La neurorigenerazione retinica cellulomediata

Paolo G. Limoli

La neurorigenerazione retinica cellulomediata Principi, applicazioni e prospettive

Paolo G. Limoli

La neurorigenerazione retinica cellulomediata Principi, applicazioni e prospettive

ISBN 978-88-97929-30-7

FGE Editore

Volume 2 a Collan

FGE Editore

EMY N ACAD

2014

ISIO

LOW V

ITALY

Paolo G. Limoli

La neurorigenerazione retinica cellulomediata Principi, applicazioni e prospettive con la collaborazione di Gianluca Campiglio Nicola Pescosolido Genni Santorelli Sergio Scalinci Duilio Siravo

FGE Editore

Paolo Giuseppe Limoli Responsabile scientifico del Centro Studi Ipovisione di Milano e del Centro Oculistico Eye.com a Palermo, Segretario scientifico della Low Vision Academy e membro della Association of Research on Vision and Ophthalmology. Ha sviluppato il protocollo scientifico per la riabilitazione visiva del soggetto ipovedente in ambiente virtuale. Ha identificato le metodologie per incrementare la capacità di lettura da associare alla riabilitazione visiva. Ha scoperto il ruolo della fissazione nel processo visivo e le modalità per modificarla ai fini riabilitativi creando una via complementare alla riabilitazione visiva. Unendo la conoscenza della chirurgia del segmento anteriore, della clinica della retina e della riabilitazione visiva sta studiando con successo la possibilità di rendere meno discriminante la condizione dell’ipovedente.

Si occupa dal 2002 di rigenerazione tissutale. .

Dedico questo libro alla professoressa Rita Levi Montalcini che mi ha onorato per avermi scelto come suo oculista e chirurgo, stimolando la mia passione verso la ricerca nel campo neurorigenerativo Ringrazio i professionisti e i ricercatori che mi hanno aiutato a curare questa edizione, per la collaborazione e la competenza, Gianluca Campiglio, Nicola Pescosolido, Genni Remo Santorelli, Sergio Zaccaria Scalinci, Duilio Siravo.

Ringrazio il prof. Renato Meduri che mi ha iniziato a questa tecnica e all’uso dei fattori di crescita e su cui spesso abbiamo potuto confrontarci.

Ringrazio il dott. Renzo Carpi e il personale tutto del Centro di Chirurgia Ambulatoriale Vista Vision di Milano, per l’attenzione e la cura con cui hanno seguito e seguono ogni passo volto negli anni alla messa a punto e al perfezionamento della tecnica chirurgica.

Ringrazio gli ortottisti, gli oftalmologi, le segretarie e le amministratrici del Centro Studi Ipovisione a Milano e di Eye.com a Palermo, per le capacità dimostrate nel seguire la riabilitazione visiva di questi pazienti, nell’organizzare la chirurgia, nel gestire lo studio.

Ringrazio i miei familiari per la loro comprensione e per gli stimoli e mi scuso per non averli considerati in molti momenti perché “troppo occupato” a scrivere.

Ringrazio soprattutto tutte le persone che soffrendo di una grave patologia oculare, hanno riposto in me fiducia e stima, affidandomi la conservazione della loro vista.

Paolo Limoli

“La neurorigenerazione retinica cellulomediata – Principi, applicazioni e prospettive” © Copyright 2014 – Fabiano Gruppo Editoriale Impaginazione e stampa: FGE Srl Regione Rivelle 7/F – Moasca (AT) Gli autori e l’Editore declinano ogni responsabilità per eventuali errori contenuti nel testo. Tuttti i diritti sono riservati. È vietata ogni riproduzione totale o parziale senza il consenso dell’autore.

ISBN: n. 978-88-97929-30-7 Finito di stampare nel mese di Ottebre 2014 FGE S.r.l. – Regione Rivelle 7/F – 14050 Moasca (AT) - Italy Tel. 0141 1768908 Fax 0141 1768911 e–mail: info@fgeditore.it – www.fgeditore.it

Indice

I Premessa .......................................................................................................................................................................................................................................7 La medicina rigenerativa ........................................................................................................................................................................................................9 Il tessuto adiposo ..................................................................................................................................................................................................................77 Le cellule staminali ................................................................................................................................................................................................................95 Le cellule staminali derivate dal grasso ..................................................................................................................................................................123 I fattori di crescita ..............................................................................................................................................................................................................159 Implicazioni bioetiche e medicolegali ......................................................................................................................................................................207

II Il lipofilling ...............................................................................................................................................................................................................................231 Il gel piastrinico ....................................................................................................................................................................................................................247 Cellule retiniche: premesse anatomofunzionali .................................................................................................................................................271 Apoptosi e neurobiologia retinica ............................................................................................................................................................................293 Studi sulla neurorigenerazione retinica ..................................................................................................................................................................309 Patologie oculari e medicina rigenerativa .............................................................................................................................................................363 Impianto subsclerale di lipociti nella degenerazione tapetoretinica ......................................................................................................399 Limoli Retinal Regeneration Tecnique o innesto sovracoroideale di cellule autologhe .............................................................407 Anestesia in corso di innesti autologhi sovracoroideali ...............................................................................................................................425 Prospettive .............................................................................................................................................................................................................................437 Abbreviazioni e acronimi ...............................................................................................................................................................................................441 Note biografiche sui co-autori ...................................................................................................................................................................................447

Capitolo 7

Il lipofilling A cura di Paolo G. Limoli

Le ADSCs (Adipose-derived Stem Cells) potrebbero essere impiegate nella rigenerazione tissutale attraverso la metodica del lipofilling (dal greco lipos

= grasso e dall’inglese to fill = infiltrare)1-3, una metodica chirurgica mini-invasiva codificata alla fine degli anni ’80 dal dott. Sidney Coleman di New York4.

1.

Mizuno H. Versatility of adipose tissue as a source of stem cells. J Nippon Med Sch. 2003 Oct;70(5):428-31.

2.

Kølle SF, Fischer-Nielsen A, Mathiasen AB, Elberg JJ, Oliveri RS, Glovinski PV, Kastrup J, Kirchhoff M, Rasmussen BS, Talman ML, Thomsen C, Dickmeiss E, Drzewiecki KT. Enrichment of autologous fat grafts with ex-vivo expanded adipose tissue-derived stem cells for graft survival: a randomised placebo-controlled trial. Lancet. 2013 Sep 28; 382(9898).

3.

Sultan SM, Barr JS, Butala P, Davidson EH, Weinstein AL, Knobel D, Saadeh PB, Warren SM, Coleman SR, Hazen A. Fat grafting accelerates revascularisation and decreases fibrosis following thermal injury. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2012 Feb;65(2):219-27.

4.

Coleman S.R. Lipoinfiltration in the upper lip white roll. Aesth. Surg. (1994) 14: 231-234.

Cenni storici L’ uso del tessuto adiposo come materiale per correggere difetti dei tessuti molli risale alla fine del XIX secolo.

Nel 1989 Billings e May pubblicarono una panoramica storica dell’innesto di grasso autologo1.

Nel 2004 Mojallal divise la storia del trapianto di grasso autologo in tre periodi2.

1. Primo periodo, prima dell’invenzione della lipoaspirazione, chiamato periodo della “chirurgia a cielo aperto” (1889-1977).

2. Secondo periodo, dopo l’invenzione della lipoaspirazione, detto “non raffinato” o “traumatico” (1977-1994 ).

3. Terzo periodo, dopo la divulgazione della tecnica di Lipostruttura di Coleman chiamato “raffinato”(dal 1994 a oggi).

Questi periodi storici si devono analizzare alla luce delle conoscenze del tempo sul tessuto adiposo.

Il termine “chirurgia a cielo aperto” rappresenta il trapianto in blocco del tessuto adiposo senza alcuna modifica della sua struttura.

La prima relazione su innesto di grasso autologo è stata pubblicata da G. Neuber nel 1893 dove venne descritto l’impianto di piccole quantità di tessuto adiposo per il riempimento di depressioni cicatriziali.

Neuber ha riportato buoni risultati postoperatori inficiati però da notevoli tassi di riassorbimento dell’innesto in caso di grandi volumi di trapianto3.

Come accennato precedentemente il grasso, fino al secondo periodo (anni ’80), era considerato nel migliore dei casi poco più di una riserva energetica, in genere un eccesso da tenere a bada o da eliminare.

A partire dagli anni ’90 si fa strada invece un concetto

232

Capitolo 7: il lipofilling

diverso del tessuto adiposo, che comincia ad essere considerato un vero e proprio organo multicentrico con attività di tipo endocrino, in grado di essere un elemento regolatore fondamentale per una miriade di funzioni vitali quali il metabolismo glucidico, la termoregolazione, l’increzione di tutti gli ormoni surrenalici, corticali e midollari, di tutti gli ormoni liposolubili, il controllo neuroendocrino dell’appetito4-7.

Ma la più grande rivalutazione biologica del tessuto adiposo arrivò proprio da quei clinici che ne praticavano l’eliminazione massiva, per lo più con finalità estetiche.

Le pratiche chirurgiche volte all’eliminazione del grasso formarono l’esperienza per poterlo riutilizzare, per esempio, nella ricostruzione dei tessuti molli, in caso di gravi demolizioni per cause traumatiche o tumorali.

Questi chirurghi, spesso supportati da un pragmatico empirismo, più che da una consapevolezza biologica dettagliata, cominciarono a modificare le tecniche di asportazione del tessuto adiposo passando della demolizione chirugica alla meno invasiva e traumatica liposuzione, finalizzandone poi la raccolta per procedure ricostruttive.

Per la cultura del chirurgo plastico è sempre stato chiaro e indiscutibile che il tessuto adiposo, trasferito con la sua architettura tridimensionale intatta, non riesce a sopravvivere a causa della povertà della sua trama vascolare, che lo porta ad una inevitabile necrosi ischemica con colliquazione completa.

Per ridurre il riassorbimento del tessuto impiantato era pratica utilizzare impianti associati al derma profondo, anche se la necrosi interessava comunque la metà del tessuto innestato, limitando le indicazioni dell’innesto dermoadiposo solo alle perdite di sostanza sottocutanea causa di importanti alterazioni di una data regione.

I chirurghi dell’epoca impararono così a manipolare e riutilizzare il tessuto adiposo rimosso, ideando la pratica del lipofilling, consistente, in sintesi, nell’innesto di piccolissimi lobuli di tessuto adiposo ottenuti mediante aspirazione tramite un’apposita ago-cannula e collocati nella sede ricevente mediante una

semplice iniezione transcutanea: pratica semplice ed economica.

Parte del grasso infatti potrebbe riassorbirsi, il rimanente, una volta attecchito, rimane nella sede di impianto permanentemente.

L’avvento del lipofilling dunque, pur non garantendone il completo attecchimento, mantiene stabile nel tempo il tessuto adiposo innestato.

Inizialmente tale effetto venne attribuito alla maggior facilità di attecchimento che i lobi adiposi di piccoli dimensioni avrebbero rispetto a maggiori volumi di tessuto.

Dopo le prime iniziali indicazioni come la riduzione di una ruga o il rigonfiamento labiale, se ne affiancarono altre più importanti, miranti a ricostruire o, meglio, ristrutturare alcune aree come orbite scavate, guance incavate o colpite dal morbo di Romberg, mani senili, genitali esterni, cicatrici depresse.

Il risultato non era solo l’incremento volumetrico, ma soprattutto il migliorato trofismo delle aree trattate8-9.

Si studiarono poi le modalità ideali per ottenere e prevedere il miglior risultato clinico: lavaggi, centrifugazioni, addizioni .

Gli studi degli ultimi dieci anni hanno rivelato che la capacità trofica degli innesti ottenuti con lipofilling dipende dalla presenza di cellule staminali all’interno del tessuto stesso (Adipose Derived Stem cells o ADSCs), dotate di potenzialità rigenerative analoghe alle cellule staminali mesenchimali estratte dal midollo osseo (Bone Mesenchimal Stem Cells o BMSCs)11-12.

Un grammo di tessuto adiposo contiene circa 5.000 cellule staminali mesenchimali, mentre un grammo di midollo osseo ne contiene da 100 a 1000.

Le ADSCs sono un relativamente nuovo sottotipo di MSCs che può essere ottenuta con metodi meno invasivi e in quantità maggiori rispetto ad altri MSCs. L’attività secretoria delle hMSCs aiuta a creare un microambiente con proprietà rigenerative nei siti di danno tissutale13.

E’ quindi da ritenere che la tecnica del lipofilling consista in realtà nell’autoinnesto di cellule staminali mesenchimali, presenti nel tessuto adiposo14.

La neurorigenerazione retinica cellulomediata Principi, applicazioni e prospettive

Figura 1: Sono mostrati alcuni esempi di positività per l’espressione di beta integrina 1 nelle cellule prelevate dallo strato vascolo-stromale mediante lipoaspirazione. Poiché l’espressione di beta integrina 1 è considerata tipica delle cellule staminali adipose, è possibile identificare alcune delle cellule estratte come cellule staminali mesenchimali. La positività è caratterizzata dalla colorazione marrone.

Le indicazioni del lipofilling si sono dunque moltiplicate e attualmente viene utilizzato per trattare patologie in cui è utile un impulso rigenerativo ulteriore, come nelle radiodermiti, nelle ustioni, nelle cicatrici ipotrofiche, nelle lesioni nervose, in ulcere e ferite A

difficili, nei trapianti cutanei con vascolarizzazione incerta, nella costruzione di tessuti ingegnerizzati15-20.

Le proprietà rigenerative delle ADSCs ottenute dalla frazione vascolostromale del tessuto adiposo è stata utilizzata per la riparazione di nervi periferici21-23.

B

Figura 2: La rigenerazione dei nervi appare migliorata dopo innesto di ADSCs. Sezioni trasversali semisottili della porzione distale dell’innesto nervoso sono stati sottoposti a colorazione blu di toluidina 12 settimane dopo chirurgia.

L’innesto nervoso non trattato con ADSCs (A, caso controllo) ha mostrato rigenerazione compromessa con remielinizzazione sottile.

L’innesto nervoso trattato con ADSCs (B) ha mostrato una maggiore densità di fibre nervose correttamente mielinizzate.

Barra della scala = 50 micron (21).

233

234

Capitolo 7: il lipofilling

Sulla base della letteratura Limoli et coll., che dal 2000 stanno studiando la possibilità di rigenerare, ristrutturare, conservare la retina attraverso innesti cellulari adiposi, hanno ragione di credere nell’applicazione del microlipofilling sovracoroideale al fine di

mantenere volume e trofismo del peduncolo adiposo impiantato sotto la sclera e di esercitare una azione trofica sulle cellule della coriocapillare, dell’epitelio pigmentato e della retina24-25.

1.

Billings E Jr, May JW Jr. Historical review and present status of free fat graft autotransplantation in plastic and reconstructive surgery. Plast Reconstr Surg; (1989) 83: 368-81.

2.

Mojallal A., Foyatier J.L Historique de l’utilisation du tissu adipeux comme produit de comblement en chirurgie plastique.

Ann chir plast esthet (2004) 49: 419-425.

3.

Neuber GA Fettransplantation. Chir Kongr Verhandl Dtsch Gesellsch Chir (1893) 22:66.

4.

Chaldakov G, Tonchev A, Tunsel N, Atanassova P, Aloe L. (2006) dipose tissue and mast cells. Adipokines as yin-yang modulators of inflammation. Nutrition and health: Adipose tissue and adipokines in health and disease, edited by G. Fantuzzi and T. Mazzoni, Humana Press Inc., Totowa, NJ (12): 147-154

5.

Trayhurn P, Beattie JH. Physiological role of adipose tissue: White adipose tissue as an endocrine and secretory organ. Proc Nutr Soc 2001; 60: 329-39. 5.

6.

Ahima RS, Prabakaran D, Mantzoros C, Qu D, Lowell B, Maratos-Flier E et al. Role of leptin in the neuroendocrine response to fasting. Nature 1996, Jul 18;382(6588):250-252.

7.

Ehrhart-Bornstein M, Lamounier-Zepter V, Schraven A. Human adipocytes secrete mineralcorticoid-releasing factors. Proc Natl Acad Sci USA 2003. 100: 14211-14216.

8.

Coleman SR. Structural fat grafting. Aesthet Surg J. 1998 Sep-Oct;18(5):386, 388.

9.

Coleman SR. Structural fat grafting: more than a permanent filler. Plast Reconstr Surg 2006 Sep;118(3 Suppl):108S-120S.

10. Gentile P, Orlandi A, Scioli MG, Di Pasquali C, Bocchini I, Curcio CB, Floris M, Fiaschetti V, Floris R, Cervell V. A comparative translational study: the combined use of enhanced stromal vascular fraction and platelet-rich plasma improves fat grafting maintenance in breast reconstruction. Stem Cells Transl Med. 2012 Apr;1(4):341-51.

11. Gronthos S, Franklin DM, Leddy HA, Robey PG, Storms RW, Gimble JM. Surface protein caracterization of human adipose tissue-derived stromal cells. J Cell Physiol. 2001 Oct;189(1):54-63.

12. Gimble JM. Adipose tissue-derived therapeutics. 2003 Aug;3(5):705-13.

13. Zuk PA, Zhu M, Mizuno H et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering, 2001. vol. 7, no. 2, pp. 211–228.

14. Zhu M, Heydarkhan-Hagvall S, Hedrick M, Benhaim P, Zuk P. Manual isolation of adipose-derived stem cells from human lipoaspirates. J Vis Exp. 2013 Sep 26;(79):e50585. doi: 10.3791/50585.

15. Nakagami H, Morishita R, Maeda K, Kikuchi Y, Ogihara T, Kaneda Y. Adipose tissue-derived stromal cells as a novel option for regenerative cell teraphy. J Atheroscler Thromb. 2006 Apr;13(2):77-81.

16. Costantino A, Fioramonti P, Ciotti M, Onesti MG. Lipofilling in skin affected by radiodermatitis: clinical and ultrasound aspects.

Case report. G Chir. 2012 May;33(5):186-90.

17. Blanton MW, Jhonstone BH, Hadad I, Mund JA, Rogers PI, March KL, Eppley BL. Vascularization during tissue injury repair is enhanced by topical treatment with adipose-derived stromal cells. Plast Reconstr Surg 2007, 120 (suppl): 11.

La neurorigenerazione retinica cellulomediata Principi, applicazioni e prospettive

18. Cervelli V, Gentile P, Grimaldi M. Regenerative surgery: use of fat grafting combined with platelet-rich plasma for chronic lower-extremity ulcers. Aesthetic Plast Surg. 2009 May;33(3):340-5.

19. Goessler UR, Hormann K and Riedel F: Tissue engineering with adult stem cells in reconstructive surgery. Int J Mol Med 2005, 15: 889-905.

20. Caplan AI. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. Journal of Cellular Physiology 2007. vol. 213, no. 2, pp. 341–347.

21. Liu GB, Cheng YX, Feng YK, Pang CJ, Li Q, Wang Y, Jia H, Tong XJ. Adipose-derived stem cells promote peripheral nerve repair.

Arch Med Sci. 2011 Aug;7(4):592-6.

22. Shen CC, Yang YC, Liu BS. Peripheral nerve repair of transplanted undifferentiated adipose tissue-derived stem cells in a biodegradable reinforced nerve conduit. J Biomed Mater Res A. 2012 Jan;100(1):48-63.

23. Erba P, Mantovani C, Kalbermatten DF, Pierer G, Terenghi G, Kingham PJ. Regeneration potential and survival of transplanted undifferentiated adipose tissue-derived stem cells in peripheral nerve conduits.J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2010 Dec;63(12):e811-7.

24. Limoli PG, Carpi R,Tassi, Vingolo EM, D’Amato LM, Giacomotti E, Solari R, Di Corato R. Adipocyties Subscleral Implant. Growth Factors May Be Considered A New Therapy of Atrophic Retinal Pathology? Invest. Ophthalmol. ARVO 2011 - Fort Lauderdale.

25. Limoli PG, Vingolo EM, Morales MU, Limoli C. ERG changes after suprachoroideal graft of autologous cells in AMD. ARVO 2014 – Orlando.

La tecnica La tecnica consiste nel prelevare un piccolo quantitativo di grasso attraverso una microliposuzione da una sede idonea (addome, fianchi, cosce, ginocchia) e nel

suo reimpianto in un altro distretto corporeo dello stesso individuo, in modo da ottenere un effetto di “filling”, cioè di riempimento.

Figura 3: Materiale necessario alla lipostruttura manuale e, previa centrifugazione del lipoaspirato, alla sua purificazione.

235

236

Capitolo 7: il lipofilling

L’innesto di grasso libero combinato con ADSCs gioca un ruolo molto importante nel mantenimento del volume del tessuto adiposo iniettato. Attualmente per la metodica del lipofilling è possibile utilizzare esclusivamente le ADSCs già presenti nel grasso libero prelevato dai pazienti mentre l’utilizzo di elevate concentrazioni di cellule staminali adipose differenziate in vitro non è ancora possibile in ogni sala operatoria. In primo luogo la preparazione, la progettazione e il mantenimento in vitro delle ADSCs è possibile solo in laboratori specializzati con tecniche adeguate (Cells Factory). Inoltre le conoscenze attuali non permettono di controllare le ADSCs una volta impiantate ed escludere che un’eventuale iperproliferazione possa degenerare in patologie tumorali.

La tecnica chirurgica del lipofilling è costituita da tre fasi ben distinte: prelievo di grasso, purificazione attraverso centrifugazione e infiltrazione nell’area da trattare.

elevate pressioni negative, per la vaporizzazione all’interno del tubo che li disidrata.

Le cellule adipose prelevate in tal modo, una volta infiltrate, non sono in grado di sopravvivere nel sito di impianto.

Una seconda possibilità è quella di utilizzare la metodica della lipostruttura.

Con tale metodica, al contrario, il grasso non viene aspirato tramite un comune liposuttore come avviene nella liposuzione, ma mediante una siringa da 10 ml con attacco Luer-lock e con una cannula di 3 mm. di diametro e 15, 23 o 36 cm. di lunghezza, i cui fori di ingresso hanno dimensioni tali da permettere il passaggio delle particelle di tessuto adiposo attraverso il lume dell’ago della siringa.

Una volta che la siringa è stata riempita dal grasso aspirato, la cannula viene rimossa e un tappo LuerLok viene posto sulla siringa per sigillare l’apertura4-5.

Prelievo

Prima di procedere all’aspirazione, viene praticata l’anestesia, introducendo attraverso la superficie dell’area del prelievo una grande quantità di soluzione di Klein nel grasso. La soluzione di Klein contiene, in rapporto, 500 ml di soluzione fisiologica, 150 mg di lidocaina e 0,5 mg di adrenalina. L’adrenalina provoca vasocostrizione riducendo il sanguinamento, la lidocaina induce anestesia locale, la soluzione fisiologica aiuta a ridurre le aderenze tra le cellule in previsione della successiva aspirazione che avviene circa 30 minuti dopo1-3.

Il prelievo di grasso può essere effettuato attraverso due metodiche: 1. Liposuzione 2. Lipostruttura Attraverso la liposuzione il grasso viene aspirato meccanicamente con una cannula a pressione negativa. Con la liposuzione, il rischio di alterare sia la struttura che la funzione cellulare è elevato: la liposuzione danneggia gli adipociti, oltre che per le

Figura 4: Cannula e successivo prelievo di tessuto adiposo dall’area prescelta.

La neurorigenerazione retinica cellulomediata Principi, applicazioni e prospettive

Figura 5: La cannula nel grasso sottocutaneo si muove con lieve aspirazione negativa aspirando nel proprio lume le cellule adipose.

E’ stato dimostrato che gli innesti di tessuto adiposo prelevati con la tecnica di Coleman, cioè con siringhe collegate a cannule, contengono una quantità maggiore di cellule vive, dotate di funzionalità e capacità di attecchire, rispetto agli innesti ottenuti mediante prelievo con aspirazione.

Questa osservazione è riconducibile al fatto che, aspirando a bassa pressione, il traumatismo del processo sulle cellule adipose è notevolmente ridotto.

Coleman ritiene che per proteggere gli adipociti durante il loro reimpianto, il prelievo deve mantenere la propria architettura strutturale lobulare: i frammenti devono essere abbastanza grandi per conservare la propria architettura strutturale, ma abbastanza piccoli per poter passare dalla cannula di 17-18 G6.

La purificazione (centrifugazione)

La fase successiva è la purificazione: una volta rimosso lo stantuffo, la siringa viene posizionata in una centrifuga sterilizzata e fatta centrifugare a 3000 rpm per tre minuti. Alcuni autori utilizzano velocità inferiori con tempi maggiori come 2500 rpm per 8 minuti o superiori (3500 rpm per 3 minuti).

Figura 6: Alla fine della lipostruttura, ecco come si presenta la siringa riempita del lipoaspirato. A questo punto si deve procedere alla sua purificazione.

Con la centrifugazione si formano nella siringa 3 strati: 1. lo strato superiore è oleoso e costituito essenzialmente da materiale fuoriuscito da cellule adipose traumatizzate; 2. lo strato inferiore è il più denso fra i tre ed è formato da sangue e soluzione fisiologica; 3. lo strato intermedio contiene cellule adipose vive

237

238

Capitolo 7: il lipofilling

che saranno poi infiltrate nella zona da correggere.

Lo strato intermedio verrà poi isolato e purificato.

Figura 7: Dopo la centrifugazione si osserva la disposizione del tessuto adiposo in tre strati, olio in alto grasso omogeneo nello strato intermedio e liquidi ematici nello strato inferiore.

Figura 8: Le centrifughe vengono utilizzate per creare una stratificazione del lipoaspirato o di altri liquidi biologici in modo da permettere l’utilizzo mirato dei singoli componenti.

Sia lo strato superiore che quello inferiore vengono rimossi rispettivamente usando stoppini assorbenti, esercitando con lo stantuffo una lieve pressione o lasciandolo fuoriuscire dalla siringa per gravità; nella siringa rimane il solo strato intermedio. E’ infatti necessario isolare il più possibile gli adipociti da trapiantare al fine di diminuire la risposta infiammatoria dopo il reimpianto; se nel sito ricevente sono presenti molti detriti cellulari si sviluppa un’intensa reazione infiammatoria con l’attivazione delle cellule della flogosi che vengono richiamate a pulire la zona interessata.

La centrifugazione non reca danno alle cellule adipose, ma è stato osservato che nel materiale ottenuto con questa metodica è presente il 13% di adipociti in meno rispetto al materiale ottenuto con la decantazione.Tuttavia, con la centrifuga viene eliminata la maggior parte delle cellule adipose distrutte7,8.

Inoltre, lo strato intermedio, quello ricco di cellule adipose integre e vitali, è a sua volta divisibile in tre strati, di cui il profondo e l’intermedio contengono rispettivamente il 250% e il 140% in più di adipociti vitali rispetto al superficiale, rappresentando la parte dello strato di tessuto adiposo più fertile.

La tecnica di Coleman utilizza come procedura di purificazione la centrifugazione, ma sono state messe a punto altre metodiche come il lavaggio, la decantazione e la filtrazione9,10.

Il lavaggio viene generalmente effettuato con soluzione di Ringer lattato. Non è una tecnica molto apprezzata in quanto si ritiene che possa danneggiare l’adipocita sia da un punto di vista meccanico che osmotico11-14.

La decantazione consente di purificare e isolare il tessuto adiposo da materiale non necessario e potenzialmente dannoso per l’instaurarsi di un processo flogistico, senza traumatizzare gli adipociti. Si tratta quindi di una metodologia piuttosto vantaggiosa, anche se comporta un aumento del tempo operatorio in confronto alla centrifugazione e, di conseguenza, il rischio di ossidazione delle cellule adipose che possono entrare in contatto con l’aria: una lunga esposizione all’aria può determinare la lipolisi del 50% degli adipociti15-17.

Figura 9: Decantazione (a sx) ed eliminazione del materiale sedimentato (a dx).

La neurorigenerazione retinica cellulomediata Principi, applicazioni e prospettive

La filtrazione è un metodo sconsigliato se effettuato con filtri metallici o posti all’interno del tubo di aspirazione, in quanto aumenta il traumatismo sulle cellule adipose. Alcuni autori la preferiscono alla centrifugazione18, perché meno traumatica se effettuata mediante raccolta del grasso su una garza posta su un recipiente, lavaggio ripetuto (4-5 volte) del tessuto raccolto con soluzione fisiologica ed esercizio su di esso di una leggera pressione, per eliminare i liquidi in eccesso. Il grasso concentrato viene trasferito in piccole siringhe collegate ad aghi di 16-18- 20 G18.

Il reimpianto

Il materiale adiposo così ottenuto, detto frazione vascolostromale del tessuto adiposo e ricco in ADSCs, deve essere infiltrato nei tessuti da ristrutturare.

Per l’innesto di piccole quantità di tessuto adiposo, è consigliato l’impiego di siringhe da 1 ml; la cannula deve essere smussa per evitare di danneggiare i tessuti e gli adipociti rilasciati e progettata al fine di indurre il minor trauma possibile durante l’infiltrazione. Noi utilizziamo all’uopo il venflon: il materiale acrilico di cui è costituito lo rende particolarmente interessante per il lipofilling sovracoroideale, dove, per la contiguità della retina è richiesta l’assoluta atraumaticità.

L’iniezione deve iniziare in profondità e creare un reticolo tridimensionale che consenta il contatto di tutti gli adipociti con il sito ricevente.

Figura 10: Per effettuare la filtrazione del tessuto adiposo lo si posiziona sopra una garza e si esercita con una spatola una lieve pressione su di esso per poter eliminare la parte liquida.

Si distinguono quattro modalità di iniezione: 1. iniezione immediata sub-dermica 2. iniezione immediata tridimensionale (tecnica di Coleman) 3. congelamento con iniezione frazionata differita 4. emulsione per aumento cutaneo autologo L’innesto deve avere piccole dimensioni in modo da indurre velocemente una nuova vascolarizzazione; se la zona da trattare è molto ampia è necessario procedere con l’impianto ripetuto di piccole quantità di grasso che, rispetto all’innesto unico, aumenta la sopravvivenza delle cellule adipose che, non essendo vascolarizzate, andrebbero incontro a necrosi certa.

A tal fine, è nata l’esigenza di conservare il tessuto adiposo prelevato in un’unica seduta attraverso il congelamento e la reiniezione a posteriori19,6.

1. Klein JA. Anesthetic formulation of tumescent solutions. Dermatol Clin. 1999 Oct;17(4):751-9, v-vi.

2. Venkataram J. Tumescent liposuction: a review. J Cutan Aesthet Surg. 2008 Jul;1(2):49-57.

3. Kucera IJ, Lambert TJ, Klein JA, Watkins RG, Hoover JM, Kaye AD. Liposuction: contemporary issues for the anesthesiologist. J Clin Anesth. 2006 Aug;18(5):379-87. Review.

4. Coleman SR. Structural fat grafting. Aesthet Surg J. 1998 Sep-Oct;18(5):386, 388.

5. Ellenbogen R. Fat transfer: current use in practice. Clin Plast Surg. 2000 Oct;27(4):545-56 6. Illouz YG. The fat cell “graft”: a new technique to fill depressions. Plast Reconstr Surg. 1986 Jul;78(1):122-3.

7. Illouz YG, Pfulg ME. Selective lipectomy and lipolysis after Illouz. Handchir Mikrochir Plast Chir. 1986 May;18(3):118-21.

8. Sidman RL. Histogenesis of brown adipose tissue in vivo and in organ culture. Anat Rec. 1956 Mar;124(3):581-601.

239

240

Capitolo 7: il lipofilling

9. Lewis CM. The current status of autologous fat grafting. Aesthetic Plast Surg. 1993 Spring;17(2):109-12.

10. Boschert MT, Beckert BW, Puckett CL, Concannon MJ. Analysis of lipocyte viability after liposuction. Plast Reconstr Surg. 2002 Feb;109(2):761-5; discussion 766-7.

11. Coleman SR. Facial recontouring with lipostructure. Clin Plast Surg. 1997 Apr;24(2):347-67.

12. Sommer B, Sattler G. Current concepts of fat graft survival: histology of aspirated adipose tissue and review of the literature.

Dermatol Surg. 2000 Dec;26(12):1159-66.

13. Mojallal A, Foyatier JL. The effect of different factors on the survival of transplanted adipocytes. Ann Chir Plast Esthet. 2004 Oct;49(5):426-36.

14. Asken S. Autologous fat transplantation: micro and macro techniques. Am J. Cosm.Surg. 1987. 4: 111-121 15. Ersek RA, Chang P, Salisbury MA. Lipo layering of autologous fat: an improved technique with promising results. Plast Reconstr Surg. 1998 Mar;101(3):820-6.

16. Khater R, Atanassova P, Anastassov Y, Pellerin P, Martinot-Duquennoy V.Clinical and experimental study of autologous fat grafting after processing by centrifugation and serum lavage. Aesthetic Plast Surg. 2009 Jan ;33(1):37-43. doi: 10.1007/ s00266-008-9269-9. Epub 2008 Nov 20 .

17. Condé-Green A, de Amorim NF, Pitanguy I. Influence of decantation, washing and centrifugation on adipocyte and mesenchymal stem cell content of aspirated adipose tissue: a comparative study. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2010 Aug;63(8):1375-81.

18. Kuran I, Tumerdem B. A new simple method used to prepare fat for injection. Aesthetic Plast Surg. 2005 Jan-Feb;29(1):18-22; 19. Rieck B, Schlaak S. Measurement in vivo of the survival rate in autologous adipocyte transplantation. Plast Reconstr Surg.

2003 Jun;111(7):2315-23.

Fattori che influenzano il successo del lipofilling Il successo di un intervento di lipofilling dipende essenzialmente dalla sopravvivenza del tessuto adiposo trapiantato nell’area da correggere.

La vitalità del trapianto delle cellule adipose può essere spiegata da due teorie: la teoria della sostituzione cellulare dell’ospite e la teoria degli adipociti superstiti che sembra incontrare maggior favore in tempi più recenti1,2.

Secondo la teoria della sostituzione cellulare dell’ospite, proposta da Tuffier prima e da Koll poi nei primi anni del secolo scorso, la sofferenza dell’innesto determina il richiamo di istiociti che eliminano i detriti cellulari. Nel sito si realizza una reazione fibrosa per l’afflusso di fibroblasti. Gli istiociti assumono le caratteristiche degli adipociti e li sostituiscono interamente; in altre parole, l’innesto di tessuto adiposo

genera, per induzione, la formazione di nuovo tessuto adiposo a livello locale3.

Secondo la teoria degli adipociti superstiti, sostenuta da Coleman e altri autori, gli adipociti trapiantati sopravvivono e continuano i loro cicli di crescita a livello del sito ricevente. Inizialmente, attraversano una fase ischemica con il richiamo di macrofagi, istiociti e polimorfonucleati che ripuliscono il sito dai detriti cellulari; successivamente (di solito al quarto giorno), grazie alla neoangiogenesi dell’ospite, inizia la rivascolarizzazione centripeta dell’innesto. La vascolarizzazione del grasso centrale, che subisce quindi un’ischemia prolungata, non avviene, a meno che il trapianto non coinvolga innesti di piccole dimensioni4-6 .

Dunque tutto ciò che ostacola la rivascolarizzazione e la sopravvivenza cellulare nell’ambito del filling ridu-

La neurorigenerazione retinica cellulomediata Principi, applicazioni e prospettive

ce l’efficacia clinica del trattamento.

Dobbiamo considerare poi che il tessuto adiposo è piuttosto fragile e per preservare la vitalità degli adipociti trapiantati, oltre ad una manipolazione delicata del materiale cellulare da utilizzare, vanno considerati una serie di fattori riguardanti le sequenze che costituiscono l’intero processo, l’anestesia, le tecniche di reiniezione, il trattamento post-operatorio.

E’ fondamentale che le fasi di prelievo, raccolta e reiniezione del grasso siano le meno traumatiche possibili; in caso contrario, la sopravvivenza delle cellule adipose risulta limitata e così la loro capacità di attecchire nella nuova sede.

Quantità

La quantità di grasso iniettato è limitata dalla disponibilità del sito donatore e dal volume del sito ricevente. Così, correzioni significative spesso richiedono più di una procedura proprio per favorire la sopravvivenza degli adipociti. Il grasso è prelevato a livello di zone corporee in cui il tessuto adiposo è abbondante o in eccesso. Occorre anche tener conto del fatto che gli adipociti, in base al loro sito di origine, non hanno tutti la stessa grandezza o la stessa attività lipogenetica.

Sito

I distretti maggiormente utilizzati per il prelievo sono la regione trocanterica, la faccia interna delle cosce e la regione periombelicale. Fulton considera come miglior sito donatore quello della regione trocanterica poiché le cellule adipose di questo distretto sono più voluminose ed hanno un’attività lipoprotein-kinasica più elevata7,8.

Niechajev preferisce il grasso prelevato dalla parte interna delle cosce perché più vascolarizzato9.

Coleman non è ancora in grado di affermare quale sia la zona migliore per il prelievo10,11.

Tuttavia, la longevità degli adipociti in funzione dei differenti siti donatori è ancora in fase di ricerca e altri studi hanno evidenziato che non sembrano esserci grandi differenze sulla qualità del grasso in relazione al sito di prelievo12-14.

Anche il sito ricevente ha un ruolo molto importante per la sopravvivenza dell’innesto: una zona priva di

precedenti traumatismi o patologie è ben più predisposta ad accettare l’innesto rispetto ad un tessuto cicatriziale che pone maggiore resistenza ed è meno vitale e malleabile. Alcuni autori ritengono che il miglior sito ricevente sia il muscolo e che l’innesto abbia più probabilità di attecchire grazie all’abbondante vascolarizzazione di quest’area. Secondo altri, invece, l’innesto nel muscolo determina l’insorgenza di un ematoma che può portare alla lisi delle cellule adipose. La coroide sembra dare ottime garanzie da questo punto di vista e, in generale, i distretti maggiormente vascolarizzati sono i migliori15.

Anestesia

Altro aspetto da non sottovalutare è il tipo di anestesia e più specificatamente l’effetto dell’anestetico iniettato. In particolare, sono stati valutati gli effetti di lidocaina e adrenalina sul tessuto adiposo, osservando che gli adipociti infiltrati con la sola lidocaina subiscono un’inibizione del trasporto di glucosio, della lipolisi e della crescita in coltura, mentre in quelli infiltrati con lidocaina e adrenalina non è evidenziabile nessuna alterazione del metabolismo e della funzionalità. Questi risultati sono indicativi di un effetto negativo della lidocaina più che dell’adrenalina sulle cellule adipose16.

Autori come Coleman preferiscono ricorrere all’anestesia generale o loco regionale e ad un’anestesia locale per il trattamento di piccole aree; quest’ultima viene invece sconsigliata da Chajchir per il maggior danno che reca agli adipociti17,18.

Sotto anestesia locoregionale o generale, gli adipociti mostrano maggiore vitalità, mentre con l’iniezione di vasocostrittori e di grandi quantità di soluzione fisiologica a livello del sito donatore o ricevente la loro vitalità diminuisce. Inoltre, l’anestesia locale induce modificazioni del volume del sito ricevente rendendo più difficile la valutazione del quantitativo di grasso da inniettare.

Additivi biologici

E’ possibile aumentare il tasso di sopravvivenza di queste cellule associando all’innesto fattori ormonali e fattori di crescita. L’insulina, l’IGF-1 (Insulin-Like

241

242

Capitolo 7: il lipofilling

Growth Factor -1), il bFGF (Basic Fibroblastic Growth Factor) o un mix di questi fattori aumentano infatti il tasso di sopravvivenza cellulare, agendo sui preadipociti presenti nell’innesto di grasso19.

Inoltre, se l’ambiente di coltura viene arricchito con aminoacidi, vitamine, glucosio, oligoelementi, fattori di crescita, insulina e tiroxina si passa da una sopravvivenza a 4 mesi del 31% ad una del 44%20,21.

Alcuni autori hanno notato una maggior sopravvivenza cellulare se il lipoaspirato viene trattato con Coenzima Q1022.

Molti autori preferiscono comunque perfezionare il procedimento dalla raccolta al reinnesto piuttosto che usare fattori di crescita supplementari23.

Tecnica di reimpianto

Anche le modalità di reimpianto influenzano la buona riuscita del lipofilling: gli strumenti utilizzati, le dimensioni, la forma, il diametro e il volume della cannula o dell’ago impiegati per l’iniezione sono tutti aspetti da valutare attentamente prima di procedere all’intervento. Per l’innesto di piccole quantità di tessuto adiposo, Coleman consiglia di utilizzare durante l’infiltrazione cannule smusse per evitare di danneggiare i tessuti e gli adipociti. L’iniezione deve iniziare in profondità e creare un reticolo tridimensionale che consenta il contatto di tutti gli adipociti con il sito ricevente24.

Alcuni autori più recentemente utilizzano per il prelievo cannule con microfori multipli per selezionare gli agglomerati cellulari adiposi, da reimpiantare, previa centrifugazione lavaggio e filtraggio, con cannule

più piccole, di 27 G, da utilizzare in microimpianti volti al ringiovanimento del tessuto trattato. Con tale metodica cellule staminali CD34+ sono risultate presenti e vitali nel lipoaspirato25.

Nel lipofilling sovracoroideale si utilizzano le cannule in materiale plastico con punta smussa dei venflon.

Pratiche di congelamento

Se si deve provvedere a innesti ripetuti nel tempo è possibile praticare il congelamento del lipoaspirato per poter disporre di materiale cellulare senza praticare liposuzioni o lipostrutture. Naturalmente le modalità con cui avviene il congelamento influenzano la vitalità degli adipociti e ad oggi i risultati ottenuti sono piuttosto contrastanti.

Coleman ha proposto la crioconservazione del grasso prelevato fino ad una temperatura di -30° C, ottenendo buoni risultati. Infatti, dopo scongelamento ad uno, tre e sei mesi, il numero di cellule vitali era tale da rendere l’innesto funzionale.

Altri autori hanno ottenuto risultati soddisfacenti congelando gli adipociti prelevati ad una temperatura di -20° C e conservandoli per due mesi. Lafontan ritiene invece che il congelamento delle cellule adipose sia un processo dannoso e distruttivo e che riduca il loro tasso di sopravvivenza in modo direttamente proporzionale alla durata del tempo di conservazione26.

Ad oggi, si ritiene che il congelamento effettuato lentamente fino a una temperatura di -20° C, seguito da scongelamento a due mesi, non provochi effetti dannosi sulla qualità dell’innesto e consenta di mantenere un’alta percentuale di cellule vitali.

1.

Guerney CE. Experimental study of behaviour the free fat transplants. Surgery 1938. 3:679-692.

2.

Peer LA. Cell survival theory versus replacement theory. Plast Reconstr Surg (1946). 1955 Sep;16(3):161-8.

3.

Tuffier T. Des graffes de cartilage et d’os humain dans les resections articulaires. Bull Mem Soc Chir Paris 1911; 39: 1078—1096.;

4.

Neuber GA Fettransplantation. Chir Kongr Verhandl Dtsch Gesellsch Chir (1893) 22:66

5.

Van de Graaf RC, Korteweg SFS. Gustav Adolf Neuber (1850-1932) and the First Report on Fat Auto-Grafting in Humans in 1893.

Hist Plast Surg 2010;1(1):7-11.

6.

Coleman SR. Long-term survival of fat transplants: controlled demonstrations. Aesthetic Plast Surg. 1995 Sep-Oct;19(5):421-5.

La neurorigenerazione retinica cellulomediata Principi, applicazioni e prospettive

7.

Fulton JE, Parastouk N. Fat grafting. Dermatol Clin. 2001 Jul;19(3):523-30, ix.

8.

Fulton JE, Suarez M, Silverton K, Barnes T. Small volume fat transfer. Dermatol Surg. 1998 Aug;24(8):857-65.

9.

Niechajev I. Geographic update. Plast Reconstr Surg. 2005 Dec;116(7):2038.

10. Coleman SR. Long-term survival of fat transplants: controlled demonstrations. Aesthetic Plast Surg. 1995 Sep-Oct;19(5):421-5.

11. Coleman SR. Structural fat grafts: the ideal filler? Clin Plast Surg. 2001 Jan;28(1):111-9.

12. Moore JH Jr, Kolaczynski JW, Morales LM, Considine RV, Pietrzkowski Z, N oto PF.Viability of fat obtained by syringe suction lipectomy: effects of local anesthesia with lidocaine. Aesthetic Plast Surg. 1995. 19: 335–339.

13. Viterbo F, Marques M,Valente M. Fat-tissue injection versus graft: experimental study in rabbits. Ann Plast Surg. 1994 Aug;33(2):18492.

14. Sommer B, Sattler G. Current concepts of fat graft survival: histology of aspirated adipose tissue and review of the literature.

Dermatol Surg. 2000 Dec; 26(12):1159-66.

15. Rieck B, Schlaak S. Measurement in vivo of the survival rate in autologous adipocyte transplantation. Plast Reconstr Surg. 2003 Jun;111(7):2315-23.

16. Illouz YG. Body contouring by lipolysis: a 5-year experience with over 3000 cases. Plast Reconstr Surg. 1983 Nov;72(5):591-7.

17. Chajchir A. Fat injection: long-term follow-Up. Aesthetic Plast Surg. 1996 Jul-Aug;20(4):29118. Chajchir A, Benzaquen I, Wexler E, Arellano A. Fat injection. Aesthetic Plast Surg. 1990 Spring;14(2):127-36.

19. Yuksel E, Weinfeld AB, Cleek R et al. Increased free fat-graft survival with the long-term, local delivery of insulin, insulin-like growth factor-I, and basic fibroblast growth factor by PLGA/PEG microspheres. Plast Reconstr Surg 105:1712, 2000.

20. Ayhan M, Senen D, Adanalii G, Gorgu M et al: Use of beta-blockers for increasing survival of free fat grafts. Aesth Plast Surg 25:338-242,2001.

21. Moscona R, Shoshani O, Lichtig H, Karnieli E. Viability of adipose tissue injected and treated by different methods: an experimental study in the rat. Ann Plast Surg. 1994 Nov;33(5):500-6.

22. Witort EJ, Pattarino J, Papucci L, Schiavone N, Donnini M, Lapucci A, Lulli M, Lo Russo G, Mori A, Dini M, Capaccioli S. Autologous lipofilling: coenzyme Q10 can rescue adipocytes from stress-induced apoptotic death. Plast Reconstr Surg. 2007 Apr 1;119(4):11919.

23. Jauffret JL, Champsaur P, Robaglia-Schlupp A, Andrac-Meyer L, Magalon G. [Arguments in favor of adipocyte grafts with the S.R. Coleman technique]. Ann Chir Plast Esthet. 2001 Feb;46(1):31-8.

24. Illouz YG. The fat cell “graft”: a new technique to fill depressions. Plast Reconstr Surg. 1986 Jul;78(1):122-3.

25. Tonnard P, Verpaele A, Peeters G, Hamdi M, Cornelissen M, Declercq H. Nanofat grafting: basic research and clinical applications.

Plast Reconstr Surg. 2013 Oct;132(4):1017-26. doi: 10.1097/PRS.0b013e31829fe1b0.

26. Lafontan M, Bouloumie A. Angiogenèse : une implication physiologique de plus pour la leptine. Méd/Sci 1999. 15: 382-1185.

243