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DIAGNOSTIC AUTOMATION, INC. 23961 Craftsman Road, Suite E/F, Calabasas, CA 91302 Tel: (818) 591-3030 Fax: (818) 591-8383 onestep@rapidtest.com; technicalsupport@rapidtest.com www.rapidtest.com

Véase la etiqueta externa

2°C-8°C

Σ=96 tests

#6101-17

Cortisol ELISA Cat. No. 6101-17

USO Método competitivo inmunoenzimático colorimétrico para la determinación cuantitativa de concentraciones de Cortisol en suero ó plasma. PRINCIPIO DE LA PRUEBA El Cortisol (antígeno) presente en la muestra compite con el cortisol unido a peroxidasa de rábano picante (antígeno marcado con enzima) por un número limitado de sitios de unión del anti cortisol (anticuerpo) situado en la microplaca (fase sólida). Luego de la incubación, la separación de las fracciones unida/libre se realiza mediante un simple lavado de fase sólida. El substrato enzimático (H2O2) y el substrato TMB son agregados. Después de que ha trascurrido el tiempo apropiado para el desarrollo máximo del color, la reacción enzimática se detiene y se determinan las absorbancias. La concentración de cortisol en la muestra, es calculada basadas en una serie de estándares. La intensidad del color es inversamente proporcional a las concentraciones de Cortisol en la muestra.


COMPONENTES 96 tests  PLACA DE POCILLO. 1 placa. Tiras de micropocillos en blanco fijado en un soporte de tiras blancas. La placa se encuentra dentro de una bolsa sellada con desecante. 8x12/12x8 tiras de pozo por placa. Anti IgG cortisol absorbido en la microplaca. Las tiras de los pocillos pueden ser rotas para usarse por separado. Coloque los pozos y tiras sin usar en la bolsa plástica sellada junto con los desecantes y colóquelos de nuevo a 2 ~8ºC.  Estándares de Cortisol* 5 frascos.

*. Estándares (líquido) El estándar tiene la siguiente concentración de cortisol:

Estabilidad: hasta la fecha de expiración impresa en el kit. Cuando el frasco es abierto el estándar se mantiene estable por hasta seis meses a +4ºC.  REACTIVO CONJUGADO HRP 1 botella. 21ml por frasco. Conjugado de peroxidasa de rábano picante cortisol. Listo para usarse como se suministró. Una vez abierto, se mantiene estable por un mes a 2-8ºC.  SUBSTRATO DE TMB 1 botella. 12ml por frasco. H2O2. TMB 0.25gr/L (evite cualquier contacto con la piel). Listo para usarse como se suministró. Una vez abierto, se mantiene estable por un mes a 2-8ºC.  SOLUCIÓN DE PARADA 1 botella. 12ml por botella. Solución de ácido sulfúrico (0.15 H2SO4). Listo para usarse como se suministró.  BOLSA DE PLÁSTICO SELLABLE 1 unidad. Para cerrar las tiras que no estén en uso.  PAQUETE DE INSERTOS 1 copia. MATERIALES ADICIONALES E INSTRUMENTOS REQUERIDOS, PERO NO SUMINISTRADOS


         

Agua destilada o deshionizada fresa. Guantes y temporizador desechables. Contenedores de desechos apropiados para materiales potencialmente contaminantes. Canales en forma de V desechables. Sistema dispensador y/o pipetas (simples o multicanales), puntas de pipetas desechables. Papel absorbente o toallas limpias. Incubador seco o baño maría, 37±0.5ºC. Microbatidor para disolver y mezclar el conjugado con las muestras. Lector de micro placas, con longitud de onda simple de 450nm o con longitud de onda dual 450nm y 630nm. Sistema de aspiración/lavado de pocillos.

RECOLECCIÓN DE MUESTRAS, TRANSPORTE Y ALMACENAMIENTO 1. Recolección de Muestras: para este análisis pueden usarse tanto suero fresco como plasma. La sangre recolectada por venipunción debería dejarse coagular naturalmente y completamente – el suero/plasma debe ser separado de la coagulación tan pronto como sea posible para evitar hemólisis del RBC. Se debe tener cuidado para asegurar que las muestras de suero estén claras y no contaminadas por microorganismos. Cualquier partícula visible importa porque la muestra debe ser removida por centrifugación a 3000 RPM por al menos 20 minutos a temperatura ambiente, o al filtrar en filtros de 0.22u. Las muestras de plasma tomadas en EDTA, citrato de sodio o heparina pueden ser evaluadas, pero muestras altamente lipémicas, ictéricas, o hemolizadas no deberían ser usadas ya que podrían dar resultados erróneos en el análisis. No caliente muestras inactivas. Esto podría causar deterioro de la muestra. 2. Transporte y Estabilidad: almacene las muestras a 2-8ºC. las muestras que no requieran análisis en tres días deberían ser almacenadas en congelación a (-20ºC o menos). Múltiples ciclos de descongelamiento y congelamiento deben ser evitados. Para el envío, las muestras deberían ser empacadas y etiquetadas de acuerdo a las regulaciones locales e internacionales existentes para el transporte de muestras clínicas y agentes etiológicos. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD Los componentes del kit se mantendrán estables hasta la fecha de expiración indicada en la etiqueta y el empaque cuando se mantenga en almacenamiento, debe estar a 2-8ºC; no congelar. Para asegurar almacenamiento máximo proteja los reactivos de formas de contaminación con microorganismos o químicos. PRECAUCIONES Y SEGURIDAD Este kit fue realizado SÓLO PARA USO IN VITRO Y SÓLO PARA USO PROFESIONAL. El análisis ELISA es un método sensible al tiempo y a la temperatura. Para evitar resultados incorrectos, siga estrictamente los pasos del procedimiento del test y no los modifique.


1. No intercambie los reactivos de lotes diferentes, o use reactivos de otros kits comercialmente disponibles. Los componentes del kit están precisamente diseñados para alcanzar una actuación óptima durante la prueba. 2. Asegúrese de que todos los reactivos estén dentro de la validez indicada en la caja del kit y sean del mismo lote. Nunca use reactivos que hayan pasado la fecha de vencimiento colocada en la etiqueta de los reactivos o en la caja del kit. 3. PRECAUCIÓN – PASO CLAVE: permita que los reactivos y las muestras se estabilicen a temperatura ambiente (18-30ºC) antes de usar. Bata suavemente los reactivos, y devuélvalos a 2-8ºC inmediatamente después de usar. 4. Use sólo el volumen de la muestra indicado en los pasos de procedimiento. El no hacerlo, puede causar un análisis de sensibilidad baja. 5. No toque la parte inferior exterior de los pozos; huellas dactilares y rasguños pueden interferir con la lectura de los pocillos. 6. Cuando esté leyendo los resultados, asegúrese de que el fondo de la placa esté seco y que no haya burbujas de aire dentro de los pozos. 7. Nunca permita que los pozos de las microplacas se sequen luego del lavado. Inmediatamente proceda al siguiente paso. Evite la formación de burbujas de aire cuando agregue el reactivo. 8. Evite largas interrupciones entre los pasos del análisis. Asegure condiciones de trabajo idénticas para todos los pozos. 9. Calibre la pipeta frecuentemente para asegurar la precisión de las muestras/reactivos dispensadas. Siempre use diferentes puntas desechables de pipetas para cada muestra y reactivo, para evitar contaminación cruzada. Nunca pipetee las soluciones con la boca. 10. Se recomienda el uso de pipetas automáticas. 11. Asegúrese de que la temperatura de incubación sea de 37ºC dentro del incubador. 12. Cuando agregue las muestras, evite tocar el fondo de los pozos con la punta de la pipeta. 13. Cuando lea los resultados con un lector de placa, se recomienda determinar la absorbancia a 450nm con referencia a 630nm. 14. Todas las muestras de origen humano deben ser consideradas potencialmente infecciosas. 15. Se deben haber usado materiales de origen humano en el kit. Estos materiales han sido evaluados con kits de desempeño aceptable y fueron encontrados negativos para HIV ½ HCV, TP y HBsAG. Sin embargo, no hay método analítico que pueda asegurar que los agentes infecciosos en las muestras o reactivos estén completamente ausentes. Por lo tanto, maneje los reactivos y las muestras con extrema precaución como si estos transmitieran enfermedades infecciosas. La estricta adherencia a las regulaciones GLP (Good Laboratory Practice = Buenas Prácticas de Laboratorio) pueden asegurar la seguridad personal. Nunca coma, beba, fume, o aplique cosméticos en los laboratorios de análisis. 16. Suero derivado de bovinos puede haber sido usado en este kit. La albúmina de suero bovino (BSA) y suero fetal bovino (FCS) son derivados de animales de áreas geográficas libres BSE/TSE. 17. Las puntas de pipetas, frascos, tiras y contenedores de muestras deberían ser recolectados y esterilizados por 1 hora a 121ºC o tratados con 10% de sodio hipoclorhídrico por 30 minutos para descontaminar antes de que cualquier paso de desecho sea realizado.


18. La Solución de Parada (0.15M H2SO4) es un ácido fuerte. Corrosivo. Úselo con la precaución apropiada. Limpie las salpicaduras inmediatamente o lave con agua si entra en contacto con la piel u ojos. 19. La actividad enzimática del conjugado HRP puede afectada por el polvo, reactivos químicos, y substancias como el sodio hipoclorhídrico, ácidos, alcalinos, etc. No realice el análisis ante la presencia de tales substancias. 20. Materiales de la Hoja de Datos de Seguridad están disponibles a pedido. 21. Si se está usando un sistema de procesamiento de microplaca totalmente automatizado durante la incubación, no cubra las placas con el cobertor de placa. El golpeteo de los residuos dentro de la placa luego del lavado, también puede ser omitido. PROCEDIMIENTO DEL ANÁLISIS Paso 1. Preparación de los Reactivos: permita que los reactivos y muestras lleguen a temperatura ambiente (18-30ºC) por al menos 15-30 minutos. Paso 2. Enumeración de los Pozos: coloque las tiras necesarias en el mezclador y enumere la cantidad suficiente de pozos. Como es necesario realizar la determinación en duplicado, prepare dos pozos para cada uno de los cinco puntos de la curva de calibración (S0, S4), dos para cada muestra y uno para el blanco Paso 3. Agregar la muestra y Conjugado HRP Pipeta: Estándar Muestra --Estándares S0 -S4 20 μl Conjugado 200 μl

Muestra 20 μl --200 μl

Blanco -------

Paso 4. Incubación: incubar por 60 minutos a 37ºC. Se recomienda usar un tanque de agua controlada por termostato para asegurar la estabilidad de la temperatura y humedad durante la incubación. Si se usa un incubador en seco, la abra la puerta con frecuencia. Paso 5. Lavado: al final de la incubación, remueva los contenidos de cada pozo; lave los pozos con 300μl de agua destilada. Repita el proceso de lavado drenando completamente el agua. Permita que los pocillos se remojen por 30-60 segundos. Después del último ciclo de lavado, voltee el pozo sobre papel secante o toalla limpia, y golpéelo ligeramente para remover cualquier líquido que quede. Paso 6. Coloreado. Pipeta:

Estándar Muestra Substrato-TMB 100μl 100μl Incube la placa a 37°C por 15 minutos, evitando la luz.

Blanco 100μl

Paso 7. Reacción de Parada: pipetee solución de parada en cada pozo y mezcle suavemente. Estándar Muestra Blanco


Solución de Parada

100μl

100μl

100μl

Paso 8. Medición de la Absorbancia: calibre el lector de placa con el pozo en Blanco y lea la absorbancia a 450nm. Si se usa un instrumento de filtro dual, coloque la longitud de onda a 630nm. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Y CONTROL DE CALIDAD Cada pocillo debería ser considerado por separado cuando se calcula e interpreta el resultado del análisis, sin importar el número de placas procesadas. CURVA DE CALIBRACIÓN – CÁLCULO DE LOS RESULTADOS Absorbancia media y porcentaje relativo. Calcule la media de las absorbancias (Em) por cada punto de la curva de calibración y de cada muestra. Exprese los datos como el porcentaje de la media de absorbancia de B0 (EmB0) con la siguiente formula:

Curva de Calibración Trace los valores de los estándares expresados como (B/0) % en el papel milimetrado logia-log adjunto. Extrapole la línea pasando por los puntos. Cálculo de los resultados Interpole los valores de las muestras expresadas como (B/B0) % en la curva de calibración para obtener los valores correspondientes de las concentraciones expresadas en ng/mL. VALORES DE REFERENCIA El valor de referencia del suero o plasma cortisol es de: 60-230ng/mL Paciente tratado (a) con ACTH; 280 – 600 ng/mL Paciente tratado (a) con dexametasona 0 – 50 ng/mL DESEMPEÑO DEL TEST Y VALORES ESPERADOS Especificidad La reacción cruzada del anticuerpo calculada a 50% de acuerdo a Abraham se muestra en la tabla: Cortisol Cortisona 11 α deoxicortisol

100.0 % 10.8 % 18.7 %


Corticosterone Progesterona Aldosterona 11 α Oh-Progesterona Colesterol

2.4 % 0.1 % 0.01 % 0.01 % <1x10-6 %

Sensibilidad La sensibilidad de este método, fue calculada como dos veces el D.S de B0 es de 1 ng/mL cuando el valor de (B/B0) % aprox 90%. Precisión La precisión inter e intra corrida tenia un coeficiente de variación de 3.2% y 5.8% respectivamente. Exactitud La recuperación de 10 – 50 – 150 – 500 ng/mL de Cortisol agrega a la muestra “libre de plasma” dio un valor promedio de (±SE) de 105% ± 4.8% con referencia a las concentraciones originales. Correlación con RIA Correlación con RIA realizada a las mismas muestras:

LIMITACIONES 1. Puede que ocurran resultados positivos no repetibles debido a las características generales biológicas y bioquímicas del método ELISA. El test está diseñado para alcanzar altísimas características de desempeño en cuanto a sensibilidad y especificidad. Sin embargo, en casos muy raros algunos mutantes HBV o subtipos pueden mantenerse indetectables. Los anticuerpos pueden también ser indetectables durante las etapas tempranas de la enfermedad y en algunos individuos inmunosuprimidos. 2. Cualquier resultado positivo debe ser interpretado en conjunción con la información clínica del paciente y los resultados de otros tests de laboratorio. 3. Fuentes comunes de errores: kits más allá de la fecha de expiración, malos procedimientos de lavado, reactivos contaminados, pasos incorrectos del procedimiento de análisis, aspiración insuficiente durante el lavado, fallas al agregar muestras o reactivos, equipo de cronometraje, naturaleza de la muestra y calidad. 4. El predominio del marcador afectará los valores predicativos del análisis. 5. Este es un análisis cualitativo y los resultados no pueden ser usados para medir las concentraciones de anticuerpos.


6. Si, luego de volver a analizar las muestras inicialmente reactivas, los resultados del análisis son negativos, estas muestras deben ser consideradas como no repetibles (falso positivo) e interpretadas como negativas. Al igual que con muchos análisis ELISA sensibles, resultados falso positivos pueden ocurrir debido a diversas razones, la mayoría de las cuales están relacionadas pero no limitadas al paso de lavado inadecuado. VALIDÉZ Por favor no use este kit más allá de la fecha de vencimiento indicada en la caja del kit y en las etiquetas de los reactivos. REFERENCIAS

DIAGNOSTIC AUTOMATION, INC. 23961 Craftsman Road, Suite E/F, Calabasas, CA 91302 Tel: (818) 591-3030 Fax: (818) 591-8383 ISO 13485-2003

Versión Original: 02-08-06


cortisol