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UNIVERSIDAD NACIONAL DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD CARRERA DE LABORATORIO CLÍNICO E HISTOPATOLÓGICO

PROCESAMIENTO DE TEJIDOS: FASES (FINALIDAD Y OBJETIVOS), LÍQUIDOS UTILIZADOS O SUSTITUTOS (VENTAJAS Y DESVENTAJAS), TIEMPOS DE CADA UNO (OPCIONES Y TEMPERATURAS).

TEMA: ELABORADO POR: •

KATERINE VIMOS DOCENTE:

Lic. IVAN PEÑAFIEL CATEDRA: Técnicas Histológicas TERCER SEMESTRE FECHA DE ENTREGA: 03 de Diciembre Septiembre –Marzo RIOBAMBA – ECUADOR

de 2013


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PROCESAMIENTO DE TEJIDOS

TEMA:

Procesamiento de Tejidos: Fases (Finalidad y objetivos), Líquidos utilizados o Sustitutos (Ventajas y Desventajas), Tiempos de cada uno (Opciones y Temperaturas).

OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL: •

Conocer el procesamiento de tejidos.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS: •

Adquirir conocimiento del manejo de los procesamientos de tejido dentro de ello sus fases.

Investigar los líquidos utilizados o sustitutivos en el procesamiento de tejidos y las ventajas y desventajas de los mismos.

Saber el tiempo de cada uno de los líquidos que se ocupa en el procesamiento de tejidos tanto en opciones y temperaturas.

RESUMEN

El procesamiento de tejido comprende el conjunto de procedimientos a los que se somete una muestra para su análisis microscópico.

La elaboración de preparaciones histológicas pasibles de ser observadas tanto por microscopía fotónica como electrónica, obedece a una serie de principios generales que son comunes para ambas.

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En este repartido nos referiremos fundamentalmente a la técnica histológica de rutina, empleada en la realización de preparados para su observación al microscopio óptico.

Para obtener una preparación histológica es necesario procesar el material siguiendo las etapas que se detallan a continuación:

1 - Obtención del material biológico.

2 - Fijación.

3 - Inclusión.

4 - Corte (microtomía).

5 - Coloración.

6 - Montaje.

7 - Identificación y archivo.

1 - Obtención del material biológico Los fragmentos de órganos ó tejidos a observar, deben ser extraídos inmediatamente después de la muerte del animal, ó mediante técnicas quirúrgicas (ej. biopsia). Una vez muerto el de autólisis que conduce a propia de la materia de fundamental rapidez, colocando la en el líquido fijador. Tec. Histológicas

animal, se inicia un proceso la pérdida de la estructura viviente, por consiguiente es importancia proceder con pieza lo más pronto posible Página 3


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2 - Fijación

Tiene por objetivo preservar la estructura celular y tisular, de modo que ésta se mantenga lo más similar posible a la observada en el animal vivo.

La efectividad de cada líquido fijador estará dada por su capacidad para lograr esta preservación.

FIJAR: significa inmovilizar, y esto puede lograrse empleando medios físicos, químicos ó una combinación de ambos.

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* Medios físicos

α) CONGELACION: con CO2; el material puede estar previamente fijado o no.

b) CRIOSTATO: enfriamiento rápido a -20ºC.

c) CALOR: se hierve la pieza en un líquido especial durante más o menos un minuto (biopsias extemporáneas).

d) DESECACION.

*MEDIOSQUÍMICOS

a –Acido crómico, ácido ósmico. b - Bicloruro de mercurio, bicromato de potasio. c - Ácido acético, ácido tricloracético, ácido pícrico. d - Formol, acetona, alcohol etílico, alcohol metílico. * CUALIDADES DE UN BUEN FIJADOR - Rápida penetración. - Penetración homogénea. - No producir retracción de los tejidos.

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- Revelar los orgánulos celulares. - Evitar la desaparición de las sustancias solubles (ej. glucógeno). - Cuidar la actividad de ciertas enzimas. - Permitir la observación de elementos celulares visibles con coloraciones vitales. - No crear artefactos. - Asegurar a células y tejidos una conservación e imagen fiel. * EL FIJADOR: - Da a la pieza un color que no es el real. - En general se usa a temperatura ambiente. - Para enzimas debe actuar lentamente y a una temperatura de 0 a 4ºC. - Lo ideal es que los fijadores actúen a pH neutro.

Desde el punto de vista químico los buenos fijadores son, por lo general, moléculas que poseen por lo menos dos cualidades esenciales: son pequeñas de modo de poder “acomodarse” entre las moléculas de la materia viviente y forman fácilmente enlaces, particularmente con los grupos carboxilo y amino de las proteínas. * Formas de fijación a - INMERSION: se sumerge la pieza en un determinado volumen de líquido fijador. En este caso existen una serie de reglas prácticas que son importantes: Tec. Histológicas

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- El volumen del líquido fijador debe ser de 20 a 40 veces mayor que el del fragmento a fijar. - El tiempo de fijación debe regularse empíricamente ya que depende de factores diversos, como por ej. el tamaño de la pieza, la constitución del tejido, el poder de penetración del líquido fijador, el objetivo final de la técnica a emplear, la temperatura de fijación, etc. - El fijador debe estar en contacto con todas las superficies disponibles de la pieza. En el caso de órganos huecos, la cavidad también debe rellenarse con fijador. b - INYECCION: se realiza utilizando el sistema vascular del órgano ó por otras vías. c - PERFUSION: el fijador se gotea a través de una cánula insertada en el sistema vascular del animal anestesiado, a temperatura corporal, de manera que la propulsión del líquido fijador se lleve a cabo con el propio flujo sanguíneo del organismo viviente. * Fijadores químicos Generalmente se emplean fijadores simples o primarios, y mezclas fijadoras. Fijadores simples: los más utilizados son el formol, el tetróxido de osmio (OsO4) y el glutaraldehído. Todos ellos se emplean en solución acuosa con medios que permiten regular el pH de la solución (buffers).

Las mezclas fijadoras: son en su mayoría soluciones acuosas de fijadores primarios combinados entre sí, y en los cuales se incluyen sustancias químicas que favorecen la penetración del fijador, o regulan el pH del líquido fijador, ó contienen determinados mordientes que favorecen la coloración subsiguiente. 3 - Inclusión Tec. Histológicas

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Luego que una pieza ha sido fijada se debe proceder a impregnarla con una sustancia plástica, que sea fácilmente manejable y que, por su mayor dureza, permita obtener cortes finos (3 a 10 µ). Dicha sustancia debe penetrar íntimamente en el tejido u órgano, de manera homogénea, formando con el material una masa de consistencia pareja. Esta operación se denomina IMPREGNACIÓN ó IMBIBICIÓN. El paso siguiente es la INCLUSIÓN, que consiste en colocar la pieza en el interior de un bloque de la misma sustancia, tratando de ubicar los tejidos u órganos en posición adecuada (“orientarlos”), para obtener cortes en el plano deseado. Los productos empleados para la inclusión se denominan genéricamente “masas de inclusión”. Para que estas sustancias penetren más fácilmente en los tejidos, deben estar en solución ó fundidas. Al enfriarse, dichas masas plásticas recobran su consistencia, posibilitando la realización de los cortes finos.

En microscopía óptica el más empleado es la parafina. Para microscopía electrónica se utilizan las resinas (araldita, epon, spurr, etc.). En general, estas sustancias son insolubles en agua y escasamente solubles en alcohol, por lo que es necesario antes de la impregnación, deshidratar la pieza y luego embeberla con un solvente del medio de inclusión. Los pasos a seguir son: a - Deshidratación. b - Diafanización ó aclaramiento. c - Impregnación con el medio de inclusión. d - Inclusión definitiva de la pieza. a - Deshidratación

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En este paso la sustancia más comúnmente utilizada es el alcohol etílico. La pieza es sometida a baños sucesivos en alcoholes de graduación creciente, de modo que la deshidratación se realice paulatinamente, evitando la retracción de los tejidos. Eventualmente pueden emplearse otros alcoholes (metílico, butílico, etc.). b - Diafanización

Consiste en la impregnación del material con un solvente del medio de inclusión. El producto empleado en este paso se denomina “líquido intermediario”, y debe ser miscible tanto con alcohol como con medio de inclusión. Los productos más usados son: xilol, benzol, toluol, cloroformo y acetona. Cuando la sustitución del alcohol por el intermediario es total, las sustancias empleadas comunican a la pieza su alto índice de refracción, tornándola brillante. c - Impregnación con el medio de inclusión Luego de la diafanización, la pieza puede colocarse directamente en el medio de inclusión, ó someterse previamente a un pasaje con una mezcla proporcional de líquido intermediario y medio de inclusión. En la inclusión con parafina, estos pasajes se llevan a cabo en el interior de una estufa graduada entre 58 y 60 ºC (temperatura a la que se funde la parafina). Comúnmente se realizan 2 ó 3 baños sucesivos con parafina, de modo de eliminar en cada uno de ellos, los vestigios de líquido intermediario, e ir embebiendo progresivamente la pieza en el medio de inclusión.

d - Inclusión definitiva de la pieza Para la confección del bloque se utilizan moldes (barras de Leuckart, caja de plástico ó papel, moldes de silicona, etc.), donde se coloca el medio de inclusión fundido.

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Con una pinza se orienta la pieza de tejido en la posición adecuada; se identifica el material, y se deja enfriar a temperatura ambiente ó en la heladera, en caso de trabajar con parafina. Cuando se trabaja con resinas, estas generalmente se llevan a la estufa hasta completar su polimerización. Todos los pasos que acabamos de mencionar, variarán su duración según de que material se trate y según el tamaño de la pieza. 4 - Corte (Microtomía) - Fijar el bloque que se desea cortar en la platina por la cara opuesta a la cara de corte, cuidando que quede firme. - Colocar la platina con el bloque en el micrótomo. - Tallar con hoja de afeitar una cara de corte que posea un margen de 2 ó 3 mm de parafina a cada lado de la pieza.Es conveniente procurar que los bordes superior e inferior de dicha cara sean paralelos para facilitar la recolección de cortes seriados.También se debe tratar de tallar una cara lo mas pequeña posible. Esto isminuye la resistencia que ofrece el bloque a la cuchilla como también la aparición de pliegues en los cortes realizados, permitiendo además evitar posibles melladuras de la cuchilla. - Cuando se ha concluido con el tallado se procede a la colocación de la cuchilla en el micrótomo.

- Siempre es aconsejable asentar la cuchilla antes de cortar. Esto se realiza con una banda de cuero tensado y lubricado (asentador), sobre la cual se desliza el filo de la cuchilla. Se debe avanzar con el lomo de dicha cuchilla hacia adelante (el filo queda hacia atrás), y procurando asentar de forma homogénea todo el filo de la cuchilla. Al finalizar se debe limpiar la cuchilla con un paño humedecido en xilol a favor del filo. Tec. Histológicas

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- La cuchilla se coloca en el micrótomo con una inclinación de unos 15 º a 25º respecto de la cara del bloque (el ángulo varía según el tipo de material, cuanto más duro, menor es el ángulo). - La cara del bloque se orienta paralela al filo de la cuchilla. - Regular el micrótomo para el espesor de cortes que se desea (óptimo de 3 a 5 µm). - Desgastar el bloque hasta que la cara de corte salga entera y comiencen a observarse muestras del material incluido. - La tira de cortes se recoge tomando al primero de ellos con una pinza roma y al último con un pincel humedecido. Así se los lleva hasta un baño de agua tibia cuya temperatura sea algo menor al punto de fundición de la parafina empleada en la confección del bloque. Esto permite estirar los cortes realizados, y su recolección sobre porta objetos de vidrio previamente albuminados. La cara brillante de la cinta de cortes es la que se coloca en contacto con el agua. La aparición de pliegues puede solucionarse aumentando un poco la temperatura del agua. - El medio de montaje sirve para pegar los cortes al vidrio. Generalmente se usa Albúmina de Mayer, la cual disminuye la tensión superficial y aumenta la capilaridad permitiendo la adhesión. Para levantar los cortes del baño, se sumerge el portaobjetos albuminado inclinándolo por debajo de los cortes que, con un pincel ó una aguja, se orientan sobre él a medida que lo retiramos del agua. Se centran los cortes en el vidrio, se dejan escurrir 2 ó 3 minutos y se ponen a secar. 5 - COLORACIÓN La coloración debe ser contrastada. La afinidad del colorante con determinada estructura va a depender de condiciones físico-químicas. Cada estructura presenta distinta apetencia por los diferentes colorantes. - Tinción: Es la unión molecular entre colorante y tejido. - Impregnación: Es la precipitación de sales metálicas pesadas sobre determinadas estructuras.

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- Coloración directa: La solución de colorante actúa directamente sobre el tejido ó la célula. - Coloración indirecta: Se necesita una sustancia mordiente que puede estar en el colorante ó separada. - Coloración en bloque: Se realiza previo a la inclusión del material. - Coloración progresiva: Se deja actuar un colorante durante un tiempo determinado y luego se detiene su acción (generalmente con agua). - Coloración regresiva: Se sobrecolorea la preparación y luego se trata con un diferenciador (diferente para cada colorante), siempre controlando al microscopio. La acción del diferenciador se detiene con el lavado. - Colorante ácido: La sustancia activa es un ácido que tiene un grupo básico inactivo ó incoloro. Tiñe estructuras predominantemente básicas (por ej. citoplasma). - Colorante básico: La sustancia activa es una base que tiene un grupo ácido inactivo. Tiñe estructuras de naturaleza ácida (por ej. núcleo). - Colorante neutro: Mezcla de colorantes ácidos y básicos con grandes complejos moleculares poco solubles en agua, pero sí solubles en alcohol. Dan una coloración intermedia. Se utilizan en citología hematológica. +} La coloración de rutina se realiza con Hematoxilina y Eosina. HEMATOXILINA - Se extrae de la pulpa del Palo Campeche (árbol centroamericano). - Viene en polvo ó en cristales de color amarillo pardo. - Es soluble en agua y en alcohol, pero por sí sola no colorea, necesitando entonces de un oxidante y de un mordiente.

Hematoxilina + oxidante = Hemateína La Hemateína por sí sola no colorea, sino que necesita un mordiente. Se forma entonces un complejo Laca - Hematoxilina - Colorante, que sí colorea. Tec. Histológicas

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EOSINA - Las eosinas son xantenos ácidos ó colorantes de ftaleína. - Las más comunes son: - Eosina amarilla (yellow), es la más usada. - Eosina B (azul). - Floxina. - Eritrocina (está halogenada con iodo en lugar de bromo). - Zafranina. - Rosa de Bengala. - El nombre “Eosina” proviene de aurora (naranja). - Su punto de solubilidad es del 44 % en agua y del 7 % en alcohol. - Se puede usar un acentuador del color (por ejem. ácido acético al 0.2 % ó ácido tánico). - Da una buena coloración citoplasmática ó de fondo.

6 - Montaje La preservación de las preparaciones histológicas se realiza generalmente empleando un medio de montaje y colocando sobre ellas un cubre objeto de vidrio. El Bálsamo de Canadá es el medio de montaje clásico, aunque existen actualmente medios sintéticos (por ej. Entellant), con los cuales se obtienen también muy buenos resultados. Es importante evitar la hidratación del preparado para obtener una visualización óptima. Para ello debemos actuar con premura luego de pasar el preparado por el último pasaje con xilol. Tec. Histológicas

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- Escurrir brevemente el exceso de xilol. - Colocar una gota de medio de montaje sobre el corte o sobre el cubre objeto. - Colocar el cubre objeto sobre el corte dejándolo caer en ángulo agudo y tratando de evitar la formación de burbujas. - Presionar ligeramente con un paño limpio. - Eliminar el exceso de medio de montaje con un paño humedecido en xilol. 7 - Identificación y archivo - Etiquetar rotulando con lápiz la preparación. - También se puede grabar el extremo del porta objetos con diamante.

CONCLUSIONES: •

Gracias a la consulta quedaron mis dudad despejadas y pude conocer bien el procesamiento de tejidos ya que es muy fundamental saber

Logre adquirir conocimiento del manejo de los procesamientos de tejidos los cuales es de suma importancia su fase y objetivos que cumple cada una.

Debido a la consulta logre investigar los líquidos utilizando o sustitutivos también llamados para el procesamiento de tejidos estos en tanto ventajas y desventajas que cada liquido tiene comúnmente con los tejidos y debido al proceso que se realice.

Gracias al tiempo que toma en realizar cada uno de estos líquidos que se ocupa del procesamiento es también esencial ya que hay que hacer bien hecho sino nuestra muestra podría dañarse.

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RECOMENDACIONES: •

Cumplir a cabalidad con las normas de bioseguridad ya que esto es muy importante a la hora de manejar cualquier tipo de tejido a realizar.

Se recomienda tener cuidado con cada uno de los líquidos que se va utilizar.

La limpieza del equipo como el micrótomo es importante ya que de ello depende que hagamos buenos cortes.

Es muy esencial tener un conocimiento de cómo se realiza paso a paso el procesamiento de tejidos.

LINKOGRAFÍA: 1) http://bcelular.fcien.edu.uy/index_archivos/practico1.pdf 2) http://www.dermato101.com.ar/tecnica.pdf 3) http://medicina.usac.edu.gt/histologia/tecnicas_histo.pdf 4) http://bibliotecavirtual.dgb.umich.mx:8083/jspui/bitstream/123456789/110/1/MANUA LDEPROCEDIMIENTOSYTECNICASHISTOPATOLOGICAS.pdf 5) http://www.leicabiosystems.com/es/preparacion-de-muestras/procesamiento-de-tejidos/ 6) http://www.leicabiosystems.com/fileadmin/downloads/Leica%20PELORIS %20II/Brochures/95.10043_Rev_C_PELORIS_II_Brochure_ES.pdf 7) https://es.vwr.com/app/Header? tmpl=/healthcare_clinical/tissue_processing_equipment_consumables.htm 8) http://es.scribd.com/doc/45000709/Procesamiento-histologico 9) https://es.vwr.com/app/Header? tmpl=/healthcare_clinical/tissue_processing_chemicals.htm 10) http://www.slideshare.net/jipa87/procesamiento-de-tejidos

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