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Scientific Journal of Frontier Chemical Development

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MTT法检测汉防己碱对人肺癌A549细胞增殖的抑 制作用 蒋心惠1,滕永真2,黄开顺2,周岐新1* 1.重庆医科大学药学院,重庆市 400016 2.重庆医科大学生命科学院,重庆市 400016

要:目的-探讨汉防己碱对人肺腺癌细胞株A549细胞生长增殖的影响及汉防己碱能否有效用于肺癌患者的治疗。方法-采

用噻唑蓝(MTT)比色法检测肺腺癌细胞株A549细胞增殖的状况。结果-汉防己碱对A549细胞株的IC50分别为:8.57 g/mL, 24 h; 6.25 g/mL, 36 h; 4.43 g/mL, 48 h。结论-不同浓度的汉防己碱对肺腺癌细胞A549增殖有抑制作用,呈明显的时效和量效关系。 汉防己碱在体外可有效抑制肺癌细胞A549的生长。

关键词: MTT法;汉防己碱;肺腺癌细胞株A549

Inhibitation of A549 Cells Induced by Tetrandrine with MTT Assay 1

2

2

Xinhui Jiang , Yongzhen Teng , Kaishun Huang , Qixin Zhou

1*

1 Pharmacy school, Chongqing Medical University,Chongqingshi,400016 2 Life Sciences, Chongqing Medical University,Chongqingshi,400016

Abstract: Objectives—To study the ability of tetrandrine to inhibit the human lung adenocarcinoma A549 cell and whether tetrandrine can be used in lung cancer patients’ chemotherapy. Methods—MTT method was used to detect the effects of tetrandrine in inhibiting the grouth of A549 cells. Results—The IC50 of tetrandrine to A549 were 8.57 μg/mL for 24 h, 6.25 μg/mL for 48 h and 4.43 μg/mL for 48 h, respectively. Conclusion—The inhibition ratio of tetrandrine on lung adenocarcinoma A549 cells increased with the concentration of tetrandrine and it showed significant time and dose-effect relationships. Tetrandrine in vitro can inhibit the growth of A549 lung cancer cells effectively.

Key words: MTT; Tetrandrine; Lung Adenocarcinoma A549 cell 汉防己碱(tetrandrine, Tet)是从中草药防己的根块中提取的双苄基异喹啉类生物碱,又称倒地拱素、粉防己碱、 汉防己碱甲素,为一种具有氧桥的双分子苯甲基异喹啉生物碱,是中药汉防己的主要有效生物碱成分。分子式 C38H42N2O6,其结构如图1所示。Tet为白色针状结晶,熔点215~218℃;不溶于水、石油醚,溶于乙酸乙酯、乙 醚和甲醇等有机溶剂。现代药理研究证实Tet具有降压、抗心肌缺血及再灌注损伤、抗心律失常等心血管系统作用, 拮抗Ca2+ 通道,抗炎及免疫抑制,抗矽肺,抗糖尿病,抗自由基损伤和抗肿瘤等广泛的药理作用。许多研究认为粉 防己碱是一种有前途的抗癌药物,可以抑制多种肿瘤细胞的生长。我们采用MTT法观察了汉防己碱对肺癌细胞A549 增殖的影响,为探讨汉防己碱抗肿瘤细胞作用机制以及抗肿瘤作用的应用和开发提供了依据 [1-4]。

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材料与方法

1.1 药物与试剂 汉防己碱(Tetrandrine)购自西安飞达生物技术有限公司,RPMI-1640培养液(hyclone,北京赛默飞生物技术有 限责任公司),噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(均为美国GIBCO公司产品)、小牛血清(杭州四季青生物工程材 料有限公司产品),0.25%胰酶、体积分数为2%台盼蓝染液、PBS缓冲液(均为Sigma公司产品)。

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1.2 细胞 人肺癌细胞株A549,由重庆医科大学生命科学院提供。

图1 Tet的化学结构

1.3 仪器和器材 台式高速离心机,恒温水浴箱,低温冰箱,高压灭菌锅,微量加样器,恒温二氧化碳培养箱,超净工作台,高 温烤箱,倒置显微镜,酶联免疫测定仪(BIO—RAD),96孔板离心机(SIGMA一4K15),96孔板(美国COSTAR 3599) 等。

1.4 实验方法 1.4.1 溶液配制 汉防己碱储备溶液的配制方法:称取汉防己碱40 mg置于10mL量瓶中,加入5 ml的磷酸盐缓冲液(PBS),用 盐酸调节至pH1使汉防己碱充分溶解,补加磷酸盐缓冲液(PBS)至刻度,用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌, 放4℃冰箱保存备用。 汉防己碱工作液的配制方法:分别准确吸取汉防己碱储备液适量,加入RPMI-1640培养液至刻度,摇匀,即得 不同浓度的工作液。 MTT溶液的配制方法:称取MTT 0.5克,溶于100 ml的磷酸缓冲液(PBS)中,用0.22μm滤膜过滤以除去溶液 里的细菌,放4℃避光保存。注意:在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住。实验时关闭超净台上的日光 灯来避光。 1.4.2 汉防己碱对 A549 的抑制作用 (1)细胞培养:A549细胞株常规方法培养。培养条件:加10%小牛血清的PRMI-1640培养液,相对湿度94%,5% CO2,37 ℃,细胞浓度为2×1065mL传代。 (2)细胞处理:肺癌细胞株A549用常规方法培养,实验时收集对数生长期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入 100ul,铺板使待测细胞密度1000-10000/孔,(边缘孔用无菌PBS填充)。5%CO2,37℃孵育,至细胞单层铺满孔底, 加入浓度梯度(10.00、7.50、5.00.3.75 g/mL)的汉防己碱溶液,每孔100uL,设3个复孔。继续培养24 h、36 h和48 h 后,每孔加入20L MTT溶液,继续培养4 h。然后终止培养,小心吸去孔内培养液。每孔加入150L 二甲基亚砜, 置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。用酶联免疫检测仪(测定波长492 nm )测定每孔的吸光(OD)值,同时 设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚 砜)。计算各组细胞的生长抑制率。生长抑制率=[(对照组平均OD值-实验组平均OD值)/对照组平均0D值]×100%。

1.5 统计学处理 依据如下公式计算IC50的值:IC50=lg-1[Xm-i(ΣP-0.5)],重复4次,取平均值。Xm:设计的最大浓度的对数值; i:各浓度倍比浓度的对数值;ΣP:各组生长抑制率之和;0.5:经验常数。

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结果

2.1 汉防己碱对A549细胞的生长抑制作用 MTT法测定的结果见表1。 表 1 汉防己碱对 A549 细胞生长抑制作用(n=3) Time(h)

concentration (g/mL)

Inhibition(%)

24

10.0

60.23

7.50

22.33

5.00

14.47

3.75

6.22

10.0

68.96

7.50

46.53

5.00

28.60

3.75

19.80

10.0

74.56

7.50

59.42

5.00

55.45

3.75

35.94

36

48

IC50(g/mL)

RSD(%)

8.57

3.56

6.25

2.57

4.43

3.97

由表1可知汉防己碱对A549有抑制作用,并呈剂量依赖性。汉防己碱作用于A549细胞24、36、48 h的IC50分别 为:8.57 mg/L、6.25 mg/L和4.43 mg/L。 从结果中可以看出:不同浓度的汉防己碱对肺腺癌细胞A549增殖有抑制作用,且呈明显的时效和量效关系。汉 防己碱在体外可有效抑制肺癌细胞A549的生长。

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讨论 四唑盐(MTT)比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使

外源性的MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。 二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在492nm波长处测定其光吸收(OD)值,可间 接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因 子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 本实验以MTT法检测观察汉防己碱对A549细胞株的细胞毒作用,结果表明,汉防己碱对A549细胞增殖有明显 抑制作用,不同浓度汉防己碱对A549细胞增殖呈现出不同程度的抑制作用,随作用时间的延长抑制作用逐渐增强, 呈现一定的时效和量效关系。以上结果提示汉防己碱有直接抑制肿瘤细胞生长的效果,为汉防己碱抗肿瘤作用的临 床应用和新药开发提供了一定依据。 参考文献 [1]

张岱州,李洁,佟全胜.MTT法检测白头翁对人肺巨细胞癌细胞株PG细胞增殖的抑制作用[J].生物医学工程研究,2010,29(1):71-72.

[2]

徐慧敏,张仲苗,徐彩菊.MTT法研究化疗药对人胃癌细胞株(SGC-7901)的抑制作用[J].肿瘤学杂志,2008,14(11):910-912.

[3]

周林,艾中立,刘志苏等.复方苦参水溶液体外对人结肠癌细胞SW480的影响[J].癌症,2000,19(4):337-340.

[4]

田春桃,韩利艳,范慧娟.奥曲肽对人肺癌细胞株A549的增殖抑制作用[J].郑州大学学报(医学版),2008,43(1):139-141.

【作者简介】 蒋心惠(1971-) :女,汉,博士,副教授,从事肿瘤药理学和生物药物分析。E-mail:jiangxinhui3@hotmail.com。 周 岐 新 (1947-) : 通 讯 联 系 人 , 男 , 汉 , 硕 士 , 教 授 , 博 导 , 主 要 从 事 肿 瘤 药 理 学 和 受 体 药 理 学 研 究 。 E-mail:cqzhouqx@yahoo.com.cn。 SJFCD Vol.2 No.1 Mar. 2012 pp.18-20 www.sjfcd.org ©2011 American V-King Scientific Publishing, LTD - 20 -

Inhibitation of A549 cells induced by tetrandrine with MTT assay  

Objective To study the ability of tetrandrine to inhibit the human lung adenocarcinoma A549 cell and whether tetrandrine may be used in lung...

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