Issuu on Google+

ROZDZIAŁ 2. ELEMENTY ENZYMOLOGII Enzymy są swoistymi białkami, katalizującymi zachodzące w przyrodzie ożywionej reakcje chemiczne. Pod pojęciem katalizy enzymatycznej rozumie się zwiększenie szybkości reakcji termodynamicznie możliwych (nawet milionkrotne), jedynie poprzez zmniejszenie energii aktywacji cząsteczek substratu bez naruszania stanu końcowej równowagi. Enzym nie wchodzi w skład końcowych produktów reakcji i zasadniczo pozostaje w stanie nie zmienionym po zakończeniu reakcji. Zdecydowana większość dotychczas poznanych enzymów ma budowę białkową. Niektóre z nich są białkami prostymi, zbudowanymi wyłącznie z aminokwasów (np. większość hydrolaz). Jednak w przeważającej liczbie przypadków składają się one z części białkowej (a p o e n zy m u ) i niebiałkowej (witamin i ich pochodnych, jonów metali oraz małocząsteczkowych związków organicznych) tzw. g r u p p r o s t e t y c z n y c h i k o e n z y m ó w . Pod nazwą g r u p a p r o s t e t y c z n a rozumie się różnorodne niebiałkowe związki chemiczne (sacharydy, żelazoporfiryny) i jony metali luźno związane z apoenzymem oraz silnie związane z częścią białkową koenzymy. K o e n z y m y są witaminami lub ich pochodnymi. Połączenie koenzymu z apoenzymem określa się mianem h o l o e n z y m u . Trwałość tego połączenia jest różna; bardzo często koenzym łatwo oddysocjowuje od apoenzymu. A p o e n z y m jest czynny wyłącznie w połączeniu z koenzymem lub grupą prostetyczną i decyduje o swoistości substratowej enzymu, a niekiedy również kierunkowej, np. dekarboksylację i transaminację aminokwasów katalizują enzymy o różnych apoenzymach i tych samych koenzymach. Dla porządku należy wspomnieć, iż aktywność biokatalityczną mogą również wykazywać cząsteczki kwasów nukleinowych (Nagroda Nobla w 1989 roku dla G. Altmana i T. Czecha).

2.1. Ogólne właściwości katalityczne enzymów Szczególną cechą enzymów jest ich duża specyficzność (określana także jako wybiórczość czy swoistość) zarówno pod względem rodzaju katalizowanej reakcji chemicznej - tzw. specyficzność kierunkowa, jak i wobec związków (substratów) biorących w niej udział - tzw. specyficzność substratowa. Swoistość idzie często tak daleko, że enzym rozróżnia odmianę stereoizomeryczną substratu, działając wyłącznie na jedną z nich – tzw. stereospecyficzność. Nic więc dziwnego, iż enzymy mogą katalizować w sposób wybiórczy takie przekształcenia, których trudno lub wręcz nie można dokonać w inny znany sposób. Specyficzność kierunkowa. Określony enzym katalizuje na ogół pojedynczą reakcję lub grupę ściśle spokrewnionych przemian chemicznych. Dokonuje on niejako selekcji wśród możliwych reakcji, wybierając jedną z nich. Na przykład cząsteczka glukozo-6-fosforanu może w komórce ulec wielu różnym przemianom, w tym utlenieniu (do laktonu kwasu 6-fosfoglukonowego), izomeryzacji (do fruktozo-6-fosforanu) czy też mutarotacji (do glukozo-1-fosforanu). Każda z tych reakcji jest katalizowana przez inny enzym: pierwszą katalizuje dehydrogenaza glukozo-6-fosforanu, drugą – izomeraza heksozofosforanowej, wreszcie trzecią - fosfoglukomutaza. CH2O dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa

H C HO

CH2O

H C HO

C

P

O

H OH C

H C

H

OH

P

C

O

H OH C

H C

H

OH

C O

lakton kwasu 6-fosfoglukonowego P

H C OH

H

H C HO

C

O

H OH C

H C

H

OH

glukozo-1-fosforan

33

H C O

CH2OH

OH

H

C

C

H OH fruktozo-6-fosforan

CH2OH

glukozo-6-fosforan fosfoglukomutaza

C

izomeraza heksozofosforanowa

O

OH2C

P

C OH


Specyficzność substratowa. Od specyficzności działania enzymu należy odróżnić jego specyficzność substratową, polegającą na katalizowaniu przez dany enzym przemiany chemicznej tylko jednego określonego substratu lub ograniczonej ich liczby. Znane są enzymy, wykazujące absolutną wybiórczość wobec substratu: np. ureaza działa tylko i wyłącznie na mocznik powodując jego rozpad, dehydrogenaza metanolowa utlenia jedynie metanol. Jednakże nie wszystkie enzymy wykazują tak daleko posuniętą specyficzność substratową, np. proteinazy, lipazy czy amylazy hydrolizują większość swoich substratów tj. odpowiednio białek, lipidów oraz pochodnych α-glukanu niezależnie od specyficznych cech budowy tych związków. O tych enzymach mówi się, że wykazują szeroką specyficzność (są mało specyficzne). Ich przeciwieństwem są enzymy o wąskiej specyficzności (wysoko specyficzne). Stereospecyficzność. W Rozdziale 1 tego podręcznika omówiono zjawisko izomerii związków chemicznych. Wiele enzymów rozróżnia izomery i wykazuje aktywność katalityczną wyłącznie w stosunku do jednej z odmian izomerycznych związku lub też tworzy jedynie jedną z nich, np. cis lub trans, α- lub β-, D- lub L-, itp. Klasycznym FAD FADH2 przykładem jest dehydrogenaza bursztynianowa, H2C COOH HC COOH która przekształca bursztynian do fumaranu dehydrogenaza H C COOH HOOC CH 2 (odmiana trans kwasu etenodikarboksylowegobursztynianowa 1,2). Kwas maleinowy (odmiana cis kwasu bursztynian fumaran etenodikarboksylowego-1,2) nie tylko, że nie powstaje w tej reakcji, lecz ją hamuje. Innym przykładem, który dobrze obrazuje zagadnienie stereospecyficzności enzymów, jest α-glukozydaza. Ta hydrolaza działa na wszystkie α-D-glukopiranozydy, nie biorąc jednak udziału w reakcjach hydrolizy innych glikozydów (np. β-D-glukopiranozydów, fruktofuranozydów, itp.). Z kolei subtilizyna (serynowa proteinaza z B.subtilis) z mieszaniny racemicznej estrów N-acetyloaminokwasów hydrolizuje jedynie formę L-aminokwasu. Znane są enzymy wykazujące regioselektywność. Rozpoznają one miejsce w cząsteczce związku chemicznego (np. atom węgla, grupę funkcyjną, itp.), w którym pod działaniem enzymu następuje przekształcenie właściwe dla jego O CH3 specyficzności kierunkowej. Takie właściwości przejawiają m.in. C monooksygenazy, które mogą selektywnie wbudowywać atom tlenu w  jedno, ściśle określone miejsce cząsteczki, hydroksylując ją. Niektóre z 11 15 nich, hydroksylujące np. progesteron, mogą przejawiać jednocześnie stereospecyficzność. To, czy hydroksylowanie nastąpi w pozycji  lub  6  oraz w którym pierścieniu i przy którym atomie węgla zależy, z O jakiego drobnoustroju pochodzi enzym. Monooksygenazy bakterii  B.megaterium ATCC, jako jedne z nielicznych, hydroksylują progesteron przy 15 atomie węgla w pozycji  i  Monooksygenazy Progesteron szczepu B.megaterium KM hydroksylują progesteron w kilku pozycjach: 15  i  6  oraz 11. Natomiast tautomerazy, epimerazy lub Δ-izomerazy przekształcają jeden izomer w drugi. Przykładem może być epimeraza UDP-glukozowa przekształcająca UDP–1-glukozę w UDP-1galaktozę.

2.2. Istota katalizy enzymatycznej Według aktualnej wiedzy, katalityczne działanie enzymów związane jest ze zjawiskiem międzycząsteczkowych oddziaływań. Enzym (E) i substrat (S) - ewentualnie substraty - tworzą przejściowo połączenie ES, w którym na skutek specyficznych właściwości centrum katalitycznego enzymu następuje aktywacja cząsteczki substratu z jednoczesnym osłabieniem niektórych jego wiązań kowalencyjnych. Uaktywniony kompleks ES przekształca się w połączenie EP, gdzie P oznacza produkt reakcji. W końcowym etapie połączenie EP rozpada EP ES E+P się na wolny enzym i produkt reakcji. Schematycznie reakcję E + S taką można zapisać równaniem: Dokładne poznanie natury oddziaływań odpowiedzialnych za katalizę enzymatyczną jest przedmiotem badań i rozważań w literaturze naukowej od wielu lat. Pionierami w tej dziedzinie byli

34


E. Fischer, pierwszy sugerujący komplementarność centrów aktywnych enzymów do substratów, oraz L.Pauling, autor koncepcji silnej stabilizacji stanu przejściowego przez centrum aktywne. Od tego czasu, pojawiało się wiele alternatywnych propozycji jak teoria naprężeń sterycznych, optymalnego nałożenia orbitali, elektrostatycznego klucza i zamka, itp. Jedno z bardziej nowoczesnych opracowań na temat czynników odgrywających rolę w katalizie enzymatycznej zawarł w swojej książce Warshel*. Na drodze rozważań teoretycznych (półempirycznych) dochodzi on do wniosku o dominującej roli oddziaływań o naturze elektrostatycznej w katalizie enzymatycznej. Warshel rozpatruje następujące czynniki, które w różnych modelach teoretycznych proponowano jako źródło aktywności katalitycznej enzymów:  naprężenia steryczne;  desolwatację reagentów;  optymalne nakładanie orbitali (OS);  wiązania wodorowe o niskiej barierze przeniesienia protonu (LBHB);  efekty dynamiczne;  zmiany entropii w wyniku wiązania z enzymem,  oddziaływania elektrostatyczne w preorientowanym, polarnym centrum aktywnym.

Energia swobodna

Zmiany energii swobodnej podczas reakcji niekatalizowanej i enzymatycznej można przedstawić schematycznie jak na rysunku obok. Wielkość energii swobodnej tworzenia stanu przejściowego wyznacza barierę energetyczną dla całej stan przejściowy reakcji. Ta bariera dla reakcji enzymatycznej jest wyraźnie niższa (o ∆GE) ∆GE niż bariera energetyczna dla reakcji niekatalizowanej. Enzymy: zmniejszając energię swobodną tworzenia stanu przejściowego znacznie przyspieszają substraty produkty przekształcenie substratów w produkty. reakcja enzymatyczna

2.2.1. Mechanizm działania enzymów Postęp reakcji W czasie reakcji enzymatycznej cząsteczka substratu jest wiązana w określonym obszarze do cząsteczki enzymu w tzw. centrum aktywnym, przez co tworzy się kompleks enzym–substrat. Dzięki specyficznemu rozkładowi grup chemicznych w centrum, enzym oddziałuje na ugrupowania chemiczne substratu rozluźniając konkretne wiązanie chemiczne. W wyniku rozerwania tych wiązań substrat przekształca się w produkt, który uwalniany jest z kompleksu z enzymem. Enzym po powrocie do formy pierwotnej (w enzymach złożonych po przyłączeniu przenoszonych grup do innego związku) tworzy nowy kompleks z następną cząsteczką substratu itd. Mechanizm łączenia enzymu z substratem tłumaczy się obecnie indukowanym dopasowaniem, polegającym na dopasowaniu kształtu enzymu do substratu i przekształceniu go w produkt. Przy tym enzym może zniekształcić substrat wymuszając w nim konformację podobną do stanu + S E S przejściowego. Przykładem może być wiązanie E glukozy z heksokinazą. Centrum aktywne enzymów. Centrum aktywne to określony obszar cząsteczki białka enzymatycznego, w którym podczas katalizy następuje wiązanie substratu i następnie jego przekształcenie w produkt względnie produkty reakcji. Specyficzność kierunkowa i substratowa enzymów, a także wiele ich właściwości, zdeterminowanych jest budową centrum aktywnego. Przyjmuje się, że centrum aktywne enzymów zlokalizowane jest w głębi globularnej cząsteczki białka w kieszonce kształtem przypominającej szczelinę lub rowek. Obszar centrum aktywnego w przeważającej ilości tworzą reszty aminokwasów o właściwościach hydrofobowych, a co za tym idzie, panują w tym obszarze warunki hydrofobowe. Tak więc, jest to mikrośrodowisko o małej stałej * [Warshel, A.: Computer Modelling Of Chemical Reactions In Enzymes And Solutions", John Wiley & Sohns, Inc., New York, Chichester, Brisbane, Toronto and Singapore, 1991 ]

35


dielektrycznej, a stąd o zwielokrotnionych oddziaływaniach elektrostatycznych. Dzięki temu możliwe jest rozluźnienie określonych wiązań kowalencyjnych w cząsteczce substratu i ich przekształcenie w inne układy wiązań. Aminokwasy wchodzące w skład centrum aktywnego - z uwagi na funkcję, jaką pełnią – dzieli się na cztery kategorie: 1. aminokwas lub a m i n o k w a s y b e z p o ś r e d n i o d z i a ł a j ą c e ; w enzymach złożonych ich rolę pełnią koenzymy lub grupy prostetyczne, 2. a m i n o k w a s y w s p o m a g a j ą c e , 3. a m i n o k w a s y k o n t a k t o w e , zwane również w i ą ż ą c y m i , 4. a m i n o k w a s y p o m o c n i c z e . A m i n o k w a s y p o m o c n i c z e nie biorą bezpośredniego udziału w katalizie, lecz niezbędne są do utrzymanie właściwej konformacji przestrzennej pozostałych aminokwasów centrum aktywnego (można je traktować, jako czynniki strukturotwórcze centrum aktywnego). A m i n o k w a s y k o n t a k t o w e (w i ą ż ą c e ) odpowiedzialne są za rozpoznanie substratu i „wciągniecie” go do kieszonki centrum aktywnego. Z reguły są zlokalizowane na obrzeżach kieszonki. Odpowiedzialne są za specyficzność substratową enzymów. Rola a m i n o k w a s u b e zp o ś r e d n i o d z i a ł a j ą c e g o i a m i n o k w a s ó w w s p o m a g a j ą c y c h zostanie wyjaśniona na przykładzie centrum katalitycznego endopeptydaz serynowych. Enzymy te hydrolitycznie rozszczepiają wiązania peptydowe w białkach. Omawiane aminokwasy zlokalizowane są w głębi kieszonki; w przestrzeni znajdują w bliskiej od siebie odległości przyjmując z góry ściśle określoną konfigurację (tak, jak to pokazano na rysunku). 32 Asp

64 His

CH2

221 Ser

CH2

CH2

C N

H O

O

221 Ser

CH2

CH2

O-

R1

H N

221 Ser

NH

64 His

CH2

CH2

221 Ser CH2

C O-

O

32 Asp

R2

O

+C O

N

N H

O-

221 Ser R2

CH2

C O

-

OH

-

OH

R2 COOH +

O-

H2O R1 NH2

Mechanizm działania centrum katalitycznego proteinaz serynowych (opis w tekście).

W centrum katalitycznym wszystkich proteinaz serynowych występuje triada aminokwasów. Aminokwasem bezpośrednio działającym jest seryna, która w subtilizynach zajmuje pozycję 221 w łańcuchu polipeptydowym, a np. w chymotrypsynie 195. Aminokwasami wspomagającymi są histydyna i kwas asparaginowy. W środowisku alkalicznym zdysocjowana, silnie ujemna grupa karboksylanowa rodnika aspartylowego wywołuje efekt indukcyjny, który w wyniku rezonansu przenosi się poprzez rodnik imidazolowy histydyny i na azocie 3 pojawia się silny ładunek ujemny; w konsekwencji wodór grupy hydroksylowej seryny zostaje przeniesiony na azot i jednocześnie powstaje ujemny jon alkoholanowy seryny. Jeżeli w jego pobliżu znajdzie się odpowiednio ustawiony przestrzennie węgiel wiązania peptydowego – naładowany dodatnio – to oba przeciwnie naładowane atomy zaczną się zbliżać do siebie. Na skutek silnych oddziaływań elektrostatycznych panujących w tym obszarze wiązanie peptydowe ulegnie rozerwaniu. Proton z cząsteczki wody przyłączy się do atomu azotu grupy aminowej i ten fragmentu łańcucha peptydowego odłączy się od centrum 36


aktywnego. Drugi fragment łańcucha peptydowego przejściowo utworzy wiązanie estrowe z resztą seryny centrum aktywnego, by po chwili ulec hydrolizie pod działaniem wolnej grupy OH i też oddzieli się od centrum aktywnego proteinazy. 2.2.2. Koenzymy i grupy prostetyczne. W enzymach złożonych rolę aminokwasu bezpośrednio działającego pełnią koenzymy lub grupy prostetyczne. Spełniają one rolę przenośników elektronów, atomów lub niewielkich grup chemicznych. Biorą udział w 2 kolejnych reakcjach enzymatycznych: w pierwszej pobierają z jednego substratu grupę chemiczną, w drugiej oddają ją drugiemu substratowi, odtwarzając się w pierwotnej postaci, po czym proces się powtarza. Przenoszenie takie może również odbywać się w obrębie tej samej cząsteczki i mamy wtedy do czynienia z izomeryzacją substratu. Trwałość połączenia apoenzymu z koenzymami jest różna; jeśli koenzym łatwo dysocjuje, reakcje przenoszenia grup chemicznych na koenzymy i z koenzymów katalizuje układ złożony z 2 enzymów o wspólnym koenzymie; jeśli koenzym jest związany z enzymem trwale (pełniąc rolę grupy prostetycznej), enzym ten katalizuje kolejno obie reakcje. Uogólniając, niebiałkowe składniki enzymów można traktować, jako kosubstraty reakcji enzymatycznej. W tabeli 2.1. zestawiono ważniejsze koenzymy i grupy prostetyczne, których budowa chemiczna i mechanizm działania zostaną omówione dalej. Tabela 2.1. Ważniejsze koenzymy i grupy prostetyczne Nazwa koenzymu lub grupy prostetycznej Koenzymy oksydoreduktaz Dinukleotyd nikotynamidoadeninowy Fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego Dinukleotyd flawinoadeninowy Mononukleotyd flawinowy Metaloflawoproteidy Flawoproteidy transportujące elektrony Ubichinon Liponian Porfiryny

Skrót

Przenoszone grupy lub charakterystyczna cecha

NAD NADP

Atomy wodoru i epimeryzacja Atomy wodoru

FAD FMN Me-Fp ETF Q

Atomy wodoru i koenzym oksydaz Atomy wodoru Transport elektronów Transport elektronów Transport elektronów Atomy wodoru i grupy acylowe Cytochromy, oksydaza cytochromowa koenzym katalazy i peroksydaz

Lip

S S

-

Koenzymy transferaz Adenozynometionina Adenozynotrifosforan

ATP

Biotyna Difosfotiamina Fosforan pirydoksalu

DPT TPP

Koenzym A Koenzym B12

CoASH B12

Kwas foliowy

FH4

Siarczan fosfoadenilowy Urydynodifosforan

PAPS UDP

37

Grupy metylowe Grupy fosforanowe, pirofosforanowe i AMP CO2 (koenzym karboksylaz) Grupy aldehydowe lub dekarboksylacja Przemiany aminokwasów (w tym deaminacja) Grupy acylowe Wewnątrzcząsteczkowe przeniesienie grupy -COOH Grupy formylowe, hydroksymetylowe, formimidowe Reszta kwasu siarkowego Grupy glikozylowe


Koenzymy i grupy prostetyczne oksydoreduktaz Nukleotydy nikotynamidowe. Koenzymem wielu dehydrogenaz, czyli enzymów odrywających lub przyłączających atomy wodoru do substratów, jest dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD+) lub jego fosforan - NADP+. Jak wskazuje nazwa, koenzymy te są dinukleotydami O C zbudowanymi z nukleotydu adeninowego i nukleotydu nikotynamidowego lub jego NH2 fosforanu. Podstawowym składnikiem nukleotydu nikotynamidowego jest amid N kwasu nikotynowego. Kwas nikotynowy, (znany także jako niacyna), jest pochodną amid kwasu pirydyny i jest jedną z witamin z grupy B o nazwie witamina PP. nikotynowego Niedobór witaminy PP w organizmie człowieka powoduje zaburzenia czynności przewodu pokarmowego oraz ośrodkowego układu nerwowego a także powoduje zmiany skórne znane jako pelagra. Kwas nikotynowy w wystarczających dla człowieka ilościach występuje w mięsie, rybach oraz nasionach zbóż. Dzienne zapotrzebowanie człowieka na tę witaminę wynosi około 30mg.

Postać utleniona dinukleotydu nikotynamidoadeninowego przedstawiana jest skrótem NAD+, a jego forma zredukowana NADH + H+. Umownie, dla wygody, dopuszcza się również symboliczne zapisy NAD (zamiast NAD+) i NADH2 (zamiast NADH+H+). NH2

CONH2 N

+ N CH2O OH

P

P

N O

OH2C

HO

CONH2 XH2

N

+ N

N

OH

OH (

P

)

H

H

CONH2

N

Ryb

O

X

P

P

Aden

NAD

Ryb

P

+

H+

P

Aden

NADH + H+

mechanizm odrywania wodoru od substratu XH2 przez NAD

dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD) i jego fosforan (NADP)

Poznano przeszło 200 dehydrogenaz sprzężonych z NAD lub NADP. Właściwości i działanie obu koenzymów jest analogiczne. Stężenie NAD w komórkach jest znacznie większe niż NADP i stąd dehydrogenazy sprzężone z NAD są liczniejsze. Ogólnie można przyjąć, że NAD pełni w żywej komórce rolę akceptora wodoru, natomiast jego fosforan jest donorem wodoru (pełni rolę reduktora). W wielu przemianach enzymatycznych oba koenzymy mogą być nawzajem wymieniane. Ale znane są przemiany, w których różnice pomiędzy NAD i NADP są bardzo wyraźne. Np. dehydrogenaza alkoholowa z NAD (EC 1.1.1.1) jest 10000 razy aktywniejsza niż z NADP (EC 1.1.1.2); stąd rozróżnienie w klasyfikacji enzymów. Istnieje możliwość wymiany H pomiędzy obu koenzymami: NADPH2 + NAD

transdehydrogenaza EC 1.6.1.1

NADP + NADH2

Zredukowane formy NADH2 – wyjątkowo również NADPH2 - w żywych komórkach regenerowane (utleniane) są w łańcuchu oddechowym. Ale NADH2 może też regenerować się w reakcjach, w których staje się donorem wodoru + NAD (w tym, jako donor wodoru dla oksygenaz z HC COOH NADH+H H2C COOH pod-podklas EC 1.14.12. i EC 1.14.13.). HOOC CH H2C COOH Większość reakcji katalizowana przez reduktaza fumaranowa (EC 1.3.1.6) dehydrogenazy sprzężone z NAD jest kwas fumarowy kwas bursztnowy odwracalna. Jeżeli reakcja redukcji ma przewagę nad reakcją utlenienia, enzym nazywa się reduktazą, np. przyłączenie atomów wodoru do podwójnego wiązania w kwasie fumarowym katalizuje reduktaza fumaranowa (sprzężona z NAD - EC 1.3.1.6). Identyczną reakcję tyle, że biegnącą głownie w przeciwnym kierunku katalizuje dehydrogenaza bursztynianowa (sprzężona z FAD - EC 1.3.99.1). Swoistość substratowa dehydrogenaz sprzężonych z NAD lub NADP zależy od rodzaju apoenzymu. Nie jest ona jednak absolutna. W wielu przypadkach wyraża się bardzo dużymi różnicami

38


szybkości katalizowanych reakcji, np. dehydrogenaza aldehydu fosfoglicerynowego utlenia również aldehyd glicerynowy, ale około 1000 razy wolniej. Apoenzymy licznych dehydrogenaz sprzężonych z NAD lub NADP zawierają związane jony metali Mg2+, Zn2+, Mn2+. Jony te są aktywatorami działania tych dehydrogenaz. Np. jony Mg2+ lub Zn2+ odgrywają ważną rolę podczas utleniania alkoholi, ułatwiając powstawanie jonu alkoholanowego. Niektóre dehydrogenazy sprzężone z NAD lub NADP podczas swojego „właściwego” działania, czyli utleniania substratu mogą równocześnie prowadzić do jego d e k a r b o k s y l a c j i . Takiej dekarboksylacji ulegają tylko α-ketokwasy lub α-hydroksykwasy. Utlenianie α-ketokwasów połączone z ich dekarboksylacją nazywa się S ,DPT, FAD, α - o k s y d a c j ą i katalizowane jest przez u k ł a d y w i e l o e n z y m a t y c z n e (sprzężone z Lip S CoASH i NAD). Przykładem jest przemiana pirogronianu do acetylo~SCoA katalizowana przez d e h y d r o g e n a z ę p i r o g r o n i a n o w ą ( d e k a r b o k s y l u j ą c ą ) , o czym będzie mowa dalej. Natomiast przykładem dekarboksylacji α-hydroksykwasów podczas ich utlenienia jest działanie dehydrogenaz jabłczanowych (dekarboksylujących). Ogólnie znane są aż cztery dehydrogenazy jabłczanowe sprzężone z NAD lub NADP, w tym trzy o właściwościach dekarboksylujących: EC 1.1.1.37 – d e h y d r o g e n a z a j a b ł c z a n o w a - znana z cyklu Krebsa, sprzężona z NAD, utlenia jabłczan do szczawiooctanu, EC 1.1.1.38 – d e h y d r o g e n a z a j a b ł c z a n o w a ( s z c z a w i o o c t a n - d e k a r b o k s y l u j ą c a ) - sprzężona z NAD, podczas utleniania jabłczanu, jednocześnie dekarboksyluje go; posiada zdolność dekarboksylacji szczawiooctanu, EC 1.1.1.39 – d e h y d r o g e n a z a j a b ł c z a n o w a ( d e k a r b o k s y l u j ą c a ) - sprzężona z NAD, podczas utleniania jabłczanu, jednocześnie dekarboksyluje go; nie posiada zdolności dekarboksylacji szczawiooctanu, EC 1.1.1.40 – d e h y d r o g e n a z a j a b ł c z a n o w a ( s z c z a w i o o c t a n - d e k a r b o k s y l u j ą c a ) - sprzężona z NADP, podczas utleniania jabłczanu, jednocześnie dekarboksyluje go; posiada zdolność dekarboksylacji szczawiooctanu.

Nukleotydy flawinowe. W skład tych nukleotydów wchodzi r y b o f l a w i n a . Związek ten zbudowany jest z heterocyklicznej izoalloksazyny i przyłączonego do niej rybitolu, pięciowodorotlenowego alkoholu, będącego pochodną rybozy. Ryboflawina jest witaminą B2. H3C

O H3C H3C

N N

NH N

H3C

O N N

NH N

O

CH2

O

NH2

CHOH

CH2 CHOH

N

CHOH CHOH CH2O P

CHOH CHOH

P

OH2C

N O

N N

CH2OH ryboflawina

OH OH dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD)

Ryboflawina posiada charakterystyczne żółte zabarwienie. Jej niedobór w organizmie człowieka powoduje zmiany chorobowe w obrębie jamy ustnej; m.in. pękanie kącików ust i śluzówki, obrzęki warg i ich łuszczenie się, zmiany zapalne języka a także zaburzenia ze strony narządu wzroku. Duże ilości tej witaminy występują w drożdżach, w ziarnach zbóż i jajach. Zapotrzebowanie człowieka wynosi 2mg na dobę.

Fosforan ryboflawiny – m o n o n u k l e o t y d f l a w i n o w y – zapisuje się symbolicznie FMN, a jego połączenie z nukleotydem adeninowym – d i n u k l e o t y d f l a w i n o a d e n i n o w y – oznacza się skrótem FAD. Oba nukleotydy flawinowe są nierozerwalnie związane z odpowiednimi białkami enzymatycznymi, tworząc f l a w o p r o t e i d y , będąc jednocześnie przykładem grup prostetycznych. FMN i FAD są grupami prostetycznymi dehydrogenaz, przenoszących głównie atomy wodoru. Ich cechą charakterystyczną jest zdolność odrywania atomów wodoru od dwóch sąsiadujących ze sobą atomów węgla, tworząc podwójne wiązanie: -CH2-CH2-→ -CH=CH-. Przykładem może być wspomniana już dehydrogenaza bursztynianowa (EC 1.3.99.1). Zredukowaną formę FAD

39


symbolicznie zapisuje się FADH2. Podobnie jak zredukowany NADH2, zredukowany FADH2 w komórce regeneruje się (utlenia) w łańcuchu oddechowym. O H3C

N

H3C

N

H XH2

NH N

X

O

H3C

N

H3C

N

O NH O

N H

rybitol

P

P

Aden

rybitol

FAD

P

P

Aden

FADH2

mechanizm odrywania wodoru od substratu XH2 przez FAD

Ale FMN i FAD mogą być również koenzymami oksydaz: enzymów posiadających zdolność bezpośredniego przenoszenia oderwanych od substratu atomów wodoru na tlen – uaktywnianie cząsteczki tlenu prowadzą in situ, tj. w miejscu zetknięcia się enzymu z cząsteczką tlenu. Reakcja ta przebiega bez zmiany formy grup prostetycznych na ich formy zredukowane. Przykładem takiego enzymu może być o k s y d a z a a m i n o w a O2 z a w i e r a j ą c a F A D (EC 1.4.3.4). Reakcję taką (FAD) H2O O symbolicznie zapisuje się z FAD ujętym w nawias R CH2 NH2 R C + NH3 + H2O2 oksydaza H dla podkreślenia, że nie zmienia się jego forma po aminowa zakończeniu reakcji. Dla podkreślenia roli FAD lub FMN w tego typu reakcjach, nazywa się je kofaktorami reakcji utlenienia.

FAD jest również elementem składowym systemu enzymatycznego c yt o c h r o m u P 4 5 0 . Zredukowany FADH2 może z kolei być donorem wodoru dla o k s yg e n a z z podpodklasy EC 1.14.14. 2+

Dość często apoenzym oksydoreduktaz, sprzężonych z FMN lub FAD, zawiera w swojej budowie jony metali Fe2+, Zn2+ lub Mo2+, które współdziałają podczas reakcji utleniania i redukcji; enzymy tego typu nazywa się metaloflawoproteidami i oznacza symbolem Me-Fp. Transportują one przede wszystkim elektrony.

Fe

O H3C

N

H3C

N

NH N

O

R metaloflawoproteid

Ubichinon (koenzym Q). Przenośnikiem atomów wodoru może być również ubichinon, zywany też koenzymem Q. Związek ten pod względem budowy przypomina witaminy E i K, choć sam witaminą nie jest, gdyż w komórkach zwierzęcych jest syntetyzowany (z tyrozyny). Łańcych boczny zbudowany jest z jednostek izoprenoidowych. Ich liczba bywa rózna w zależności od źródła pochodzenia ubichinonu. Np. ubichinon z serca świni ma ich 50, a z serca wołu 10, co zapisuje się symbolicznie Q-50 i odpowiednio Q-10. Ilośc jednostek izoprenoidowych w ubichinonach drobnoustrojowych waha się od 5 do 13. O

(

H3C H3C

CH3

)n H

O

H3C

O ubichinon (Q)

OH R

H3C

CH3

XH2

X HC 3

R

H3C

CH3

O

OH

Q

QH2

mechanizm odrywania wodoru od substratu XH2 przez ubichinon

Mechanizm przenoszenia atomów wodoru przez ubichinon polega na utlenianiu i redukcji pierścienia chinonowego.

40


Ubichinon jako koenzym dehydrogenaz bądź reduktaz spotykany jest rzadko. Jednym z nielicznych przykładów może być d e h y d r o g e n a z a N A D H ( u b i c h i n o n o w a ) –EC 1.6.5.3, która katalizuje reakcję utlenienia NADH2 do NAD z jednoczesną redukcją ubichinonu do ubichinolu. Ciekawym enzymem jest d e h y d r o g e n a z a m e t a n o l o w a (EC 1.1.99.8) znaleziona u niektórych metylotrofów, której grupą prostetyczną jest ubichinonoproteina (kofaktor PQQ). Natomiast ubichinon w komórkach pełni bardzo ważną rolę, będąc elementem składowym łańcucha oddechowego. Związki porfirynowe. Porfiryny to związki, w których 4 pierścienie pirolowe połączone są ze sobą mostkami metinowymi (=CH–). Przy atomach węgla β (3 i 4) pierścieni pirolowych zamiast atomów wodoru występują różne grupy 1 2 1 2  chemiczne (metylowe, winylowe, octanowe i  I HC CH I inne). W celu ujednolicenia zapisu związków N tego typu Fisher zaproponował symboliczny, 8 3 3 uproszczony ich wzór. Pominięto w nim mostki 8 II IV II HN IV N H metinowe a pierścienie pirolowe zaznaczano 7 4 4 7 kodem kreskowym. Pierścienie ponumerowano N III cyframi rzymskimi od I do IV, atomy węgla w CH HC III   5 pierścieniach od 1 do 8, a mostki metinowe 6 5 6 symboliczny, uproszczony literami alfabetu łacińskiego od α do δ, jak to zapis wzoru porfiryny porfiryna przedstawiono na rysunku obok. Z uwagi na możliwość podstawiania atomów wodoru 1-8 w pierścieniach pirolowych różnymi podstawnikami, istnieje teoretycznie olbrzymia ilość izomerów pochodnych porfiryny. Jednakże w naturalnych systemach biologicznych głównie występuje izomer typu III, w którym podstawniki przy IV pierścieniu pirolowym są ułożone asymetrycznie w stosunku do innych pierścieni. Oznaczony i nazwany jest on przez Fishera p r o t o p o r f i r y n ą I X . Izomer ten jest prekursorem m e t a l o p o r f i r yn wchodzących w skład h e m o p r o t e i n i c h l o r o f i l i . I

I M

M IV

P

M

Fe2+

II

ferrochelataza EC 4.99.1.1

V

M Fe2+

IV

II

P

V III

III P

V

M

V

M

M

protoporfiryna IX

M= V= P=

CH3 CH=CH2 CH2 CH2 COOH

P

M hem

enzymatyczna transformacja protoporfiryny IX w hem

M e t a l o p o r f i r y n y to pochodne protoporfiryny IX z atomem metalu (żelaza, magnezu, miedzi) centralnie wbudowanym w układ porfirynowy za pośrednictwem atomów azotu pierścieni pirolowych. Metaloporfiryny z wbudowanym żelazem (hem i heminy) występują jako grupy prostetyczne w h e m o p r o t e i n a c h . Metaloporfiryny z wbudowanym Mg2+ są składnikami c h l o r o f i l u . H e m o p r o t e i n y to białka zawierające jako grupę prostetyczną hem lub heminę. H e m to połączenie żelaza występującego na II stopniu utlenienia (Fe2+) z protoporfiryną IX. Hem jest barwną grupą prostetyczną hemoglobiny i mioglobiny. W organizmach zwierząt, hemoglobina – czerwony barwnik krwi - uczestniczy w transporcie tlenu, CO2 a także jonów wodorowych. Mioglobina uczestniczy w transporcie tlenu w mięśniach i w jego magazynowaniu. H e m i n y to połączenia protoporfiryny IX z jonem żelaza występującym na III stopniu utlenienia (Fe ). Heminy we wszystkich organizmach pełnią funkcję przenośników elektronów w łańcuchu oddechowym (układ cytochromów), a także są grupami prostetycznymi katalaz i peroksydaz, katalizując procesy utleniania. Powstają z hemoglobiny pod wpływem kwasu solnego, a reakcja ta służy w medycynie sądowej do wykrywania śladów krwi. 3+

41


C y t o c h r o m y to hemoproteiny, które dzięki odwracalnej zmianie stopnia utlenienia żelaza grupy heminowej (z Fe2+ na Fe3+) stanowią układ przenośników elektronów w łańcuchu oddechowym w żywych organizmach. Na podstawie budowy chemicznej, widma absorpcyjnego i przede wszystkim miejsca w łańcuchu oddechowym, cytochromy dzieli się na grupy: a, b i c (np. cytochromy b) oraz podgrupy (np. cytochromy a3). Kompleks hemoprotein a + a3 jest enzymem znanym jako o k s y d a z a cytochromowa. HOOC CH2 CH2 HC

CH3 CH

N

CH3

HOOC CH2 CH2 N

+3

Fe

miejsce przyłączenia heminy

N

H3C HC

N

H2C

CH CH2 CH3

CH2

S S Liz Cys Ser Glu(NH2) Cys His fragment łańcucha polipeptydowego cytochromu ń c

hemina CH2 cytochrom c

O k s y d a z a c y t o c h r o m u c (EC 1.9.3.1) to enzym będący kompleksem hemoprotein a i a3, składający się z kilku łańcuchów polipeptydowych o różnej masie cząsteczkowej, 2 grup heminowych oraz 2 atomów miedzi. Oksydaza cytochromowa jest końcowym enzymem łańcucha oddechowego; aktywuje tlen atomowy do przyłączenia atomów wodoru, przenosząc na niego elektrony. C h l o r o f i l e , pochodne protoporfiryny IX, zielone barwniki występujące u fotosyntetyzujących roślin, glonów i bakterii (bakteriochlorofil). Chlorofile pełnią rolę grupy prostetycznej chromoproteidu zwanego chloroplastyną. Są to metaloporfiryny, zawierające wbudowany w centrum jon magnezu (Mg2+). Połączone są wiązaniem estrowym z CH CH2 CH3 fitolem. Rozróżnia się 4 rodzaje chlorofilu. U wszystkich roślin wyższych i glonów występuje chlorofil a (niebieskozielony, co HC CH N najmniej w 3 formach: P700, Ca680, Ca670 CH3 CH3 liczby oznaczają długość fali świetlnej, przy N Mg2+ N której występuje maksimum absorpcji światła). Chlorofil b - żółtozielony, występujący u C2H5 roślin wyższych i niektórych glonów. Chlorofil C20H39OOC CH2 CH2 N fityl C CH c — występuje w małych ilościach w czerwono zabarwionych roślinach wodnych CH3OOC CH CH3 (m.in. z rodzaju Alternanthera), brunatnicach, C H H niektórych okrzemkach i wiciowcach. O Chlorofil d znajdowany jest u krasnorostów. chlorofil a Chlorofil a absorbuje głównie światło fioletowe i czerwone, oraz żółtozielone, chlorofil b absorbuje głównie światło niebieskie i pomarańczowe. Chlorofile z karotenoidami wchodzą w skład fotosystemów PS-I i PS-II. Kwas liponowy (tiooktanowy). Związek ten uczestniczy w transporcie elektronów, a także w przenoszeniu grup acylowych w reakcjach α-oksydacji (oksydacyjnej dekarboksylacji α-ketokwasów). Jest elementem składowym układów wieloenzymatycznych wraz z DPT, CoASH, FAD i NAD, np. w dehydrogenazie pirogronianowej (dekarboksylującej). Jest to kwas 6,8-ditiolooktanowym. Łatwo ulega odwracalnemu utleenieniu i redukcji.

42


Enzym-NH O

CH2 C CH2 CH2 CH2 CH2 CH

Lip

CH2 S

S

XH2

S

X Lip

S

liponian uteniony

liponian

SH SH

liponian zredukowany

Jak już wspomniano, liponian jest składnikiem układów wieloenzymatycznych. W układach tych, jako kosubstrat, transportuje rodniki acylowe. FAD

FADH2

OH DPT CH

Lip

S

Lip

S

O CH3 C~SCoA

SH SH

enzym CH3

O DPT

Lip

enzym

S ~C CH3

CoASH

SH

Koenzymy i grupy prostetyczne transferaz Adenozynometionina. Jest to koenzym transferaz przenoszących jednowęglową grupę –CH3. Grupa metylowa w tym układzie jest wybitnie reaktywna (tzw. „aktywny metyl”). I dlatego, w formie jonu CH3+, może być przenoszona na elektroujemnie naładowane inne grupy chemiczne (najkorzystniej z wolną parą elektronową). Koenzym ten bierze udział w wielu szlakach anabolicznych, metylując m.in. grupę aminową (np. w biosyntezie choliny). NH2 N

CH3 CH2 S CH2 + CH2

N

N O

N3 2

H2N

CHNH2 COOH

OH

OH

N

4 1

N

H N

5 6 8 7

O CH2 NH 9

10

COOH

C NH CH

N H

CH2 CH2 COOH

OH

kwas tetrawodorofoliowy (H4folian)

adenozynometionina

Kwas foliowy. Koenzym ten jest pochodną pterydyny, heterocyklicznego dipierścieniowego związku, do którego bocznej gupy metylowej przy C6 przyłączona jest cząsteczka kwasu p-aminobenzoesowego i dalej poprzez wiązanie amidowe jedna lub więcej cząstwczek kwasu glutaminowego. Kwas foliowy jest witaminą. Jej niedobór w ustroju człowieka może prowadzić do pojawienia się trombocytopenii i pokrewnych odmian niedokrwistości. Do organizmu człowieka dostarczany jest przez bakterie jelitowe. Kwas foliowy - a właściwie produkt jego redukcji, kwas 5,6,7,8-tetrawodorofoliowy (H4folian) jest grupą prostetyczną enzymów przenoszących jednowęglowe rodniki typu:  CH3–  HOCH2–  –CH2–  –CH=  HOC–  HN=CH– Miejscem przyłączenia grup C1 są atomy N-5 lub N-10 tetrawodorofolianu. Natomiast źródłem ich pochodzenia są przemiany aminokwasów: histydyny, tryptofanu, seryny i metioniny.

43


Biotyna. Biotyna jest grupą prostetyczną karboksylaz i dekarboksylaz. Przyłączenie grupy -COO do substratu wymaga dostarczenia energi chemicznej; jej dawcą jest ATP, który transformuje do aż AMP. O

O HN

HN

NH

O NH

ATP

NH-Enzym S

S

C O biotyna

biotyna

R

AMP+PP HOOC

karboksylaza CO2

N

NH

S

R

karboksybiotyna

Biotyna jest witaminą H. Jej brak w organizmie człowieka wywołuje zaburzenia skórne oraz zmiany psychomotoryczne: depresję, brak łaknienia i snu, itp. Witamina ta jest wytwarzana przez bakterie jelitowe.

Koenzym A. Na pierwszy rzut oka przypomina on opisane wcześniej dinukleotydy. Jednakże koenzym ten nie jest zaliczany do dinukleotydów. Zbudowany jest z adenozyno-3’-fosforanu–5’pirofosforanu połączonego wiązaniem estrowym z kwasem pantotenowym, a ten z kolei wiązaniem peptydowym z cystoaminą. Cysteoamina jest produktem dekarboksylacji cysteiny. Kwas pantotenowy jest amidem kwasu 2,4-dihydroksy-3,3-dimetylomasłowego i β-alaniny. Symbolicznie koenzym A zapisuje się jako CoASH. NH2 N

N N

N

O

OH

CH2

O

P

P

CH3 O O O CH2 C CH C NH CH2 CH2 C NH CH2 CH2 SH CH3OH

P kwas pantotenowy

adenozyno-3'-fosforan-5`-pirofosforan

cysteoamina

koenzym A (CoA-SH)

Kwas pantotenowy jest witaminą B5. Niezbędna jest ona do prawidłowego metabolizmu białek, cukrów i tłuszczów oraz do syntezy niektórych hormonów, uczestniczy w regeneracji tkanek i przyspiesza gojenie ran, zapobiega przemęczeniu i usprawnia układ sercowo-naczyniowy, nerwowy i pokarmowy, bierze udział w wytwarzaniu tłuszczów, cholesterolu, poprawia pigmentację i stan włosów. Kwas pantotenowy wytwarzany jest w organizmach roślin, drobnoustrojów, a także niektórych pleśni. Bogatym źródłem tego związku są drożdże, grzyby, groch, wątróbka, otręby pszenne, ryby (np. śledzie, makrele, pstrągi), mleko pełne, mięso kurczaka, mleczko pszczele, pestki słonecznika, sery, orzechy, jajka, owoce awokado, pomarańcze, ziemniaki, brokuły, ciemny ryż, melony, pełnoziarnisty chleb, soja, masło orzechowe, banany.

Koenzym A odgrywa podstawową rolę podczas aktywacji i ATP AMP+PP przenoszenia rodników acylowych. Reakcje przyłączenia CoASH O do kwasu karboksylowego katalizują syntetazy, które do swego X COOH X C ~SCoA syntetaza działania wymagają dostarczenia energii, której źródłem jest X-CoA CoASH ATP. Powstałe wiązanie tioestrowe jest wiązaniem wysokoenergetycznym (zaznaczane we wzorach chemicznych tyldą „~”). Przykładem może być synteza acetylo~SCoA z kwasu octowego, katalizowana przez syntetazę acetylo-CoA (EC 6.2.1.1). Difosfotiamina. Tiamina jest związkiem zbudowanym z pierścienia pirymidynowego połączonego z heterocyklicznym pierścieniem tiazolowym grupą metylenową. W difosfotiaminie grupa hydroksylowa łańcucha bocznego pierścienia tiazolowego jest zestryfikowana pirofosforanem. Z apoenzymem wiąże się właśnie przez ugrupowanie pirofosforanowe. Symbolicznie diosfotiaminę zapisuje się jako DPT. 44


CH2

N H3C

N

+ N

NH2

CH3 CH2 CH2 O

S

P

P

difosfotiamina (DPT) Tiamina jest w i t a m i n ą B 1 . Skutkami jej niedoboru są zaburzenia czynności centralnego układu nerwowego (uczucie osłabienia i zmęczenie, możliwy oczopląs, zaburzenia pamięci i koncentracji a nawet depresja), niewydolność krążenia (przyspieszona akcja serca, powiększenie wymiarów serca, obrzęki kończyn), zaburzenia ze strony przewodu pokarmowego (utrata łaknienia, nudności, wymioty, biegunki, bóle brzucha, brak apetytu, spadek wagi). W przypadku silnej awitaminozy B1 może wystąpić choroba Beri-beri, objawiająca się bólami kończyn, osłabieniem mięśni i ich drżeniem oraz wyraźną niewydolnością układu krążenia. Etanol powoduje rozkład tego związku, o czym powinni pamiętać ludzie nadużywający alkoholu i dbać o dostarczanie jej do organizmu. Ź r ó d ł e m t e j w i t a m i n y są produkty zbożowe, mięso, groch, fasola, drożdże, orzechy, ryby, owoce i warzywa. Zapotrzebowanie człowieka na tę witaminę wynosi ok. 1,5 mg na dobę.

Difosfotiamina jest grupą prostetyczną enzymów przenoszących aldehydy: glikolowy, octowy i semialdehyd bursztynowy. Jako grupa prostetyczna k e t o l a z , DPT przenosi aldehyd glikolowy, który odrywa od ksylulozo5-fosforanu i transportuje go na erytrozo-4-fosforan. Jako e l e m e n t u k ł a d ó w w i e l o e n z y m a t y c z n y c h - podczas α-oksydacji - np. pirogronianu lub α-ketoglutaranu zachowuje się jak transferaza, a równocześnie jak liaza. Jako dehydrogenaza pirogronianowa (acetyl-transportująca) – EC 1.2.4.1, prowadzi dekarboksylację pirogronianu do aldehydu octowego, a jako dehydrogenaza ketoglutaranowa (bursztyniantransporująca) – EC 1.2.4.2, dekarboksyluje α-ketoglutaran do semialdehydu bursztynianowego, które dalej przenosi na kwas liponowy. R + N

CH2OH

CH3

H

S

HO CH

CH2 CH2 O PP Enzym

P

CH2O transketolaza

~

HO C

S CH2OH

aktywny aldehyd glikolowy

P

HO H3C

CH2OH N

pirydoksyna

S

H3C

~ DPT

związków:

CH2OH N

pirydoksamina

45

CH2 CH2 O PP Enzym

CH2NH2 HO

CO2

hydroksyetylo

Pirydoksyna. Mieszanina trzech naturalnych pirydoksaminy. Są one pochodnymi pirydyny. CH2OH

CH3

OH

aldehyd 3-fosfoglicerynowy

~ DPT

+ H N

~

CH2O

Enzym

COOH pirogronian

fragment dehydrogenazy pirogronianowej (dekarboksylującej)

CH3 C

CH OH

CH2 CH2 O PP

Enzym

ksylulozo-5-fosforan

O C H

CH3

C O

CH2 CH2 O PP

DPT

R + H N

CH3

CH3 S

H

CH OH

DPT

R

R + N

C O

pirydoksyny,

C HO H3C

O H

N

pirydoksal

CH2OH

pirydoksalu

i


5 - F o s f o r a n p i r y d o k s a l u (PLP) jest koenzymem lub grupą prostetyczną przeszło 50 enzymów. Bierze udział w przemianach aminokwasów. Przede wszystkim współdziała z aminotransferazami przenoszącymi grupę aminową z aminokwasów na α-ketokwasy i odwrotnie. Jest koenzymem dekarboksylaz aminokwasów. Uczestniczy ponadto w przemianie tryptofanu w amid kwasu nikotynowego, transformacji glicyny w serynę i w biosyntezie cysteiny. Szczegóły dotyczące reakcji transaminacji i dekarboksylacji aminokwasów zostaną opisane w rozdziale omawiającym metabolizm aminokwasów. Mieszanina pirydoksyny, pirydoksalu i pirydoksaminy nazywana jest witaminą B6. Wszystkie trzy związki ulegają w organizmie wzajemnym przekształceniom i wykazują podobne działanie biologiczne. Niedobór witaminy B6 występuje tylko wyjątkowo, np. u małych dzieci karmionych sztucznymi odżywkami lub karmionych przez matki, które długo przyjmowały doustne środki antykoncepcyjne oraz u alkoholików i ich potomstwa. Do najczęściej spotykanych objawów należą stany zapalne skóry (łojotokowe zmiany na twarzy), podrażnienie języka i błon śluzowych jamy ustnej (języka, kącików warg) zmiany w ośrodkowym układzie nerwowym (apatia, bezsenność, nadwrażliwość, napady drgawek), zwiększona podatność na infekcje. Witamina B6 wytwarzana jest przez florę bakteryjną przewodu pokarmowego, w dużych występuje w wątrobie, jajach, jarzynach i mięsie.

Cyjanokobalamina. Jej nazwa wywodzi się od jonu cyjankowego połączonego koordynacyjnie z atomem kobaltu, wbudowanym w rdzeń porfirynowy. Rdzeń porfirynowy wraz z jonem kobaltu noszą nazwę k o b a l a m i n y . Zamiast jonu CN , z kobalaminą może być połączony inny anion, np. hydoksylowy, chlorkowy czy azotynowy. W tym ostatnim przypadku związek nosi nazwę nitrokobalaminy, a znajdowany jest w podłożach hodowlanych Streptomyces griseus. Cyjanokobalamina jest koenzymem niektórych dehydrataz, amoniako-liaz i mutaz.

H2NOH2CH2C H2NOH2C H3C

H3C CH2CONH2 CH2CH2CONH2 CH3 CH HC CH3 N N CH3

H2NOH2C

+ Co N

CH3

N CN

CH2CH2CONH2

N

C

HOH2C

CH2

N

O

CH CH3 3

CH3 CH3

CH3

CH2 CO NH CH2 CH

P

O

OH

cyjanokobalamina Witamina B12, znana jako czynnik przeciwdziałający niedokrwistości złośliwej lub jako czynnik przeciwanemiczny. Brak tej witaminy powoduje charakterystyczne zmiany w obrazie krwi, związane z anemią złośliwą. Obserwuje się również zmiany zapalne języka oraz brak kwasu solnego w żołądku. Organizmy roślin i zwierząt nie produkują cyjanokobalaminy. Zdolność tą mają niektóre gatunki bakterii (choć u niektórych mikroorganizmów jest ona także czynnikiem wzrostowym). Zwierzęta mięsożerne zapotrzebowanie na tę witaminę pokrywają, spożywając mięso innych zwierząt. Szczególnie obfita w cyjanokobalaminę jest wątroba. Zwierzęta roślinożerne wykorzystują cyjanokobalaminę wytwarzaną przez florę bakteryjną ich przewodu pokarmowego. Źródło to jest czasem niewystarczające i u niektórych gatunków zwierząt dochodzi niekiedy do zjadania własnych odchodów, co prowadzi do zwiększenia ilości tej witaminy w organizmie. Organizm dorosłego człowieka potrzebuje ok. 3 mg cyjanokobalaminy dziennie. Zapotrzebowanie to jest w zupełności pokrywane przez normalną dietę.

Nukleozydofosforany. Nukleotydy, które do swojej reszty fosforanowej dodatkowo mają przyłączoną jedną lub dwie cząsteczki kwasu fosforowego, czyli nukleozydodi- i trifosforany są koenzymami, a właściwie poprawniej definiując kofaktorami czy też kosubstratami reakcji katalizowanych przez liczne enzymy. Zaliczane są one do związków bogatych w energię chemiczną; tzw. związków makroergicznych lub inaczej związków wysokoenergetycznych. Wśród nich najczęściej kosubstratem w reakcjach enzymatycznych bywa a d e n o z y n o t r i f o s f o r a n – ATP. Jest on kosubstratem większości ligaz (enzymów z klasy EC 6.), kinaz (transferaz z podklasy EC 2.7.,

46


przenoszących grupę fosforanową na różne substraty) czy wreszcie niektórych karboksykinaz (enzymów z pod-podklasy EC 4.1.1.). NH2 N

O

N N

N

O

CH2 O

P O OH

OH

O

O

 P O P OH

OH

OH

OH

adenozyna AMP ADP ATP

T e r m o d y n a m i k a r e a k c j i e n z y m a t y c z n y c h . Zgodnie z prawami termodynamiki reakcje endoergiczne nie mogą przebiegać spontanicznie, nawet jeśli są katalizowane przez enzymy. Tego typu reakcje muszą być sprzężone z inną reakcją silnie egzoergiczną, tak by suma ich energii swobodnej ΔG była równa zero lub ujemna. -H2O glukozo-6- P G= 12 kJ/mol Przykładowo reakcja glukozy z kwasem glukoza + H3PO4 +H2O fosforowym jest reakcją endoergiczną; zmiana G= -29 kJ/mol ATP ADP + Pi energii swobodnej ΔG = 12 kJ/mol. Stąd ADP ATP równowaga tej reakcji jest silnie przesunięta na lewą stronę; glukozo-6-fosforan G= -17 kJ/mol glukozo-6- P glukoza praktycznie nie powstaje. Reakcja hydrolizy ATP do ADP + Pi* jest z kolei silnie egzoergiczna; ΔG = −29 kJ/mol. Przy tak dużej ujemnej wartości ΔG jest to reakcja praktycznie nieodwracalna. W przypadku enzymatycznego sprzęgnięcia obu tych reakcji suma energii swobodnej ΔG = −17 kJ/mol. W takim układzie równowaga reakcji przesunięta jest zdecydowanie na prawą stronę i praktycznie cała pula glukozy jest przemieniona w glukozo-6-P. W ATP pierwsza cząsteczka kwasu fosforowego przyłączona jest do grupy –OH rybozy zwykłym wiązaniem estrowym. Energia swobodna jego hydrolizy wynosi ΔG = −14 kJ/mol. Natomiast kolejne cząsteczki kwasu fosforowego wiążą się ze sobą wiązaniem bezwodnikowym. Energia swobodna ich hydrolizy odpowiednio wynosi: ADP

AMP + Pi

G= -28 kJ/mol,

ATP

ADP + Pi

G= -29 kJ/mol

Stąd ATP i ADP (adenozynodifosforan) należą do związków bogatych w energię chemiczną. Natomiast AMP (adenozynomonofosforan) jest związkiem niskoenergetycznym. Przyjmuje się, że dolną wartością energii swobodnej hydrolizy, która decyduje o zaliczeniu związku do makroergicznych jest ΔG zbliżone do −29 kJ/mol. W tabeli 2.2. przykładowo podano przybliżone średnie wartości energii swobodnej hydrolizy kilku związków zawierających grupę fosforanową. Energia swobodna hydrolizy ATP do ADP+Pi wynosi ΔG = −29 kJ/mol, co sprawia, że ten nukleozydotrifosforan wraz z ADP i pirofosforanem należą do grupy fosforanów znajdujących się pośrodku listy cytowanych związków wysokoenergetycznych i niskoenergetycznych. Dlatego ATP może być donorem fosforanów dla związków niskoenergetycznych znajdujących na liście poniżej, o ΔG >−29 kJ/mol. Z tego samego powodu ADP może być akceptorem wysokoenergetycznego fosforanu od związków znajdujących się na tej liście powyżej, o ΔG <−29 kJ/mol.

* umownie Pi oznacza fosforan nieorganiczny 47


Należy jeszcze dodać, że wiązania bezwodnikowe w ATP łatwo ulegają rozerwaniu. Oderwana reszta fosforanowa lub pirofosforanowa może być przenoszona na różne substraty, tym łatwiej, iż rozkład ATP jednocześnie dostarcza energii swobodnej niezbędnej dla takich reakcji. Tabela 2.2. Energia swobodna hydrolizy niektórych fosforanów Nazwa związku

ΔG [kJ/mol] 1

Fosfoenolopirogronian Karbamoilofosforan 1,3-difosfoglicerynian Fosfokreatyna Acetylo~SCoA

−62 −51 −49 −43 −34

ATPAMP+PP

−31 −29 −28 −27

ATPADP+P ADPAMP+P PP (pirofosforan) Glukozo-1-fosforan AMP Glukozo-6-fosforan 1

−21 −14 −14

cytowane dane są przybliżonymi wartościami ΔG

ATP zawiera dwa wysokoenergetyczne wiązania bezwodnikowe. Oderwanie fosforanu, prowadzące do powstania ADP, powoduje utratę jednego z nich (ΔG =−29 kJ/mol). Oderwanie fosforanu od ADP prowadzi do powstania AMP (ΔG =−28 kJ/mol). Teoretycznie wyliczona, sumaryczna energia swobodna takiej dwuetapowej przemiany ATP do AMP obniża się więc o ΔG =−57 kJ/mol*. Ale od ATP może być oderwany również pirofosforan, jednoetapowo prowadząc do powstania AMP. Zmiana energii swobodnej ΔG takiej przemiany równa jest −31 kJ/mol. Dla pełnego jej bilansu należy jednak uwzględnić dodatkowo energię swobodną zawartą w pirofosforanie pirofosfataza 2Pi (ΔG =−27 kJ/mol), co po podsumowaniu daje ΔG =−58 kJ/mol*. Ta PPi nieorganiczna swobodna energia zawarta w PPi jest uwalniana podczas jego enzymatycznej hydrolizy pod działaniem pirofosfatazy nieorganicznej (EC 3.6.1.1). W komórkach żywych organizmów pomiędzy ATP, ADP i AMP istnieje pewnego typu specyficzna równowaga. Kinaza adenylanowa (EC 2.7.4.3) kinaza 2 ADP przenosi jeden z wysokoenergetycznych fosforanów z ATP na ATP + AMP adenylanowa AMP, co prowadzi do powstania dwóch cząsteczek ADP, tak jak to przedstawiono na rysunku obok. Dla pełnego obrazu należy jeszcze wspomnieć, że w komórkach ATP uczestniczy w reakcjach enzymatycznych w postaci kompleksu z jonem Mg2+. Stąd jony Mg2+ są aktywatorami enzymów współdziałających z ATP. Reasumując, r o l a A T P j a k o k o s u b s t r a t u w reakcjach enzymatycznych jest następująca: 1. ATP jako d o n o r e n e r g i i s w o b o d n e j w reakcjach syntez katalizowanych przez ligazy. W większości takich przypadków ATP ulega rozkładowi do AMP + PPi. Jak już wspomniano, ilość energii swobodnej dostarczona do takiego układu jest równoważna ΔG =−58 kJ/mol, co wystarcza do przeprowadzenia rozmaitych syntez, niekiedy nawet związków wysokoenergetycznych. Za przykład niech posłuży synteza acetylo~SCoA katalizowana przez syntetazę acetylo-CoA (EC 6.2.1.1). * Sumaryczna energia swobodna wyzwolona w jednoetapowym i dwuetapowym przekształceniu ATP do AMP oczywiście musi być taka sama. Różnica 1 kJ/mol pomiędzy wyliczeniami wynika ze stosowania przybliżonych wartości ΔG.

48


ATP dużo rzadziej, jako koenzym ligaz, ulega podczas reakcji rozkładowi do ADP. Tym niemniej znanych jest sporo i takich przypadków. Dla podkreślenia, że ATP rozkłada się jedynie do ADP w nazwie ligazy w nawiasie umieszcza się (ADP-tworząca). Jako przykład podana zostanie syntetaza acetylo-CoA (ADP-tworząca) – EC 6.2.1.13. Wybrano ją celowo, gdyż tylko wyjątkowo niektóre bakterie posiadają ten enzym, a z energetycznego „punktu widzenia” komórki jest on korzystniejszy od wcześniej opisanej syntetazy acetylo-CoA. ATP CH3 COOH CoASH

AMP+PP

syntetaza acetylo-CoA

CH3

ATP O C ~SCoA

ADP+P

CH3 COOH

O CH3 C ~SCoA

syntetaza acetylo-CoA CoASH (ADP-tworzaca)

2. ATP jako d o n o r o r t o f o s f o r a n u . Odpowiednie transferazy (kinazy) przenoszą rodnik fosforanowy na rozmaite substraty, np. na monosacharydy, ADP ATP glicerol, nukleozydy, itp. Za przykład posłuży synteza NADPH z NADH katalizowana przez kinazę NADH (EC 2.7.1.86). NADH NADPH kinaza NADH

Na marginesie omawianego zagadnienia warto zwrócić uwagę na fakt, że w wyjątkowych sytuacjach źródłem ortofosforanu może być pirofosforan. Nie powinno to budzić większego zdziwienia, bowiem energia swobodna jego hydrolizy ΔG =−27 kJ/mol. Przykładem może być kinaza octanowa (pirofosforanowa) – EC 2.7.2.12, katalizująca przeniesienie fosforanu z PPi na kwas octowy z wytworzeniem acetylofosforanu.

3. ATP jako d o n o r p i r o f o s f o r a n u . W niektórych przypadkach konieczne jest przyłączenie do substratu rodnika pirofosforanowego. Jego donorem jest ATP, a reakcję katalizują pirofosfokinazy. Jako przykład może posłużyć synteza AMP ATP difosfotiaminy z tiaminy. Reakcję katalizuje difosfotiamina tiamina pirofosfokinaza pirofosfokinaza tiaminowa (EC 2.7.6.2). tiaminowa

4. ATP jako d o n o r r o d n i k a a d e n y l i l o w e g o . Adenylacja to reakcja przeniesienia rodnika adenylilowego z ATP na substrat z jednoczesnym odłączeniem PPi. Reakcja ta ma podstawowe znaczenie dla syntezy dinukleotydów adenilowych i związków o podobnej budowie (choćby wspomnianego wcześniej CoASH). Reakcję katalizują adenylilotransferazy (zwane zwyczajowo pirofosforylazami). Jako przykład posłuży synteza FAD z FMN katalizowana przez adenylilotransferazę FMN (EC 2.7.7.2). Ale enzymy z pod-podklasy EC 2.7.7. mogą również transportować inne nukleotydilowe rodniki z nukleotydotrifosforanów. Jedną z takich reakcji o podstawowym znaczeniu dla procesów biochemicznych jest synteza UDPG (urydyliloglukozy). Reakcja katalizowana jest przez urydylilotransferazę glukozo-1-fosforanową (EC 2.7.7.9). ATP FMN

PPi

UTP glukozo-1- P

FAD adenylilotransferaza FMN

PPi

urydylilotransferaza glukozo-1-fosforanowa

UDPG

5. ATP jako d o n o r a d e n o z y n y . W pewnych szczególnych przypadkach ATP staje się donorem adenozyny. Przykładem może być synteza adenozynometioniny. Koenzym ten powstaje w reakcji metioniny z ATP, katalizowanej przez adenozynotransferazę metioninową (EC 2.5.1.6). adenozynotransferaza metionina + ATP

metioninowa EC 2.5.1.6

adenozynometionina PP + P

Niekiedy rolę ATP w omówionych wyżej reakcjach może pełnić inny z nukleozydotrifosforanów. O urydynotrifosforanie (UTP) i jego roli już wspomniano. Guanozynotrifosforan (GTP) lub inozynotrifosforan (ITP) są koenzymami syntetazy bursztynylo-CoA

49


(patrz cykl Krebsa). Cytydynotrifosforan (CTP) bierze udział w syntezie substancji lipidowych pod postacią cytydylodifosfocholiny. Pomiędzy ATP a pozostałymi nukleotydotrifosforanami występuje zależność: kinaza nukleozydodifosforanowa

nukleozydotrifosforan + ADP 2.2.3. Kinetyka reakcji enzymatycznych

EC 2.7.4.6

nukleozydodifosforan + ATP

S z y b k o ś ć r e a k c j i e n z y m a t y c z n e j , podobnie jak każdej reakcji chemicznej, wyraża się ubytkiem stężenia jednego z substratów lub też przyrostem stężenia któregoś z produktów: S

enzym

v

P

d [ S ] d [ P]  dt dt

(2.1)

R ó w n o w a g a r e a k c j i e n z y m a t y c z n y c h . Teoretycznie wszystkie reakcje chemiczne (również katalizowane enzymatycznie) są odwracalne. Po pewnym czasie ustala się równowaga pomiędzy substratami reakcji a jej produktami, objawiająca się tym, że szybkość powstawania produktów jest równa szybkości ich rewersji do substratów. Szybkość powstawania produktów v1 jest proporcjonalna do stężeń reagujących substratów. Szybkość reakcji rewersji produktów v-1 jest proporcjonalna do stężeń produktów. W stanie równowagi: A+B

v+1, k +1 v-1, k-1

AB

v1  v 2

v1  k 1  [ A]  [ B]

v 1  k 1  [ AB]

(2.2)

gdzie: A,B – substraty; AB – produkt; k+1, k-1 – stałe szybkości reakcji Dla przypomnienia: stałe szybkości reakcji k są charakterystyczne dla konkretnych reagentów. Rosną wraz ze wzrostem temperatury reakcji.

Zgodnie z prawem działania mas Guldberga i Waagego w stanie równowagi, stężenia reagentów spełniają zależność:

k1 [ AB]  K k 1 [ A]  [ B]

gdzie: K jest stałą równowagi konkretnej reakcji.

(2.3)

Im większa jest stała równowagi K, tym większe stężenie produktu AB, czyli równowaga reakcji bardziej przesunięta na prawo. Reakcja pomiędzy A i B zachodzi tym energiczniej, im większa jest stała równowagi reakcji K. Jeszcze raz należy wyraźnie podkreślić: obecność enzymu w układzie nie zmienia wartości stałej K. Enzym jedynie przyspiesza moment osiągnięcia równowagi przez reagenty. Jeżeli K>1 to reakcja jest spontaniczna. Stałą K można wyrazić liczbowo, o ile znane są stężenia substratów i produktów reakcji w stanie równowagi. Wartości K można również wyliczyć na drodze termodynamicznej. Pomiędzy zmianami energii swobodnej ∆G a stałą równowagi reakcji K istnieje zależność:

G  -RT  ln K

gdzie: R - stała gazowa, T – temperatura bezwzględna (2.4) Z zależności tej wynika prosta formuła potwierdzająca wcześniejsze stwierdzenia: im większa stała równowagi reakcji K, tym większa różnica pomiędzy wartościami energii swobodnej substratów i produktów. I odwrotnie: im większe ∆G, tym równowaga reakcja jest bardziej przesunięta na korzyść produktów. W krańcowych przypadkach, gdy ujemna wartość ∆G jest bardzo duża cały substrat ulega przekształceniu w produkt, a reakcja praktycznie staje się nieodwracalna. Z kolei pomiędzy zmianami energii swobodnej ∆G (w chemii fizycznej znanej pod słuszną nazwą potencjału termodynamicznego), entalpią układu i zmianami entropii występuje zależność:

G  H  T S (2.5) Szybkość początkowa reakcji enzyma tycznej. Szybkość początkowa reakcji v jest to szybkość wyznaczona przed powstaniem dostatecznie dużej ilości produktu, który by umożliwiał zachodzenie reakcji odwrotnej. Szybkość początkowa reakcji enzymatycznej jest zawsze proporcjonalna do stężenia enzymu.

50

V

[S]>>[E]

[E] Wpływ stężenia enzymu [E] na szybkość reakcji enzymatycznej V


Stąd oznaczenie ilości enzymu (jego aktywności) powinno być oparte, o ile jest to możliwe, na pomiarach początkowej szybkości reakcji przy znacznym nadmiarze substratu S. W takim układzie szybkość reakcji nie zależy od stężenia substratu i reakcja jest rzędu zerowego. A k t y w n o ś ć e n z y m a t y c z n a . Oznaczenie bezwzględnej ilości enzymu (np. w gramach lub molach) jest trudne do wykonania, gdyż wiąże się z oczyszczeniem białka enzymatycznego do stanu homogenności. Stąd umówiono się, że za miarę ilości enzymu w biopreparatach przyjmuje się jego aktywność katalityczną (enzymatyczną), czyli szybkość, z jaką w założonych warunkach preparat enzymatyczny przekształca określoną ilość wybranego arbitralnie substratu. Miarą tej szybkości jest ubytek substratu lub przyrost produktów reakcji enzymatycznej w przeliczeniu na jednostkę czasu. Zdefiniowano również oficjalnie obowiązujące standardowe jednostki enzymatyczne. Pierwszą z nich, obowiązującą w układzie SI, nazwano k a t a l e m (Kat). 1 Kat to taka ilość enzymu, która katalizuje przemianę 1 mola substratu w czasie 1 sekundy w temperaturze 30C. Druga z tych oficjalnie obowiązujących jednostek, rekomendowana przez Międzynarodową Unię Biochemiczną, nazwana została m i ę d z y n a r o d o w ą j e d n o s t k ą e n z y m a t y c z n ą (w skrócie m.j.e.). 1 m.j.e. to taka ilość enzymu, która katalizuje przemianę 1 μmola substratu w ciągu 1 minuty w temperaturze 30C. Jednakże dla wielu enzymów obie te oficjalne obowiązujące jednostki nie znalazły praktycznego zastosowania. Natomiast powszechnie przyjęły się jednostki enzymatyczne skojarzone z odpowiednimi metodami oznaczania aktywności opracowanymi dla całej gamy konkretnych enzymów a nawet grup enzymów. Teoria Michaelisa-Menten. W 1913 roku L.Michaelis i M.L.Menten przedstawili swoją koncepcję katalizy enzymatycznej. Model Michaelisa–Menten opiera się na założeniu powstawania przejściowego kompleksu enzymu-substrat: E+S

k1

ES

k2

E+P

(2.6) Zgodnie z tym równaniem, przy niewielkich stężeniach substratu - równoważnym stężeniom enzymu - reakcja enzymatyczna staje się reakcją I rzędu i jej szybkość staje się proporcjonalna do stężenia zarówno substratu [S], jak i enzymu [E]. Przy stałym stężeniu enzymu [E] szybkość reakcji będzie zależała jedynie od stężenia substratu. Wpływ stężenia substratu [S] na początkową szybkość reakcji enzymatycznej przy stałym stężeniu enzymu przedstawia poniższy wykres. V

k-1

k-2

Vmax

V max 2 [S]

Km

Dla pewnych stężeń substratu - równoważnym ilościom dostępnych centrów aktywnych enzymu - reakcja osiągnie szybkość maksymalną Vmax. Dalsze zwiększanie stężenia substratu nie przyspiesza jego przemiany. Jak już wspomniano wcześniej szybkość reakcji enzymatycznej zależy od łatwości tworzenia kompleksu enzymu z substratem. Z równania (2.6) wynika, że w stanie równowagi szybkość tworzenia kompleksu ES jest równa szybkości jego rozpadu: (2.7) v1  v  2  v 2  v 1

v1  k 1  [ E ]  [ S ]

v 1  k 1  [ ES ]

v 2  k  2  [ ES ]

v 1  k  2  [ E ]  [ P] (2.8)

Po podstawieniu zależności (2.8) do równania (2.7) i po prostych matematycznych przekształceniach otrzymuje się:

51


[ ES ] k 1  [ S ] k 2  [ P]   [ E ] k 1  k  2 k 1  k  2

(2.9)

Uwzględniając fakt, że na początku reakcji [P]  0 oraz po dalszych prostych przekształceniach równania (2.9), otrzymuje się:

[ E ]  [ S ] k 1  k  2   Km [ ES ] k 1

(2.10)

Wielkość Km nosi nazwę s t a ł e j M i c h a e l i s a . J est ona charakterystyczna dla danego układu enzym-substrat. Łatwo zauważyć, że im mniejsza wartość Km, tym większe stężenie kompleksu przejściowego [ES]. Analizując równania (2.6)  (2.10) należy zauważyć, że 1. stężenie enzymu [E] w równaniu (2.10), w rzeczywistości jest stężeniem enzymu wolnego w danym momencie reakcji, czyli niezwiązanego w kompleks przejściowy ES. Na każdym etapie reakcji część enzymu wyjściowego [E0] obecnego w układzie reakcyjnym jest związana w ES. Stąd [E]= [E0]-[ES]. 2. Szybkość reakcji enzymatycznej v, czyli szybkość powstawania produktu P, zależy tak naprawdę od szybkości rozpadu kompleksu ES, czyli od v+2. Stąd: v = v+2=k+2  [ES]. 3. Gdy cały enzym jest w kompleksie z substratem, czyli [E0]=[ES] szybkość reakcji enzymatycznej osiąga maksymalną szybkość Vmax. Uwzględniając powyższe założenia w równaniu (2.10) otrzymuje się r ó w n a n i e matematyczne Michaelisa-Menten:

v

Vmax  [ S ] K m  [S ]

(2.11)

Równanie (2.11) pozwala w prosty sposób zdefiniować stałą Michaelisa Km: Km = [S] gdy: v= 1/2Vmax to Stała Michaelisa Km jest to takie stężenie substratu [S], przy którym szybkość reakcji enzymatycznej równa się połowie szybkości maksymalnej Vmax. Łatwo wykazać, że: 1. Jeśli [S]<<Km (czyli przy małych stężeniach substratu), to reakcja jest I rzędu: v= f([S]), 2. Jeśli [S]=Km, to v=1/2Vmax 3. Jeśli [S]>>Km, to reakcja jest 0 rzędu i v=Vmax. Odwrotność stałej Michaelisa 1/Km nazywana jest powinowactwem danego enzymy do substratu. Im mniejsza stała Michaelisa Km, tym większe powinowactwo enzymu do substratu, co pokazuje poniższy rysunek. Celowo dla obu substratów - S1 i S2 – przyjęto identyczne szybkości maksymalne reakcji Vmax. Km2>Km1, co oznacza, że ten enzym wykazuje większe powinowactwo do substratu S1 aniżeli do S2. Oznacza to, że szybciej przekształca on substrat S1 aniżeli S2. v

1 v

Vmax

tgα = Km/Vmax

S2

S1

Km1

Km2

-1 Km

[S]

Wpływ rodzaju substratu na szybkość reakcji enzymatycznej

Vmax

1 [S] Wykres Lineweavera-Burka

Stałe Michaelisa Km dla różnych układów enzym-substrat mogą mieć różne wartości; nawet od 10–2 mola/dm3 do 10–7mola/ dm3. Stałą Km można wyznaczyć graficznie korzystając ze wzoru Lineweavera-Burka..

52


1 Km 1 1    v Vmax [ S ] Vmax Szczegółowo kinetyką reakcji enzymatycznych zajmuje się enzymologia i tam można znaleźć więcej danych odnośnie tematu.

2.2.4. Klasyfikacja i nomenklatura enzymów Pierwotne nazewnictwo enzymów było nieuporządkowane i dopuszczało stosowanie dowolnych nazw takich, jak pepsyna, papaina, subtilizyna. W późniejszym okresie nazwę enzymu wywodzono od typu reakcji lub substratu, na który działał, przy czym za charakterystyczną dla enzymów uznano końcówkę -aza (np. reduktaza, lipaza, itp.). Od 1964 roku Komisja Enzymowa Międzynarodowej Unii Biochemicznej zaleciła stosowanie s y s t e m a t y c z n y c h n a z w e n z y m ó w , składających się przeważnie z dwu części. Pierwsza jest utworzona od nazwy katalizowanej reakcji i określa jej rodzaj (np. oksydoreduktaza, glukohydrolaza, itp.). Druga część nazwy enzymu składa się z nazwy substratu lub substratów biorących udział w reakcji. Np.: maltohydrolaza 1,4-α-D-glukanu (zwana oficjalnie i zwyczajowo β-amylazą) - EC 3.2.1.2, oksydoreduktaza alkohol:NAD (oficjalnie zwana dehydrogenazą alkoholową) - EC 1.1.1.1. Nazwy systematyczne enzymów są długie i niekiedy bardzo skomplikowane. Z tego powodu ich stosowanie napotyka na spory opór ze strony biochemików. Ponadto do wielu enzymów przylgnęły nazwy stosowane pierwotnie. Dlatego zdecydowano, że obok nazwy systematycznej, dopuszczalne jest stosowanie nazw zwyczajowych. Ostatnio (po 2000 roku) pojawiła się koncepcja wprowadzenia tzw. nazw oficjalnych enzymów wywodzących się od nazw zwyczajowych. I tak np. nazwa α-amylaza jest w świetle tej koncepcji nazwą oficjalną enzymu sklasyfikowanego pod numerem EC 3.2.1.1. Należy jeszcze uzupełnić, że pierwotne, zwyczajowe nazwy niektórych enzymów (np. sacharaza, maltaza) okazały się w świetle aktualnej wiedzy bez pokrycia i dla nich nie zaleca się ich stosowania. Ponadto zdarza się, że pod jedną i tą samą nazwą zwyczajową są znane nawet trzy różne enzymy, np. tyrozynaza. Nazwa „tyrozynaza” dla dwóch z nich oczywiście jest nazwą błędną. W numerze 1 czasopisma "Postępy Biochemii" z 1985 roku zamieszczono słownik zalecanych i zwyczajowych nazw enzymów w języku polskim. Wszystkie poznane enzymy zostały ujęte przez Komisję Enzymową w jednolity system klasyfikacji (EC). Każdy enzym w ramach tego systemu posiada odpowiedni numer złożony z czterech członów liczbowych oddzielonych kropkami (np. dehydrogenaza alkoholowa ma numer EC 1.1.1.1). Podanie tego numeru jednoznacznie określa konkretny enzym, co pozwala uniknąć nieporozumień i pomyłek. Zasady klasyfikacji i numeracji zbadanych enzymów oparte zostały o ich specyficzność kierunkową (rodzaj katalizowanej reakcji) i substratową. Wszystkie enzymy podzielono na sześć głównych klas: 

   

EC.1. Oksydoreduktazy - enzymy katalizujące reakcje odłączania lub przyłączania atomów wodoru, przyłączenia atomu tlenu lub przenoszenia elektronów. EC.2. Transferazy - enzymy przenoszące grupy funkcyjne, rodniki, fragmenty cząsteczek itp. EC 3. Hydrolazy - enzymy katalizujące reakcje hydrolizy. EC 4. Liazy - enzymy niehydrolitycznie rozrywające wiązania. EC 5. Izomerazy - enzymy katalizujące przemiany wewnątrzcząsteczkowe (racemizacja, izomeryzacja, przenoszenie grup itp.). EC 6. Ligazy - enzymy syntetyzujące, katalizujące tworzenie wiązań.

Każda klasa główna dzieli się na szereg podklas, których kolejne numery stanowią drugi człon numeru klasyfikacyjnego i wynikają, ogólnie biorąc, z uściślonej specyficzności kierunkowej. Na przykład EC.3.4. jest numerem podklasy hydrolaz peptydowych, czyli enzymów hydrolizujących wiązanie peptydowe. W obrębie podklas rozróżnia się pod-podklasy - trzeci człon numeru klasyfikacyjnego. Określa on dokładniej specyfikę katalizowanej reakcji. Dla oksydoreduktaz określa grupę funkcyjną będącą akceptorem; dla transferaz uściśla rodzaj przenoszonej grupy; dla hydrolaz typ hydrolizowanego wiązania; dla liaz - rodzaj odszczepianej grupy; dla izomeraz - charakter przekształcenia i wreszcie dla ligaz - rodzaj powstałego związku.

53


Dostęp do internetowej bazy danych dotyczącej nomenklatury enzymów (Enzyme Nomenclature Database) można znaleźć pod adresem http://www.expasy.org/enzyme/. Na następnej stronie przykładowo pokazano stronę internetową ExPASy dla dehydrogenazy alkoholowej – EC 1.1.1.1.

54


Wzór strony E x P A S y dla EC 1.1.1.1 – dehydrogenaza alkoholowa. Official Name Alcohol dehydrogenase. Alternative Name(s) Aldehyde reductase. Reaction catalysed An alcohol + NAD(+) <=> an aldehyde or ketone + NADH Cofactor(s) Zinc or Iron. Comment(s)  Acts on primary or secondary alcohols or hemiacetals.  The animal, but not the yeast, enzyme acts also on cyclic secondary alcohols. Cross-references Biochemical D8 ; E6 ; J10 Pathways; map number(s) PROSITE

PDOC00058 ; PDOC00059 ; PDOC00060

BRENDA

1.1.1.1

PUMA2

1.1.1.1

PRIAM enzymespecific profiles

1.1.1.1

Kyoto University LIGAND chemical database

1.1.1.1

IUBMB Enzyme Nomenclature

1.1.1.1

IntEnz

1.1.1.1

MEDLINE

Find literature relating to 1.1.1.1

Swiss-Prot

P80222, ADH1_ALLMI; P41747, ADH1_ASPFL; P43067, ADH1_CANAL; P23236, ADH1_DROHY; P22246, ADH1_DROMT; P08843, ADH1_EMENI; Q07288, ADH1_KLUMA; Q9P6C8, ADH1_NEUCR; P14219, ADH1_PENAM; Q03505, ADH1_RABIT; P80338, ADH1_STRCA; Q07264, ADH1_ZEALU; O45687, ADH2_CAEEL; P27581, ADH2_DROAR; P48587, ADH2_DROMN; P24267, ADH2_DROWH; Q24803, ADH2_ENTHI;

P49645, ADH1_APTAU; P12311, ADH1_BACST; P48814, ADH1_CERCA; P48586, ADH1_DROMN; P07161, ADH1_DROMU; P05336, ADH1_HORVU; P00333, ADH1_MAIZE; P20306, ADH1_ORYSA; P25141, ADH1_PETHY; P22797, ADH1_RANPE; P13603, ADH1_TRIRP; P20368, ADH1_ZYMMO; O94038, ADH2_CANAL; P25720, ADH2_DROBU; P09369, ADH2_DROMO; P37686, ADH2_ECOLI; P10847, ADH2_HORVU;

P06525, ADH1_ARATH; Q17334, ADH1_CAEEL; P23991, ADH1_CHICK; P09370, ADH1_DROMO; P12854, ADH1_DRONA; P20369, ADH1_KLULA; P80512, ADH1_NAJNA; P12886, ADH1_PEA; O00097, ADH1_PICST; P14673, ADH1_SOLTU; P00330, ADH1_YEAST; P42327, ADH2_BACST; P48815, ADH2_CERCA; P23237, ADH2_DROHY; P07160, ADH2_DROMU; P54202, ADH2_EMENI; P49383, ADH2_KLULA;

Zasady klasyfikacji enzymów w podklasach i pod-podklasach. Oksydoreduktazy. W tej klasie enzymów drugi człon numeru - czyli podklasa - wskazuje, na jaką grupę funkcyjną lub grupę związków działa dana oksydoreduktaza. Pewnego typu odstępstwo występuje w podklasach EC 1.13. i EC 1.14. Te dwie podklasy skupiają oksygenazy – enzymy

55


wbudowujące atom lub dwa atomy tlenu do substratów, choć oficjalnie mówi się o „oksydoreduktazach działających na pojedyncze lub podwójne donory z jednoczesnym wybudowaniem atomów tlenu”. Poniżej przedstawiono przykłady podklas (w EC 1.13. i EC 1.14. również pod-podklas) w tej klasie enzymów. EC 1. Oksydoreduktazy EC 1.1. działające na grupę –CH2-OH jako donor EC 1.2. działające na grupę –CHO lub >C=O jako donor EC 1.3. odrywające atomy wodoru od –CH2-CH2, prowadząc do –CH=CH EC 1.4. działające na grupę –CH2-NH2 jako donor EC 1.5. działające na grupę -CH-NH- jako donor EC 1.6. działające na NADH lub NADPH EC 1.7. działające na inne związki azotowe jako donory EC 1.8. działające na związki siarki jako donory EC 1.9. działające na grupę hemową jako donor EC 1.10. działające na związki difenolowe i pokrewne jako donory peroksydazy EC 1.11. działające na H2O2 jako akceptor Są to p e r o k s y d a z y . W tej podklasie brak jest pod-podklas, stąd ich numer zaczyna się od EC 1.11.1. Na przykład numer EC 1.11.1.6 odnosi się do k a t a l a z y . EC 1.12. działające na wodór jako donor EC 1.13. oksygenazy, enzymy wbudowujące atom lub dwa atomy tlenu do substratu, nie wymagają dodatkowego donoru wodoru EC 1.13.11. dioksygenazy- wbudowują dwa atomy tlenu EC 1.13.12. monooksygenazy – wbudowują jeden atom tlenu EC 1.14. oksygenazy, enzymy wbudowujące atom lub dwa atomy tlenu do substratu, wymagają dodatkowego donoru wodoru Schematycznie, reakcje katalizowane przez te enzymy można przedstawić następująco: O2 DH2 D O2 DH2 D OH X-OH XH X XH2 OH H2O mechanizm działania dioksygenazy z podklasy EC 1.14.

mechanizm działania monooksygenazy z podklasy EC 1.14.

EC 1.14.11. dioksygenazy, DH2 = 2-ketoglutran EC 1.14.12. dioksygenazy, DH2 = NADH EC 1.14.13. monooksygenazy, DH2 = NADH EC 1.14.14. monooksygenazy, DH2 = FADH2 lub zredukowany FMN EC 1.14.15. monooksygenazy, DH2 = zredukowane żelazowo-siarkowe białka EC 1.14.16. – EC 1.14.20. monooksygenazy, DH2 = inne zredukowane związki EC 1.15. działające na ponadtlenki jako akceptory EC 1.16. utleniające jony metali EC 1.17. działające na grupy =CH lub –CH2 jako donory EC 1.18. działające na siarkowo-żelazowe białka jako donory EC 1.19. – EC 1.21. działające na inne związki jako donory EC 1.97. inne oksydoreduktazy

W klasie oksydoreduktaz trzeci człon numeru - czyli pod-podklasa - wskazuje, co jest donorem lub akceptorem atomów wodoru względnie elektronów. Poniżej podano kilka przykładów pod-podklas z klasy oksydoreduktaz. EC 1.x.1. akceptorem wodoru jest NAD lub NADP, dehydrogenazy i reduktazy EC 1.x.2. akceptorem elektronów są cytochromy EC 1.x.3. akceptorem wodoru jest tlen cząsteczkowy, oksydazy Oksydazy są flawoproteidami (np. z FAD), metaloflawoproteidami bądź hemoproteidami. Znane są dwa typy oksydaz: oksydazy typu I wytwarzają podczas działania wodę, oksydazy typu II wytwarzają nadtlenek wodoru.

1/2 O2

XH2

O2

(koenzym) X

XH2

(koenzym) X H2O2

H2O oksydazy typu I

oksydazy typu II 56


Przykładem oksydazy typu I jest oksydaza cytochromu-c (EC 1.9.3.1), a przykładem oksydazy typu II oksydaza glukozowa (EC 1.1.3.4). EC 1.x.4. akceptorem są związki disulfidowe (min. liponian) dehydrogenazy (dekarboksylujące) EC 1.x.5. akceptorem wodoru jest ubichinon dehydrogenazy EC 1.x.7. akceptorem są żelazo-siarkowe białka EC1.x.99.z innym akceptorem (najczęściej z FAD) dehydrogenazy

Transferazy. W tej klasie enzymów drugi człon numeru - czyli podklasa - wskazuje, jaką grupę funkcyjną transportuje dana transferaza. Trzeci człon numeru – pod-podklasa – uściśla o jaki rodnik chodzi lub wskazuje akceptor przenoszonej grupy. EC 2. Transferazy EC 2.1. transportujące grupy jednowęglowe (C1) EC 2.1.1. metylotransferazy (CH3) EC 2.1.2. hydroksymetylo- i formylotransferazy (CH2OH, CHO) EC 2.1.3. karboksy i karbamoilotransferazy EC 2.1.4. amidynotransferza (CONH2) EC 2.2. transportujące grupy aldehydowe lub ketonowe EC 2.3. Acylotransferazy EC 2.3.1. transportujące grupy inne niż acetylo-aminowe EC 2.3.2. aminoacylotransferazy EC 2.3.3. acylowe grupy przekształcane na alkilowe rodniki podczas transportu EC 2.4. glikozylotransferazy EC 2.4.1. heksozylotransferazy EC 2.4.2. pentozylotransferazy EC 2.4.99 transportujące inne glikozylowe grupy EC 2.5. transportujące alkilowe lub arylowe grupy, inne niż metylowe grupy EC 2.6. transportujące grupy z azotem EC 2.6.1. Transaminazy EC 2.6.2. Oksymotransferazy EC 2.6.99. transportujące inne grupy z azotem EC 2.7. transportujące grupy zawierające fosfor EC 2.7.1. Fosfotransferazy z grupą alkoholową jako akceptorem EC 2.7.2. Fosfotransferazy z grupą karboksylową jako akceptorem EC 2.7.3. Fosfotransferazy z grupą z azotem jako akceptorem EC 2.7.4. Fosfotransferazy z grupą fosforową jako akceptorem EC 2.7.6. Difosfotransferazy EC 2.7.7. Nukleotydilotransferazy EC 2.7.8. Transferazy dla innych pochodnych grup fosforowych EC 2.7.9. Fosfotransferazy z parą akceptorów EC 2.8. transportujące grupy zawierające siarkę EC 2.8.1. Siarkotransferazy EC 2.8.2. Siarczanotransferazy EC 2.8.3. CoA-transferazy EC 2.8.4. transportujące grupy tioalkylowe EC 2.8. transportujące grupy zawierające selen

aminotransferazy

kinazy kinazy kinazy kinazy difosfokinazy dikinazy

Hydrolazy W tej klasie enzymów drugi człon numeru (podklasa) wskazuje, jakiego rodzaju wiązanie ulega hydrolizie. Trzeci człon numeru – pod-podklasa – uściśla typ hydrolizowanego wiązania. EC 3.Hydrolazy EC 3.1. działające na wiązanie estrowe EC 3.1.1. Hydrolazy estrów karboksylowych EC 3.1.2. Hydrolazy tioestrów EC 3.1.3. Hydrolazy monoestrów fosforowych EC 3.1.4. Hydrolazy diestrów fosforowych EC 3.1.5. Hydrolazy monoestrów trifosforowych EC 3.1.6. Hydrolazy estrów kwasu siarkowego EC 3.1.7. Hydrolazy monoestrów difosforowych EC 3.1.8. Hydrolazy triestrów fosforowych EC 3.1.11. 3.1.31. Egzo- i endorybonukleazy EC 3.2. Glikozylazy

57

esterazy, lipazy i laktonazy fosfatazy i nukleotydazy fosfolipazy i fosfodiesterazy difosfatazy


EC 3.2.1. Glikozydazy, i inne enzymy hydrolizujące O- i S-glikozyle EC 3.2.2. hydrolizujące związki N-glikozylowe EC 3.3. działające na wiązanie eterowe EC 3.3.1. Hydrolazy tioeterowe i trialkilosulfonianowe EC 3.3.2. Hydrolazy eterowe EC 3.4. działające na wiązanie peptydowe hydrolazy peptydowe EC 3.4.11. Aminopeptydazy EC 3.4.13. Dipeptydazy EC 3.4.14. Dipeptydylo- i tripeptydylo-peptydazy EC 3.4.15. Peptydylo-dipeptydazy EC 3.4.16 Karboksypeptydazy serynowego typu EC 3.4.17 Metalokarboksypeptydazy EC 3.4.18 Karboksypeptydazy cysteinowego typu EC 3.4.19 Omega peptydazy EC 3.4.21. Endopeptydazy serynowe EC 3.4.22. Endopeptydazy cysteinowe EC 3.4.23. Endopeptydazy aspartylowe EC 3.4.24. Metaloendopeptydazy EC 3.4.25. Endopeptydazy treoninowe EC 3.4.99. Endopeptydazy o nierozpoznanym mechanizmie działania EC 3.5. działające na wiązanie CN, inne niż peptydowe EC 3.5.1. w linearnych amidach m.in. amidazy i deacylazy EC 3.5.2. w cyklicznych amidach EC 3.5.3. w linearnych amidynach EC 3.5.4. w cyklicznych amidynach EC 3.6. działające na bezwodniki kwasowe EC 3.6.1. w związkach zawierających fosforanowe bezwodniki m.in. difosfatazy EC 3.6.2. w związkach zawierających sulfonowe bezwodniki EC 3.6.3. działające na bezwodniki kwasowe; katalizujące przenoszenie transmembranowe EC 3.6.5. działające na GTP; związane z komórkowym transportem EC 3.7. działające na wiązanie CC EC 3.7.1. w ketonowych substancjach EC 3.8. działające na halogenkowe wiązania EC 3.8.1. w związkach Chalogen EC 3.9. działające na wiązanie fosforo-azotowe EC 3.10. działające na wiązanie siarkowo-azotowe EC 3.11. działające na wiązanie węglowo-fosforowe EC 3.11. działające na wiązanie siarkowo-siarkowe EC 3.11. działające na wiązanie węglowo-siarkowe

Liazy W tej klasie enzymów drugi człon numeru (podklasa) wskazuje, jakiego rodzaju wiązanie ulega rozerwaniu. Trzeci człon numeru – pod-podklasa – uściśla typ rozrywanego wiązania. EC 4. Liazy EC 4.1. Liazy węgiel-węgiel EC 4.1.1. karboksy-liazy EC 4.1.2. aldehydo-liazy EC 4.1.3. liazy ketokwasów EC 4.1.99. inne węgiel-węgiel liazy EC 4.2. Liazy węgiel-tlen EC 4.2.1. hydro-liazy EC 4.2.2. działające na polisacharydy EC 4.2.3. działające na fosforany EC 4.2.99 inne węgiel-tlen liazy EC 4.3. Liazy węgiel-azot EC 4.3.1. amoniako-liazy EC 4.3.2. liazy działające na amidy, amidyny, itp. EC 4.3.3. amino-liazy EC 4.3.99. inne węgiel-azot liazy EC 4.4. Liazy węgiel-siarka EC 4.5. Liazy węgiel-halogen EC 4.6. Liazy fosfor-tlen

dekarboksylazy

dehydratazy syntazy

Izomerazy W tej klasie enzymów drugi człon numeru (podklasa) uściśla typ katalizowanej reakcji. Trzeci człon numeru – pod-podklasa – wskazuje, jakie związki lub ugrupowania ulegają izomeryzacji. EC 5. Izomerazy

58


EC 5.1. Racemazy i epimerazy EC 5.1.1. działające na aminokwasy i ich pochodne EC 5.1.2. działające na hydroksykwasy i ich pochodne EC 5.1.3. działające na węglowodory i ich pochodne EC 5.1.99. działające na inne związki EC 5.2. cic-trans izomerazy EC 5.3. wewnątrzcząsteczkowe oksydoreduktazy EC 5.3.1. wzajemnie przekształcające się aldozy i ketozy EC 5.3.2. wzajemnie przekształcające się ugrupowania enolowe i ketonowe EC 5.3.3. przenoszące wiązania C=C EC 5.3.4. przenoszące wiązania SS EC 5.3.99. inne wewnątrzcząsteczkowe oksydoreduktazy EC 5.4.wewnątrzcząsteczkowe transferazy EC 5.4.1. transportujące grupy acylowe EC 5.4.2. fosfotransferazy EC 5.4.3. transportujące grupy aminowe EC 5.4.99. transportujące inne grupy EC 5.5. wewnątrzcząsteczkowe liazy EC 5.99. inne izomerazy

tautomerazy Δ-izomerazy mutazy fosfomutazy

Ligazy W tej klasie enzymów drugi człon numeru (podklasa) wskazuje, jakiego typu wiązanie jest tworzone. Trzeci człon numeru – pod-podklasa – uściśla, jakiego typu związki lub ugrupowania powstają w wyniku syntezy. EC 6. Ligazy EC 6.1. tworzące wiązanie węgiel-tlen EC 6.1.1. ligazy tworzące aminoacylo-tRNA i spokrewnione związki EC 6.2. tworzące wiązanie węgiel-siarka EC 6.2.1. ligazy kwas-tiol EC 6.3. tworzące wiązanie węgiel-azot EC 6.3.1. ligazy kwas-amoniak EC 6.3.2. ligazy kwas- D-aminokwas EC 6.3.3. cyklo-ligazy EC 6.3.4. inne ligazy tworzące wiązanie węgiel-azot EC 6.3.5. ligazy wiązania węgiel-azot z glutaminą, jako amido-N donorem EC 6.4. tworzące wiązanie węgiel-węgiel EC 6.5. tworzące wiązanie fosforowoestrowe EC 6.6. tworzące wiązanie azot-metal

syntetazy acylo-CoA syntetazy amidowe syntetazy peptydowe

chelatazy

Izoenzymy Izoenzymy, to odmiany tego samego enzymu o identycznym centrum aktywnym i mechanizmie działania, a różniące się w niewielkim stopniu sekwencją aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym. Konsekwencją tego mogą być pewne różnice właściwości fizyko-chemicznych i biologicznych takich odmian enzymu, np.: różne pI, optymalne pH i temperatura działania, KM i odczyn immunologiczny. Izoenzymy są umieszczane w Klasyfikacji i Nomenklaturze Enzymów pod tym samym numerem. Zazwyczaj w komentarzu do danego enzymu wspomina się o jego odmianach i podaje odpowiednie odnośniki literaturowe. 2.2.5. Czynniki wpływające na efektywność działania enzymów Zaletą enzymów są łagodne pod względem temperatury, pH i ciśnienia warunki działania, co obniża koszt procesów, w których uczestniczą oraz pozwala na zachowanie w otrzymanych produktach cennych, a nieodpornych na drastyczne warunki obróbki, składników. Ponadto przebieg procesów katalizowanych przez enzymy można łatwo regulować, zmieniając stężenie enzymu bądź temperaturę lub pH środowiska reakcyjnego. Do podstawowych czynników określających przebieg (kinetykę) reakcji enzymatycznych należą: pH środowiska, temperatura, stężenie jonów, potencjał oksydoredukcyjny, obecność inhibitorów, aktywatorów oraz stabilizatorów (substancji hamujących lub podwyższających efektywność działania enzymu) i oczywiście tak istotne parametry procesu, jak stężenie enzymu i substratu, o czym mowa była już wcześniej. Optymalne pH

59


pH środowiska. Szybkość reakcji enzymatycznych w znacznym stopniu zależy od pH środowiska. Każdy enzym wykazuje charakterystyczne dla siebie optimum pH. Na poniższym rysunku przedstawiono wpływ pH na aktywność trzech endopeptydaz: pepsyny, metaloproteinazy z Bacillus subtilis oraz subtilizyny.

Aktywność względna [%]

100

metaloproteinaza B.subtilis

pepsyna

subtilizyna

80 60 40 20 0 0

2

4

6

8

10

12

pH

Wpływ pH na aktywność trzech różnych endopeptydaz

Aktywność względna [%]

Jak widać, każda z tych endopeptydaz działa w zupełnie innym zakresie pH: pepsyna w środowisku kwaśnym (optymalne pH 1,8), metaloproteinaza w obojętnym (optymalne pH 7,3), a subtilizyna w alkalicznym (optymalne pH 10,2). Związane jest to z wpływem stężenie jonów hydronowych na konformację centrum aktywnego każdej z nich. Pepsyna, której aminokwasem bezpośrednio działającym w centrum aktywnym jest kwas asparaginowy, wymaga jego formy niezdysocjowanej (czyli grupy -COOH). Grupa taka w przewadze występuje w środowisku kwaśnym. Endopeptydazy serynowe, których centrum aktywne opisano wyżej, wymagają do aktywnego działania zdysocjowanej formy kwasu asparaginowego (grupy karboksylanowej –COO ), która występuje w przewadze w środowisku alkalicznym. Należy ponadto zwrócić uwagę na to, że o ile subtilizyna jest aktywna w szerokim zakresie pH od 6 do 11, to pozostałe dwie proteinazy działają w bardzo wąskim przedziale pH i niewielkie jego zmiany wykazują znaczny wpływ na wzrost lub obniżenie ich aktywności. Optymalne pH niektórych enzymów (np. aktywność subtilizyny) zmieniać się może w zależności od substratu na który działają, choć są to wahania nie większe niż 0.5 jednostki (np. subtilizyna wobec hemoglobiny optimum pH wykazuje przy 10,2, a wobec kazeiny 10,5). Optymalna temperatura. Temperatura z jednej strony przyspiesza samą reakcję enzymatyczną, z drugiej jednak przyspiesza denaturację enzymu, co wiąże się z jego inaktywacją. Na poniższym 100 rysunku przedstawiono wpływ temperatury na 80 aktywność subtilizyny. Do osiągnięcia pewnej 60 granicznej wielkości (w tym przypadku 40 temperatury 60C), szybkość reakcji katalizowanej przez ten enzym wzrasta, podobnie 20 jak to się dzieje przy wszystkich reakcjach 0 chemicznych, a następnie dość gwałtownie spada -20 0 20 40 60 80 do wartości zerowych. Większość enzymów o Temperatura [ C] drobnoustrojowych najefektywniej działa w Wpływ temperatury na aktywność subtilizyny granicach 60C. Enzymy roślinne i zwierzęce z reguły już powyżej 40-50C ulegają denaturacji. Znane są enzymy z bakterii termofilnych, wykazujące optimum działania nawet w temperaturach sięgających 90C. Stabilność enzymów w roztworach wodnych. Jak już wspomniano pH środowiska i temperatura bezpośrednio wpływają na szybkość reakcji enzymatycznej. Jednakże mogą również niekorzystnie oddziaływać na sam enzym, prowadząc do jego inaktywacji. Dlatego niezbędna jest znajomość wpływu tych dwóch czynników na aktywność enzymu w subtilizyny stabilność subtilizyny warunkach rzeczywistych lub do nich zbliżonych, panujących podczas procesu prowadzonego z jego udziałem. 60


Większość enzymów jest względnie stabilna w obszarze pH zbliżonym dla ich optymalnego działania, jakkolwiek nie jest to regułą. Na rysunku 3 przedstawiono wpływ pH na stabilność subtilizyny. Jej optymalne pH (porównaj rys.1) przekracza 10, jednakże obszar stabilności tego enzymu w warunkach przykładowej reakcji (1% kazeiny, 45 C, 60 min.) zawarty jest w zakresie 6.5-9.5, a w pH zbliżonym do optymalnego straty aktywności (w wyniku postępującej autolizy) sięgają 50% wyjściowej.

Aktywność względna [%]

100 80 60

w buforze

Z dodatkiem 1% CaCl2

40

Preinkubacja: 45C, 60min

20 0 3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

pH

Wpływ pH na stabilność subtilizyny w roztworze buforowym i z dodatkiem 1% CaCl2 Dużo poważniejsze straty enzymu spowodowane mogą być wpływem podwyższonej temperatury reakcji. Znaczna część enzymów jest bardzo wrażliwa na ten czynnik (wyjątkiem są niektóre enzymy termostabilne otrzymywane ze szczepów drobnoustrojów termofilnych). Na rys.4 pokazano wpływ temperatury na zachowanie się subtilizyny podczas przykładowego procesu hydrolizy kazeiny (1% roztwór substratu w buforze o pH 9).

100

Aktywność względna [%]

20C 80

40C Z dodatkiem 1%CaCl2 60C

60

40

Preinkubacja: w buforze o pH 9

20

60C

70C

0 0

15

30

45

60

75

90

105

120

c z as [minuty ]

Wpływ temperatury na stabilność subtilizyny w roztworze buforowym i z dodatkiem 1%CaCl2 Należy wyraźnie zaznaczyć, że subtilizyna (konsekwentnie w tekście niniejszego opracowania rozpatrywana jako enzym modelowy) jest wyjątkowo odporna na działanie wielu czynników fizykochemicznych, w tym temperatury. Tym niemniej w warunkach testu, po 40 minutach reakcji prowadzonej w 60 C straty jej aktywności sięgają 70%. W tym samym czasie w temperaturze 70 C enzym ulega już pełnej inaktywacji. Natomiast w 50C po 60 minutach straty enzymu są stosunkowo niewielkie i wynoszą 36%. Oczywiście, ostatecznego wyboru temperatury dokonuje się po szczegółowej analizie wyników wszystkich badań, uwzględniającej aspekty technologiczne i ekonomiczne procesu. Przy tego typu analizach przydatne jest wyznaczenie produktywności reakcji enzymatycznej w kilku wytypowanych temperaturach (rys.5). Wybór optymalnej temperatury skojarzony jest w tym przypadku z czasem procesu, który może być determinowany innym czynnikiem (np. kosztem energii). 61


Rys. 5 Produktywność subtilizyny w hydrolizie kazeiny

Inhibitory, aktywatory, stabilizatory. Oprócz wymienionych wyżej czynników inaktywujących działanie enzymów, istnieje grupa substancji zdolnych do wybiórczego hamowania ich aktywności katalitycznej (są to tzw. inhibitory specyficzne). W opracowaniu pominięto szczegóły dotyczące tego działu enzymologii. Należy jednak wiedzieć, że tego typu naturalne inhibitory występują w przyrodzie, co może mieć istotne znaczenie dla aplikacji enzymów w niektórych przypadkach. Przykładem mogą być specyficzne inhibitory proteinaz serynowych (w tym subtilizyny) znalezione m.in. w ziemniakach czy soi, które skutecznie blokują aktywność tej grupy enzymów. Istnieje wiele typów cząsteczek , które są zdolne do zakłócania aktywności danego enzymu. Każda cząsteczka działająca bezpośrednio na enzym w kierunku zmniejszenia jego aktywności katalitycznej jest określana jako inhibitor. Pewne inhibitory enzymów są normalnymi metabolitami komórkowymi, które hamują dany enzym w ramach naturalnej metabolicznej kontroli odpowiedniego szlaku. Inne inhibitory mogą być substancjami obcymi dla organizmu, takimi jak toksyny i leki, i w tym przypadku hamowanie enzymu może mieć działanie terapeutyczne , ale również letalne. Rozróżnia się dwa główne typu inhibicji : - nieodwracalną - odwracalną. Inhibicję odwracalną można podzielić na: 1) kompetycyjną 2) niekompetycyjną Inhibicja nieodwrcalna polega na wiązaniu się inhibitora i enzymu w sposób trwały , nieodwracalny, często tworząc wiązania kowalencyjne z resztami aminokwasów, znajdującymi się w miejscu aktywnym lub jego pobliżu i w ten sposób inaktywują enzym na stałe. W wiązaniu tym biorą udział reszty Ser i Cys mające , odpowiednio, reaktywne grupy -OH i -SH . Przykładem może być związek diizopropylofluorofosforan (DFP) , składnik gazów bojowych (soman) działający na układ nerwowy, reaguje z resztą Ser w miejscu aktywnym enzymu esterazy acetylocholinowej, nieodwracalnie hamując enzym i uniemożliwiając przekazywanie impulsów nerwowych.

Inhibitor kompetycyjny jest zazwyczaj strukturalnie podobny do normalnego substratu danego enzymu. Dzięki temu współzawodniczy z cząsteczkami o wiązanie się z miejscem aktywnym. Enzym może się wiązać albo z cząsteczkę substratu, albo cząsteczkę inhibitora, ale nie z obiema jednocześnie. Inhibitor kompetycyjny wiąże się z miejscem aktywnym odwracalnie. Przy dużych stężeniach substratu działanie inhibitora kompetycyjnego zostaje przezwyciężone , ponieważ duże stężenie substratu będzie z powodzeniem współzawodniczyć z cząsteczką inhibitora o wiązanie się w miejscu aktywnym. Nie nastąpi więc żadna zmiana w wartości Vmax enzymu , ale w obecności inhibitora kompetycyjnego zmniejsza się powinowactwo enzymu do jego substratu i dlatego wratośc

62


Km wzrasta. Przykładem hamowania kompetycyjnego może być dehydrogenaza bursztynianowa. Enzum ten używa bursztyniany jako substratu i jest hamowany kompetycyjnie przez malonian, który różni się od bursztynianu posiadniem tylko jednej, a nie dwóch grup metylenowych.

Inhibitor niekompetycyjny wiąże się odwracalnie w innym miejscu enzymu niż jego miejsce aktywne i powoduje zmianę przestrzennego kształtu enzymu, co prowadzi do zmniejszenia aktywności katalitycznej. Ponieważ inhibitor wiąże się w innym miejscu niż substrat, enzym może wiązać albo inhibitor, albo substrat równocześnie. Efektu inhibitora niekompetycyjnego nie można przezwyciężyć przez zwiększanie stężenia substratu i dlatego zmniejsza się wartość Vmax . W inhibicji niekompetycyjnej powinowactwo enzymu do substratu pozostaje nie zmienione, a więc wartość Km nie zmienia się . Przykładem inhibicji niekompetycyjnej jest działanie pepstatyny na enzym reninę .

Na działanie enzymów wpływ mogą wywierać jony obecne w środowisku reakcyjnym. Jony dwuwartościowych metali, jak magnez, wapń, cynk, mangan lub kobalt w specyficzny sposób aktywują wielu enzymów (t.zn. zwiększa- ją szybkość reakcji przez nie katalizowanej). Aktywatorami mogą być też aniony np. amylaza ślinowa jest aktywowana jonami Cl . Jony metali mogą wykazywać również wpływ stabilizujący na enzym (tzn. podwyższać jego stabilność wobec niekorzystnego wpływu m.in. pH i temperatury). Przy- kładem może być wpływ jonów Ca na subtilizynę. Na rys. 3 i 4 pokazano, że jony te podwyższają termostabilność subtilizyny (z 50 do 60 C) i jej trwałość w alkalicznym środowisku (z pH 9.5 do 10.5). Natomiast jony wielu metali ciężkich (np. Hg, Cu, Pb) są

63


silnymi inhibitorami enzymów (tzn. inaktywują one enzym, tym samym hamując reakcję przebiegającą przy jego udziale). Jest to inhibicja niespecyficzna, której podlegają wszystkie znane enzymy. Istnieje ponadto wiele innych substancji mających zdolność niespecyficznej inaktywacji enzymów (związanej ze zniszczeniem naturalnej struktury białka). Do nich zalicza się mocznik, aldehyd mrówkowy czy glutarowy, silne utleniacze (np. nadmanganian lub chlor). Koncentracja wody. W praktyce nie wszystkie reakcje katalizowane przez enzym przebiegają do końca. Należy bowiem pamiętać, że są one odwracalne i po pewnym czasie ustala się równowaga pomiędzy reakcją przebiegającą do "przodu" i odwrotną. Jednym z czynników wpływających na ich stałą równowagi może być stężenie wody w środowisku reakcyjnym. Dotyczy to zwłaszcza prze- mian, w których woda jest jednym z reagentów (np. w reakcjach enzymatycznej hydrolizy). Wykazano, że stężenie wody decyduje o kierunku ich przebiegu. I tak, subtilizyna w środowisku wodnym katalizuje hydrolizę wiązań peptydowych w białkach lub wiązań estrowych w licznych estrach, natomiast w środowisku bezwodnym lub o obniżonej koncentracji wody katalizuje rewersję tych reakcji. Dla pożądanego przesunięcia stałej równowagi takich reakcji stosuje się rozmaite zabiegi. M.in. rewersję enzymatycznej hydrolizy (czyli syntezę) osiąga się, stosując w środowisku reakcyjnym rozpuszczalniki organiczne, prowadząc proces w układzie dwufazowym (z rozpuszczalnikiem apolarnym nasyconym wodą), korzystnie z immobilizowaną formą enzymu itp. Obecnie jest to jeden z najbardziej preferowanych kierunków badawczych, m.in. z uwagi na potencjalnie możliwe do uzyskania efekty (również o charakterze aplikacyjnym w wielu procesach przemysłowych). Charakterystyka biokatalizatorów przemysłowych Termin "biokatalizatory przemysłowe" (używany obecnie w bardzo szerokim znaczeniu) oznacza katalizatory otrzymywane w skali przemysłowej na drodze biologicznej. Pod tym pojęciem rozumie się zarówno enzymy: natywne, spreparowane rozmaitymi technikami (np. ich immobilizowane formy), ich mikstury, rozmaite proszki zawierające ich dodatek, jak i komórki: całe lub ich fragmenty, żywe i martwe. Enzymy wyodrębniane są z tkanek zwierzęcych lub roślinnych oraz wytwarzane przez drobnoustroje. Te pochodzące z dwóch pierwszych wymienionych źródeł występują na rynku stosunkowo w małych ilościach i są względnie drogie. Niektóre z nich: renina, pepsyna, trypsyna, papaina i bromelaina są ekstrahowane ze spożywczych surowców. Tabela 1 Enzymy produkowane przez mikrobiologiczną fermentację (adaptowane z Trampera, 1994).

Enzym

Substrat

-amylaza

Skrobia

-amylaza

Skrobia

Amyloglukozydaza (glukoamylaza) Celulazy

Dekstryny

Izomeraza glukozowa

Glukoza

Oksydaza glukozowa -glukozydaza

Glukoza Maltoza

Mikroorganizm Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis Bacillus polymyxa

Celuloza

Aspergillus niger Rhizopus niveus Phanerochaete chrysosporium Trichoderma reesei Actinoplanes missouriensis Streptomyces murinus Streptomyces olivochromogenus Aspergillus niger Aspergillus niger Bacillus amyloliquefaciens Saccharomyces cerevisiae

64


Lipazy

Lipidy

Pektynoesteraza

Pektyna

Proteinaza alkaliczna (serynowa)

Białka

Proteinaza kwaśna (pepsyno-podobna) Proteinaza kwaśna (reninopodobna)

Białka

Proteinaza obojętna Pullulanaza

białka białka Amylopektyna

Aspergillus niger Candida rugosa Geotrichum candidum Rhizopus arrhizus Aspergillus niger Aspergillus oryzae Aspergillus oryzae Bacillus licheniformis Bacillus subtilis Aspergillus oryzae Aspergillus saitoi Endothia parasitica Mucor michei Mucor pusillus Bacillus stearothermophilus Bacillus subtilis Aerobacter aerogenes Bacillus cereus var.mycoides

W wyniku rozwoju biotechnologii, mikroorganizmy stanowią podstawowe źródło enzymów. Zastosowanie mutacji i specjalnych technik selekcji drobnoustrojów pozwoliło osiągnąć wysoki poziom produkowanych przez nie enzymów, w niektórych przypadkach sięgający 10% wszystkich wytwarzanych białek . Ponadto użycie dużych fermentorów (do 300 m ) sprawia, że obecnie w krótkim czasie i przy niskich kosztach produkuje się na skalę przemysłową olbrzymie ilości rozmaitych enzymów (tabela 1). Niezależnie od źródła pochodzenia enzymy mogą katalizować te same reakcje chemiczne, ale nie muszą posiadać identycznej budowy chemicznej, a tym samym mogą znacznie różnić się optymalnymi warunkami działania. I tak na przykład α -amylaza katalizuje hydrolizę wiązań ŕ-1,4- między cząsteczkami D-glukozy w polisacharydach, takich jak amyloza. α-amylaza trzustkowa posiada optymalne pH około 7 i optymalną temperaturę 37 C, podczas gdy enzym ten wyodrębniony z Aspergillus oryzae - optymalne pH 4,7 i optymalną temperaturę działania 50 C, a z Bacillus subtilis odpowiednio pH 6,5 i 75 C. W zasadzie te dwa parametry (pH i temperatura) decydują o możliwości zastosowania enzymów w procesach produkcji środków spożywczych przebiegających w różnych warunkach (np. w różnych gałęziach przemysłu spożywczego). Fakt ten tłumaczy występowanie na rynku rozmaitych preparatów homologicznych enzymów. Należy jednak mieć na uwadze, że tylko część drobnoustrojów i wytwarzanych przez nie bioproduktów (w tym enzymów) traktowana jest jako nieszkodliwa dla stosowania w środkach spożywczych (tabela 2). W ogólnym zarysie proces produkcji enzymów drobnoustrojowych polega na hodowli wyselekcjonowanych kultur mikroorganizmów na specjalnie opracowanych dla każdej z nich pożywkach, z zachowaniem specyficznych warunków fizycznych środowiska hodowlanego, a w następnym etapie wyodrębnieniu wytworzonego enzymu. Jeśli enzym jest nagromadzany pozakomórkowo, to można go wyodrębnić z podłoża pohodowlanego na drodze wirowania lub filtracji. Filtrat lub supernatant poddaje się ogólnie stosowanym proce- durom wydzielania i oczyszczania białek. Jeśli zanieczyszczenia zawarte w preparacie nie działają ujemnie na własności katalityczne enzymu oraz nie stanowią toksykologicznego zagrożenia dla konsumenta nie zachodzi konieczność poddawania ich skomplikowanym i drogim procesom oczyszcza- nia. W dużej mierze przeznaczenie enzymu decyduje o stopniu czystości jego handlowych preparatów. Ogólnie biorąc, preparaty enzymów wykorzystywane dla celów analitycznych charakteryzują się najwyższą czystością (niekiedy są one homogennym białkiem enzymatycznym). Również enzymy stosowane w farmacji posiadają wysoką czystość. Natomiast te same enzymy przeznaczone dla przemysłu spożywczego nie wymagają już tak wysokiego stopnia czystości. Dla niektórych technologii nie muszą być nawet wyjaławiane. Coraz częściej dla konkretnego procesu wytwarza się specjalnie przeznaczony preparat enzymu, dobierając jego aktywność tak, aby dodana ilość wynosiła 0.05-0.5 % na kg substratu.

65


Tabela 1 Mikroorganizmy używane dla produkcji enzymów (adaptowane z Gacesa i Hubble, 1987). Grupa A Mikroorganizmy tradycyjnie używane w produkcji żywności (nie wymagające testowania)  Bacillus subtilis (włączając szczepy znane jako mesentericus, natto i amyloliquefaciens),  Aspergillus niger (włączając awamori, foetidus, phoenicis, saitoi i usamii),  Asp. oryzae (włączając sojae i effesus)  Mucor javanicus  Rhizopus arrhizus, oligosporus, oryzae  Saccharomyces cerevisiae  Kluyveromyces fragilis, lactis  Leuconostoc oenos Grupa B Mikroorganizmy uważane za nieszkodliwe w żywności (enzymy wytwarzane przez nie, testowane są jedynie pod kątem ewentualnej toksyczności)  Bacillus stearothermophilus, licheniformis, coagulans, megaterium, circulans,  Klebsiella aerogenes

Grupa C

Mikroorganizmy nie włączone do grup A i B (ewentualne stosowanie enzymów produkowanych przez nie w produkcji żywności, wymaga specjalistycznych testów)  Mucor miehei, pusillus  Endothia parasitica  Actinoplanes missouriensis  Streptomyces albus, olivaceus  Bacillus cereus  Trichoderma reesei (T. viride)  Penicillium dimorphosporum, simplicissium, funiculosum

Zwykle handlowe preparaty zawierają od 2 do 10% suchej masy czystego enzymu. Reszta to zanieczyszczenia pochodzące z podłoża hodowlanego (np. inne białka wytworzone przez rosnącą kulturę, niektóre z nich będące również enzymami) oraz celowo dodane stabilizatory, wypełniacze itp. Z aplikacyjnego punktu widzenia istotna jest zwłaszcza wiedza na temat enzymów stanowiących zanieczyszczenie handlowych preparatów. Niektóre z nich mogą bowiem katalizować niekorzystne, uboczne reakcje chemiczne. Niekiedy jednak gotowe preparaty celowo są mieszaniną kilku enzymów (np. preparaty typu "Protogal" przeznaczone dla detergentów, a otrzymywane w oparciu o technologię opracowaną w Instytucie Biochemii Technicznej PŁ zawierają w swoim składzie proteinazę, ŕamylazę i lipazę- wszystkie trzy przydatne w środkach piorących). Przeznaczenie preparatu enzymatycznego określa jego postać końcową. Mogą być one otrzymywane w postaci ciekłego koncentratu lub ciała stałe- go, o różnym stopniu oczyszczenia, ewentualnie z dodatkiem stabilizatorów. Preparaty enzymatyczne w stanie stałym charakteryzują się znacznie wyższą stabilnością od preparatów ciekłych. Te drugie podatne są na działanie drobnoustrojów, a ponadto w środowisku wodnym enzym ulega łat- wiej denaturacji i dodatkowo narażony jest na działanie enzymów proteolitycznych, których obecność w gotowych preparatach (choćby w nieznacznych ilościach) jest dość powszechna. Preparaty stałe enzymu nie powinny być pyliste (z uwagi na możliwość wywołania reakcji alergicznych u pracowników), stąd najczęściej wytwarzane są w postaci granulowanej. Zasadniczym przełomem w biotechnologii było zastosowanie enzymów immobilizowanych. W uogólnieniu, immobilizacją enzymu można nazwać za- biegi umożliwiające wielokrotne jego użycie. Jeden ze sposobów immobilizacji polega na unieruchomieniu enzymu na nośniku. Takie formy enzymów w wielu przypadkach wykazują wyższą stabilność od natywnych enzymów, zarówno w

66


trakcie przechowywania jak i w warunkach samej reakcji bio- chemicznej. Jednakże największa korzyść związana jest z możliwością ich wielokrotnego stosowania, w tym w procesach o charakterze ciągłym (np. w reaktorze o działaniu ciągłym z immobilizowaną izomerazą glukozową produkuje się wysoko fruktozowy syrop). Metody stosowane w immobilizacji enzymów mogą być również wykorzystane w unieruchamianiu komórek zarówno martwych jak i żyjących. Unieruchomione biokatalizatory (enzymy i komórki) są szczególnie obiecujące w zastosowaniu do procesów przetwórstwa żywności. Chemiczne katalizatory nie mogą konkurować z enzymami, chociażby ze względu na przepisy sanitarne obowiązujące w produkcji żywności. Najnowszym kierunkiem badań w tym zakresie jest ko-immobilizacja enzymów, czyli jednoczesne unieruchomienie na wspólnym nośniku dwu lub więcej enzymów przeznaczonych do katalizowania pojedynczego procesu. Cena preparatów enzymatycznych jest bardzo zróżnicowana (od 3 $/kg w przypadku preparatu glukoamylazy przeznaczonego do scukrzania dekstryn, aż do 1 miliona $/kg w przypadku czynnika VIII enzymów trombolitycznych stosowanych w medycynie). Zależy ona od wiele czynników, w tym tak oczywistych jak koszty produkcji (a głównie stopień oczyszczenia enzymu), ale także w dużej mierze zależy od rynkowego zbytu, konkurencyjności i skuteczności działania (ich produktywności w aplikacyjnych warunkach). Ogólnie biorąc, najdroższe są enzymy przeznaczone dla analityki, a najtańsze stosowane masowo w różnych gałęziach przemysłu (tabela 3). Przyjmuje się ponadto, że koszt aplikacyjny enzymów przemysłowych powinien stanowić 2-4 % kosztów całego procesu, co w pewien sposób determinuje ich cenę. Tabela 2 Wielkość produkcji enzymów i ich cena (adaptowane z Trampera, 1994)

Typ aplikacji Analityka Farmacja Specjalna Przemysł masowy

Wielkość produkcji (tony) 10-3 - 1 1 – 102 1 – 102 102 – 104

Cena ($/kg) 10 – 109 102 – 105 102 – 105 3 – 50 6

Potencjał aplikacyjny enzymów tkwi w specyficzności i ich katalitycznej wydajności, przy czym działają one w umiarkowanych warunkach pH, temperatury i ciśnienia zapewniając wysoką wydajność nawet w skomplikowanych reakcjach lub ich ciągach. Jednakże z aplikacyjnego punktu widzenia dla każdego konkretnego procesu i enzymu w nim biorącego udział konieczna jest skojarzona optymalizacja temperatury, pH środowiska reakcyjnego, stężenia reagentów oraz innych parametrów technologicznych. Niepowodzenia napotykane niekiedy w stosowaniu enzymów w krajowych technologiach, o których się nieraz słyszy, wynikać mogą z niepełnej wiedzy o właściwościach samych enzymów, ich preparatów lub procesach, w których biorą udział.

67


ROZDZIAŁ 3. BIOCHEMIA GENÓW

DNA

RNA Nukleotyd H3PO4

H3PO4 Nukleozyd

ryboza

deoksyryboza zasady purynowe i pirymidynowe

5'

N3 2

4 1

N1

5

2

6

6 3

N 7

5 4

N

C 4'

9 8

H

N H puryna

N pirymidyna

O

HOH2C

H 3'

C

OH

5'

OH

C 4'

1' C

H

2'

H

H

C OH

OH

O

N H cytozyna

O

N H uracyl

O

N N H

adenina

tymina

68

2'

3'

C

C

1' C

H

H

N

N N

N H

H

OH

NH2 CH3

N

H

D-deoksyryboza

OH

N

N

OH

OH

D-ryboza

NH2

O

HOH2C

H2N

N N

N H

guanina


Biochemia ma olbrzymie znaczenie praktyczne dla wielu dziedzin życia codziennego, w tym również w przemyśle spożywczym. Powstały nowe gałęzie przemysłu spożywczego oparte na osiągnięciach biochemii (m.in. biotechnologia). Wielka rola przypada biochemii w unowocześnianiu procesów technologicznych przemysłu spożywczego oraz w opracowaniu nowych metod przeróbki surowców (a zwłaszcza wykorzystania enzymów). Dzięki temu udaje się zredukować do minimum różnorodne straty zarówno ilościowe, jak i jakościowe, wynikające z procesów niepożądanych dla technologii.

69


70


PISMIENNICTWO Stryer L.: Biochemia, PWN, W-wa 1986 Gacesa P., Hubble J.: Enzyme technology. Open University Press, 1987. Chaplin M.F., Bucke C.: Enzyme technology. Cambridge University Press, 1990. Chmiel A., Biotechnologia, PWN, W-wa 1991 Murray R.K., Granner D.K., Mayes P.A., Rodwell V.W.: Biochemia Harpera, Wyd. Lekarskie PZWL, W-wa 1994 Tramper J. W: Applied Biocatalysis. ed.by Cabral J.M.,Best D.,Boross L., and Tramper J., Harwood Ac. Publish., 1994, s.1-45 Galas E.: WiadomoĹ&#x203A;ci chemiczne (1984), 11, 11-30 Galas E., Trzmiel T.: Kosmos (1989), 38, 15-24

71


Dodatek S S

Lip<

O

NH2

CONH2 N

+ N CH2O OH

P

HO

N

H3C

N N CH2

N

OH (

OH

CHOH CH2O

)

P

dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD) i jego fosforan (NADP)

(

)n H

Enzym-NH

CH2 C CH2 CH2 CH2 CH2 CH

O

CH3

adenozyna

P

P

dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD)

O

H3C

O

CHOH CHOH

O

H3C

NH

N

N O

OH2C

P

H3C

CH2 S

O

S

liponian NH2

ubichinon (Q) N HOOC CH2 CH2 HC

CH3

CH2 CH2

CH

N

CHNH2 COOH

CH3

HOOC CH2 CH2 N

Fe+3

CH3 S CH2 +

N

HC CH

N O

OH

N

N

OH

adenozynometionina

CH

H3C

N

CH2

CH

OH

CH3

CH2

N

hemina (porfiryna)

H2N

N

H N

O CH2 NH

COOH

C NH CH CH2

N H

CH2 COOH

kwas tetrawodorofoliowy (H4folian) O HN

NH

S

C O biotyna H

C

CH2

N

NH-Enzym H3C

N

NH2

S

CH2OH adenozyno-5`-fosforan

H3C

CH3 CH2 CH2 O

P

P

difosfotiamina (DPT)

O

HO

+ N

N

P

P

CH3 O O CH2 C CH C NH CH2 CH2 SH CH3OH

pirydoksal

koenzym A (CoA-SH)

72


#_Skrypt_Biochemia_czesc4