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MARÍA JOSÉ MAGAÑA ARCOS


1. Materiales y aparatos utilizados 2. Prácticas de clase Extracción casera de ADN vegetal Extracción casera de ADN de hígado de pollo Jornada de simulación, cultivo de células eucariotas (insecto) Visualización del subcultivo y preparación del medio de congelación Congelación de células Descongelación y primer cultivo de células de hibridoma Visualización al microscopio invertido del cultivo de hibridoma y subcultivo Visualización al microscopio invertido, recuento en cámara de Neubauer y subcultivo Visualización al microscopio invertido, recuento en cámara de Neubauer, estudio de viabilidad celular, preparación del medio de congelación y criopreservación de las células


NOVIEMBRE Lunes

Martes 1

Miércoles 2

Jueves 3

7

8

9

10

14

15

16

17

Visualización Congelación subcultivo y de células preparación medio de congelación

21

22

Visualización microscopio del cultivo y preparación de subcultivo

Visualización microscopio invertido, recuento en cámara Neubauer y subcultivo

28

29

Viernes 4

Sab 5

Dom 6

11

12

13

18

19

20

26

27

Descongelación y primer cultivo de células de hibridoma

23

24

25 Visualización microscopio invertido, recuento cámara Neubauer, preparación medio de congelación y criopreservación de las células

30


(PRIMER TRIMESTRE)

Incubador CO2

Bomba de vacío

Cabina Flujo Laminar

Baño termostático

Microscopio invertido


Auxiliar de pipeteado

Microscopio biológico

Gradillas Centrífuga

Contenedor CoolCell

Frasco T-Flask

Cámara Neubauer


Pipetas graduadas estĂŠriles

Tubos Falcon

Pipetas Pasteur estĂŠriles


1.- Describe el fundamento de este método: La técnica de extracción de ácidos nucleicos en eucariotas, está relacionada con su ubicación en el núcleo celular y las propiedades físicas y químicas de todas las biomoléculas celulares. Hay que desorganizar la estructura de paredes y membranas para liberar los ácidos nucleicos. Por mecanismos mecánicos y posteriormente químicos a través de la solución de lisis, se actúa sobre las paredes y las estructuras lipoproteicas de las membranas. Se extraen de la mezcla de fragmentos celulares con alcoholes específicos, en los que los ácidos nucleicos no son solubles. Una vez extraídos los ácidos nucleicos, se guardan en congelación. ¿Por qué se consigue la extracción de ADN de esta forma? Porque el detergente casero sirve para romper las células y de esta forma deja el ADN queda libre. ¿Cuál es la función de la sal común, el lavavajillas y el alcohol helado?  Sal: Hace que la solubilidad de las proteínas disminuya, precipiten y el ADN se separa más fácilmente  Lavavajillas: ataca a las proteínas de las células, lo que permite romperlas y separarlas del ADN  Alcohol helado: El alcohol sirve para separar el ADN de otros componentes celulares. 2.- En algunos métodos como en este, se recomienda añadir una pizca de ablandador de carne, zumo de piña o liquido enzimático para lentillas ¿Por qué? Al lisar a las células se libera una gran cantidad de proteínas, algunas de estas proteínas tienen como función degradar al ADN de patógenos como son las bacterias y los virus. Si no detenemos a estas proteínas (conocidas como nucleasas) nuestro ADN será degradado. Para evitarlo agregamos el ablandador de carnes, zumo de piña o liquido enzimático para lentillas los cuales contienen proteasas, es decir, proteínas especializadas en la degradación de otras proteínas.


Fundamento La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos son atraídos hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolución y posterior extracción de la célula. Se empieza por lisar (romper) las células mediante un detergente, vaciándose su contenido molecular en una disolución tampón en la que se disuelve el ADN. El tampón contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, proteínas y otras sustancias en menor proporción. Las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrán fraccionado en cadenas más pequeñas y separadas de él por acción del detergente. Sólo queda extraer el ADN de esa mezcla de tampón y detergente, para lo cual se utiliza etanol. Materiales    

Hígado de pollo Agua destilada Sal de mesa Bicarbonato Sódico  Detergente liquido

     

Etanol frio Batidora Nevera Gasas Tubo de ensayo Varilla

Procedimiento 1º- Preparar el tampón con los siguientes ingredientes y mantener en la nevera o en un baño de hielo triturado: o 120 ml de agua, si es posible destilada y si no mineral. No usar agua del grifo. o 1,5 g de sal de mesa, preferiblemente pura. o 5 g de bicarbonato sódico o 5 ml de detergente líquido.


2º- Elegir la muestra que va a proporcionar el ADN (de 15 a 20 g de hígado de pollo) y cortarla en cuadraditos. 3º- Triturar la muestra con un poco de agua en la batidora accionando las cuchillas a impulsos de 10 segundos. Así se romperán muchas células y otras quedarán expuestas a la acción del detergente. 4º- Mezclar en un recipiente limpio 5 ml del triturado celular con 10 ml del tampón frío y agitar vigorosamente durante al menos 2 minutos. Separar después los restos vegetales más grandes del caldo molecular haciéndolo pasar por un colador lo más fino posible. Lo ideal es centrifugar a baja velocidad 5 minutos y después pipetear el sobrenadante. 5º- Retirar 5 ml del caldo molecular a un tubo de ensayo y añadir con pipeta 10 ml de alcohol isoamílico enfriado a 0ºC. Se debe dejar escurrir lentamente el alcohol por la cara interna del recipiente, teniendo éste inclinado. El alcohol quedará flotando sobre el tampón. 6. Se introduce la punta de una varilla estrecha hasta justo debajo de la separación entre el alcohol y el tampón. Remover la varilla hacia delante y hacia atrás y poco a poco se irán enrollando los fragmentos de mayor tamaño de ADN. Pasado un minuto retirar la varilla atravesando la capa de alcohol con lo cual el ADN quedará adherido a su extremo con el aspecto de un copo de algodón mojado. Resultado El producto filamentoso obtenido de la extracción no es ADN puro ya que, entremezclado con él, hay fragmentos de ARN. Una extracción "profesional" se realiza añadiendo enzimas que fragmentan las moléculas de ARN e impiden que se unan al ADN.

Observaciones:


JORNADA SIMULACIÓN CULTIVO DE CÉLULAS EUCARIOTAS (de insecto)

Objetivo de la práctica El objetivo de esta práctica es la introducción de los conocimientos básicos en el cultivo de células eucariotas para estudiar la viabilidad y el crecimiento celular. Materiales y Reactivos Células de insecto Medio de cultivo de células Colorante azul tripán Colorante Giemsa Tampón fosfato Salino (PBS) Frasco cultivo celular estéril de 25 cm2 (T-Flak) Placas de cultivo celular (Petri) Cámaras de recuento celular (Neubauer) Pipetas grandes de transferencia estériles (Pasteur) Pipetas pequeñas de transferencia (Pasteur) Pipetas de 10 y 25 ml Tubos de fondo cónico de 15 ml Tubos de fondo cónico de 50 ml (estériles) Tubo de centrífuga de 1,5 ml Microscopio de contraste de fases Etanol al 70% en botellas de aerosol

Precauciones Abstenerse de la práctica los estudiantes con alergias a antibióticos como penicilina o estreptomicina. Limpiar el área de trabajo con lejía al 10% y etanol al 70% Todos los materiales que entren en contacto con las células deben desinfectarse antes de tirarse a la basura, en el autoclave a 121ºC durante 20 min o sumergiendo en lejía al 10% durante la noche y luego desecharlos.


PREPARACIÓN PARA EL TRABAJO DE LA CABINA DE FLUJO LAMINAR 1. Encender la cabina 2. Limpiar con agua jabonosa toda la superficie de la cabina (incluyendo las paredes interiores de la cabina y el techo) 3. Limpiar nuevamente todo el interior de la cabina con etanol al 70% 4. Introducir todos los materiales estériles a utilizar dentro de sus embalajes, y los que no llevan embalaje hay que aplicarles etanol al 70% con el bote de aerosol antes de meterlos en la cabina. 5. Encender la luz ultravioleta durante 5 min 6. Apagar la luz ultravioleta y la cabina esta lista para su uso.

PREPARACIÓN DE LA ESTUFA INCUBADORA DE CO2

1. Ponemos en funcionamiento el Incubador accionando el interruptor de encendido. 2. Añadimos agua destilada a la bandeja situada en la parte inferior del Incubador (el volumen de agua es variable dependiendo del modelo de la estufa, suele oscilar entre 1 y 3 litros). Existen modelos donde el reservorio de agua destilada está en el lateral (consultar manual). 3. Seleccionamos la Temperatura y el CO2 necesario para el cultivo. 4. Dejar estabilizar el Incubador durante una noche, para que las condiciones en el interior sean las adecuadas. 5. Una vez comprobado en el display que la atmósfera del interior del Incubador es la correcta, procedemos a introducir los cultivos celulares.


COMIENZO DE LA JORNADA DE PRÁCTICA Lunes 7 de noviembre de 2016 La programación para este día es la siguiente: 1) Esterilización de las cabinas de flujo laminar 2) Preparación de las alícuotas del medio de cultivo y de la suspensión de las células de insecto 3) Llenado de los T-Flak con el medio de cultivo y las células 4) Llevamos las muestras preparadas en los T-Flak al Incubador de CO2 5) Esterilizamos en el autoclave todos los desechos generados en la cabina de flujo laminar. Notas/incidentes: Preparamos 2 T-Flak con la cantidad correcta de medio y células de insecto, y preparo un tercer T-Flak con una cantidad sobrante (inferior de la requerida) de células por lo que la cantidad de medio de cultivo se la calculo “a ojo”. (este T-flak lo he señalizado con el nº 3 para diferenciarlo de los otros.

Martes 8 de noviembre de 2016 La programación es la siguiente: 1) Visualización preliminar de los cultivos celulares en el microscopio invertido. 2) Teñimos con azul tripán las células para hacer el recuento (inicial) en la cámara de Neubauer usando un microscopio biológico normal. Para realizar la tinción procedo a echar 50µl de azul tripan y seguidamente echo 50µl de la suspensión de células cultivadas en un tubo eppendorf. Pipeteo suavemente la mezcla un par de veces para resuspender las células con el colorante. 3) Preparo la cámara de Neubauer con la suspensión de células teñidas con el azul tripán y procedo al recuento de células en el microscopio. Para hacer el recuento de células en la cámara Neubauer se utilizan los cuadrados grandes de las esquinas de la cámara (los marcados de color celeste).


RESULTADOS OBTENIDOS Observación al microscopio invertido Muestra1 Poco crecimiento celular

Recuento en cámara de Neubauer

Muestra2 Muestra3 Muestra1 Muestra2 Muestra3 Poco Escaso Bajo Bajo Insuficiente crecimiento crecimiento recuento recuento para celular (pero recuento existe)

Viernes 11 de Noviembre de 2016 La programación es la siguiente: 1) Visualización al microscopio invertido de los cultivos de células 2) Preparamos un eppendorf para recuento de células al microscopio óptico normal con 50µl de azul tripán y 50µl de células. 3) Hago un subcultivo de las células después observarlas al microscopio invertido (he usado el T-Flak2) - Para realizar el subcultivo he seguido los siguientes pasos (siempre dentro de la cabina de flujo laminar); - He pasado el medio con las células a un tobo cónico de centrífuga. - Centrifugo la muestra a 700 r.p.m durante 8 min - Elimino el sobrenadante con una pipeta esteril (4 ml) - Echo el medio de cultivo en el tubo donde está el botón de células y resuspendo varias veces con la pipeta. - Llevo la suspensión obtenida con el medio de cultivo “nuevo” a un T-Flak estéril y lo llevo a la estufa incubadora. 4) Realizo el contaje de células en la cámara de Neubauer con la tinción preparada con el azul tripán.

RESULTADOS OBTENIDOS Observación al microscopio invertido Muestra1 Crecimiento normal celular

Muestra2 Muestra3 Crecimien Bajo to elevado crecimiento celular celular

Recuento en cámara de Neubauer Muestra1 No relizado

Muestra2 Muestra3 140.000 No celulas/µl realizado


Resultado del recuento en la cámara de Neubauer (de criterio para recuento he usado la línea de la izquierda y la superior)

5

0

1

0

0

4

0

1

0

0

2

0

0

0

0

1

Incidencia: todas las células que he contado estaban muertas

Concentración células/µl = (14 x 10.000) / 1 x (1/2 : ½) = 140.000 células/µl

Recuento cámara Neubauer

Visualización microscopio invertido


Lunes 14 de Noviembre 2016 Para el día de hoy hay previstas dos prácticas principales: Visualización del subcultivo realizado el último día Preparación del medio de congelación

Resultado visualización del subcultivo al microscopio invertido: hay buen crecimiento celular. Incidencias registradas: Se ha observado también la presencia de esporas en el cultivo celular

Preparación del medio de congelación Materiales: Suero fetal bovino (FBS) Dimetil sulfóxido (DMSO) Pipetas serológicas graduadas estériles Auxiliar de pipeteado Matraz o envase donde preparar el medio Procedimiento. 1. En mi caso tengo que preparar 100 ml de medio de congelación para repartirlo entre el grupo de trabajo. Teniendo en cuenta que al Suero fetal bovino (FBS) se le añade el 10% v/v de Dimetil sulfóxido (DMSO), tengo que echar las siguientes cantidades para hacer los 100ml: El proceso de mezcla de los compuestos hay que llevarlo a cabo dentro de la cabina de flujo laminar. Compuesto FBS DMSO

Volumen 22,5 ml 2,5 ml

2. Este paso puedo realizarlo fuera de la cabina, consiste en filtrar el medio de congelación a través de unos filtros y mediante bomba de vacío.

3. Una vez acabado el filtraje, se almacena en el frigorífico y se saca justo antes de resuspender las células en él.


Preparación del subcultivo para la congelación. 1. Después de la visualización al microscopio invertido, llevamos el T-Flak a la cabina de flujo laminar. 2. Trasvasamos el preparado de células a un tubo cónico de centrífuga. (en este caso hemos rellenado hasta 5 ml con medio de cultivo para poder equilibrarlo con el tubo de otros compañeros en la centrífuga). 3. Una vez metidos todos los tubos en la centrífuga la programamos a 82 xg (1000 r.p.m) durante 8 min. 4. Una vez centrifugado volvemos a la cabina y eliminamos todo el sobrenadante dejando solo el tapón celular al fondo del tubo cónico. 5. Al sedimento de células que nos ha quedado le echamos 3 ml del medio de congelación que hemos preparado anteriormente. Resuspendemos las células pipeteando varias veces. 6. Traspasamos las células con el medio de congelación al tubo en el que vayamos a congelar.

INCIDENCIAS: Después del paso 3, no nos ha dado tiempo a seguir con la práctica por lo que hemos tenido que introducir el tubo centrifugado en la estufa de CO2

Como pasar de xg a r.p.m en la centrífuga: Previamente tenemos que saber el radio de la centrífuga que vayamos a usar C(mirándolo en las instrucciones por ejemplo).

Una vez que sepamos el radio, buscamos la tabla diseñada para hacer los cambios de xg a r.p.m sin necesitar de hacer la cuenta matemática. La tabla consiste en 3 columnas, una con las r.p.m, otra con los xg y otra con el radio de la centrifuga. Dibujamos un punto en la cantidad de xg, otro punto en la cifra que representa el radio y para terminar trazamos una línea que pase por los 2 puntos marcados, y la continuamos hasta que atraviese la columna que contiene los valores de r.p.m. El valor que nos dé en la columna de las revoluciones/min es la equivalencia de los xg que nos daban.


Martes 15 de Noviembre de 2016 La programación para el día de hoy es la siguiente: Saco el cultivo celular del tubo cónico que dejé en el Incubador de CO 2 y lo vuelvo a centrifugar a 1000 r.p.m durante 8 min. Una vez centrifugado, llevo el tubo a la cabina de flujo laminar (previamente preparada y esterilizada). Elimino el sobrenadante del cultivo centrifugado (solo dejo el botoncito de células pegado al fondo del tubo) y lo desecho. Filtro el medio de congelación a un tubo Falcón estéril. Añado 3 ml del medio de congelación filtrado al tubo donde está el tapón celular. Resuspendo un par de veces con la pipeta. Trasvaso el contenido (células más medio de congelación) a un tubo pequeño (criotubo) y lo llevo a un contenedor de congelación (coolcell). Acto seguido lo introduzco en el congelador a -80ºC.

OBSERVACIONES/INCIDENCIAS: La única incidencia es la que estaba prevista al tener que volver a centrifugar el tubo que previamente ya se había centrifugado el día anterior y no pude seguir con la práctica por falta de tiempo. La observación “importante” es que he preparado y congelado el cultivo celular que había en el T-Flask marcado con *, sin observarlo previamente en el microscopio invertido para comprobar si seguía habiendo crecimiento celular estable.


Viernes 18 de Noviembre 2016 Las prácticas para el día de hoy son las siguientes: 1º. Descongelación de células de hibridoma 2º. Primer cultivo con las células descongeladas Los materiales a utilizar son: Baño termostatizado Medio de cultivo DMEM (preparado el último día de clase) Pipetas serológicas graduadas estériles Tubos Falcon de 15 ml (tubo cónico estéril) T-Flasks estériles Gradilla Etanol al 70% v/v para desinfectar. Descripción de la práctica Ante de comenzar con la descongelación de células encendemos el baño termostático a 37ºC, y limpiamos y esterilizamos la cabina de flujo. En la cabina (una vez preparada), filtramos el medio de cultivo que preparamos el último día con la bomba de vacío y se reparte en tubos Falcon de 50 ml para cada grupo. Una vez repartido el medio en los tubos Falcon, los metemos en el baño termostatizado sin sumergirlo por completo, durante unos 10 min. Pasados los 10 min, llevamos los tubos a la cabina de flujo laminar y lo dejamos ahí mientras comenzamos con la descongelación de las células de hibridoma.

El proceso para descongelar las células es el siguiente: 1. Sacar los viales congelados y los dejamos en la mano cerrada aproximadamente 1 min para que entren en calor. 2. Pasado el primer minuto, los introducimos el vial en el baño a 37ºC durante 2 min (sin sumergirlo por completo).


3. Una vez atemperado a 37ºC, lo llevamos a la cabina donde previamente hemos dejado el tubo con el medio de cultivo. 4. Al vial descongelado con las células le añadimos 1 ml de medio de cultivo y homogeneizamos el contenido con la pipeta suavemente un par de veces. 5. Transferimos la mezcla (células descongeladas + medio de cultivo) a un tubo estéril de 15 ml. 6. Centrifugamos a 80 xG durante 8 min y una vez centrifugado volvemos con el tubo a la cabina de flujo. 7. Con una pipeta Pasteur eliminamos todo el sobrenadante. 8. Echamos 4 ml del medio de cultivo y con la pipeta Resuspendo el pellet. Una vez resuspendido, dejamos el tubo en la gradilla (dentro de la cabina) y a cada T-Flak le echamos 3 ml solo del medio de cultivo. 9. Terminamos de rellenar los T-Flak con 2ml del cultivo (a cada uno) y homogeneizamos con la pipeta 10. Introducir los cultivos en el Incubador de CO2

Observaciones/Incidentes: El medio de cultivo se preparó con otras cantidades distintas a las que dictaba el protocolo. Una vez resuspendido el pellet, el siguiente grupo nos sacó el medio de cultivo de la cabina con el tapón abierto, y dada la hora que era no nos dio tiempo a atemperar el medio guardado, por lo que tuvimos que dividir los 4ml entre los 2 T-Flaks.


Lunes 21 de Noviembre de 2016

Para el día de hoy se han planificado dos prácticas principalmente. Son las siguientes: Visualización al microscopio invertido del cultivo de hibridoma Hacer un subcultivo si la visualización es positiva

El desarrollo de la práctica se explica a continuación. 1. Visualización del cultivo de hibridoma. RESULTADO En ambos T-Flaks hay crecimiento celular (en uno más que en otro); pero ambos están contaminados. Los he vuelto a meter en el Incubador de CO2 por recomendación del profesor para volver a visualizarlos el próximo día.

2. Debido a la presencia de contaminación en el cultivo, en lugar de realizar un subcultivo, vuelvo a repetir el cultivo de hibridoma desde el principio. Los pasos a seguir para el cultivo de hibridoma son los siguientes: Limpieza y esterilización de la cabina de flujo laminar e introducción de los materiales pulverizados con etanol al 70% Dentro de la cabina, vuelvo a filtrar el medio de cultivo sobrante de la última práctica. Una vez filtrado, echo 8 ml del medio en un tubo cónico de 15 ml y lo llevo al baño a 37ºC durante 10 min. Cojo un vial congelado de células de hibridoma y lo descongelo primeramente sosteniéndolo en la mano cerrada durante 1 min y después al baño a 37ºC durante 2 min.


Llevo los 2 tubos a la cabina una vez finalizado el tiempo en el baño termostático y añado 1 ml del medio de cultivo al vial de células de hibridoma descongeladas. Transfiero el contenido del vial a un tubo estéril de 15 ml, lo homogeneizo en el vórtex un segundo y lo centrifugo a 1000 r.p.m (80 xg) durante 8 min. Una vez centrifugado vuelvo a la cabina de flujo con el tubo. Retiro el sobrenadante y resuspendo el pellet en 4 ml de medio de cultivo (filtrado). En los 2 T-Flaks añado 3 ml de medio de cultivo a cada uno. Reparto los 4 ml del tubo con el medio y la resuspensión de células entre los 2 T-Flaks (2 ml a cada uno). Cada T-Flak tiene que tener 5 ml totales al final. Introduzco los T-Flaks en el Incubador de CO2

MATERIALES

     

Pipetas estériles y auxiliares de pipeteado Dos T-Flaks Tubos cónicos de 15 ml estériles Pipetas Pasteur estériles Medio de cultivo Vial con células congeladas de hibridoma

Incidencias/Observaciones: Después de los 8 min de centrifugación no se observaba nada de pellet en el fondo, por lo que se ha vuelto a centrifugar otros 8 min más (siempre bajo recomendación del profesor)


Martes 22 de Noviembre de 2016 Para hoy martes, hay tres prácticas programadas: Visualización al microscopio invertido de los dos cultivos celulares hechos el día anterior Recuento en la cámara de Neubauer para ver la viabilidad de los cultivos Hacer un subcultivo del T-Flak que contenga más densidad celular

Resultados de las prácticas

Visualización cultivos T-Flak 1

Buen crecimiento celular (vivas)

T-Flak 2

Buen crecimiento celular (vivas)

Recuento en la cámara de Neubauer

Para teñir las células he usado 50μl de azul tripán y 50 μ del cultivo celular

Visualización cámara de Neubauer (células vivas y abundantes)


7

2

1

0 Formula porcentaje viabilidad:

0

0

0

3

2

1

0

1

0

4

0

0

% viabilidad = (nº de células vivas) X 100 (nº de células totales)

% viabilidad = (21 células vivas / 21 células totales) x 100 = 100%

Observación: Solo he contado uno de los cuatro cuadros totales que hay en la cámara de Neubauer.


Viernes 25 de Noviembre Las prácticas previstas para hoy son las siguientes: Visualización al microscopio de los cultivos celulares Recuento en cámara de Neubauer y estudio de viabilidad celular Preparación del medio de congelación y congelar las células viables (criopreservación)

Resultados obtenidos Visualización de los cultivos al microscopio invertido Resultados T-Flask 1 Mucho crecimiento celular

T-Flask 2 Poco crecimiento celular

Recuento en cámara de Neubauer

Células vivas = 6 Células muertas = 16


Células vivas = 9 Células muertas = 12

Cálculos: Recuento de células: Cuadro 1: células contadas: 22 Cuadro 2: células contadas: 21

Total de células: 43

Células/ml = (células totales x 10000) / nº cuadrados contados (43 x 10000) / 2 = 215.000 células/ml Porcentaje de viabilidad celular % viabilidad = (células vivas / células totales) x 100 (15 / 43) x 100 = 34,89% viabilidad

Preparación del medio de congelación y criopreservación de las células viables 1. El primer paso es calcular el número de viales necesarios partiendo del recuento hecho previamente en la cámara de Neubauer. Para calcular el nº de viales a congelar por cultivo, se calculará el número total de células y posteriormente se dividirá entre el número de células por vial. 2. Una vez calculado el número de viales y de células por vial para la criopreservación, se procede a la realización de la misma.  Etiqueto los viales de criopreservación (nº de células y la fecha)  Introduzco el cultivo en tubos Falcon de 15 ml  Centrifugo a 80 xg (unas 1000 r.p.m aprox) y una vez centrifugado llevo los tubos a la cabina de flujo laminar.


 Con una micropipeta elimino el sobrenadante  Resuspendo el pellet en el volumen de medio de congelación necesario  Con una pipeta serológica cojo todo el volumen (el obtenido al mezclar el medio de congelación con el pellet de células) y lo añado al vial de criopreservación.  Introduzco los viales de criopreservación en el congelador de -20ºC durante 4-5 horas. Este tiempo es muy importante para que el proceso de congelación vaya bien.  Una vez pasado este tiempo, meto los viales en una de las cajas de criopreservación (coolcell) y lo llevo al congelador de 80ºC o a Nitrógeno líquido.

Observaciones/Incidencias: No se ha registrado ninguna


cuaderno de prácticas  
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