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Dipartimento Multidisciplinare di Specialità Medico-Chirurgiche ed Odontoiatriche FACOLTA’ DI MEDICINA E CHIRURGIA ODONTOIATRIA E PROTESI DENTARIA Presidente del Corso di Laurea in Odontoiatria e Protesi Dentaria Prof. Gregorio Laino

L’ Azacitidina-S-adenosin-metionina (AZA) induce il crosstalk tra il recettore del fattore di crescita epiteliale e l’E-caderina, rimuovendo il blocco epigenetico nelle cellule di cancro orale Antonio Di Napoli(1), Antonia Feola(2), Luigi Laino(1), Alfredo De Rosa(1) and Marina Di Domenico(2) (1) Dipartimento Multidisciplinare di Specialità Medico-Chirurgiche ed Odontoiatriche, Seconda Università degli Studi di Napoli (2) Dipartimento di Biochimica, Biofisica e Patologia Generale, Seconda Università degli Studi di Napoli

La prognosi dei pazienti affetti da carcinoma squamoso orale è ancora variabile, soprattutto a causa dell’ elevata invasività di questo tumore. La ridotta espressione della proteina di adesione, l’ E-caderina, si verifica nella fase di progressione del tumore primario e la metilazione del suo gene (CDH1) correla con il fenotipo metastatico di questo tumore. In questa prospettiva, abbiamo studiato il gene della E-caderina (CDH1) e lo stato di metilazione del promotore nelle cellule del cancro orale (KB). Abbiamo analizzato con la microscopia confocale la co-localizzazione della proteina E-caderina e del recettore del fattore di crescita epiteliale (EGFR) nelle cellule di cancro orale (KB) in presenza e in assenza di fattore di crescita epiteliale (EGF). Le proteine EGF-R e E-caderina ​co-localizzano nella membrana, ma dopo trattamento con il fattore di crescita, EGF-R e E-caderina si spostano nel citoplasma. Per confermare questa co-localizzazione, abbiamo stimolato le cellule con EGF, preparato i lisati cellulari e successivamente mediante l’immunoprecipitazione con anticorpi anti-EGF-R, abbiamo dimostrato l’associazione fisica tra EGF-R e Ecaderina, in particolare è stata eseguita una cinetica (0-15-45-60 minuti). In questo studio, inoltre, abbiamo dimostrato che la down-regolation del gene della Ecaderina (CDH1) può essere revertita con il farmaco-azacitidina S-adenosil-metionina (AZA), rimuovendo il blocco epigenetico. I nostri dati dimostrano che: 1) in queste condizioni sperimentali, i farmaci non risultano tossici per le cellule KB; 2) le cellule KB trattate con AZA, inducono una upregulation della E-caderina; 3) Il trattamento terapeutico con AZA rappresenta un tool terapeutico nel carcinoma squamoso del cavo orale.

Struttura della E-caderina

A B C

L’E-caderina è composta da cinque domini extracellulari ripetuti (EC1 EC5) leganti il calcio, responsabili delle interazioni cellula-cellula (A), da un dominio idrofobico transmembrana (B), da un dominio citoplasmatico che prende rapporto con il citoscheletro attraverso l'interazione con complesso di bcatenina (C).

Co-localizzazione e co-immunoprecipitazione della E-caderina e di EGF-R nelle cellule KB

E’ possible utilizzare inibitori delle DNA metiltransferasi allo scopo di up-regolare l’espressione della E-caderina?

AZA M

M

M

M

M

DNMT

DNMT

M

DNMT

AZA

AZA

AZA

AZA

Cellule KB trattate con EGF

Anticorpi Primari: anti-EGF-R anti-E-caderina

Anticorpi Secondari: Fluoresceina isotiocianato anti-rabbit and Texas Red anti-mouse

Contr

Azione sulla metilazione del DNA: Azacitidina

M

C’è correlazione tra EGF-R ed E-caderina, in presenza di un carcinoma orale?

La Microscopia Confocale è stata utilizzata per studiare: 1) la localizzazione del recettore per il fattore di crescita epidermico e la E-caderina 2) il trattamento con EGF delle cellule KB associato ad un aumento della co-immunoprecipitazione di EGF-R e di E-caderina 3) l'aumento della co-localizzazione citoplasmatica e l’ interazione tra EGF-R e E-caderina, andava di pari passo con una diminuzione dei livelli della E-caderina

C

L’ AZAcitidina è un analogo della citosina, che viene incorporato nel DNA al posto della citidina e non può essere legato dalla DNA metil-transferasi (DNMT) l’enzima coinvolto nel processo di metilazione; in questo modo previene il trasferimento di un gruppo metile in posizione -5 della citosina.

E’ possibile considerare l’E-caderina un target farmacologico nella terapia del carcinoma orale?

DNMT M

10

+AZA

100

Le cellule KB sono state stimolate con EGF-R concentrazioni crescenti di AZAcitidina per 72 ore. In vitro, le cellule KB E-caderina trattate con AZAcitidina mostravano una upregulation della ETubulina caderina.

In questo studio, si evidenzia che la ipermetilazione del gene CDH1 della E-caderina, correla con la downregulation della proteina, evento preliminare nella tumorigenesi. Il trattamento con l’ agente demetilante AZAcitidina, può effettivamente ripristinare l'espressione della E-caderina che è downregolata nel carcinoma orale. Questi risultati possono essere utilizzati per lo sviluppo di future strategie di prevenzione del cancro.

Di Domenico M, Pierantoni GM, Feola A, Esposito F, Laino L, De Rosa A, Rullo R, Mazzotta M, Martano M, Sanguedolce F, Perillo L, D’Angelo L, Papagerakis S, Tortorella S et al. Prognostic significance of N-cadherin expression in oral squamous cell carcinoma. Anticancer Research, 31: 3-10, 2011. Wheelock M, Shintani Y, Maeda M, Fukumoto Y, Johnson K. R. Cadherin switching. Journal of Cell Science, 121, 727-735, 2008. Chang HW, Chow V, Lam Ky, Wei WL, Yuen A. Loss of E-cadherin expression resulting from promoter hypermethylation in oral tongue carcinoma and its prognostic significance. Cancer, 15;94(2):386-92, 2002.

AZA induce il crosstalk tra EGF-R e E-caderina, rimuovendo il blocco epigenetico nel cancro orale  

La prognosi dei pazienti affetti da carcinoma squamoso orale è ancora variabile, soprattutto a causa dell’ elevata invasività di questo tumo...

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