicar e circular no organismos fazendo com que a doença inicie a sua evolução. A resposta imunológica do organismos é o surgimento das imunoglobulinas para combater o avanço da doença. Os testes imunológicos buscam detectar esta resposta do organismo a infecção viral. Sendo assim, os testes dependem diretamente da resposta imunológico do organismo e sua velocidade de replicação viral. Houve uma aprovação massiva destes testes juntamente a Anvisa. Atualmente no mercado existe testes com diferentes especificações, dentre eles existem: I) Testes que detectam anticorpos totais, não possibilitam a distinção entre IgM e IgG; II) Testes que detectam anticorpos IgM e IgG; III) Testes detectam o antígeno. Neste ponto destaco uma observação com os primeiros testes comprados pelo Ministério da Saúde, que são da marca Wondfo. Este kit avalia os anticorpos totais e não tem a capacidade de diferenciar as imunoglobulinas específicas IgG e IgM. Existem algumas notícias contestando os testes.


Figura 1:

Fig 1: Testes Wonfo adquiridos governo federal. Possuem apenas a linha controle e linha teste. Não tem a capacidade de identificar IgG e IgM.

Um teste de diagnóstico perfeito é aquele com alta sensibilidade e alta especificidade. No entanto, quando aumentamos demais a sensibilidade em determinadas metodologias podemos começar a perder a especificidade e gerar testes falsos-positivos. Um exemplo é o teste rápido para triagem de HIV que possuem uma alta sensibilidade, no qual pode ter reações cruzadas e apresentar falsos-positivos, por isso, temos que utilizar de técnicas mais complexas para confirmação como RT-PCR e Western Blotting. Entretanto, no momento não é possível afirmar que os testes imunológicos para o SARS-CoV-2 podem ser considerados testes para triagem, pois possuem baixa sensibilidade nos primeiros dias da doença. Estudos vem demonstrando que do 1º ao 7º dia do início dos sintomas, os testes de IgG e IgM tem eficiência máxima de 28,7%. Por isso, a utilização incorreta dos testes pode gerar falso-negativos. Adicionalmente foi observado uma baixa sensibilidade de IgM e janela de detecção curta, sendo a melhor resposta a partir do 14º até 17º dia do início dos sintomas do paciente. Já a sensibilidade da IgG tem se mostrado mais eficaz, no entanto, ela só é reagente a partir do 19º dia após o paciente apresentar os sintomas. Por isso, salienta-se o cuidado com resultados falsos-negativos. A seguir apresentam-se gráficos e tabelas para ilustrar os resultados dos testes e melhor momento para a análise.


2. Gráficos da evolução do vírus e o período que cada teste realiza a detecção

RT-PCR Período da Janela

Declínio

O exame realizado pela metodologia de RT-PCR é considerado o padrão ouro para detecção e confirmação de casos suspeitos de infecção pelo SARS-CoV-2. O teste tem a capacidade detectar o RNA viral na fase assintomática e mantém bom desempenho até o 14º dia após paciente apresentar sintomas. A partir desta etapa o sistema imunológico começa a reagir causando uma redução na eficiência do teste devido ao declínio da replicação RNA viral no organismo. Em casos graves o teste pode ficar positiva praticamente até final da infecção

Convalescença

RT-PCR Início da recuperação

Estágio Assintomático Início dos sintomas

0

5

7

14

21

28

DIAS DESDE A INFECÇÃO

Figura 2

IgM Período da Janela

Declínio

Convalescença

Os testes sorológicos para a detecção da IgM não apresentam uma boa sensibilidade até o 14º dia após o paciente apresentar ao sintomas. A melhor performance da análise ocorre em uma curta janela de detecção do 14º ao 17º após o paciente apresentar os sintomas.

Melhor performance de detecção

IgM desaparece 0

5

7

14

21

28

DIASDESDE DESDEAAINFECÇÃO INFECÇÃO DIAS

Figura 3

IgG Período da Janela

Declínio

Convalescença

Melhor performance de detecção

Os testes sorológicos para a detecção da IgG tem uma ótima sensibilidade após o 19º dia do paciente apresentar os sintomas. Esta análise é ideal para realizar em pacientes que já passaram pela infecção e querem saber se estão imunizados.

IgG início da produção 0

Figura 4

5

7

14 DIAS DESDE A INFECÇÃO

21

28

35


Tabela auxiliar dos Testes Imunológicos

Figura 5

RESULTADOS

PROBABILIDADE DE SIGNIFICADO CLÍNICO

RT-PCR

IgM

IgG

+

-

-

Paciente pode estar em janela imunológica - anticorpos ainda indetectáveis ou não circulantes. O resultado da IgM pode ser falso-negativo alta probabilidade

+

+

-

O paciente pode estar no estágio inicial da infecção em evolução*

+

+

+

O paciente está na fase ativa da infecção

+

-

+

O paciente pode estar no estágio tardio ou recorrente da infecção

-

+

-

O paciente pode estar no estágio inicial da infecção. O resultado da Proteína CR pode ser falso-negativo. O resultado da IgM pode ser falso-negativo.

-

-

+

O paciente pode ter tido uma infecção passada e se recuperou. Paciente imunizado***

-

+

+

O paciente pode estar no estágio de recuperação de uma infecção ou o resultado da PCR pode ser falso-negativo (a doença pode estar em declínio).

doença

doença em declínio**

Fonte: Imersão Consultoria Laboratorial

* Acompanhar marcadores laboratoriais de prognósticos. ** Cuidado: ainda há carga viral presente mesmo sem sintomas clínicos. *** Não há evidências quanto à manutenção da IgG e da imunidade, assim como possibilidade de reinfecção.


Gráfico representando todos os testes descritos anteriormente

Figura 6

RT-PCR

Período da Janela

Declínio

Convalescença

Início da recuperação Melhor performance de detecção

Melhor performance de detecção Estágio Assintomático

Início dos sintomas

IgM desaparece IgG início da produção

0

5

7

14 DIAS DESDE A INFECÇÃO

SARS-CoV-2 RNA e Antígeno IgM anticorpos IgG anticorpos

21

28

35


CONCLUSÃO RT-PCR Excelente marcador desde a fase assintomática até o 14º dia, do aparecimento dos sintomas.

TESTES RÁPIDOS IgM Recomendamos a realização entre 14º a 17º dia após o início dos sintomas. ANTICORPOS TOTAIS Tem bons resultados após o 12º dia depois do início dos sintomas. Neste caso, isoladamente não há como prever o momento da doença em caso positivo.

IgG Recomendamos após o 19º dia após o início dos sintomas.


ReferĂŞncias

1 - Corman Victor M et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 202025 (3):pii=2000045. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045 2 - Guia de exames DB molecular: https://gde.diagnosticosdobrasil.com.br/GDE_Home/DetalheExame.aspx?ExameId=PCOV19 3 - https://noticias.r7.com/saude/coronavirus/governo-compra-teste-de-covid-19-queda-resultado-em-20-minutos-02042020. 4 - Juanjuan Zhao et al. Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients of novel coronavirus disease 2019. Clin Infect Dis. 2020 Mar 28. pii: ciaa344. doi: 10.1093/cid/ciaa344.


Contatos Drยบ. Mauricio Dalbosco diretor-geral Laboratรณrio Widal Pacheco 54 9.8105.0440 mauricio@laboratoriowidalpacheco.com.br Drยบ. Rafael Dalbosco diretor-operacional Laboratรณrio Widal Pacheco 49 9.9931.0045 rafael@laboratoriowidalpacheco.com.br Unidade Central SC 49 3018.2222 49 9.9947.7392 Unidade Central RS 54 3581.0017 54 9.8157.0009

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