Issuu on Google+

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS CENTRO DE BIOCIENCIAS LICENCIATURA DE INGENIERO BIOTECNÓLOGO

UNIDADES DE HABILITACIÓN DE TALLER EXPERIMENTAL II

CUERPOS ACADÉMICOS BIOTECNOLOGÍA

DE Y BIOTECNOLOGÍA AVANZADA

TAPACHULA, CHIAPAS, MÉXICO. 2009

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS CENTRO DE BIOCIENCIAS

CenBio UNACH


LICENCIATURA DE INGENIERO BIOTECNÓLOGO

UNIDADES DE HABILITACIÓN DE TALLER EXPERIMENTAL II

PROFESORES RESPONSABLES: MC. JOSÉ ALFREDO VÁZQUEZ OVANDO


CONTENIDO

Normas de laboratorio UH 1 UH 2

El cuestionario (dos sesiones) El microscopio Tinciรณn de organismos

UH 3 UH 4 Curva de calibraciรณn UH 5 UH UH UH UH

6 7 8 9

UH 10

Propiedades coligativas Cรฉlulas en divisiรณn: tinciรณn de cromosomas Identificaciรณn de grupos funcionales Extracciรณn e identificaciรณn de alcaloides Tranesterificaciรณn de รกcidos grasos: producciรณn de metilesteres y evaluaciรณn de sus propiedades (hasta tres sesiones) Cuantificaciรณn de polifenoles totales


NORMAS DE LABORATORIO


Unidad de habilitación 1. El cuestionario

El cuestionario es la herramienta de colecta de datos más empleada en la investigación (sobre todo con fines cualitativos), auxiliada de la entrevista, resulta de bajo costo y puede ampliarse tanto como los recursos humanos lo permitan. El cuestionario puede definirse como un instrumento utilizado para la colecta de información, diseñado para poder cuantificar y universalizar la información y estandarizar el procedimiento de la entrevista. Su finalidad es conseguir la comparabilidad de la información, es por esto que muchas veces se refiere a los cuestionarios como instrumentos o escalas de medida.

Objetivos: conocer los elementos de un cuestionario y de una entrevista, construir un cuestionario, aplicarlo a una población y analizar la información surgida de éste.

Materiales y métodos (dos sesiones) Previo a la entrada a esta sesión deberá mostrar haber revisado información referente al cuestionario (definiciones, tipos, elaboración). En la sesión se hará una discusión guiada para consensuar con el grupo en los puntos antes mencionados. Posteriormente en grupos de 4 integrantes, definirá un objetivo para la aplicación de un cuestionario, seleccionará un tema de interés en biotecnología y redactará el cuestionario. Recuerde durante su redacción los comentarios hechos en la sesión y por si alguno faltara, considere: • Utilizar preguntas breves y fáciles de comprender • No emplear palabras que induzcan una reacción estereotipada • No redactar preguntas en forma negativa • Evitar lo más posible el uso de la interrogación ¿por qué? • No formular preguntas en las que una de las alternativas de respuesta sea tan deseable que difícilmente pueda rehusarse • Evitar preguntas que obliguen a hacer cálculos o esfuerzos de memoria


En el tiempo restante para culminar la sesión de taller y el resto del día, en su caso, aplique su cuestionario, procese la información y elabore una presentación de los mimos. La sesión siguiente presente dicho informe ante el profesor y sus compañeros.

Unidad de habilitación 2. El microscopio

La invención del microscopio revolucionó el avance y quehacer de las ciencias biológicas, al convertirse en aquel momento, si bien no el único, si en el principal instrumento, para el estudio de la célula. El microscopio compuesto es un tubo provisto de dos lentes dispuestas de tal modo que amplían sucesivamente la imagen del objeto, el cual está intensamente iluminado. El aspecto más importante a considerar cuando se emplea un microscopio no es el aumento sino el poder de resolución, éste se define como la capacidad de distinguir como imágenes distintas dos puntos que se encuentran entre sí muy cercanos. De forma “gruesa”, las partes que componen un microscopio son: sistema óptico, de iluminación y mecánica. Dentro de los procesos que se utilizan en microscopía óptica y que tienen como función mejorar la resolución son: fijación, inclusión, corte y tinción, éste último paso, aumenta el contraste de la muestra y los colorantes a emplear dependen de los diferentes componentes tisulares que se requieren observar.

Objetivo: que el alumno pueda conocer y manejar el microscopio óptico, estereoscopio, además conocerá técnicas para mejorar la resolución al observar muestras.


Materiales y Métodos Previo al ingreso a la unidad de habilitación, el alumno deberá hacer una revisión bibliográfica acerca de los componentes del microscopio, los cuidados y las principales técnicas de tinción. El profesor realiza una instrucción comentada de las partes del microscopio y del estereoscopio. Los alumnos intervienen para reforzar el aprendizaje. Se comenta acerca de las técnicas de iluminación. Explorar el uso del instrumento con muestras diversas como un cabello, un fragmento de vidrio, insectos, una gota de agua y otros. Debe tener especial cuidado de atender las instrucciones recién comentadas acerca del uso y cuidados de los instrumentos. Empiece siempre observando con el objetivo de menor aumento, contraste con la iluminación y al usar el objetivo 100X no olvide emplear aceite de inmersión.

Cortar fragmentos del catáfilo de cebolla y colocar en tres portaobjetos un fragmento de aprox. 1 cm2. Agregar a cada portaobjetos, una gota de agua, una gota de lugol y una gota de azul de metileno, cubrir con cubreobjetos evitando la formación de burbujas y observar al microscopio.

Cortar un fragmento de hoja de hawaiana, colocar una capa delgada de esmalte incoloro de uñas sobre el envés de la hoja. Dejar secar el esmalte y después adherir sobre éste un segmento de diurex para retirarlo de la hoja y montarlo sobre un portaobjetos limpio y seco. Observe con los diversos objetivos, anote y comente sus observaciones. Para enriquecer la discusión de su informe revise acerca de la función de los estomas. Unidad de habilitación 3. Tinción de organismos

Como parte complementaria del conocimiento, uso y aplicaciones del microsocopio óptico en esta sesión se repasarán algunas técnicas de tinción de uso cotidiano en las ciencias biológicas para el mejor contraste y visualización de organismos microscópicos como células, hongos y bacterias y algunos otros macroscópicos que requieren de contraste. La principal dificultad para observarlos es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para


distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares. La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son cationes y se combinan con intensidad con los constituyentes aniónicos, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Ejemplos de colorantes aniónicos, los cuales se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo.

Objetivo: emplear técnicas de fijación y tinción de muestras previo a su análisis microscópico.

Materiales y métodos Fijación y tinción de bacterias Colocar una gota de suspensión bacteriana o asada de una colonia sobre un portaobjetos conteniendo una gota de agua. Extender la colonia o gota formando círculos. Dejar secar al aire. Posteriormente fijar con calor suave, para esto pasar el portaobjetos con la capa de células hacia arriba por la parte superior de la flama. Coloque el portaobjetos en un lugar donde pueda escurrir líquidos. Agregue varias gotas con colorante cristal violeta hasta cubrir la preparación, dejar 1 min y retirar el exceso de colorante, lavar. Para estabilizar el colorante agregue unas gotas de lugol, cubra la preparación y deje 1 min. Retire el exceso y lave con agua. Con el portaonjetos inclinado 45º, agregue unas gotas de alcohol para decolorar bacterias gramnegativas y dejar coloreadas a las grampositivas. Finalmente para teñir las gramnegativas use el colorante de contraste safranina siguiendo el mismo procedimiento que con los anteriores. Deje secar, observe al microscopio y haga sus anotaciones. En otro(s) portaobjeto(s) coloque 5 gotas de los colorantes (azul de metileno, eosina, fucsina y rojo congo), un colorante por cada portaobjeto. Coloque la preparación de bacterias o solución bacteriana y mezcle con el colorante formando círculos. Deje secar al aire y no caliente. Observe al microscopio y anote sus observaciones.

Hongos Con la ayuda de un fragmento de cinta adhesiva transparente, tome una pequeña cantidad de colonia fúngica, colocando la cinta sobre la colonia y presionando


ligeramente con un objeto suave, despegue con cuidado y colóquelo sobre un portaobjetos conteniendo una gota de agua. Repita nuevamente esta operación pero en vez de agua emplee colorante azul de lactofenol.

Celulas vegetales Con ayuda de un bisturí, realice cortes transversales de tejido vegetal muy delgados y colóquelos en un vidrio de reloj con etanol al 70% para proceder posteriormente a su tinción. Coloque cada uno de los cortes en un portaobjetos con una gota de agua, agregue a cada portaobjetos las siguientes: a) verde brillante, b) azul de metileno y c) sin teñir, deje los colorantes durante 3 min y enseguida lave el exceso de colorante. Solo para el portaobjetos a) agregue safranina durante 15 segundos y lave el exceso con agua destilada. Seque con ayuda de un papel toalla, cubre la preparación con cubreobjetos cuidando no dejar burbujas y observe al microscopio.

Celulas animales (glóbulos rojos) Con ayuda de una lanceta, pinche su dedo pulgar y coloque sobre uno de los extremos de un portaobjetos una gota de sangre. Realice un frotis con ayuda de otro portaobjetos, deslizando éste sobre la gota a fin de distribuirla uniformemente sobre el portaobjetos. Agregue unas gotas de etanol sobre la capa y espere a que seque para fijar la muestra. Cubra la extensión con unas gotas de hematoxilina y mantenga en ese estado por 15 min, agregue más colorante de ser necesario para evitar la desecación. Lavar con agua destilada y sin secar poner sobre todo el portaobjetos unas gotas de eosina durante un minuto. Retire los residuos de colorante con agua destilada, seque el extremo no teñido y deje secar. Observe al microscopio atendiendo las instrucciones aprendidas y diferencíe entre células blancas y rojas.


Unidad de habilitación 4. Curva de calibración Una curva de calibración es un método estandar para determinar la concentración de cualquier elemento o compuesto. Una definición concreta de curva de calibración (que en realidad es una recta), sería la proporcionada por la IUPAC: “es la representación gráfica de la relación funcional (no estadística) para los procesos químicos de medición, donde se relaciona los valores esperados de los observados (en cifras brutas) o señal de respuesta variable E (y) a la cantidad de analito (x)” (The Goold book, IUPAC, 1997). Para construir una recta de calibrado, el experimentador (hoy Usted), empleará una serie de patrones o diluciones en toda la gama de concentraciones que la técnica analítica puede determinar. Se debe tener cuidado de que estas concentraciones se encuentran en el intervalo de trabajo de la técnica (instrumentos) que están usando, (para nuestro caso, espectrofotómetro). Estas diluciones tendrán una concentración conocida del elemento o compuesto en estudio, las cuales después de hacerse reaccionar mediante la técnica de elección, producirá una serie de lecturas (absorbancia o transmitancia en el espectrofotómetro). Trazando estos puntos (frente a la concentración conocida) en un gráfico, es posible obtener una línea de lectura frente a la concentración de análisis en todo el rango empleado. Así, cuando una muestra de concentración desconocida se ejecuta y muestra una lectura obtenida, el experimentador puede simplemente referirse a la gráfica y por interpolación podrá obtener la concentración. Un método muy socorrido para el ajuste de los puntos a una “recta” es la regresión lineal simple que se basa la más de las veces en el método de los mínimos cuadrados.

Objetivos: construir una curva de calibración para la determinación de un analito “X”, ajustar a la recta mediante regresión lineal simple y determinar la concentración de analito en una muestra problema.

Materiales y métodos Curva de calibración para determinar fósforo total. Para realizar las diluciones de concentración conocida, procederá a diluir 100 veces la muestra proporcionada (solución stock) que contiene 1 mg de fósforo •mL-1, (ésta será la solución de trabajo). Pipetear por triplicado 0.0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 mL de la solución estándar de trabajo en un tubo de ensayo de 10 mL. Diluya cada tubo hasta completar 1 mL con agua destilada. Adicionar a cada tubo, 0.8 mL de sulfato de hidracina al 0.015% y agitar. Posteriormente, adicione 0.2 mL de


molibdato de amonio, tapar y agitar por inversión dos o tres veces. Quitar la tapa y poner en baño de agua en ebullición durante 10 ± 0.5 min, enseguida retire del agua, enfríe a temperatura ambiente y adicione 3 mL de agua destilada. Transfiera a una celda espectrofotométrica seca, mida la absorbancia a 650 nm con el espectrofotómetro ajustado a 0% de absorbancia (100% transmitancia) usando como blanco una celda con agua destilada. Proceda de forma análoga para determinar la concentración de fósforo en la muestra proporcionada por el profesor.

Para su informe: •

Calcule la concentración de fosforo en cada una de las diluciones que realizó

Estime el promedio y la desviación estándar de los tres datos de absorbancia que obtuvo para cada concentración de analito

Grafique cada promedio obtenido la absorbancia de cada estándar contra su contenido de fósforo en mg•mL-1 en papel gráfico

Ajuste los puntos graficados a una recta mediante regresión lineal simple y muestre los cálculos del método empleado (se sugiere mínimos cuadrados)

Muestre la ecuación de la recta y los valores R y R2

Estime y reporte la concentración de la muestra problema que le fue proporcionada

Nota: estos puntos son los requisitos mínimos para su informe

Unidad de habilitación 5. Propiedades coligativas

Las propiedades coligativas de las soluciones son las propiedades físicas que dependen de la concentración de moléculas de soluto o de iones en solución, pero no de la identidad química o tipo de partículas del soluto y se distinguen en: abatimiento de la presión de vapor, elevación del punto de ebullición, depresión del punto de congelación y presión osmótica. La cantidad en que disminuye o aumenta el punto de fusión y de ebullición, al disolver un mol de no electrolito en un kilogramo de disolvente se le denomina constante crioscópica y ebulloscópica respectivamente. La unidad de concentración en que se expresan estas constantes se denomina molalidad.


Objetivo: comprobar que las propiedades físicas de un solvente pueden verse afectadas por la presencia de un soluto y verificar la importancia de la osmosis en un sistema biológico.

Materiales y Métodos: Actividad 1 Prepare en un matraz o vaso de precipitados soluciones de sacarosa (C 12H22O11) en agua destilada de diferente concentración, según el siguiente cuadro:

Concentración de sacarosa (% p/v)

Temperatura inicial (°C)

Temperatura de ebullición (°C)

Temperatura de congelación (°C)

Observaciones

0 20 35

Registre con ayuda del termómetro la temperatura inicial de la solución, posteriormente enfríe la solución colocándola por duplicado al ultracongelador en tubos de ensayo y revise periódicamente hasta la formación del primer cristal de hielo, inmediatamente registre la temperatura (T de congelación). Ponga cada uno de los recipientes en el baño de arena y caliente de forma gradual hasta que observe la formación de la primera burbuja de ebullición, inmediatamente registre la temperatura a la que ocurre. Para su informe calcule la constante ebulloscópica (Ke) y constante crioscópica (Kc) a partir de la temperatura de ebullición y congelación registradas, respectivamente. Para esto recuerde que Ke=ΔT/M y la Kc= ΔT/M. Compare con valores teóricos.

Actividad 2 Prepare 250 de una solución de sacarosa al 60%. Corte 10 fragmentos delgados de fruta (manzana, papaya), de aproximadamente 5 mm de espesor. Pese cada uno de los fragmentos y procure que todos tengan el mismo peso. Coloque los fragmentos en la solución antes preparada, encienda su cronómetro y cada 15 min retire un fragmento de la fruta, enjuague con agua corriente, seque con un papel toalla y pese. Para su informe, grafique el peso en función del tiempo y explique lo que la grafica representa y los fenómenos que ocurren a nivel celular para justificar el comportamiento del peso del vegetal.


Unidad de habilitación 6. Celulas en división: tinción de cromosomas

La mitosis es el proceso de división celular por el cual se conserva la información genética contenida en sus cromosomas, que pasa de esta manera a las sucesivas células a que la mitosis genera. El proceso tiene lugar por medio de una serie de operaciones sucesivas que se desarrollan de manera continua, y que para facilitar su estudio han sido separadas en varias etapas. En la mitosis típica (división celular presente en los organismos superiores animales y vegetales), las etapas son prometafase, metafase, anafase y telofase. El aspecto más relevante en estas fases son los cambios que sufre el material hereditario (cromatina), que es el componente más abundante del núcleo. La cromatina, tanto en el núcleo interfásico como la que forma el cromosoma durante la mitosis, se tiñe con colorantes básicos. Estos procesos revisten de importancia cuando se requiere tener un acercamiento al cariotipo básico de una especie.

Objetivos: observar e identificar el material genético de células en división.


Materiales y métodos Preparación y tinción de células vegetales Coloque una cebolla (Allium cepa) sana en un recipiente con suficiente agua para cubrir 1 cm de la parte inferior de ésta. Mantenga en este estado hasta que las raíces del vegetal tengan un tamaño aproximado de 2 cm (de 3 a 6 días). Con una navaja, corte segmentos muy pequeños (2 mm) de la parte terminal de la raíz, deposítelos en un vidrio reloj, adicione 4 mL o hasta cubrir de orceína A, coloque el vidrio sobre un tripié y asbesto y caliente con flama lenta por un lapso de 8 a 10 min, cuidando que el colorante no ebulla y en caso de requerirse adicione mas colorante. Posteriormente, coloque los fragmentos en portaobjetos, adicione una gota o suficiente colorante orceína B para cubrir el tejido. Se deja actuar por lo menos un minuto, cubra con un porta objeto haciendo una suave presión con una superficie delicada (como la goma de un lápiz), selle la preparación con esmalte para uñas y observe al microscopio.

Preparación y tinción de células animales Se toman huevos fértiles de 24 h de oviposición de moscas de la fruta (Anastrepha ludens) y se extraen las células embrionarias, para esto, cuidadosamente rompa el corión y coloque la masa embrionaria en un vial que contenga 500 µl de ácido acético al 60%. Coloque el tejido en 500 µl de una solución de acido acético:metanol (1:3) por 5 min, después regrese a la solución de acético al 60% y macere el tejido. Coloque una gota de la suspensión en un portaobjetos y sequelo sobre una parilla a no más de 60ºC, posteriormente agregue una gota de HCl 0.1N durante 20 min. Retire el exceso de acido con agua destilada, coloque unas gotas del reactivo de Schiff y mantenga por 30 min. Elimine el exceso de colorante con agua destilada, coloque el cubreojetos y selle la preparación con esmalte para uñas y observe al microscopio.

Para su informe incluya imágenes de las observaciones, así como discusión fundamentada de la identificación de los posibles cromosomas observados.


Unidad de habilitación 7. Identificación de grupos funcionales

En la práctica cotidiana de la investigación en ciencias biológicas es recurrente la necesidad de conocer la naturaleza de las sutancias recién descubiertas, obtenidas o simplemente para verificar supuestos. Para lograr tal objetivo es necesario recurrir a reacciones características de los grupos funcionales de la molécula en cuestión; para esto, la química orgánica nos oferta una serie de reacciones que permiten caracterizar determinados grupos funcionales. En algún caso varios grupos funcionales pueden dar positivo a una misma reacción, por lo que será necesario aplicar alguna otra reacción característica para estar seguros de la naturaleza de los mismos.

Alcoholes Los alcoholes terciarios reaccionan con facilidad con el reactivo de Lucas (ZnCl2/HCl conc), para dar cloruros de alquilo insolubles en agua, mientras que los secundarios reaccionan lentamente, a su vez los primarios permanecen prácticamente inertes. La prueba no es válida para alcoholes arílicos o insolubles en agua. R-OH + HCl + ZnCl2 → R-Cl + H2O La presencia de un alcohol terciario y por tanto la formación del cloruro de alquilo insoluble enturbia la solución, mientas que un secundario o primario, mantiene la solución clara.


Otra característica de los alcoholes primarios y secundarios es su fácil reacción con el acido crómico (formado por la combinación de K2Cr2O7/H2SO4), dando como resultado una suspensión verdosa debido a la formación de Cr (III), mientras que los alcoholes terciarios no dan esta reacción. La presencia de otras funciones fácilmente oxidables como aldehídos o fenoles pueden interferir, ya que también reaccionan con este reactivo (debe considerar esto cuando haga interpretaciones).

Fenoles La mayor parte de los fenoles dan disoluciones vivamente coloreadas (azul, verde, violeta, etc) al hacerlas reaccionar con cloruro férrico. Si el color es amarillo débil, el mismo que el del FeCl3, la reacción se considera negativa. Algunos fenoles no dan coloración, como la hidroquinona, ya que se oxidan con el reactivo a quinona y no da coloración. Los ácidos a excepción de los fenólicos no dan la reacción aunque algunos dan disoluciones o precipitados de color amarillento.

Aldehídos y Cetonas Existen las llamadas reacciones comunes para este par de grupos funcionales, un ejemplo es la formación de 2,4-dinitrofenilhidrazonas al reaccionar con 2,4fenilhidrazina, obteniéndose un precipitado. Los resultados deben interpretarse de acuerdo al color del precipitado, si éste es amarillo es indicativo de un compuesto carbonílico saturado, si se obtiene un precipitado naranja indica la presencia de un sistema α,β-insaturado y un precipitado rojo es indicativo de una cetona o un aldehído aromático. Otra reacción es la combinación bisulfítica, reacción positiva para todos los aldehidos y la mayoría de las cetonas a excepción de las impedidas estéricamente.

Reacciones diferenciadoras de aldehídos a) El ensayo de Tollens se lleva a cabo con el empleo de un agente oxidante suave (reactivo de Tollens), una disolución amoniacal de hidróxido de plata que al oxidar a los aldehídos produce el correspondiente acido carboxílico y los iones plata se reducen de forma simúltanea a plata metálica, formando un espejo que se deposite en el tubo de reacción. Las cetonas no dan esta reacción, excepto las hidroxicetonas y las dicetonas 1-2, que son reductoras y algunos compuestos nitrogenados como las hidrazinas, hidroxilaminas, aminofenoles, que no están comprendidos en este grupo, por lo que no interfieren.


b) El ensayo de Fehling se basa en la reacción de oxidación empleando como oxidante el ión cúprico en medio alcalino, la formación de un precipitado de oxido cuproso (rojo) indica la presencia de un aldehído.

Reacciones diferenciadoras de cetonas Existe una prueba que se utiliza para identificar metilcetonas y se ha denominado la prueba del yodoformo. Si se coloca una solución alcalina de I 2, en la presencia de una metilcetona los productos que se generan son un carboxilato y el yodoformo. Este último compuesto es un sólido amarillo que precipita en el medio de reacción, por lo que es muy fácil de detectar al momento de realizar el experimento. Consiste en la ruptura del compuesto carbonilo por el enlace metil-carbonilo y la oxidación posterior a ácido carboxílico. I2 + NaOH → IO3H + INa R-CO-CH3 + 3I2 + 4NaOH → CHI3 + RCOONa + INa + H2O Aminas Al hacer reaccionar una amina aromática con una disolución de de 2 - naftol en medio alcalino, se forma un precipitado que puede ser de color rojo o naranja del colorante azoico. Objetivo: que el alumno pueda identificar las muestras proporcionadas mediante reacciones características de los grupos funcionales además de comprender y explicar los fenómenos ocurridos. Materiales y métodos Basado en la información proporcionada en la parte introductoria de esta unidad de habilitación podrá llevar a cabo las siguientes reacciones, para cada una de las muestras proporcionados por el profesor-facilitador: Identificación de Alcoholes Reacción de Lucas. Tomar 0.5 mL del alcohol sospechado o muestra en un tubo de ensayo o 500 mg si la muestra es sólida, añadir 3 mL del reactivo de Lucas. Cerrar el tubo y agitar durante 15 segundos. Interprete el resultado. Oxidación con ácido crómico. En un tubo de ensayo coloque 2 mL de reactivo, enseguida añada de 5-10 gotas del alcohol o muestra. Agite la mezcla, anote su resultado y haga la correspondiente interpretación.


Identificación de Fenoles Deposite 1 mL de la solución problema en un tubo de ensayo y añada 10 gotas de una disolución de FeCl3 al 2,5% y agite. En otro tubo de ensayo coloque 1 mL de agua destilada y agregue la misma cantidad de cloruro férrico (blanco), agite. Compare inmediatamente después de completada la reacción la coloración obtenida de su problema contra el blanco. Anote su resultado e interprételo. Nota: Elcolor obtenido en la prueba puede que no sea permanente. Identificación de Aldehídos y Cetonas Formación de 2,4-dinitrofenilhidrazonas (ensayo de Brady). A un tubo de ensayo conteniendo 1 mL del reactivo 2,4-dinitrofenilhidrazina añada de 2-5 gotas de su muestra problema y agite de forma vigorosa. La aparición de un precipitado aunque no sea de forma inmediata denota presencia de grupos carbonilo. Combinación bisulfítica. Prepare una mezcla a partir de 1 mL de solución saturada de bisulfito sódico y 10 gotas de la muestra problema (tantas veces como muestras problema tenga). Agite vigorosamente la mezcla y anote la presencia/ausencia de precipitado. Ensayo de Tollens. En un tubo de ensayo coloque 2 seguida añada 10 gotas de la muestra problema problema posea), agite y caliente en baño maría en enfriar, realice sus anotaciones e interpretaciones. Nota: en caso de formarse un espejo de plata en el diluida de acido nítrico.

mL del reactivo de Tollens, en (tantas veces como muestra ebullición durante 1 min. Deje tubo, lavarlo con una solución

Ensayo de Fehling. Si el facilitador no lo ha realizado, prepare 100 mL de una mezcla 1:1 de reactivos A y B de Fehling, respectivamente. En un tubo de ensayo coloque 3 mL del reactivo antes preparado y añada 10 gotas de la muestra problema (tantas veces como muestras problema), caliente en el baño en ebullición durante 2 min, deje enfriar y anote las observaciones. Haga la interpretación de los resultados. Ensayo de yodoformo. En un tubo de ensayo colque 5 gotas de la muestra problema (tantos tubos como muestra problemas), añada 1 mL de agua, 1 mL de NaOH al 10% y el reactivo de lugol gota a gota hasta que persista el color oscuro del yodo. Deje reposar durante algunos minutos, si no observa formación de precipitado caliente en baño a 60º C, durante 5 min, si desaparece el color al calentar, añadir más reactivo lugol. Pasado el tiempo, deje enfriar durante 10 min, realice las observaciones y anote sus interpertaciones. Nota: también dan positivo a esta reacción el acetaldehido y aquellos alcoholes que por oxidación puedan formar metil-cetonas. Identificación de Aminas Ensayo con 2-naftol para aminas primarias. Coloque 10 gotas de la muestra problema en un tubo de ensayo y añada 2 mL de la disolución de 2 - naftol en sosa al 5. Agite la mezacla, deje reposar y anota sus observaciones. Al finalizar todas las reacciones, trace en su bitácora un cuadro que esquematice y exprese los resultados obtenidos, interprete y compare en el pizarrón con los


obtenidos por los demás compañeros. Para su informe comparativo con las justificantes de los aciertos y desaciertos.

incluye

el cuadro

Unidad de habilitación 8. Extracción e identificación de alcaloides Los alcaloides son sustancias orgánicas nitrogenadas generalmente con características básicas y primordialmente de origen vegetal, en los cuales se producen como metabolitos secundarios derivados de aminoácidos, terpenos o acetogeninas; tienen estrucuras químicas complejas, lo que hace que ejerzan diferentes acciones fisiológicas. Se encuentran en mayor concentración en las gimnospermas, especialmente en las dicoteledoneas; los tejidos donde se localizan son corteza, raíces, hojas frutos y semillas en donde cumplen funciones de defensa contra insectos, productos de reserva nitrogenada o de excresión. Los alcaloides pueden extraerse con solventes orgánicos apolares bien sea en medio alcalino, neutro o ligeramente ácido; pueden ser cualitativamente identificados con reactivos específicos y pueden ser fraccionados por diversos métodos de separación


de biomoléculas como por ejemplo mediante una cromatografía de capa fina, cuyo método es el más ampliamente utilizado. Objetivo: extraer alcaloides vegetales y verificar su presencia con reactivos característicos. Materiales y métodos Pese aproximadamente 2 g de hojas de alguna planta que sospecha puede contener alcaloides. Macere las hojas hasta obtener una pasta, posteriormente adicione en un recipiente 25 ml de cloroformo, mantenga esta mezcla durante 30 min y agite cada cinco. Cromatografía en capa fina. Para preparar su fase estática, corte una cromatoplaca de 2 X 8 cm (10 g de gel de sílice G, 10 g de yeso y 10 mL de agua destilada) y marque con grafito a un centímetro de uno de los extremos una línea la cual será su marca de corrida. Con ayuda de una cánula o microtubo tome unas gotas del extracto recién preparado y deposite de dos a tres gotas sobre la marca de corrida, seque su cromatoplaca a temperatura ambiente. Utilice como fase móvil acetona, corra su cromatoplaca y revele con reactivo de Draggendorff. Prepare como control positivo un extracto de tabaco y compare con las bandas obtenidas. Adicionalmente realice pruebas con su extracto en tubo agregando los reactivos de Dragendorff, Mayer, Wagner y FeCl3.


Unidad de habilitación 9. Transesterificación de acidos grasos: producción de metilesteres. La producción de biocombustibles por diversas vías es una de las áreas de la investigación que más fuerza ha cobrado en los últimos años. La transesterificación de los acidos grasos de aceites vegetales o grasas animales para producir metil o etil ésteres (comúnmente llamado biodiesel) oferta algunas ventajas sobre otras formas de producir energía, siempre enmarcada en un ambiente de autosufiencia. Para lograr la ruptura de los acidos grasos y el glicerol puede recurrirse a una reacción química o catalizada por una enzima (producto el cual sería el verdadero biodiesel), en la figura 1 se muestra la reacción catalizada por una base fuerte produciendo los consecuentes acidos grasos que después de reaccionar con los grupos metilo formaran los metiléstres o “biodiesel”, el cual asemeja el


comportamiento como combustible al diesel de petróleo, pero con menores efectos adversos después de su combustión.

Figura 1. Esquema general del proceso de producción de metilésteres catalizado por una base fuerte

Objetivo: producir metilésteres a partir del aceite vegetal o grasa animal y comprobar las características del producto obtenido. Materiales y métodos (dos sesiones) NOTAS PREVIAS: Usar equipo de seguridad: bata, googles, mascarilla antigases y guantes de hule, ya que los reactivos que empleará y los que se producirán resultan tóxicos o peligrosos, p. ej, el metanol es un reactivo peligroso que causa daño por inhalación o absorción a través de la piel y el metóxido que se formará es un radical sumamente corrosivo. Medir 100 mL de metanol en una probeta de vidrio graduada y verterlo en una botella de vidrio de 500 mL con boca angosta. Pesar 1.75 g de NaOH sobre un vidrio de reloj (hacer este paso rápidamente para evitar que se hidrate) y añadirlo a la botella con metanol, cuidadosamente. Poner un tapón de hule al frasco y mezclar agitando hasta disolución completa. Medir 500 mL de aceite vegetal y vaciarlo en un recipiente de vidrio o vaso de ppdo de 1 L de capacidad. Añadir un magneto en el interior y poner sobre una parrilla agitadora/calentadora. Calentar el aceite a 50º C y estabilizar a dicha temperatura monitoreando con un termómetro (por lo menos durante 15 min). Mientras agita el aceite, añadir poco a poco el metóxido y mezclar completamente. Mantener la mezcla en agitación y a 50º C durante 8horas, transcurrido este tiempo, apague la agitación, etiquete y deje en reposo. Nota: Guarde suficiente aceite o grasa (300 mL) para realizar las pruebas comparativas con el producto que obtendrá. Sesión 2 La reacción de transesterificación se verifica observando la formación de dos fases: una ligera y clara (que contiene los metil ésteres de los ácidos grasos), y una densa y de color más oscuro (que contiene glicerol). Separar las fases por decantación o por sifoneo con una bomba peristáltica. La fase densa o glicerol será considerada un producto secundario que deberá etiquetarse y almacenarse en un frasco de vidrio con tapa. La fase ligera o metil ésteres serán el producto principal y, debido a que contiene muchas impurezas (restos de metanol, jabón que pudo formarse en el proceso, restos de NaOH sin reaccionar, etc.) deberá lavarse con agua destilada. Para el lavado, mezcle partes iguales de metil ésteres con agua destilada en un embudo de separación. Agite y espere a que se separen las fases. Elimine la fase densa (agua) y repita la operación de lavado.


Coloque los metil ésteres en un recipiente de vidrio o plástico limpio y etiquete correctamente. Sesiones 2 y 3 Haga pruebas de calidad al biodiesel y compare los mismos parámetros con el aceite vegetal del cual obtuvo el biodiesel, por lo menos lso siguientes paramétros:  pH (que deberá estar cercano a 7.0)  flash-point o punto de ignición (deberá ser cercano a 150º C)  viscosidad (por el método del descenso de la esfera aplicando la ecuación de Stokes) Reporte los resultados en el formato acostumbrado.

Unidad de habilitación 10. Cuantificación de polifenoles totales Los polifenoles son un grupo de sustancias químicas orgánicas que se caracterizan por la presencia de más de un grupo fenol por molécula. Los polifenoles son generalmente subdivididos en taninos hidrolizables, que son ésteres de ácido gálico de glucosa y otros azúcares; y fenilpropanoides, como la lignina, flavonoides y taninos condensados. Estas moléculas se encuentran distribuidas ampliamente en las plantas terrestres y acuáticas y han despertado mucho interés, pues se ha demostrado que se encuntran involucradas en procesos de respuesta de las plantas al estrés debido a intoxicaciones, variaciones bruscas de temperatura o al ataque de microorganismos o insectos. Se ha atribuido además un sinmunero de efectos beneficos cuando son consumidos por el hombre ya que se ha reportado participan


en la reducción del daño celular por efecto de radicales libres. Por ejemplo los flavonoides, un grupo de compuestos fenólicos se sabe participan en el atrapamiento de radicales libres, inhibición de enzimas hidrolíticas y oxidantes y que poseen actividad antiinflamatoria. Ejemplos de alimentos que se ha reportado poseen compuestos fenólicos son bebidas como el vino, té, frutas o salvado de algunos cereales como el sorgo. Objetivo: extraer y ciantificar los compuestos fenólicos de muestras diversas. Materiales y métodos Primeramente se realizará la extracción de los compuestos fenólicos totales mediante la combinación de los métodos sugeridos por Jiménez-Escrig y col. (2003) y Cannac y col. (2007). Coloque un gramo de muestra molida y tamizada a través de malla de 1 mm en un matraz de 125 mL y adicione 10 mL de solución metanol:agua (1:1) acidificada a pH 2 con HCl. Ponga el matraz en agitación constante por 12 h. Posteriormente adicione 10 mL más de la misma solución y deje por 12 h más. Transcurrido este tiempo filtre a través de papel filtro la solución obtenida; puede conservar esta solución en refrigeración hasta la determinación. El extracto antes obtenido, se empleará para medir el contenido de polifenoles totales con el reactivo de Folin Ciocalteu de acuerdo al método sugerido por Pourmorad y col. (2006) con una ligera adaptación en el volumen. Del extracto obtenido tome 10 µL y diluya a 50 µL con la solución de metanol:agua (1:1) pH 2 que empleo antes. Posteriormente adicione 500 µL del reactivo de Folin Ciocalteu (diluido 1:10 con agua destilada) y 400 µL de una solución acuosa de Na 2CO3 1M. Deje la mezcla durante 15 min en la oscuridad, transcurrido este tiempo lea la absorbancia de la solución por espectrofotometría a 765 nm usando como blanco la solución metanol:agua (1:1) de pH 2. Para conocer la concentración de su muestra, prepare una curva estándar de ácido gálico usando soluciones de concentraciones 0, 50, 100, 150, 200, 250 mg∙L -1 en metanol:agua. Los valores de polifenoles totales se expresan en términos de equivalentes de ácido gálico (mg∙g-1 de muestra). Presente en su informe la curva de calibración que construyó, así como los valores de la pendiente, R y los resultados de las concentraciones de polifenoles totales de la muestra que trajo.


DIRECTORIO Dr. Ángel René Estrada Arévalo RECTOR Mtro. Hugo Armando Aguilar Aguilar SECRETARIO GENERAL Dr. Carlos Eugenio Ruiz Hernández SECRETARIO ACADÉMICO C.P. Juan Guillermo Gutiérrez SECRETARIO ADMINISTRATIVO Dr. Roberto Villers Aispuro DIRECTOR GENERAL DE PLANEACIÓN Dr. Fernando Álvarez Simán DIRECTOR GENERAL DE EXTENSIÓN UNIVERSITARIA Mtro. Lorenzo Franco Escamirosa Montalvo DIRECTOR GENERAL DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO Dr. Miguel Salvador Figueroa DIRECTOR DEL CENTRO DE BIOCIENCIAS


Taller 2