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GESTION DE MICOTOXINAS: MARCO LEGISLATIVO Y METODOS ANALITICOS. OCTUBRE 2013

ANALISIS DE MICOTOXINAS POR CROMATOGRAFIA José Antonio Ayala. Responsable División Analítica. LABORATORIOS MUNUERA, S.L.U.

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• INTRODUCCION • ¿Qué son las micotoxinas? -Sustancias químicas de distinta naturaleza producidas por los hongos filamentosos (mohos) como metabolitos durante su crecimiento en determinados sustratos. Los mohos toxigénicos pueden contaminar los alimentos cuando estos son cultivados, procesados, transformados o almacenados en condiciones adecuadas para su desarrollo.

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Especie de moho

Micotoxinas producidas

Aspergillus parasiticus

Aflatoxinas B1, B2, G1 y G2

Aspergillus flavus

Aflatoxinas B1 y B2

Fusarium sporotrichioides

Toxina T-2

Fusarium graminearum

Desoxinivalenol y Zearalenona

Fusarium moniliforme (F. verticillioides)

Fumonisina B1

Penicillium verrucosum

Ocratoxina A

Aspergillus ochraceus

Ocratoxina A ANALISIS DE MICOTOXINAS POR CROMATOGRAFIA

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• - Aflatoxinas: - Aflatoxina B1, Aflatoxina G1, Aflatoxina B2 y Aflatoxina G2 (cereales y transformados, semillas oleaginosas, frutos secos, especias y condimentos).

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Metabolito de Aflatoxina B1: Aflatoxina M1 (leche y derivados).

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• Ocratoxinas - Ocratoxina A (cereales no elaborados, uva, vino, especias, café…)

OCRATOXINA A

OCRATOXINA B

OCRATOXINA C

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Otras micotoxinas

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• Toma de muestras. •

Procedimiento para el control de micotoxinas en un lote. PREPARACION DE LA MUESTRA

TOMA DE MUESTRA

LOTE

Error TM

+

Error PM

+

ANALISIS

Error A

Error total

El error asociado a la toma de muestra es notablemente mayor que los errores cometidos en la preparación de la muestra y en el análisis de la misma.

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REGLAMENTO (CE) No 401/2006 DE LA COMISIÓN de 23 de febrero de 2006 por el que se establecen los métodos de muestreo y de análisis para el control oficial del contenido de micotoxinas en los productos alimenticios El muestreo tiene un papel fundamental en la precisión de la determinación del contenido de micotoxinas, que están distribuidas muy heterogéneamente en los lotes. Es por tanto necesario establecer los criterios generales que debe cumplir el método de muestreo. ANEXO I. A fin de garantizar que los laboratorios de control utilizan métodos de análisis con niveles de eficacia comparables, es necesario fijar también los criterios generales a los que deben ajustarse los métodos de análisis. ANEXO II.

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GESTION DE MICOTOXINAS: MARCO LEGISLATIVO Y METODOS ANALITICOS. OCTUBRE 2013 REGLAMENTO (CE) No 882/2004 DEL PARLAMENTO EUROPEO Y DEL CONSEJO de 29 de abril de 2004 ANEXO III CARACTERÍSTICAS DE LOS MÉTODOS DE ANÁLISIS

Los métodos de análisis se caracterizarán por seguir los siguientes criterios: a) Exactitud b) Aplicabilidad (matriz y gama de concentración) c) Límite de detección d) Límite de determinación e) Precisión – Ensayos interlaboratorios f) Repetibilidad g) Reproducibilidad h) Recuperación i) Selectividad j) Sensibilidad k) Linealidad l) Incertidumbre de medida m) Otros criterios que puedan adoptarse según las necesidades.

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REGLAMENTO (CE) No 401/2006 DE LA COMISIÓN de 23 de febrero de 2006.

En tanto la legislación comunitaria no exija ningún método específico para la determinación del contenido de micotoxinas en los productos alimenticios, los laboratorios podrán aplicar cualquier método de su elección, siempre que se ajuste a los siguientes criterios:

a) criterios de funcionamiento para las aflatoxinas: Criterio Blancos Recuperación Aflatoxina M1 Recuperación Aflatoxinas B1, B2, G1, G2 Precisión RSDR

Intervalo de concentración Todos 0,01-0,05 μg/kg > 0,05 μg/kg < 1,0 μg/kg 1-10 μg/kg > 10 μg/kg Todos

Valor recomendado Desdeñable de 60 a 120 % de 70 a 110 % de 50 a 120 % de 70 a 110 % de 80 a 110 % Derivada de la ecuación de Horwitz

Valor máximo autorizado —

2 veces el valor derivado de la ecuación de Horwitz La precisión puede calcularse como 0,66 veces la precisión RSDR a la concentración que interesa. •Nota: •—valores aplicables tanto a B1 como a la suma de of B1 + B2 + G1 + G2. •—si debe notificarse la suma de cada aflatoxina B1 + B2 + G1 + G2 la respuesta de cada una al sistema analítico tiene que ser conocida o equivalente

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a) criterios de funcionamiento para Ocratoxina A:

Contenido μg/kg <1 1-10

RSDr % ≤ 40 ≤ 20

Ocratoxina A RSDR % ≤ 60 ≤ 30

% de recuperación de 50 a 120 de 70 a 110

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Métodos de Análisis. 1ª etapa Clean-up

Las columnas de inmunoafinidad (IAC) se basan en el principio de unión específico anticuerpo-analito. Contienen un gel que actúa de soporte a los anticuerpos específicos. Estos anticuerpos pueden captar las micotoxinas de las muestras y liberarlas luego de un paso de lavado y elución. Estas columnas se usan para purificar y concentrar extractos con micotoxinas antes de analizarlos con varias técnicas como HPLC, TLC, LCMS, GC, ELISA o fluorometría.

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2ª Etapa. Determinación por HPLC-FLD AFLATOXINAS B1, B2, G1, G2

Para determinar las aflatoxinas por HPLC con detección de fluorescencia es necesario incluir derivatización post-columna para aumentar la respuesta de las aflatoxinas más importanes B1 y G1 .

Métodos de referencia: AOAC. Official Method 999.07. UNE-EN 14123:2007

• • •

El método cromatográfico utiliza una columna C18 de 250 x 4.6 mm y 5 µm de tamaño de partícula. La fase móvil está compuesta de Agua:Metanol:Acetonitrilo (60:20:20), con flujo 1 ml/min. Las condiciones del detector de fluorescencia son: - Sensibilidad alta, - Long. Excitación 365 nm - Long. Emision 431 nm.

Se han diseñado varios métodos de derivatización de ambas aflatoxinas: - Derivatización con Yodo. Necesita un sistema de bombas adicional y un reactor de derivatización. - Sistema KOBRA CELL. Es una celda electroquímica que genera in situ una forma reactiva de bromo como derivatizante. -Módulo de derivatización con luz UV. ANALISIS DE MICOTOXINAS POR CROMATOGRAFIA

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Sistema de derivatizaci贸n con UV

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OCRATOXINA A

• • •

El método cromatográfico usa una columna C18 250x4.6 mm, 5 µm de tamaño de partículas. La fase móvil es Acetonitrilo:Agua:Acido Acético (48:51:1) (v/v/v) Las condiciones del detector son: – Sensibilidad alta. – Long. Excitación 333 nm – Long. Emisión 443 nm

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ESTANDARES Y MATERIALES DE REFERENCIA •

En el mercado existe una amplia variedad de Estándares de Micotoxinas para su uso en solución o en forma seca para ser reconstituidos in situ.

Los estándares de Micotoxinas se utilizan de forma rutinaria en el análisis de Micotoxinas con fines diversos. Se pueden utilizar para realizar una curva de calibración para el sistema de HPLC, asegurando una determinación precisa de la toxina. La solución estándar también puede utilizarse para fortificar muestras con el fin de comprobar la eficacia de la extracción de la toxina a partir de determinados alimentos utilizando un disolvente en particular. También pueden utilizarse para fortificar extractos de muestras. Pueden prepararse a partir de Micotoxinas en polvo, que son diluidas y calibradas fotoespectrométricamente. Sin embargo, son peligrosos tanto el manejo como la manipulación de esos polvos altamente tóxicos, y la preparación y verificación de estas soluciones estándar constituyen una labor intensiva.

• • • •

Los Materiales de Referencia de Micotoxinas son materiales contaminados naturalmente caracterizados por un laboratorio, o varios, que se utilizan para verificar periódicamente los métodos analíticos de un laboratorio acreditado y controlar su exactitud.

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Muchas gracias por su atención José Antonio Ayala Martí laboratorio@munuerlab.com

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