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MANUAL DE TÉCNICAS

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MANUAL DE TÉCNICAS

El presente manual se compone por los siguientes puntos:

1. OBJETIVOS: 2. Técnica para determinación de % de materia seca a 60°C 3. Técnica para determinación de % materia seca a 105°C 4. Técnica para determinación de % ceniza 5. Técnica para determinación de % extracto etéreo 6. Técnica para determinación de % fibra FDN y FDA 7. Técnica para determinación % de lignina

8. Técnica para determinación de fosforo 9. Técnica para determinación de proteína

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MANUAL DE TÉCNICAS

1. OBJETIVOS: a. Participar en la formación de profesionistas capacitados en el uso de técnicas de laboratorio e interpretación de resultados de análisis de forrajes, alimentos y otros productos. b. Apoyar el desarrollo de proyectos de investigación, relacionados con la producción de forrajes y nutrición animal. c. Ofrecer servicio de análisis bromatológicos de forrajes, alimentos y otros productos agropecuarios a productores pecuarios y de forrajes y a empresas del ramo. d. Fortalecer la relación entre el Cuerpo Académico 336 del Centro Universitario de Los Altos y el sector productivo, en este caso el sector forrajero y de nutrición animal, a través de la difusión de información generada con investigación. e. Fortalecer la formación de redes entre el Cuerpo Académico 336 del Centro Universitario de Los Altos y otras instituciones de investigación, regionales, nacionales e internacionales.

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MANUAL DE TÉCNICAS

2. Técnica para determinación de % de materia seca a 60°C

2.1. Introducción: La humedad se expulsa por medio de aire caliente en circulacion. La temperatura del aire se regula para efectuar un maximo de secado y un minimo de perdidas de sustancias volatiles. Este procedimiento es un metodo indirecto para la determinacion de humedad. 2.2. Objetivo: Deshidratar la muestra por medio de calor y aire en circulación, para determinar la cantidad de materia seca de esta muestra y de ahí partir para realizar los analis posteriores. 2.3. Material y equipo: Deshidratadora Balanza analitica Charolas de aluminio Estufa de alta resistencia Pinzas de acero inoxidable 2.4. Procedimiento: a. Colocar la charola de aluminio en una estufa de alta resistencia a 105°C durante una hora. b. Retirar la charola de la estufa con las pinzas de acero y colocarla en desecador durante una hora para poder obtener un peso constante. c. Identificar nuestra charola con un numero, pesarla y registrar el peso. Elaboró

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MANUAL DE TÉCNICAS d. Agregar aproximadamente 200gr de la muestra sobre la charola (la cantidad de muestra dependera del tipo de alimento con el que se este trabajando) y registrar el dato. e. Colocar la charola en la deshidratadora y dejarla dentro de 48 a 92 hrs, dependiendo el ingrediente del cual se trate, a una temperatura de 60°C, con aire en circulacion a velocidad baja. f. Retirar la charola de la deshidratadora, y colocarla 1 hora en desecador para obtener un peso constate. g. Pesar la caharola y registrar el dato.

2.5. Tabla de tiempos para el deshidratado: Ingrediente

Ensilaje de Maíz EM Rastrojo sin maíz RSM Rastrojo con maíz RCM Alfalfa heno AH Avena heno AVH Sorgo heno SH Sorgo Concentrado Semilla de algodón Pasto Pasto fibroso Minerales Premezcla de vitaminas y minerales PVM Excretas

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Cantidad de muestra (gr)

200-230 gr 80-100 gr

18-35 % 90-95 %

Tiempo de secado en la deshidratadora a 60°C con flujo de aire a baja velocidad 48-72 hrs 48 hrs

80-100 gr

90-95 %

48 hrs

80-100 gr 80-100 gr 80-100 gr 80-100 gr 200-230 gr

80-90 80-90 80-90 80-90 88-91 80-90 13-25 13-25 97-99 97-99

48 48 48 48 48 48 48 48 48 48

100-150 100-150 200-250 200-250

gr gr gr gr

% Materia seca aproximado

% % % % % % % % % %

hrs hrs hrs hrs hrs hrs hrs hrs hrs hrs

350 gr

13-18 %

72-92 hrs

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MANUAL DE TÉCNICAS 2.6. Calculos

%MS = W3-W1 . (100) . W2 W1= Peso de la charola W2= Peso de la muestra W3= Peso de la charola + residuo

2.7. Ejemplo: Num. De muestra

Num. De charola

W1 (Peso de la charola)

W2 (Peso de la muestra)

W3 (Peso de la charola + residuo

1

17

19.1gr

223.6 gr

220.9 gr

% MATERIA SECA = (220.9) - (19.1) . (223.6)

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(100) = 90.25

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MANUAL DE TÉCNICAS 2.8. Bibliografia Oficial Methods of Analysis of the Associatio of Official Analytical Chemists, 15 th. Arlington, USA. 1990. Sosa D.P.E. 1981 Manual de procedimientos analíticos para alimentos de consumo animal Chapingo México. Tejeda de Hernández I. 1992 Control de Calidad y Análisis de alimento para Animales. Sistemas de Educación Continua en Producción Animal en México, A.C., México. Manual AOAC, 16th Edition, OFFICIAL METHOD 930.15.

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MANUAL DE TÉCNICAS

3. Técnica para determinación de % materia seca a 105°C

3.1. Introducción: El agua es un nutrimento esencial. Sin embargo el agua no contribuye al valor nutritivo de un alimento, excepto en condiciones especiales de aridez. Por el contrario diluye el contenido de nutrimentos sólidos y los hace más susceptibles de sufrir fenómenos de descomposición por enzimas tisulares, bacterianas o de hongos. 3.2. Objetivo: Determinar el porcentaje de materia seca y humedad existente en el alimento para poder calcular diferentes nutrientes presentes en el alimento en base seca. 3.3. Material y equipo: Estufa de alta resistencia Crisol de porcelana Pinzas de acero inoxidable Desecador Balanza analítica 3.4. Procedimiento: a. Colocar el crisol en la estufa de alta resistencia a 105°C durante una hora y pasar a desecador nuevamente una hora con las pinzas para obtener un peso constante. Elaboró

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UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA CENTRO UNIVERSITARIO DE LOS ALTOS DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOMÉDICAS E INGENIERÍA DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS LABORATORIO DE FORRAJES Y NUTRICIÓN ANIMAL

MANUAL DE TÉCNICAS b. Pesar el crisol en la balanza analítica, colocándolo con las pinzas dentro de esta para evitar trasmitirle humedad. c. Registrar el número de crisol y el peso del mismo. d. Tarar el peso del crisol y agregar un gramo de muestra. e. Colocar el crisol con las pinzas dentro de la estufa a una temperatura de 105°C durante 24 horas. f. Trascurridas las 24 horas, colocar el crisol con las pinzas dentro del desecador durante 1 hora para obtener un peso constante. g. Posteriormente, pesar el crisol más el residuo y registrar el peso. h. Terminada la práctica lavar el crisol con agua y jabón y enjuagar con agua destilada. NOTA: Todos los pesos deben ser registrados, es decir el peso del crisol, el peso de la muestra y el peso del crisol más el residuo. 3.5. Calculo: % MS = (W3) – (W1) . (W2)

(100)

W1= Peso de crisol W2= Peso de muestra W3= Peso de crisol +residuo

3.6. Ejemplo: Num. De muestra 1

Num. de crisol 192

W1 (Peso de crisol) 19.4916 gr

% MS = (21.4369) – (19.4916) . (2.0036) Elaboró

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W2 (Peso de muestra) 2.0036 gr

W3 (Peso de crisol +residuo) 21.4369 gr

(100) = 97.09 Vo. Bo.

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MANUAL DE TÉCNICAS 3.7. Bibliografía: Oficial Methods of Analysis of the Associatio of Official Analytical Chemists, 15 th. Arlington, USA. 1990. Sosa D.P.E. 1981 Manual de procedimientos analíticos para alimentos de consumo animal Chapingo México. Tejeda de Hernández I. 1992 Control de Calidad y Análisis de alimento para Animales. Sistemas de Educación Continua en Producción Animal en México, A.C., México.

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MANUAL DE TÉCNICAS

4. Técnica para determinación de % ceniza

4.1. Introducción: El material mineral es el residuo de la calcinación de la muestra, es decir la eliminación de la materia orgánica y el agua. Nutricionalmente esta fracción es demasiado cruda y carece de importancia, ya que no indica que minerales la componen, y en qué proporción se encuentra. Sin embargo, es el punto de partida en la determinación de materiales específicos como Ca, K, Mg, Na, P, Fe, Mn, Cl, S, Cu, Co, Zn, Mo, Se, y Si; además es necesario para el cálculo de la materia orgánica de un alimento. 4.2. Objetivo: Obtener el conocimiento y la importancia de la materia orgánica e inorgánica y tener la habilidad de separar ambos contenidos de un alimento. 4.3. Material y equipo: Mufla Balanza analítica Crisol de porcelana Desecador Pinzas de acero inoxidable 4.4. Procedimiento: a. Colocar el crisol en la estufa de alta resistencia a 105°C durante una hora y pasar a desecador nuevamente una hora con las pinzas para obtener un peso constante. Elaboró

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UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA CENTRO UNIVERSITARIO DE LOS ALTOS DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOMÉDICAS E INGENIERÍA DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS LABORATORIO DE FORRAJES Y NUTRICIÓN ANIMAL

MANUAL DE TÉCNICAS b. Pesar el crisol en la balanza analítica, colocándolo con las pinzas dentro de esta para evitar trasmitirle humedad. c. Registrar el número de crisol y el peso del mismo. d. Tarar el peso del crisol y agregar un gramo de muestra. e. Colocar el crisol con las pinzas dentro de la mufla, encender la mufla y esperar a que la temperatura alcance los 600°C para comenzar a contar el tiempo de calcinación. f. Las muestras deben permanecer en mufla 24 horas. g. Transcurrido el tiempo apagar la mufla y dejar que la temperatura descienda a 100 C. h. Colocar los crisoles en desecador con las pinzas de acero inoxidable y dejar enfriar durante 1 hora para obtener un peso constante. i. Pesar los crisoles más el residuo en la balanza analítica.

NOTA: Para esta técnica pueden ser utilizados los crisoles con residuo de la técnica de determinación de materia seca a 105°C. Después de haber pesado los crisoles con residuo, de la técnica de determinación de humedad, estos se colocan en la mufla para determinar ceniza. No abrir la mufla cuando este incinerando. 4.5. Calculo: % CENIZAS= (W3) – (W1) . (W2)

(100)

W1= Peso de crisol W2= Peso de muestra W3= Peso de crisol + residuo 100 - % Cenizas = Materia Orgánica

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MANUAL DE TÉCNICAS 4.6. Ejemplo: Num. de crisol

W1 (Peso de crisol)

192

19.4916 gr

W2 (Peso de muestra) 2.0036 gr

% CENIZAS= (19.8875) – (19.4916) . (2.0036)

(100) =

W3 (Peso de crisol +residuo) 19.8875 g

19.76

100 – 19.76 = 80.24% Materia Orgánica

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MANUAL DE TÉCNICAS 4.7. Bibliografía AOAC 16 ht Edition, OFFICIAL METHOD 942.05

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MANUAL DE TÉCNICAS

5. Técnica para determinación de % extracto etéreo

5.1. Introducción: Los aceites y grasa presentes en la muestra seca, se extraen para cuantificarse con un solvente orgánico. Por este método se extrae también otras sustancias solubles en estos solventes como ceras y pigmentos. En el caso de forrajes verdes ricos en clorofila y pigmentos el método descrito sobre estima el contenido de grasa. 5.2. Objetivo: Tener la capacidad de separar la fracción soluble por medio de hexano y determinar la cantidad de ceras, ácidos grasos, pigmentos y vitaminas en ingredientes para consumo animal. 5.3. Material y equipo: Soxleth Balanza analítica Estufa Desecador Hexano

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Material de cristalería Hexano Papel filtro de poro medio Bomba recirculadora de agua.

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MANUAL DE TÉCNICAS 5.4. Procedimiento: a. Pesar en un papel filtro de poro medio, aproximadamente 2gr de muestra. b. Colocar la muestra en un dedal de celulosa que permita el paso rápido del solvente. c. Pesar el matraz bola seco y después de haber permanecido una hora en desecador para obtener un peso constante. d. Agregar hexano en el matraz (aproximadamente el 60% de la capacidad del mismo, es decir si la capacidad del matraz es de 250ml, debemos agregar dentro de él 150ml de hexano). e. Colocar la cristalería con la muestra en el soxleth. f. Conectar el equipo a una corriente eléctrica de 220 volts y la bomba a una corriente eléctrica de 110 volts. g. Girar las perillas hasta 360 C. h. Cuando comience a gotear uniformemente el hexano (de 5 a 6 gotas por min) sobre todas las muestras, comenzar a contar el tiempo de recirculación del hexano (2hrs). i. Trascurridas las dos horas debemos retirar el dedal con la muestra de la cristalería y recuperar el hexano. j. Colocar el matraz con el residuo en la estufa a 100 °C durante una hora. k. Trascurrido el tiempo en estufa, introducir los matraces durante una hora en el desecador. l. Posteriormente pesar los matraces, colocándolos con pinzas en la balanza analítica. m. Lavar los matraces bola con una solución de hidróxido de sodio y agua 1:10 NOTA: deben registrarse los pesos del matraz seco a peso constate, la muestra y el matraz con el residuo a peso constante.

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MANUAL DE TÉCNICAS 5.5. Cálculos: % EXTRACTO ETEREO= (W3) – (W1) . (W2)

(100)

W1= Peso del matraz W2= Peso de muestra W3= Peso del matraz + residuo

5.6. Ejemplo:

Num. De muestra

Num. De matraz

1

1

W1 (Peso del matraz) 108.4988 gr

W2 (Peso de muestra) 2.0035 gr

% EXTRACTO ETÉREO= (108.5134) – (108.4988) . (2.0035)

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W3 (Peso del matraz + residuo) 108.5134

(100) =

0.73

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MANUAL DE TÉCNICAS 5.7. Bibliografía: Castellanos, R. A., Llamas, L. G. y Shimada A. 1990. Manual de Técnicas de Investigación en Ruminología. México1990.

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MANUAL DE TÉCNICAS

6. Técnica para determinación de % fibra FDN y FDA

6.1. Introducción: Los monogástricos (aves y cerdo) se caracterizan por tener un estómago relativamente simple, con funciones de digestión y absorción en el tracto intestinal mediante mecanismos enzimáticos y bioquímicos. La alimentación de estos animales se debe basar en productos que se puedan digerir enzimáticamente, es decir, que se puedan desdoblar y absorber principalmente en el intestino delgado para poder obtener un buen grado de asimilación y utilización de los nutrientes con fines productivos. Los rumiantes (bovinos, ovinos y caprinos) poseen un estómago complejo, de importancia fundamental en los procesos de digestión y absorción. En los cuatro compartimentos que tiene su estómago (rumen, retículo, omaso y abomaso) se desarrollan procesos digestivos y de fermentación microbiana, que permiten al animal utilizar grandes cantidades de forrajes fibrosos y hacen posible la inclusión de compuestos nitrogenados no proteicos en su programa de alimentación. Las materias primas con altos contenido de fibra (pastos, forrajes, cascarillas, etc.) sufren a nivel del rumen un proceso de fermentación microbiana que permite la transformación de carbohidratos complejos (celulosa, hemicelulosa y lignina) en ácidos grasos volátiles y en glucosa. En esta forma son aprovechados por el rumiante como fuente de energía útil. Por otra parte, los microorganismos ruminales tienen la capacidad de transformar los compuestos nitrogenados no proteicos en proteína que es digerida y absorbida por el intestino delgado.

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MANUAL DE TÉCNICAS Fibras solubles e insolubles: Fibras insolubles o carbohidratos estructurles, disponibles solo para rumiantes.

Celulosa Lignina Hemicelulosa

Salvado de avena Nueces Cebada Lentejas Manzana Papas

Pectina Fibra de soya Inulina Remolacha

Fibras solubles

Granos enteros Salvado de trigo Cereal integral

Basándonos en la importancia de las fibras, sobre todo en los rumiantes, la siguiente técnica nos permite captar la capacidad de los detergentes para solubilizar proteínas y almidones para evitar así su interferencia en el aislamiento de las fibras. 6.2. Objetivo: Este método nos permite determinar la fracción de fibras estructurales que contiene la pared celular, tales como celulosa, hemicelulosa y lignina; solubilizando proteínas y almidones. Además de diferenciar la cantidad que existe de ellas a partir de FDN y FDA. El método para la determinación de la fibra detergente neutro, nos da como resultado el residuo que queda después de digerir una muestra en una solución detergente, predominando la hemicelulosa, la celulosa y la lignina. Elaboró

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MANUAL DE TÉCNICAS El método para la determinación de la fibra detergente acido, nos da como resultado el residuo que queda después de digerir una muestra en una solución detergente, eliminando la hemicelulosa y predominando, la celulosa y la lignina. Estos métodos pueden ser aplicados a granos, forrajes, y a todos los alimentos que contengan fibra. 6.3. Material y equipo: ANKOM A200 ANKOM RD Dryer, 120v Balanza analítica Termoplatos Desecador Pipeta Vasos de precipitado Fiber Filter bags F-57 Sulfito de sodio Alfa amilasa Detergente FDN Detergente FDA Agua destilada Acetona 6.4. Procedimiento: 6.4.1. Preparación del detergente FDN: a. Agregar 3.5lt de agua bidestilada sobre un vaso de precipitado y colocarlo sobre el termoplato. Elaboró

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MANUAL DE TÉCNICAS b. Posteriormente agregar en el agua una porción del reactivo con su solución, calentando y agitando la solución hasta que esté totalmente disuelto. c. Repetir este proceso 5 veces hasta obtener 17lt aproximadamente de la solución en un garrafón y aforar hasta 20lt con agua bidestilada. 6.4.2. Preparación del detergente FDA: a. Mezclar 10lt de agua bidestilada con 535ml de ácido sulfúrico. b. Agregan 3.5 lt de esta solución en un vaso de precipitado más una porción del reactivo FDA. c. Se coloca el vaso sobre el termoagitador girando solo la perilla de agitación hasta que esté totalmente disuelto (NO CALENTAR), y se repite el mismo proceso 2 veces más con el resto de la solución. d. Finalmente se afora el garrafón a 20lt con agua bidestilada. 6.4.3. Determinación de fibra FDN: a. Pesar en las bolsas filtro F-57 0.5 gr de muestra deshidratada y molida y pesar también una bolsa vacía (blanco) que debe incluirse en el lavado para utilizarla como factor de corrección en el cálculo de la determinación de las fibras. b. Depositar en el equipo 1.8lt de detergente FDN, 20gr de sulfito de sodio (paras solubilizar proteínas) y 4ml de alfa amilasa (para solubilizar almidones). c. Colocar máximo 23 bolsas con muestra y una bolsa blanco sobre los contenedores dentro del equipo, cerrar la tapa y presionar los botones calentar y agitar; cuando el equipo alcanza los 100°C comenzar a contar el tiempo del lavado (1:15 hrs).

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MANUAL DE TÉCNICAS d. Transcurrido el tiempo de lavado, apagar los botones (calentar y agitar) y abrir la válvula de drenaje para liberar la presión y la solución detergente. e. Abrir la tapa del equipo y volver a cerrar la válvula de drenaje. f. Agregar 1.8lt de agua destilada previamente calentada entre 70 y 90°C y presionar solamente el botón agitar para hacer el primer enjuague por 5 min. g. Repetir el enjuague dos veces más. h. Extraer los contenedores con las muestras del equipo. i. Presionar suavemente las muestras para expulsar el exceso de solución y colocarlas en acetona durante 5min. j. Remover las muestras de la acetona y colocarlas sobre una parrilla para dejarlas secar 30 min. k. Colocar las muestras en el ANKOM RD Dryer, 120v, para terminar de secarlas durante 30min. l. Finalmente pasar las muestras al desecador mínimo 1hora para después pesarlas. 6.4.4. Determinación de fibra FDA: a. Se realiza con el mismo proceso pero sin agregar sulfito de sodio ni alfa amilasa al equipo para el lavado, utilizando las mismas bolsas filtro de muestra q se utilizó en el lavado de FDN incluyendo también la bolsa blanco.

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MANUAL DE TÉCNICAS 6.5. Calculo para determinación de fibra FDN: .

FDN= (W3) - (W1* FACTOR DE CORRECION FDN) (100) (W2) W1= Peso de la bolsa W2= Peso de la muestra W3= Peso de la bolsa + residuo FDN FACTOR DE CORRECION FDN= W3B / W1B W1B= Peso de la bolsa blanco antes del lavado W3B= Peso de la bolsa blanco al final del lavado FDN

6.6. Cálculo para determinación fibra FDA: .

FDA= (W4) - (W1* FACTOR DE CORRECION FDA) (100) (W2) W1= Peso de la bolsa W2= Peso de la muestra W3= Peso de la bolsa + residuo FDN FACTOR DE CORRECION FDA= W4B / W1B W1B= Peso de la bolsa blanco antes del lavado. W4B= Peso de la bolsa blanco al final del lavado FDA

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MANUAL DE TÉCNICAS 6.7. Ejemplo: W1 (Peso de la bolsa) 0.5007gr

W2 (Peso de la muestra) 0.5027gr

W1B (Peso de la bolsa BLANCO) 0.4728gr

W3 (Peso de la bolsa con el residuo FDN) 0.6431gr

W3B (Peso final de la bolsa FDN) 0.4794gr

W4 (Peso de la bolsa con el residuo FDA) 0.5607gr

W4B (Peso final de la bolsa FDA) 0.4732 gr

FACTOR DE CORRECION= (0.4794 /0.4728) = 1.0139 FDN= (0.6431) - (0.5007 * 1.0139) (100) = 26.95 % . 0.5027

(hemicelulosa, celulosa y lignina)

FACTOR DE CORRECION= (0.4732 /0.4728) = 1.0008 .

FDA= (0.5607) – (0.5007 * 1.0008) (100) = 11.85 % 0.5027

(celulosa y lignina)

Restando el % del resultado de FDA al resultado del % de FDN se obtiene solamente el % de hemicelulosa presente en la muestra, es decir: 26.95% - 11.85% = 15.1%

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(hemicelulosa)

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MANUAL DE TÉCNICAS 6.8. Bibliografía ANKOM Technology Method 6 ANKOM Technology Method 5 Características Nutricionales De Fuentes Alimenticias Y Su Utilización En La Elaboración De Dietas Para Animales Domésticos, Boletín Técnico No.38, Corpoica, PRONACA. VAN SOEST, P.J. ROBERTSON J.B. 1985. Analysis of forages and fibrous foods. A laboratory manual for Animal Sciense 613 Ithaca, New York, EE. UU. Cornell University, 165 p.

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MANUAL DE TÉCNICAS

7. Técnica para determinación % de lignina 7.1. Introducción: La lignina es una macromolecula fenólica compleja, que después de la celulosa es la sustancia organiza más abundante en las plantas; es un polímero altamente ramificado de los grupos fenilpropanoides, del cual no se conoce su estructura precisa. Esta macromolécula no puede ser degradada por los microorganismos existentes en el tracto digestivo de los rumiantes además de que impide la acción microbiana sobre la celulosa y la hemicelulosa que se transforman en fuente de energía útil para los rumiantes. 7.2. Objetivo: Conocer el porcentaje existente de lignina en un alimento ya que es una fibra no degradable para los rumiantes por su compleja estructura. 7.3. Material y equipo: ANKOM DAISY Incubator ANKOM RD Dryer, 120v Balanza analítica Desecador Potenciómetro Mufla Fiber Filter bags F-57 Acetona Ácido Sulfúrico

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MANUAL DE TÉCNICAS 7.4. Procedimiento: a. Pesar en las bolsas filtro F-57, 0.5 gr de muestra deshidratada y molida y pesar también una bolsa vacía (blanco) que debe incluirse en el proceso de extracción para utilizarla como factor de corrección en el cálculo de la determinación de la fibra. b. Sellar todas las bolsas. c. Hacer la determinación de FDA con el método ya descrito en la técnica anterior. NOTA: Pueden ser reutilizadas las bolsas filtro F-57con muestras que fueron sometidas a las determinaciones de fibra FDN y FDA para hacer esta determinación. d. Introducir 23 bolsas filtro con muestra e incluir la bolsa blanco en cada una de los frascos del equipo DAISY Incubathor, colocando la mitad de las muestras en un lado del divisor de plástico y el resto del otro lado del divisor. En total podemos hacer la determinación de lignina para 92 bolsas con muestra incluyendo los blancos en una sola corrida; en caso de no contar con tal número de muestras, los frascos que no son utilizados también deben colocarse en el equipo con 500 ml de agua. e. Agregar a cada uno de los frascos que contengan muestras, 500ml de Ácido Sulfúrico al 72%. f. Cerrar los frascos y colocarlos dentro del equipo. g. Encender sólo el interruptor de rotación, dejando la puerta del DaisyII abierta. h. Hacer la rotación de las muestras durante 3 horas. i. Después de 3 horas debemos verter fuera el H2SO4 y enjuagar con agua del grifo para eliminar el ácido. j. Repetir los enjuagues hasta que el pH del agua utilizada sea neutro. Maneje con cuidado las bolsas durante el enjuague. k. Colocar las 24 bolsas en 100 ml de acetona aproximadamente durante 5 minutos para eliminar el agua. Elaboró

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MANUAL DE TÉCNICAS l. m. n. o. p.

Remover las muestras de la acetona y colocarlas sobre una parrilla para dejarlas secar 30 min. Colocar las muestras en el ANKOM RD Dryer, 120v, para terminar de secarlas durante 30min. Pasar las muestras al desecador mínimo 1hora para después pesarlas. Posteriormente hacer la determinación de ceniza presente en la muestra. Doblar cada bolsa, reduciéndola a un cuarto de su tamaño real, haciendo un pliegue primero de la parte inferior a la superior de la bolsa y después de izquierda a derecha; finalmente sellar las esquinas de ángulo recto para evitar que se deshaga el dobles.

q. Colocar las bolsas en crisoles de porcelana previamente pesados. r. Colocar los crisoles con las muestras en la mufla para calcinar a 550°C las muestras durante 3 horas. s. Dejar que la temperatura de la mufla descienda hasta 100°C para poder retirar los crisoles de la mufla y colocarlos en desecador durante 1 hora para obtener un peso constante. NOTA: Para realizar los cálculos es necesario tener el resultado de gramos de materia seca de la muestra a analizar, por medio de la técnica ya descrita en el presente manual.

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MANUAL DE TÉCNICAS 7.5. Calculo: % Lignina = (W3 - (W1 x FC1)) . W2

x 100

% Lignina en Materia Seca = (W3 - (W1 x FC1)) x 100 . W2 x MS % Lignina en Materia Orgánica = (W4 - (W1 x FC2)) x 100 W2 x MS W1= Peso de la bolsa W2= Peso de la Muestra W3= Peso de la bolsa después del proceso de extracción W4= Peso de Materia Orgánica W4= 100 - (PC – PCF) . W3 PC= Peso del crisol PCF= Peso del crisol final (después de la incineración) FC1= Factor de corrección 1 FC1= W3B/W1B W1B= Peso de la bolsa blanco W3B= Peso de la bolsa blanco después de la extracción FC2 = Factor de corrección 2 FC2 = W4B/W1B W1B= Peso de la bolsa blanco W3B= Peso de la bolsa blanco después de la incineración MS= Peso de Materia Seca

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MANUAL DE TÉCNICAS 7.6. Ejemplo: W1 (Peso de la bolsa)

W2 (Peso de la muestra)

0.4728gr

0.5017gr

W3 (Peso de la bolsa después del proceso de extracción) 0.5231gr

W4 (Peso de Materia Orgánica)

MS

0.4459gr

0.4842gr

W1B (Peso de la bolsa blanco)

W3B (Peso de la bolsa blanco después de la extracción)

0.4753gr

0.4794gr

W4B (Peso de la bolsa blanco después de la incineración) 0.4432 gr

FC1= 0.4794/0.4753=1.0086 FC2= 0.4432/0.4728= 0.9373 % Lignina = (0.5231 - (0.4728 x 1.0086)) . 0.5017

x 100 = 11.5344

% Lignina en Materia Seca = (0.5231 - (0.4728 x 1.0086)) x 100 = 19.0201 . (0.5017x 0.4842) % Lignina en Materia Orgánica = (0.4459 - (0.4728 x 0.9373)) x100 = 1.1299 (0.5017 x 0.4842)

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MANUAL DE TÉCNICAS 7.7. Bibliografía: Method 9 – determining Acid Detergent Lignin in DaisyII Incubator. Fisiologia Vegetal, Lincoln Taiz, Eduardo Zeiger – Castello de la Plana, Publicacions de la Universitat Jaume I, D.L. 2006. Ed. III Nutrición de Rumiantes, Guía Metodológica de Investigación, Manuel E. Ruiz, Arnoldo Ruiz; IICA-RISPAL 1990. Bases de la Producción Animal, F.P. Caravaca Rodríguez, J.M. Castel Genis, J.L. Guzmán Guerrero, M.J. Alcalde Aldea y P. González Redondo; Edición 2003. VAN SOEST, P.J. ROBERTSON J.B. 1985. Analysis of forages and fibrous foods. A laboratory manual for Animal Sciense 613 Ithaca, New York, EE. UU. Cornell University, 165 p.

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MANUAL DE TÉCNICAS

8. Técnica para determinación de fosforo 8.1. Introducción: En nutrición animal el fosforo es importante para un buen metabolismo ruminal, la reproducción y el crecimiento óseo. El fosforo es esencial para la reproducción, pues dietas deficientes de este elemento conducen a trastornos en la alimentación, después de una disminución de la eficiencia reproductora. Al igual que una prolongada ingesta de altos niveles de fosforo desemboca en desordenes metabólicos asociados con la absorción de calcio y su metabolismo afectándose de modo serio la reproducción. El porcentaje de fosforo puede ser identificado por medio de la técnica analítica de espectrofotometría UV/visible, la cual nos permite determinar la concentración de fosforo de una muestra debido a la capacidad de las moléculas para absorber la radiación electromagnética del espectro UV/visible a una determinada longitud de onda, disminuyendo la potencia del haz de radiación electromagnética (luz) al interaccionar con una sustancia. Al incidir el haz de luz sobre una muestra, éste absorberá ciertas longitudes de onda y reflejará otras, siendo éstas últimas las responsables del color. El color observado es complementario del que se percibiría si la luz absorbida se pudiera detectar. Dado que en la parte experimental de esta práctica las medidas van a realizarse con espectrofotometría visible, es conveniente conocer para qué longitud de onda tiene cada color su máxima absorción, lo que se muestra en la tabla siguiente:

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MANUAL DE TÉCNICAS

El fósforo presente en forma de fosfatos en una muestra, sometida a una digestión acida y diluida en un volumen determinado, reacciona con el reactivo llamado molibdato de amonio y metavanadato de amonio, lo cual origina un compuesto de color amarillo, denominado fosfomolibdovanadato de amonio. La cantidad de compuesto formada es directamente proporcional a la cantidad de fósforo presente en la muestra. La medición de la cantidad de fosfomolibdovanadato formado, se mide en un espectrofotómetro calibrado a una longitud de onda de 400 nanómetros. 8.2. Objetivo: Desarrollar la técnica de manera exitosa para obtener resultados confiables, de porcentaje de fosforo, presente en el alimento de una dieta o bien en una excreta después de algún tratamiento. Elaboró

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MANUAL DE TÉCNICAS 8.3. Equipo: MarsXpress (Horno de microondas) Thermo (Espectrofotómetro UV visible 400 nm) Balanza analítica Campana de extracción de gases Estación de cerrado 8.4. Material: Vasos de teflón Gradillas Carrucel Fotoceldas Matraces aforados de 25ml Matraces aforados de 100ml Pisetas Probeta de 500ml Tubos de ensayo Pipetas de precisión 8.5. Material de protección: Mascarillas Guantes de látex Lentes protectores 8.6. Reactivos: Solución estándar de FOSFORO a 10 000 ppm Acido nítrico HNO3 (JT Baker 69-70%) Elaboró

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MANUAL DE TÉCNICAS Acido perclórico HCLO4 (Fermont 70%) Agua des ionizada 8.7. Procedimiento: 8.7.1. Digestión: a. Pesar la muestra en los vasos, colocando el vaso dentro de la balanza, tarar el peso del vaso, agregar la muestra y registrar el peso. Dependiendo el ingrediente es el peso aproximado que debe pesarse. Forrajes Excretas Minerales Concentrados

0.3 gr 0.3 gr 0.1 gr (0.1 gr - 0.3 gr)

b. Ejemplo del registro: Num. De muestra 158

Num. serial

Ingrediente

Repetición

Peso W1

Absorbancia

AV

Identificación de proyecto TESIS

158

1

0.3045

AV

TESIS

2

0.3050

0.4134 0.4139 0.4228 0.4225

159

8.7.2. Pesaje: a. 2 repeticiones de cada muestra. b. 1 estándar (en este caso una muestra de alfalfa conocida de muy buena calidad “Std AH”) c. 1 blanco mas 1ml de solución madre de fosforo(Bco + F) d. 1 blanco (Bco) Elaboró

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MANUAL DE TÉCNICAS e. Contamos con dos juegos de vasos de 16 piezas y dos gradillas para estos, colocaremos: 6 ½ muestras con doble repetición, 1 Std AH, 1 Bco + F y 1 Bco. En ese orden de izquierda a derecha sobre la gradilla. NOTA: no olvidar agregar 1ml de solución madre de fosforo al Bco+F 8.7.3. Preparación de soluciones: a. La solución madre de fosforo o estándar de fosforo: se prepara a 200 ppm, tomando 2ml del estándar de fosforo (que generalmente viene en una presentación de 10 000 ppm) y aforar en un matraz volumétrico a 100 ml con agua desionizada al 2% de HNO3 (ácido nítrico). En caso de no contar con el estándar liquido a 10 000 ppm, disolver 0.8788 gr. de fosfato monobásico de potasio (KH2PO4), en agua desionizada y diluir a 100 ml. b. El agua des ionizada al 2% de HNO3 se prepara midiendo 28.98 ml de HNO3 en una probeta y aforando a 1lt en un matraz volumétrico. 8.7.4. Preparación de la muestra a. Colocar la gradilla con muestras dentro de la campana de extracción de gases y agregar a cada vaso las siguientes cantidades de los reactivos. Acido nítrico HNO3 (JT Baker 69% - 70%) Acido perclórico HCLO4 (Fermont 70%)

b. c. d. e.

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7.5 ml 2.5 ml

7500 µl 2500 µl

Colocar las almendras y las tapas con rosca a cada vaso. Agitar los tubos para evitar la efervescencia. Apretar las tapas con la estación de cerrado. Colocar los vasos dentro del carrusel en orden, ocupando primero los espacios de la parte de afuera, de dos en dos dejando un Reviso

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MANUAL DE TÉCNICAS espacio entre cada par; ya que solo contamos con una corrida de 16 vasos y de esta manera se le de un mejor uso al equipo. 8.7.5. Funcionamiento del equipo MarsXpress a. Colocar el carrusel con las muestras dentro del equipo y verificar que embone en la base. b. En la pantalla Editar o Crear método. c. Mover con las flecha y seccionar con el botón select. d. Seleccionar COECYJAL Xpress ya que este método esta ya programado para forrajes, excretas y minerales. e. Verificar que la rampa de temperatura programada de COECYJAL suba a 200°C durante 20 min y se mantenga a 200° C durante 20 min. f. Abrir el equipo terminada la digestión y retirar el carrusel del equipo. g. Restirar los vasos del carrusel y colocarlos en la gradilla para dejar enfriar. h. Abrir los vasos con la estación de cerrado dentro de la campana. i. Agregar un poco de agua des ionizada con la piseta a cada vaso para neutralizar la digestión. j. Tomar 16 matraces volumétricos de 25 ml y colocarles un embudo con papel filtro. k. Vaciar las muestras digeridas de los vasos a los matraces, haciendo tres enjuagues con agua des ionizada a cada vaso. l. Aforar los matraces de 25 ml con agua des ionizada. 8.8. Lectura en el EspectrofotómetroThermo UV: a. Tomar 700 µl de cada muestra digerida ya aforada de los matraces y vaciarlas a tubos de ensayo. b. Agregar a cada tubo 9.3 ml de reactivo molibdovanadato y dejar reposar durante 10 min para poder leer en el equipo. Elaboró

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MANUAL DE TÉCNICAS 8.8.1. Preparación del reactivo molibdovanadato (2 litros): a. MEZCLAR BAJO UNA CAMPANA b. Disolver 40 gr de molibdato de amonio (NH4) 6Mo7024 * 4H2O, en 400 ml de agua caliente desionizada y enfriar. c. Disolver 2 gr de metavanadato de amonio (NH4VO3), en 250 ml de agua caliente desionizada y enfriar, adicionar 250 ml de ácido perclórico (HClO4) al 70%. d. Añadir poco a poco la solución molibdato a la solución vanadato con agitación y se diluye hasta 2 litros con agua desionizada. e. Solución madre o estándar de fósforo (2 mg P/ml): se prepara a 200 ppm, tomando 2ml del estándar de fosforo (que generalente viene en una presentación de 10 000 ppm) y aforar en un matraz volumétrico a 100 ml con agua desionizada al 2% de HNO3 (ácido nítrico). En caso de no contar con el estándar liquido a 10 000 ppm, disolver 0.8788 gr. de fosfato monobásico de potasio (KH2PO4), en agua desionizada y diluir a 100 ml. f. Estándar de trabajo de fósforo (200 µg P/ml): Diluir 1.0 ml. de la solución estándar de fósforo a 10 ml. (volumen total con agua desionizada). ** El estándar de trabajo debe ser hecho sobre una base diaria.

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MANUAL DE TÉCNICAS 8.8.2. Curva estándar de fosforo

µg P/ml 0 1 2 4 6 8

Estándar de trabajo (µl) (solución madre) 0.00 25 50 100 150 200

H2O Desionizada (µl)

Blanco de digestión (µl)

Reactivo molibdovanadato (ml)

200 175 150 100 50 0.00

150 150 150 150 150 150

4.65 4.65 4.65 4.65 4.65 4.65

Tubo de muestra “0” contendrá: 150 µl de la muestra digerida + 200 µl de agua desionizada + 4.65 ml de reactivo molibdovanadato. Notas sobre las modificaciones del volumen: Los ml adicionados en la digestión del blanco deben ser igual a los ml de la muestra digerida. Los ml de muestra + ml de agua desionizada debe ser igual a 0.7 ml. + 9.3 ml de reactivo molibdovanadato. Las muestras deben ser agitadas y se dejan reposar durante 10 minutos y luego leer en el Uv-Visible a 400 nm. 8.8.3. Colocación de muestras en e l equipo: a. Preparados los puntos de la curva, iniciamos la lectura, colocando un blanco que será igual al punto O de la curva en una fotocelda en la posición B. y las otras dos fotoceldas las enjuagamos con un poco de la alícuota del primer punto, después las llenamos con la alicuota de ese mismo punto Elaboró

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MANUAL DE TÉCNICAS para hacer la primera lectura, y así sucesivamente con cada punto de la curva. o NOTA: se lee dos veces cada punto de la curva al igual que cada muestra; es decir colocamos en el equipo para cada lectura, una fotocelda con una alícuota de blanco en la posición B y las otras dos fotoceldas con una alícuota del mismo punto o la misma muestra alternadas. b. Posteriormente leer cada muestra sin mover el blanco de su posición. c. Al final de cada corrida registrar los resultados de la absorbancia. o NOTA: Se utiliza la misma curva para la jornada de trabajo de un día (aproximadamente 3 corridas). A la siguiente jornada se registra una nueva curva. d. Pasamos los resultados a la base de datos.

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MANUAL DE TÉCNICAS 8.9. Ecuación de predicción:

.

.

mg de P en 25ml = Concentración en solución aforada a 25 ml mg/L x 25 1000 Concentración en solución aforada a 25 ml mg/L= Concentración en solución de lectura, mg/L x Corrección de dilución (10/0.7)

.

Concentración en solución de lectura, mg/L = Abs – intercepto de la curva de calibración constante de curva de calibración

.

mg de P/kg de muestra en MS= mg de P/kg de muestra gr de MS

.

% P= (mg de P/kg de muestra en MS) x 100 1000000

.

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mg de P/kg de muestra = (mg de P en 25ml x 1000) Peso de la muestra

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MANUAL DE TÉCNICAS 8.10.

Ingrediente

Ejemplo: Concentración en solución de lectura, mg/L

Concentración en solución aforada a 25 mL, mg/L

0.191

2.1676

30.97

mg de P en 25 mL ó mg de P en muestra pesada 0.77

0.192

2.1782

31.12

0.78

Repetición

Peso muestra, g

Abs

1

0.3190

2

0.3010

Excreta

.

mg de P/kg de muestra

MS 105 °C

mg P/kg de muestra en MS

Promedio

2427

0.96

2517.36

2599

2585

0.96

2681.03

mg de P/kg de muestra = 0.77x1000 = 2427 0.3190 mg de P en 25ml = 30.97 x 25 = 0.77

.

1000

Concentración en solución aforada a 25 ml mg/L= 2.1676 x 14.28 = 30.97 .

Concentración en solución de lectura, mg/L = (0.191 - -0.0121) = 2.1676 0.0937

mg de P/kg de muestra en MS= .

2427 = 2517.36 0.3190

% P= (2517.36) x 100 = 0.252 . 1000000

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ds

cv

%P

115.74

4.45

0.252 0.268


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MANUAL DE TÉCNICAS 8.11.

Bibliografía: Harris, D. C. Análisis Químico Cuantitativo. 3ª ed. Capítulo 18. Ed. Reverté, 2007. Higson, S. P. J. Química Analítica. 1ª ed. Capítulo 5. Ed. Mc Graw Hill. 2007. Martínez Urreaga, J.; Narros Sierra, A.; De La Fuente García-Soto, M.M.; Pozas Requejo, F.; Díaz Lorente, V.M. Experimentación en Química General. Capítulo 5. Ed. Thomson Paraninfo, 2006. Hernández-Hernández, L.; González-Pérez, C. Introducción al análisis instrumental. Capítulo 3. Ed. Ariel Ciencia, 2002.

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MANUAL DE TÉCNICAS

9. Técnica para determinación de proteína 9.1. Introducción: Las proteínas son el principal constituyente de los órganos y estructuras blandas del cuerpo animal y están conformadas por polímeros de aminoácidos que contienen carbono, hidrogeno y oxígeno. Algunas proteínas contienen nitrógeno, azufre y fosforo y se consideran sustancias complejas de naturaleza coloidal y alto peso molecular. Los compuestos nitrogenados que contienen las proteínas son necesarios para el desarrollo y mantenimiento de los tejidos y órganos, además de componentes esenciales de secreciones y enzimas. Los rumiantes a diferencia de los monogástricos, no dependen exclusivamente de su dieta para obtener proteínas, ya que los microorganismos del rumen trasforman el nitrógeno de fuentes no proteicas en aminoácidos para su uso y gran parte de la proteína dietética es hidrolizada a nivel ruminal además del nitrógeno no proteico que es utilizado en la síntesis de proteína microbiana la cual a su vez es degradada posteriormente en el abomaso y el intestino delgado. En los programas de alimentación animal las materias primas que aportan mayores niveles de proteína son generalmente las más costosas. Uno de los método más eficientes para le determinación de proteína bruta es el Método de Análisis por Combustión o método Dumas, basado en la conversión de los gases de combustión. La liberación de Nitrógeno se lleva a cabo mediante pirolisis en una cámara de combustión, el nitrógeno es transportado con la ayuda de un gas hacia un detector en donde se realiza la medición. La compañía LECO Corporation (St. Joseph, MI, 2002) tiene en el mercado el determinador de Nitrógeno/Proteína FP-528, utilizado para éste trabajo, y que cuantifica el Nitrógeno de forma sistematizada y Elaboró

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MANUAL DE TÉCNICAS automatizada basándose en el método de combustión Dumas, AOAC 990.03(3). El equipo FP-528 consta de una cámara de oxígeno donde se lleva a cabo la combustión a una temperatura de 850°C, una celda de termo conductividad y un microprocesador para llevar a cabo los cálculos y controlar los parámetros operativos. Los gases requeridos para su operación son Oxígeno (para la cámara de combustión) aire comprimido (control de presión neumática) y Helio (gas de transporte). El tiempo de análisis para una muestra es de aproximadamente 3 minutos y los resultados se expresaron como % de proteína (de acuerdo al factor de conversión). 9.2. Objetivo: Comprender los fundamentos del método para la determinación del contenido de proteína de un alimento por medio de LECO a partir del contenido de nitrógeno obtenido. 9.3. Equipo: Leco FP-528 Balanza analítica Computadora con el software de Leco instalado 9.4. Reactivos y material: Gas oxígeno ultra alta pureza 99.99% Gas helio ultra alta pureza 99.99% Gas aire comprimido, la fuente debe ser libre de aceite y agua. Estándar EDTA Cucuruchos de estaño Capsulas de gel Crisol poroso Pinzas Espátula Elaboró

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9.5. Procedimiento: a. Instalado el equipo y los gases, conectar el equipo a una corriente de 220 volts y esperar 2 hr para que se caliente el horno a 950°C y poder operar. b. Encender la computadora y abrir el software de Leco. c. Presionar menú y abrir la ventana de diagnósticos para checar que los ambientes tengan los valores adecuados. d. Continuar con el diagnostico de comprobación de fugas de los gases oxígeno y helio. e. Terminada la comprobación de fugas cerrar la ventana de diagnósticos e insertar en la hoja de trabajo 9 blancos, que es necesario que sean leídos para después poder hacer la calibración del equipo. Al insertar los blancos en la columna masa aparecerá automáticamente (0.5000 gr). f. En menú principal presionar analizar, los porcentajes de nitrógeno de los blancos analizados deberán ser de mayor a menor. g. Hacer la calibración de blancos presionando en menú principal calibración, seleccionar los últimos tres blancos leídos y después presionar calcular blancos. h. Cerrar la ventana de calibración e insertar en la hoja de trabajo el estándar EDTA. i. Encender la balanza analítica, colocar dentro el portavasos y dentro de este la capsula de gel o el cucurucho de estaños que contendrá la muestra. j. Tarar el peso de los recipientes, agregar 0.2000 gr de EDTA y capturar el peso. k. Colocar la muestra de EDTA en el cabezal de carga y presionar analizar. l. Hacer la lectura de EDTA cuantas veces sea necesario hasta poder obtener un valor de desviación estándar <0.035 entre los resultados de tres muestras leídas de EDTA. Elaboró

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MANUAL DE TÉCNICAS m. Hacer la calibración del EDTA con las mismas tres muestras seleccionándolas, presionar en menú principal calibración y después presionar calcular estándar. n. Finalizada la calibración del estándar EDTA, iniciar con el análisis de nuestras muestras utilizando el mismo proceso de pesaje ya descrito para el estándar. o. La secuencia de operación dentro del equipo es la siguiente: p. Al colocar la muestra en el cabezal de carga esta es purgada de cualquier gas atmosférico que hubiera ingresado en el proceso de preparación de la misma. Paralelamente el recipiente que colecta los gases de la combustión Ballast® (sistema patentado por LECO®), también es purgado. q. La muestra ingresa al horno calentado a 950 ºC aproximadamente y el gas oxígeno puro es ingresado para acelerar el proceso de combustión. Los productos de la combustión son principalmente: CO2, H2O, NOx, N2; dichos gases son pasados a través de un filtro en el horno y por un enfriador termoeléctrico, para quitar la humedad. Luego son recolectados en el Ballast® r. En el análisis los gases obtenidos en la combustión son homogeneizados en el Ballast® a través de una mezcla pasiva. Donde una alícuota de 3cc de muestra homogénea es capturada y el Ballast® es forzado a evacuarse. La muestra gaseosa de 3cc pasa a través de cobre para remover el O2 y reducir los NOx a N2La muestra continua su recorrido dentro del equipo pasando ahora por Lecosorb® para remover el CO2 y por Anhidrone para retener el H2O. Finalmente el N2 arrastrado por una corriente de gas Helio hacia una celda de Conductividad Térmica (TC) en donde se mide la concentración de N2 presente en la muestra. s. El resultado final, expresado en N2 o N2/Proteína, es mostrado en la computadora.

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MANUAL DE TÉCNICAS En el siguiente esquema se puede observar el diagrama de flujo de gases del equipo.

9.6. Calculo: El resultado es dado por medio del software del equipo como porcentaje de nitrógeno presente en la muestra que por medio de la hoja de trabajo es multiplicado por el factor de proteína obteniendo el porcentaje de proteína.

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MANUAL DE TÉCNICAS 9.7. Bibliografía: Ganadería de leche, Enfoque empresarial, Producción bovina TOMO 1, Álvaro Castro Ramírez, Ed. Universidad Estatal a Distancia. Hauck, R. D. 1982. Nitrogen-Isotope Ratio Analysis, sec.363.2.2, Conversion of total nitrogen to ammonium-nitrogen. pp.744ff. In Methods of Soil Analysis, Part 2, Chemical and Microbiological Properties. American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin. Kirsten, Wolfgang. 1983. Organic Elemental Analysis: Ultramicro, Micro, and Trace Methods. Academic Press/Harcourt Brace Jovanovich, New York Stable Isotope/Soil Biology Laboratory, Institute of Ecology, University of Georgia, Athens GA 30602 USA. Bellomonte, G. A. Constantine, and S. Giammariolo. 1987. Comparison ofmodified automatic dumas method and the traditionalKjeldahl method fornitrogen determination in infant food. JAOAC 70:227-229. Colombo, B. And G. Giazzi. 1982. Total automatic nitrogen determination. Am. Lab. 14:38-45. Sweeney, R. A. 1989.Generic combustion method for the determination of crudeprotein in feeds:Collaborative Study.JAOAC. 72:770-774. LECO Corporation, Michigan USA. Depto. Capacitación y Entrenamiento INBOX Technology and Services S.A.

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