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UNIVERSIDAD DE PANAMA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA SECCION DE INMUNOLOGIA

INMUNOLOGIA MÉDICA MEDNH 340

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES TEORICAS Y GUIA DE LABORATORIO

SEMESTRE SEMESTRE

2013


INDICE

1. JUSTIFICACION

3

2. DESCRIPCIÓN

3

3. COMPETENCIAS

4

4. METODOLOGÍA DE ENSEÑANZA-APRENDIZAJE DE TEORÍA Y LABORATORIO

6

5. EVALUACIÒN

6

6. REFERENCIAS

7

7. PROFESORES DEL CURSO Y HORARIOS

8

8. CRONOGRAMA DE TEORIA Y LABORATORIO

8

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


1 1. JUSTIFICACIÓN La Inmunología tiene una historia de 200 años, los que se pueden separaren dos períodos: 1796-1958 y 1959 a la fecha. Este último período se ha caracterizado por importantes avances en el conocimiento del sistema inmune a nivel molecular. En dos siglos de historia de la inmunología se han realizado importantes avances científicos en áreas como la serología, inmunidad celular, inmunología molecular e inmunogenética. Por otra parte, se han postulado y demostrado mecanismos inmunológicos que explican la patogenia de enfermedades como las alergias, las inmunodeficiencias, las gammapatías monoclonales y las enfermedades autoinmunes. Además, se han desarrollado áreas como son la inmunofarmacología, la inmunología del cáncer y la inmunología de trasplante. En Panamá estas patologías tienen una frecuencia de un 10% según las estadísticas del ministerio de salud. Conocer los mecanismos que producen estas patologías es importante para la educación de los estudiantes de la licenciatura de medicina, ya que la inmunología básica es la base de la inmunología clínica. La OMS definió la Inmunología clínica como "una disciplina que trata del estudio, diagnóstico y tratamiento de pacientes con enfermedades causadas por alteraciones de los mecanismos inmunológicos y de las situaciones en las que las manipulaciones inmunológicas forman una parte importante del tratamiento y/o de la prevención". Por estas razones la inclusión de la inmunología básica en el currículo de la licenciatura de medicina de la Universidad de Panamá es importante para el adecuado proceso de enseñanza – aprendizaje - creación. 2. DESCRIPCIÓN Con el objetivo de adquirir y aplicar los conocimientos generales, teóricos y prácticos de inmunología básica, se han escogido los temas de mayor importancia, que le darán al estudiante una panorámica sobre la importancia de la Inmunología como asignatura base para el diagnóstico de enfermedades relacionadas con este sistema. En el módulo I. Principios de inmunología básica. Se explica los conceptos de inmunidad y su variación etimológica en el tiempo desde su primer registro escrito. Se describe la filogenia y ontogenias de las células del sistema inmune, así como las principales estructuras que permiten la producción y maduración de estas células. Además, se describe los principales componentes de la inflamación en la respuesta innata.


En el módulo II. Bases genéticas, celulares y moleculares de la inmunología. Describimos las principales características de la estructura, función, genética y uso terapéutico de los haptenos, antígenos, inmunógenos y anticuerpos. Además, se explican los principales mecanismos celulares y moleculares de la respuesta inmune adquirida. En el módulo III. Mecanismos inmunes contra microrganismos Se describe como el sistema inmune reconoce lo propio y lo no propio. Como las células se comunica entre sí y como se activan o desactivan las células de la respuesta inmune. Además, se explica los principales mecanismos inmunes que se utilizan para el reconocimiento, captura, procesamiento y presentación de los microrganismos que más frecuentemente nos afectan. En el módulo IV. Defectos inmunes que provocan enfermedad Se presentan los principales defectos en la ontogenia de las células que provocan inmunodeficiencias. Mostramos las alteraciones del sistema inmune que provocan escape del control de las células autoreactivas y las enfermedades que provocan. Además, se describen como el sistema inmune detecta, neutraliza y destruyen las células tumorales. 3. COMPETENCIAS Los estudiantes de la asignatura de inmunología básica deberán alcanzar las siguientes competencias para lograr el perfil de egreso de la Facultad de Medicina de la Universidad de Panamá. 1. Básicas A. Comunicación lingüística B. Conocimiento e interacción con el mundo físico, social y ciudadana C. Aprender a aprender D. Autonomía e iniciativa personal 2. Genéricas A. Capacidad de abstracción, análisis y síntesis B. Capacidad de aplicar los conocimientos en la práctica C. Capacidad para organizar y planificar el tiempo D. Conocimiento sobre el área de estudio y la profesión E. Capacidad de comunicación oral y escrita F. Capacidad de comunicación en un segundo idioma G. Habilidades en el uso de las tecnologías de la información y de la comunicación H. Capacidad de investigación I. Capacidad de aprender y actualizarse permanentemente J. Habilidades para buscar, procesar y analizar información procedente de fuentes diversas K. Capacidad crítica y autocritica L. Capacidad para actuar en nuevas situaciones M. Capacidad creativa Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


N. O. P. Q. R. S.

Capacidad para identificar, planear y resolver problemas Capacidad para tomar decisiones Capacidad de trabajo en equipo Habilidades interpersonales Valoración y respecto por la diversidad y multiculturalidad Compromiso ético

3. Específicas A. Cognitivas 1. Demuestra una compresión profunda de los conceptos y principios 2. 3. 4. 5.

fundamentales de la inmunología básica Describe y explica fenómenos inmunológicos innatos y adquiridos y procesos tecnológicos en términos de conceptos, principios y teorías Busca, interpreta y utiliza información científica Conoce y comprende el desarrollo conceptual de la inmunología en términos históricos y epistemológicos Conoce los aspectos relevantes del proceso de enseñanza-aprendizaje de la inmunología

B. Metodológicas B.1

Sistémicas 1. Planea, analiza y resuelve casos clínicos inmunológicos, mediante la utilización de métodos analíticos y de laboratorio clínico 2. Construye modelos simplificados que describan una situación compleja, identificando sus elementos esenciales y efectuando las aproximaciones necesarias 3. Aplica el conocimiento teórico de la inmunología básica en la realización e interpretación casos clínicos 4. Percibe las analogías entre situaciones aparentemente diversas, utilizando soluciones conocidas en la resolución de casos clínicos nuevos

B.2

Instrumentales 1. Utiliza sistemas de computación para la recolección y el procesamiento de información 2. Demuestra destrezas clínicas y uso de métodos adecuados de trabajo en el laboratorio de inmunología

B.3

Laborales y sociales 1. Participa en actividades profesionales relacionadas con tecnologías de alto nivel, sea en la básica o laboratorio de inmunología. 2. Actúa con responsabilidad y ética profesional, manifestando conciencia social de solidaridad, justicia y respecto por el paciente y el ambiente


3. Demuestra hábitos de trabajo necesarios para el desarrollo de la profesión tales como el trabajo en equipo, el rigor científico, el autoaprendizaje y la persistencia 4. Comunica conceptos y resultados científicos en lenguaje oral y escrito ante sus compañeros y en situaciones de enseñanza y de divulgación 5. Participa en la elaboración y desarrollo de proyectos de investigación en inmunología o interdisciplinarios 4. METODOLOGÍA DE ENSEÑANZA-APRENDIZAJE DE TEORÍA Y LABORATORIO: 1. Las clases teóricas, los laboratorios teóricos y clínicos serán impartidos en forma de conferencias con retroalimentación continúa por parte del profesor y los estudiantes. El estudiante tiene la obligación de revisar los temas antes de acudir al aula de clases. 2. Se realizarán seminarios por parte de los grupos de estudiantes donde se describirá un método inmunológico de interés médico y el cual será reforzado usando como ejemplo un caso clínico. 3. Se deberá participar en las investigaciones de la sección de inmunología y asistir a los congresos ó seminarios programados por la unidad, relacionados con los temas de inmunología básica y clínica. 5. EVALUACIÓN: 1. Diagnóstica a. Preguntas orales de los conceptos teóricos para evaluar conocimientos previos de los estudiantes. 2. Formativa a. Las destrezas, actitudes y asistencia de los estudiantes serán evaluados mediante la elaboración de investigación de laboratorio, asistencia a congresos o seminarios y presentación de casos clínicos en el ámbito de la inmunología básica. Para evaluar lo aprendido y retroalimentar el aprendizaje. 3. Sumativa a. Parciales teóricos # 2 Los parciales serán de las siguientes modalidades: abierto y llevar a casa b. Laboratorio i. Asistencia ii. Lectura y entrega de artículos iii. Presentación de casos clínicos # 2 iv. Elaboración de diagramas causa - efecto c. Seminario de Aplicación de Inmunología Básica d. Semestral

30% (15% c/u) Presencial libro cerrado ó

5% 5% 5% (2.5% c/u) 20% 10% 25%

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


6. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Libros de Teoría, guía de laboratorio, revistas y direcciones de internet: -

Kuby, Inmunología. Mc Graw Hill. Sexta edición. 2007

-

Abbas, Cellular and Molecular Immunology, Updated Edition: by Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman MD PhD, and Shiv Pillai MD. 2010

-

J Allergy Clin Immunol. Primer 2010

-

Medicina Interna Harrison parte xiii. Trastornos del sistema inmunitario, el tejido conectivo y las articulaciones > Sección 1. El sistema inmunitario en la salud y la enfermedad > Capítulo 295. Introducción al sistema inmunitario > Copyright ©2006 The McGraw-Hill Companies

-

Guía de Laboratorio de Inmunología Básica 315. Dep. Microbiología, Sección de Inmunología. Universidad de Panamá. 2013

-

Casos Clínicos en Inmunología. Brostoff, Gary, Male and Roitt. 1996. Mosby/Doyma Libros S.A. 92p

-

Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology 2011-13

-

Nature Reviews Immunology 2011-13

-

http://www.immunologylink.com

-

http://www.prezi.com


7. PROFESORES DEL CURSO 1. Manuel María Adames Mitre M.D. M.Sc. Doctor en Medicina - Universidad de Panamá Especialista en Inmunología Clínica - Hospital Nacional de Niños Magister Scientiae en Microbiología con énfasis en Inmunología-Universidad de Costa Rica Especialista en Docencia Superior – Universidad de Panamá 2. Griselda Arteaga, T.M. M.Sc. Tecnóloga Médica - Universidad de Panamá Magister Scientiae en Biomedicina con énfasis en inmunología - Universidad de Panamá 3. Dalys Mojica, TM. M.Sc. Tecnóloga Médica - Universidad de Panamá Magister Scientiae en Biomedicina con énfasis en inmunología - Universidad de Panamá 8. CODIGOS DE ASIGNATURA Y HORARIOS ABREV

MEDNH MEDNH

340 340

HORA

DENOMINACION

Inmunología Médica Inmunología Médica

LUNES

COD. ASIGN

COD. HOR.

22212 22212

8192 8193

PROFESOR

Manuel Adames Mitre Manuel Adames Mitre

MIÉRCOLES

1:50 – 2:35

Teoría de Inmunología

2.45 – 3:45

Laboratorio Inmunología

3:45 – 4:45

Laboratorio Inmunología

Grupos 4.1 + 4.2 GRUPO: 4.2 GRUPO: 4.2

4:25 – 5:25

Laboratorio Inmunología

Laboratorio Inmunología

GRUPO: 4.1

GRUPO: 4.2

5:25 – 6:25

Laboratorio Inmunología

6:25 – 7:05

Laboratorio Inmunología

GRUPO: 4.1

GRUPO: 4.1

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES DE TEORIA Segundo Semestre 2013 Semana

Fecha

Tema

Expositor

1

07-08-2013

Propiedades y visión de la respuesta inmune

Manuel Adames

2

14-08-2013

Inmunidad Innata

Griselda Arteaga

3

21-08-2013

Anticuerpos y Antígenos

Manuel Adames

4

28-08-2013

El Complejo Mayor de Histocompatibilidad

Griselda Arteaga

5

04-09-2013

Procesamiento de Antígeno y la presentación a los LT

Manuel Adames

6

11-09-2013

Receptores de Antígenos y las Moléculas Accesoria de los LT

Griselda Arteaga

7

18-09-2013

Desarrollo del linfocito y rearreglo y expresión de los genes de los receptores de antígenos

Manuel Adames

8

25-09-2013

Activación de los LT y LB

Griselda Arteaga

9

02-10-2013

Producción de Anticuerpos y Tolerancia Inmunológica

Manuel Adames

10

09-10-2013

Citoquinas

Griselda Arteaga

11

16-10-2013

Mecanismos Efectores de la Inmunidad Mediada por Células

Manuel Adames

12

23-10-2013

Mecanismos Efectores de Inmunidad Humoral

Griselda Arteaga

13.

30-10-2013

Inmunidad a los Microbios

Manuel Adames

14

06-11-2013

Inmunología de Trasplante

Griselda Arteaga

15

13-11-2013

Inmunodeficiencias

Manuel Adames

16

27-11-2013

Autoinmunidad

Griselda Arteaga


CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES DE LABORATORIO Segundo Semestre 2013 S

Fecha

Laboratorio Teórico

1

5-ago 7-ago 12-ago 14-ago 19-ago 21-ago 26-ago 28-ago 2-sep 4-sep 9-sep 11-sep 16-sep 18-sep 23-sep 25-sep 30-sep 2-oct 7-oct 9-oct 14-oct 16-oct 21-oct 23-oct 28-oct 30-oct 4-nov 6-nov 11-nov 13-nov 18-nov 20-nov

Introducción Introducción Diluciones Simples y Seriadas #1 Células, Tejidos y Organos del Sistema Inmune #2 Aglutinación #3.1 Turbidemetria y Nefelometria # 3.2 Inmunodifusión Radial Simple #4 Inmunodifusión Radial Doble #5 Inmunofluorescencia #6

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Ensayo de Inmunoadsorción Ligado a Enzima #7 Inmunoelectrotransferencia #8 Citometria de Flujo #9 Primer Examen Parcial Pruebas in vivo e in vitro para detectar IgE específica #10.1 Pruebas de Hipersensibilidad Celular #10.2 Separación de Células Mononucleares #11

Caso

1 2 3 4 7 9 13 14 12 6 15 16 22 23 28

G 4.1

G 4.2

Manejo de Espina de Pescado Manejo de Prezi Manejo de Espina de Pescado Manejo de Prezi Inmunidad frente a las infecciones I

4.1.1 4.2.1

Inmunidad frente a las infecciones II

4.1.2 4.2.2

Inmunodeficiencias Primarias I

4.1.3 4.2.3

Inmunodeficiencias Primarias II

4.1.4 4.2.4

Inmunodeficiencias Secundarias

4.1.5 4.2.5

Hipersensibilidad Tipo I

4.1.6 4.2.6

Hipersensibilidad Tipo II

4.1.7 4.2.7

Hipersensibilidad Tipo III

4.1.8

Linfoproliferación de Mononucleares #12 Extracción de ADN #13 Reacción en Cadena de la Polimerasa #14 Enzimas de Restricción #15 Secuenciación de ADN #16 Feriado Repaso Feriado Segundo Examen Parcial Revisión Revisión

Laboratorio Clínico

Hipersensibilidad Tipo IV 30

4.2.8

37

4.2.9

39

4.2.10

Autoinmunidad Autoinmunidad

Seminario

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


9 LABORATORIO # 1 DILUCIONES SIMPLES Y SERIADAS INTRODUCCION En los laboratorios y procedimientos de Inmunología es de uso frecuente la expresión de los reactivos como diluciones de soluciones primarias. Ejemplos: Usar el conjugado a 1:20; diluir el suero 1:100; hacer diluciones a 1:10. Todas estas expresiones deberán interpretarse como la relación de 1 vol. de solución A en X vol. de solución final total. Pero no siempre necesitamos preparar volúmenes en el cual la solución a diluir tenga el valor de la unidad y en esos casos deberemos calcular la fracción necesaria para volúmenes menores. Una manera práctica es aplicar la igualdad de las razones. Ejemplo: Preparar 3 ml de solución a relación de 1:50. La razón solicitada es de 1/50 la igualamos a una relación de x/3; al despejar el valor de x obtenemos el volumen que deberá tomarse de la solución A para luego agregarle el diluyente hasta alcanzar el volumen de 3 ml. Con esta igualdad de razones se podrá calcular el valor de cualquiera de las variables si conoce tres de ellas. Otro procedimiento para obtener diluciones altas es las denominadas diluciones seriadas. Las diluciones seriadas permiten establecer comparaciones entre soluciones sin conocer exactamente la concentración del soluto. Las diluciones seriadas es el resultado de diluciones repetidas a una razón constante. En las diluciones seriadas el proceso de dilución repetido se presenta al tener constante el volumen de diluyente y estar transfiriendo de manera repetida un volumen constante de la dilución anterior. De esta manera una serie de diluciones mantendrán un factor de dilución en común y se logran diluciones tan altas que de otra manera sería difícil de lograr por la limitante que se presenta al medir volúmenes menores de 0.001 ml.


OBJETIVO: Enfrentar al estudiante a problemas cotidianos donde tendrá que hacer diluciones simples y seriadas. MATERIALES Y REACTIVOS 1. Tubos de vidrios 12 x 75 mm. 2. Pipetas de 1, 5 y 10 ml. 3. Solución salina normal (0.85%). 4. Colorante azul de metileno. 5. Micropipetas 6. Centrífuga PROCEDIMIENTO 1. Coloque 100 ul de salina en 7 pozos de una columna de microplatos, dejando el primer pozo vacío. 2. Coloque 200 ul de tinte en el primer pozo y transfiera 100 ul al segundo pozo, mezcle y transfiera 100 ul al tercer pozo ... siga hasta el pozo #8. 3. Elimine los últimos 100 ul del pozo #8. 4. Hacer lectura de absorbancia en el lector de ELISA y trafique abs. vs. dilución. RESPONDA 1. Calcule la dilución y el título en el pozo # 8 del procedimiento anterior. 2. Investigue los valores normales para niños y adultos de los siguientes exámenes: a. b. c. d. e.

Hemograma Químico Urinálisis Heces por parásitos IgE total

3. Diagrame la dilución seriada de una proteína de fase aguda como la Proteína C reactiva. Cuyo factor de dilución es de 3, el volumen de transferencia de 75 l y volumen final de 500 l.

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


LABORATORIO # 2 CELULAS, TEJIDOS Y ORGANOS DEL SISTEMA INMUNE

INTRODUCCION La función del sistema inmunológico es mantener los microorganismos infecciosos como determinadas bacterias, virus y hongos, fuera de nuestro cuerpo, y destruir cualquier microorganismo infeccioso que logre invadir nuestro organismo. Este sistema está formado por una red compleja y vital de células y órganos que protegen al cuerpo de las infecciones. Las células involucradas en la respuesta inmune están organizadas en tejidos y órganos para llevar a cabo sus funciones de manera más eficiente. Estas estructuras son llamadas, colectivamente, sistema linfático, el cual está compuesto por órganos linfáticos primarios (centrales) y órganos linfáticos secundarios (periféricos). Los órganos linfáticos primarios son los sitios principales para la linfopoyesis, aquí los linfocitos se diferencian de las células linfáticas precursoras, proliferan y maduran hasta convertirse en células efectoras funcionales. Los órganos linfáticos secundarios reciben el flujo de los linfocitos proveniente de los órganos primarios.

OBJETIVO Introducir al estudiante en los conceptos y conocimientos básicos de la anatomía y fisiología del sistema linfático y del tráfico linfocitario.


METODOLOGIA Por medio grupos de trabajo se desarrollarán y expondrán temas asignados por el profesor relacionados con las estructuras y funciones de las células y órganos linfáticos responsables de la respuesta inmune.

RESULTADOS Discusión amplia de los temas propuestos. AUTOFORMACION: 1. Diagrame la ontogenia de linfocitos T y de B. Coloque los principales marcadores o receptores que son característicos a cada estadio. 2. Diagrame los órganos linfoides primarios y secundarios. Señale el sitio donde se localizan los LT, LB, M y NK.

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


LABORATORIO # 3.1 AGLUTINACION INTRODUCCION Las pruebas de aglutinación constituyen la base de la mayor parte de las técnicas inmunológicas. Su principio se basa en la reacción antígeno-anticuerpo. Cuando un inmunógeno particulado se encuentra con su correspondiente anticuerpo en fase líquida ocurre una reacción de aglutinación. Existen muchos ejemplos de este tipo de técnicas empleadas en el laboratorio, en donde el inmunógeno particulado, como eritrocitos o bacterias, reaccionan de modo directo con su anticuerpo. Otras veces, cuando el inmunógeno que se desea determinar por este método es soluble, es necesario pegarlo por métodos químicos a partículas de látex o bentonita para obtener reacciones de aglutinación. A esta variante se le conoce como aglutinación indirecta y si la partícula es un eritrocito, entonces se le nombra hemoaglutinación indirecta o pasiva. Una variación más del método es la inhibición de la aglutinación de las partículas cubiertas, la cual muestra tener alta sensibilidad. OBJETIVO Demostrar los principios de las principales técnicas de aglutinación utilizadas en inmunología médica MATERIAL Y METODOS Prueba de aglutinación para la detección de factor reumatoide en suero humano

MATERIALES: 1.1 Partículas de látex recubiertas con IgG 1.2 Suero control positivo 1.3 Suero control negativo 1.4 Placas de plástico desechables 1.5 Agitadores plásticos descartables


METODOLOGÍA 1. Coloque en tres celdas (zona circular de la placa) consecutivas lo siguiente: 1 gota de 2. suero humano, en la siguiente celda, 1 gota de suero control - y en la tercera celda, 1 gota de suero control +. 1.2 A cada celda agregar 1 gota de suspensión de látex recubierta de IgG. 1.3 Mezclar con agitadores individuales, cubriendo toda el área de cada celda. 1.4 Tomar la placa y agitar durante 2 minutos. 1.5 Leer inmediatamente bajo luz directa. PREGUNTAS 1. ¿Cuál es el principio de la técnica de aglutinación directa e indirecta? Diagrame cada una de ellas. 2. ¿Qué son anticuerpos heterófilos? 3. ¿Qué es y contra que reacciona el factor reumatoide? 4. ¿De cinco ejemplos de otras determinaciones que se realizan por aglutinación directa o indirecta? 5. ¿Qué es la Prueba de Coombs y cuáles son sus aplicaciones clínicas?

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


LABORATORIO # 3.2 TURBIDOMETRIA Y NEFELOMETRIA

INTRODUCION La turbidimetría: Mide la disminución de la luz transmitida a través de una suspensión de partículas utilizando para ello un espectrofotómetro (detector en la misma dirección del haz de luz, se mide A o T). Se suele utilizar para soluciones concentradas (para que haya una buena disminución de la luz transmitida) ej. determinación de proteínas totales en suero, LCR u orina (haciendo que las proteínas precipiten con TCA o ácido sulfosalicílico). La turbidimetría mide la reducción de la transmisión de luz debido a partículas de una suspensión y cuantifica la luz residual transmitida. La nefelometría: Mide la luz dispersada en dirección distinta a la luz emitida (generalmente con ángulos que oscilan entre 15 y 90º). Utiliza como instrumento el nefelómetro (en el que el detector se ubica con un ángulo que oscila entre 15 y 90º, por ejemplo a 90º. Se suele utilizar para concentraciones más diluidas). De la nefelometría se obtienen mejores resultados, porque determina concentraciones de pocos ppm, con una precisión de 1 al 5%. La nefelometría se ha empleado para el análisis y la identificación de fibrinógeno, plaquetas, triglicéridos, complejos antígeno anticuerpo y otras sustancias como por ejemplo para conocer el nivel de la inmunoglobulina en la sangre, se realiza un examen para buscar las proteínas IgM, IgG e IgA

OBJETIVO Conocer la utilidad de la técnica de turbidimetría y nefelometría para la determinación de los componentes humorales del sistema inmune. MATERIAL 1. 2. 3. 4.

Una muestra de 3 cc de sangre venosa de un avena periférica Nefelómetro (MININEPH PLUS) Tampón IgA, IgM, IgA . Contiene ácida sódica 0.099% como conservador. Controles de titulo alto y bajo de Igs humanas, Consisten en un pool de sueros humanos y son suministrados en forma líquida estabilizada. Contienen acida sódica 0.099%, EACA 0.1% y benzamidina 0.01% como conservadores.


METODO 1. Coloque la cubeta en la cámara. 2. Coloque una cubeta conteniendo una barra agitadora y 40 μL de muestra diluida en la cámara para la cubeta. Presionar suavemente la cubeta hacia abajo hasta alcanzar el piso de la cámara. 3. La cubeta será detectada automáticamente. Agregar reactivo. 4. Llenar una pipeta electrónica con 400μL de tampón IgA MININEPH y 40μL de Antisuero IgA, IgM, IgG Humano MININEPH y dispensar su contenido dentro de la cubeta. 5. El MININEPH detectará el agregado seguido por el movimiento de la barra agitadora y se iniciará el ensayo. No es necesario presionar “enter”. 6. Luego de 10 segundos de blanco, el ensayo se completará en 60 segundos, el resultado entonces se exhibirá e imprimirá automáticamente (si se encuentra conectada la impresora). PREGUNTAS 1. Investigue las concentraciones de las inmunoglobulinas por edad y sexo en mg/dl 2. ¿Qué otras proteínas humorales puede determinarse por nefelometría?

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


CASO CLÍNICO #1 INMUNIDAD FRENTE A LAS INFECCIONES (I) A la edad de 13 años Esteben fue atropellado por un automóvil cuando conducía su bicicleta, motivo por el cual hubo de ser atendido en un hospital local. La exploración física revelo múltiples laceraciones en su brazo y pierna izquierdos y la ausencia de fracturas. Las radiografías torácica, pélvica y vertebral fueron normales. Un breve examen psicológico demostró que se halla sumido en un estado de cierta confusión. Ante la sospecha de concusión cerebral, fue ingresado en el hospital durante una noche para ser mantenido en observación. A lo largo de la noche, Esteben se mostró cada vez más agitado y apareció un dolor abdominal que fue aumentado progresivamente. Su pulso era débil y presentaba taquicardia. El pulso venoso yugular no era detectable y la presión arterial era de 85/55 mm Hg. En el examen abdominal se observo un hematoma en el cuadrante superior izquierdo, así como un dolor débil y difuso en la misma zona, con reflejo defensa positivo. Se extrajo inmediatamente una muestra de sangre para la realización de las correspondientes pruebas cruzadas y se llevo acabo una transfusión sanguínea. Pese a que se le administraron cinco unidades de sangre, la presión arterial no experimento un aumento importante, por lo que fue conducido al quirófano para practicarle una laparotomía. Durante la intervención se encontró sangre procedente del bazo, que estaba roto, en loa cavidad peritoneal, por lo que dicho órgano fue extirpado. La recuperación tras la intervención trascurrió sin incidentes, aunque fue necesario administrarle varias transfusiones más. Investigación Hemoglobina (g/dl) Recuento de leucocitos (x 109/L) Recuento de neutrófilos (x109/L) Recuento de plaquetas (x109/L) Frotis sanguíneo Suero  Sodio (mmol/L)  Potasio (mmol/L)  Cloro (mmol/L)  Urea (mmol/L)  Creatinina (µmol/L) Excreción urinaria

Resultado ( Ámbito normal) (después de la transfusión) 13.2 (13.5-18.0) 12.5 (4.0-11.0) 8.5 (2.0-7.5) 512 (150-400) Cuerpos de Howell-Jolly Dianocitos Siderocitos normoblastos 141 (134-145) 4.2 (3.5-5.0) 102 (95-105) 3.2 (2.5-6.7) 120 (70-150) 75 ml/hora

Diez años más tarde, Esteben acudió a su médico de cabecera debido a la aparición de tos acompañada de dolor en el hemotórax derecho. La exploración física reveló malestar evidente, con una taquicardia de 110 latidos/min., una frecuencia respiratoria de 23/min., una temperatura corporal de 38.5 ºC y una presión arterial de 95765 mmHg. Fue ingresado en el


hospital con signos de consolidación en el lóbulo inferior de su pulmón derecho. El diagnóstico presuntivo de neumonía lobular fue confirmado mediante una radiografía de tórax, por lo que fue tratado con cefuroxina administrada por vía intravenosa, tratamiento al que mostró una buena respuesta. En los hemocultivos extraídos antes del inicio del tratamiento se aisló Streptococcus pneumoniae, un coco Gram. Positivo. Tras su recuperación, se le administró una única dosis de vacuna neumocócica por vía subcutánea y se instauró un tratamiento antibiótico profiláctico.

Preguntas 1. ¿Cuál es la estructura del bazo y cómo se relaciona con sus funciones? El bazo es un órgano encapsulado, que en un individuo normal mide unos 12 cm. de longitud y unos siete cm. de anchura. Se encuentra situado bajo las costillas novena, décima y undécima, y no suele ser posible palparlo cuando su tamaño es normal. Está abundantemente irrigado por la arteria esplénica. El bazo presenta trabéculas, pero no presenta una separación en ganglios definidos. En un corte transversal se observan dos tipos de tejido: 1.1 La pulpa roja está formada por sinusoides repletos de macrófagos, que fagocitan a los eritrocitos más viejos (vida media normal de un eritrocito: 120 días aproximadamente). También actúa como almacén de eritrocitos, plaquetas y granulositos, que pueden ser movilizados en situaciones de emergencia. 1.2 La pulpa blanca está compuesta de tejido linfoide, que se encuentra dispuesto alrededor de las arterias centrales (ramas de la arteria esplénica), dando lugar al manguito linfoide peri arterial (MLPA). El MLPA está organizado en forma concéntrica: i la región marginal esta compuesta de macrófagos especializados, células dendríticas, células asesinas naturales, y células B que circulan lentamente. En esta zona se encuentran los extremos terminales de las arteriolas centrales, denominados vasos penicilados, desde donde los linfocitos abandonan la circulación y penetran en el tejido esplénico. A continuación migran a ii o iii. ii) La región de células T está formada mayoritariamente por células dispuestas formando interdigitaciones, que expresan el antígeno de clase II de complejo principal de histocompatibilidad ( CPH) y presenta los antígenos a las células T . En esta zona también se encuentran arterias centrales. iii) la región de células B está formada principalmente por células dendríticas foliculares. (Que expresan el receptor IgG, FcyR, y el receptor del complemento, CR1) encargadas de presentar los antígenos a las células B. Hay dos niveles de organización, que reflejan el grado de estimulación del tejido linfoide por parte del antígeno: (a) folículos primarios no estimulados (agregados de células B no estimuladas); (b) folículos secundarios estimulados, con un centro germinal central y una capa celular externa. En las regiones de células T y B también se encuentran células B y T respectivamente. Es probable que este solapamiento permita la transmisión de señales que precisen un contacto directo y que son necesarias para la iniciación de las respuestas de tipo humoral.

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


En resumen, el bazo desempeña un papel importante como parte del sistema fagocítico mononuclear y constituye uno de los lugares en que se lleva a cabo la presentación de antígeno y la consiguiente expansión clonal de los linfocitos.

2. ¿Por qué la pérdida de estas funciones predispone al paciente a contraer enfermedades infecciosas? El bazo está dotado de una gran capacidad para eliminar las bacterias encapsuladas mediante fagocitosis. Las bacterias, como S. pneumoniae, son recubiertas por IgG y el componente C3 del complemento. Los macrófagos expresan receptores para estas dos moléculas, lo que facilita la fagocitosis. La extirpación del bazo suprime estas funciones, por lo que reduce la cantidad de inóculo necesaria para que una infección pueda provocar una enfermedad clínicamente manifestada. 3. Que alteraciones de las celularidad sanguínea, las inmunoglobulinas y el complemento se observan tras la esplenectomía? En el caso de Esteben los hallazgos analíticos tras la intervención son los habituales. Es frecuente el aumento de la concentración de neutrófilos y plaquetas, aunque suele ser transitorio. Es necesario movilizar al paciente, para evitar la trombosis venosa. El recuento de eritrocitos, suele ser normal y es frecuente observar cuerpos de Howell-Jolly, dianocitos, siderocitos y normoblastos en las tinciones de frotis sanguíneo. Las concentraciones séricas de IgG2 e IgM se pueden ver reducidas, ya que los linfocitos esplénicos son una de las principales fuentes de estos anticuerpos. Las concentraciones de los componentes del complemento también pueden ser menores de lo normal. 4. ¿Son aconsejables las inmunizaciones especificas tras la esplenectomía? Pese al alto riesgo de infección con bacterias encapsuladas tras la esplenectomía, no hay directrices a nivel nacional acerca de la inmunización o la profilaxis antibiótica, En estos pacientes aproximadamente el 50 % de las infecciones son producidas por S pneumonie, por lo que se viene propugnando desde algún tiempo la administración de una vacuna


compuesta de polisacáridos capsulares procedentes de cepas patógenas de neumococo. Tras la vacunación se sigue administrando profilaxis antibiótica. Últimamente, se está recomendado también la inmunización frente a Haemophilius influenzae tipo b (Hib) y frente a meningococos de los grupos A y C.

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


CASO CLINICO # 2 INMUNIDAD FRENTE A LAS INFECCIONES (I)

La Sra. Quina, una mujer de 59 años de edad, fue sometida a una sigmoidectomia electiva debido a una diverticulosis recurrente. Carecía de otros antecedentes clínicos importantes y su estado de salud antes de la intervención era bueno. El procedimiento fue llevado a cabo sin complicaciones y en las primeras fases del proceso postoperatorio no se registraron incidentes. Sin embargo, dos días después de la intervención, la paciente cayó en un estado de confusión aguda. En la exploración física se observó una temperatura corporal de 38.5ºC y un pulso radial regular de 125 pulsaciones / min. Su presión arterial había descendido hasta 100 / 70 mm Hg, desde un valor inicial de 140 / 90 mm Hg, y no era posible detectar su pulso venoso yugular. Todos los pulsos periféricos eran perceptibles, pero sus extremidades estaban frías. La exploración abdominal no reveló ningún signo digno de mención y la herida no estaba infectada y cicatrizaba con absoluta normalidad. Las determinaciones analíticas dieron como resultado un recuento de leucocitos de 18.2 x 109/L. La concentración sérica de creatinina era ligeramente alta. Ante la sospecha de septicemia, se obtuvieron muestras de sangre y orina para cultivo y se inició un tratamiento de cefuroxina, metronidazol y gentamicina. Para corregir la hipovolemia se administró un expansor plasmático por vía intravenosa. A lo largo de las doce horas siguientes su estado empeoró. Desarrolló taquipnea y perdió parcialmente la consciencia. En la exploración física se percibían crepitantes respiratorios difusos y un pulso radial de 135 pulsaciones/ min. Su presión arterial descendió hasta 90/50 mm Hg. Las gasometrías arteriales, obtenidas durante la administración de oxígeno al 60 % a través de una mascarilla, dieron como resultado una PaO2 7.8 kPa (valor normal, > 10.6 kPa) y una PaCO2 de 6.2 kPa (valor normal, 4.7 – 6.0 kPa). Fue trasladada a la unidad de cuidados intensivos. Fue intubada directamente y se inició una ventilación con presión positiva intermitente. Se administró más expansor de plasma a través de una vía venosa central, para tratar la hipovolemia y se insertó un catéter en la arteria pulmonar. Además se obtuvo una radiografía de tórax, en la que se observó una infiltración pulmonar bilateral. De acuerdo con los cuatro criterios que se indican a continuación se estableció un diagnóstico de síndrome de dificultad respiratoria del adulto:  Antecedentes de sepsis  Bajo cociente PaO2/PaCO2  Presión de enclavamiento de la arteria pulmonar no elevada.  Infiltración pulmonar bilateral. Los expansores plasmático administrados por vía intravenosa no corrigieron la presión arterial de la Sra. Quina, por lo que, ante el aumento del gasto cardíaco, se inició el tratamiento con noradrenalina (un agente vasoconstrictor). También se administró dopamina para mejorar la perfusión renal y visceral, y se procedió a investigar el foco de la septicemia. No se detectó ninguna anomalía mediante radiografía simple de abdomen ni mediante ecografía, Se procedió a practicar una laparotomía, en la que se observó la presencia de líquido purulento en la cavidad abdominal y la rotura de la anastomosis colonrectal. Se llevó a cabo una colostomía radical. Un lavado peritoneal y se volvió a trasladar a la paciente a la unidad de cuidados intensivos. Tres días después de esta segunda intervención de la Sra.


Quina, desarrolló una infección pulmonar secundaria que provocó su muerte poco tiempo después. Los cultivo de sangre, orina y exudados de la herida fueron negativos, pero en el cultivo de líquido peritoneal se aislaron Escherichia Coli (una bacteria gram negativo de la familia Enterobactericae) y Streptococcus faecalis (un coco gram positivo), ambos presentes habitualmente en flora intestinal. Preguntas y Respuestas 1. ¿Qué son las endotoxinas ? Las endotoxinas son componentes estructurales de las paredes celulares de las bacterias gram negativas, que se liberan solamente tras la lisis o la muerte celular de las mismas. Son complejos formados por fosfolípidos y polisacáridos y se suelen denominar lipopolisacáridos bacterianos (LPS). Se ha demostrado que uno de sus componentes el lípido A, es el causante de la mayoría de sus efectos tóxicos. Aunque su potencia antigénica es diferente según la especie de que procedan, sus efectos biológicos siempre son parecidos. 2. ¿Cómo ejercen sus efectos las endotoxinas ? Al contrario que en el caso de las exotoxinas, la potencia antigénica de las endotoxinas no es muy grande, pero aun así, en casos de sepsis grave, son capaces de dañar el parénquima de diversos órganos. Una propiedad importante de las endotoxinas es su capacidad para activar a los macrófagos, que son importantes mediadores del shock séptico. Los macrófagos liberan el factor de necrosis tumoral (TNF, del inglés tumour necrosis factor), que ejerce sus efecto sobre los leucocitos polimorfonucleares y los macrófagos, provocando su activación, agregación y adhesión a las células endoteliales. El TNF también estimula la producción del factor activador de las plaquetas (PAF, del inglés platelet activating factor), de IL-1, de IL-6 y de eicosanoides (tromboxanos, leucotrienos y prostaglandinas), a partir de los neutrófilos, los macrófagos, las plaquetas y a las células endoteliales. Estos mediadores tienen propiedades vasoactivas y aumentan la permeabilidad capilar. Las endotoxinas también ejercen un efecto directo sobre los neutrófilos, aumentando la síntesis y liberación de proteasas y de radicales libres de oxígeno. Además activan directamente la vía de la coagulación, la fibrinolítica y la dependiente de contacto. Se puede llegar a producir una coagulopatía por agotamiento de precursores, que se puede manifestar clínicamente en forma de coagulación intravascular diseminada (CID). Esta situación se caracteriza por una aumento del tiempo de coagulación, una disminución de la concentración de plaquetas y un aumento de la concentración de dímeros D. Además se activan las vías clásica y alternativa del complemento. Como consecuencia de estos procesos se producen vasodilatación, hipotensión y una perfusión visceral defectuosa, que pueden ser refractarias al tratamiento. 3. ¿Qué trastornos suelen estar asociados con el SDRA? El SDRA suele ser desencadenado por los siguientes trastornos:  Sepsis (bacteriemia, septicemia)  Traumatismo (lesiones craneales, émbolos grasos)  Infecciones localizadas (neumonía)  Aspiración (de contenido gástrico o de agua salada o dulce) Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


  

Hematológicos(hemorragias, transfusiones masivas de sangre) Enfermedades metabólicas (pancreatitis, insuficiencia renal) Otros (inhalación de toxinas, sobredosis de drogas de abuso, radiación)

4. ¿Cuál es la inmunopatología del SDRA? Se cree que el SDRA se inicia debido a una agresión relacionada con los trastornos mencionados en el párrafo anterior. La liberación de endotoxinas o la activación del complemento provoca la activación de los macrófagos y la liberación de TNF e IL – 1 . Estos compuestos ejercen diversos efectos sobre diferentes sistemas celulares y enzimáticos:  Neutrófilos : liberación de proteasas, aumento de al adherencia y la agregación y liberación de captores de radicales libres de oxígeno.  Plaquetas : agregación, activación y liberación de eicosanoides.  Endotelio : aumento de la permeabilidad y de la producción de óxido nítrico, aumento del metabolismo del ácido araquidónico y de la liberación de prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos.  Activación simultánea de la vía de la coagulación y de la fibrinólisis, que conduce a la aparición de hemorragias generalizadas y a la formación de microtrombos. Estos factores actúan conjuntamente y provocan lesiones del endotelio capilar y del epitelio respiratorio, causando el desprendimiento de las células que recubren los alvéolos. La permeabilidad del endotelio y del epitelio aumente, lo que conduce a un edema intersticial y alveolar con extravasión de eritrocitos. Se reduce la producción de lecitina y esfingomielina, los componentes del surfactante pulmonar, debido al daño producido por las enzimas proteolíticas sobre los neumocitos de tipo II. El SDRA no siempre resulta fatal, pero hay muchas veces en que los cuidados intensivos no consiguen evitar que se produzcan un progresivo deterioro.


LABORATORIO # 4 INMUNODIFUSION RADIAL SIMPLE INTRODUCCION Cuando una solución de inmunógeno es mezclada en proporción correcta con un anticuerpo contra ese inmunógeno, una reacción de precipitación ocurre. Este es el principio básico de las reacciones de inmunodifusión simple y doble. En el caso de la primera, un anticuerpo es adicionado a una matriz semisólida, por ej. Agar, posteriormente se añaden diferentes concentraciones de inmunógeno a los pozos previamente realizados en el agar y se incuba por 24 horas. Durante este tiempo, el inmunógeno difunde fuera de los pozos formando complejos solubles con el anticuerpo hasta que se alcanza un punto de equilibrio en el cuál los complejos precipitan formando un anillo. De esta forma el cuadrado del radio del anillo formado es directamente proporcional a la concentración del inmunógeno (Igs, complemento, etc.) presente. Este método se ha usado para la determinación de la concentración de inmunoglobulinas, C3, C4, Transferrina, Proteína C reactiva, Alfa feto proteína, etc. OBJETIVOS l. Familiarizar al estudiante con el principio de la inmunodifusión. 2. Demostrar el uso de esta técnica para la medición de Inmunoglobulinas séricas. MATERIALES l. Platos de agarosa pH 7.2 conteniendo anti -IgM humanas. 2. Controles de concentración conocida de Inmunoglobulinas 3. Pipetas automáticas calibradas, jeringuillas de 5cc, torniquetes y alcohol 5. Platos plásticos de 60mm de diámetro METODOLOGIA l. Extraiga 4 cc de sangre a un voluntario por cada grupo. 2. Centrifugue por l0 minutos a 2000 rpm 3. Separe un plato de Inmunodifusión radial comercial 4. Dispense 5 ul del suero desconocido y 5 ul de los controles en pozos diferentes 5. Tape los platos y déjelos a 23oC + 2oC 6. Después de 48 horas mida el diámetro del círculo de precipitación 7. Según el diámetro obtenido calcule la concentración de la Ig graficando el diámetro al cuadrado obtenido vs. concentración conocida de IgM.

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


AUTO-FORMACION l. Describa la producción de Ig en el recién nacido después de los 6 meses y su concentración 2. Mencione condiciones clínicas asociadas a hipo e hiperinmunoglolubilinemia.


LABORATORIO # 5 INMUNODIFUSIÓN RADIAL DOBLE INTRODUCCIÓN Esta técnica simple y de gran utilidad, conocida también con el nombre de prueba de Ouchterlony, se basa en el principio de que cuando el inmunógeno y el anticuerpo se difunden en medio semisólido forman complejos inmunitarios estables y que se pueden analizar visualmente. La prueba se lleva a cabo al verter agarosa disuelta en tampón, sobre placas de vidrio o en cajas petri y permitir que se endurezca. Se perforan pequeños pozos en la agarosa, separados unos cuantos milímetros. Las muestras que contienen inmunógenos y anticuerpos se colocan en pozos opuestos y se permite que difundan uno hacia el otro en una cámara húmeda durante 18 a 24 horas. Las líneas de precipitación resultantes que representan complejos inmunógenos -anticuerpos, se analizan visualmente a la luz directa con ayuda de lupas.

La doble difusión en agarosa también se puede utilizar para análisis semicuantitativo, en donde se enfrentan diluciones seriadas del anticuerpo colocado en pozos que rodean al inmunógeno depositado en un pozo central; la última dilución que presenta banda de precipitación se reconoce como el título de precipitación del anticuerpo para ese inmunógeno en particular. OBJETIVO Practicar la técnica de inmunodifusión radial doble y reconocer las bandas de precipitación en medios semisólidos. REACTIVOS 1. Tabletas de agarosa en tris ph 7.2 (Bio-Rad 170-3002) 2. Porta objetos nuevos 3. Micropipetas de 5ml 4. Mechero Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


5. Vaso químico de 25 ml 6. Pipetas Pasteur 7. Suero Humano 8. Suero Anti-Ig humana 9. Antígeno de superficie de hepatitis B PROCEDIMIENTO 1. Disolver 3 mg de las tabletas de agarosa en 10 ml de agua destilada y calentar en baño maría hasta disolver 2. Esperar que se enfrié hasta 50 ó 55 ºC 3. Calentar un porta objeto de vidrio y extender sobre él 1,5 ml de agarosa 4. Espere que solidifique en posición horizontal por 5 min. Cerca de la salida del aire acondicionado 5. Hacer perforaciones siguiendo el patrón que se le indique 6. Prepare un diagrama representando la orientación de la placa y los diferentes reactivos que colocará en los respectivos pozos 7. Cargue los pozos y deje la placa dentro del plato Petrí con humedad a temperatura del cuarto para observar a las 24 horas RESPONDA 1. Diagrame la reacción de identidad, identidad parcial y no identidad 2. Cuál es la utilidad clínica de la prueba de Ouchterlony


CASO CLINICO # 3 INMUNIDAD FRENTE A LAS INFECCIONES (II) John, un niño de seis años, fue trasladado al servicio de urgencias tras dos días de malestar general, fiebre, hematuria e hinchazón facial. No tenía antecedentes de enfermedades renales ni de traumatismos abdominales. Entre los antecedentes de interés se encontraba una faringitis que había padecido unos 12 días antes, de la que se había recuperado sin necesidad de acudir a su médico de cabecera. Su madre recordaba que había sido vacunado según los protocolos habituales. En la exploración física, John estaba febril, presentaba edema periorbital y en los tobillos, mientras que su presión arterial fue de 130/90 mm Hg. La piel del rostro y del tronco se estaba descamando y su lengua estaba enrojecida. El resto de los datos obtenidos en la exploración física carecía de importancia. En la figura 3.1 se muestran los resultados de las investigaciones analíticas llevadas a cabo. Se estableció un diagnóstico de glomerulonefritis postestreptocócica y se inició el tratamiento con bencilpenicilina. La retención hídrica fue controlada mediante la restricción de la ingesta de sal y de agua y también por la administración de diuréticos del asa. Al cabo de una semana, su presión arterial se había reducido a 105/70 mm Hg y habían desaparecido la hematuria y la proteinuria. Algunas semanas después, su concentración de C3 había vuelto a la normalidad. En el seguimiento posterior, el paciente se mostró normal, sin deterioro renal alguno. PREGUNTAS ¿Cuál es la patogénesis de la glomerulonefritis postestreptocócica? ¿Qué se puede observar al teñir una biopsia renal de este paciente con anticuerpos anti-lgG y anti-C3 marcados con fluoresceína? ¿Cuál es el pronóstico a largo plazo de este trastorno? ¿Son igualmente patógenas todas las cepas de estreptococos del grupo A? Investigación

Resultado (rango normal)

Hemoglobina (g/di)

10,4 I (13,5-18,0)

Recuento de leucocitos (x IO>/L>

10,1 (4,0-11,0)

Recuento de plaquetas (x 10>/L)

285 (150-400)

Albúmina sérica (g/L)

31 (35-50)

Suero Sodio (mmol/L)

1 39 (135-145)

Potasio (mmol/L)

5,5 (3,5-5,0)

Cloro (mmol/L)

104 (95-105)

Urea (mmoi/L)

8,5 (2,5-6,7)

Orina Examen macroscópico

Hematuria macroscópica

Glucosa

Negativo

Cuerpos cetónicos

Negativo

Microscopía

~5 leucocitos/ml

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


Cultivo

Eritrocitos Cilindros granulosos <104 organismos/ml en cultivo mixto

Excreción de proteínas/24 horas

2,1 g

Aclaramiento de creatinina

85 ml/min/1,73 m2

Cultivo de exudado faringeo

Positivo para Streptococcus pyogenes

Anticuerpos antiestreptocócicos Estreptolisina 0 (ASLO)

Positivo

ADNasa B

Positivo

Hialuronidasa

Positivo

C3 Sérico (g/L)

0,35 (0,75-1,65)

C4 sérico (g/L)

0,41 (0,20-0,65)

RESPUESTAS ¿Cuál es la patogénesis de la glomerulonefritis postestreptocócica? La glomerulonefritis postestreptocócica puede aparecer a cualquier edad, pero es más frecuente en niños varones. La incidencia de la enfermedad, al igual que la de la fiebre reumática, ha disminuido debido a la amplia utilización de antibióticos en niños con infecciones del tracto respiratorio. Los síntomas renales aparecen entre una y tres semanas después de una infección aguda (como una faringitis) debida a estreptococos fi-hemolíticos del grupo A. Los pacientes presentan un síndrome nefrótico, que se caracteriza por oliguria, hematuria, proteinuria, edema difuso e hipertensión. En la biopsia renal se aprecia una glomerulonefritis proliferativa difusa aguda. El tamaño de los glomérulos se encuentra aumentado, así como su celularidad. Entre los cambios celulares se observan un aumento del número de células endoteliales y mesangiales y una infiltración de neutrófilos y macrófagos. Mediante microscopía electrónica se pueden observar depósitos granulares subepiteliales electrodensos. ¿Qué se puede observar al teñir una biopsia renal de este paciente con anticuerpos anti-gG y anti-C3 marcados con fluoresceína? En la inmunofluorescencia se observa que las zonas electrodensas están formadas por acumulaciones de IgG y C3, lo que implica un depósito de inmunocomplejos a nivel subepitelial. Se supone que estos complejos también contienen antígenos estreptocócicos unidos a sus correspondientes anticuerpos. Sin embargo, los experimentos encaminados a demostrar la presencia de antígenos bacterianos en los glomérulos han dado lugar a resultados contradictorios, por lo que no se sabe con certeza si los complejos se forman en la circulación o in situ. La baja concentración de C3 circulante y los elevados títulos de anticuerpos antiestreptolisina O (ASLO) avalan la participación de los inmunocomplejos en esta forma de glomerulonefritis.

¿Cuál es el pronóstico a largo plazo de este trastorno? Si se instaura rápidamente el tratamiento adecuado, el pronóstico de esta enfermedad suele ser excelente. Los glomérulos suelen recobrar la normalidad a las pocas semanas, aunque el incremento del número de células mesangiales puede persistir durante varios meses. El curso de la enfermedad puede ser más prolongado en los pacientes adultos, y en


una parte de ellos la función renal queda permanentemente alterada. La mayoría de los pacientes no se presentan con insuficiencia renal aguda, por lo que sólo suele ser necesario un tratamiento de apoyo. En los niños es importante controlar la hipertensión para evitar el desarrollo de una encefalopatía hipertensiva, que se puede producir incluso ante leves elevaciones de la presión arterial. Conviene recordar que otros agentes infecciosos también pueden provocar glomerulonefritis, como por ejemplo Staphylococcus aureus, el virus de Epstein-Barr y los parásitos causantes del paludismo. Entre estos casos, la glomerulonefritis más importante es la que pueden padecer los individuos con endocarditis infecciosa. Esta enfermedad puede ser debida a diversos organismos, entre los que se encuentran Streptococcus viridans y los estafilococos. ¿Son igualmente patógenas todas las cepas de estreptococos del grupo A? No todas las cepas de estreptococos del grupo A son igualmente patógenas. Los tipos 1,4, 12, 25 y 49 de Griffith son nefritógenos, mientras que el resto no provoca enfermedad renal. Por el momento, no hay ninguna explicación para este fenómeno.

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


CASO CLINICO # 4 INMUNIDAD FRENTE A LAS INFECCIONES (II) El Sr. Rangel, de 61 años de edad, había trabajado toda su vida en granjas y bosques y no había padecido enfermedad alguna. Acudió a su médico de cabecera debido a una intensa cefalea, rigidez de nuca y dificultad y dolor con la flexión anterior de la cabeza. También había tenido problemas de dicción y de deglución, ya que no conseguía retener los alimentos y los líquidos en la boca. Necesitaba la ayuda de su esposa para levantarse de la cama y de su sillón, debido a la rigidez de sus articulaciones, y sus manos le dolían especialmente. Recientemente había padecido un breve episodio de gripe, y pensaba que los síntomas que presentaba debían estar relacionados con la misma. Su temperatura corporal era de 38,6 °C, y presentaba un cierto grado de fotofobia. En la figura 4.1 se muestran los resultados de las investigaciones analíticas llevadas a cabo en ese momento. El médico sospechó que había desarrollado una enfermedad sistémica aguda que afectaba a las articulaciones, por lo que decidió que debía ingresar en un hospital. En el momento del ingreso, la artralgia y la fiebre eran evidentes, pero en un primer momento no se observó que padecía parálisis facial bilateral, ya que en reposo no presentaba asimetría facial. Ante la asociación de parálisis facial, cefalea y fotofobia se llevó a cabo inmediatamente una punción lumbar. A continuación, se obtuvo una historia clínica más completa. Cuando trabajaba en el bosque sufría frecuentemente picaduras de garrapatas. Un mes antes de su ingreso había observado la aparición de un ligero exantema eritematoso alrededor de una zona de una de sus piernas en la que había sufrido una picadura de garrapata unas dos semanas antes. El exantema había llegado a medir unos 20 cm de diámetro, pero después había desaparecido espontáneamente. Se llegó a un diagnóstico clínico de enfermedad de Lyme, y se instauró un tratamiento con bencilpenicilina. Unas seis horas después del inicio del tratamiento, los síntomas gripales se acentuaron, y el paciente desarrolló taquicardia y fiebre. Estos síntomas desaparecieron 24 horas después. A lo largo de las dos semanas siguientes la parálisis facial y el dolor articular se fueron reduciendo, y durante los dos años siguientes al diagnóstico se ha mantenido en buen estado de salud. Tras ser dado de alta, se confirmó el diagnóstico clínico de borreliosis de Lyme mediante una prueba de ELISA para detectar anticuerpos IgM e IgG frente a Borrelia burgdorferi, que resultó ser fuertemente positiva, y mediante una prueba de inmunomanchado (inmunoblot), en la que se observó el patrón característico de una infección diseminada reciente por dicho microorganismo. PREGUNTAS ¿Cuáles son las fases de la borreliosis de Lyme? ¿Por qué empeoró el estado del paciente al poco tiempo de iniciar el tratamiento con penicilina? ¿Cuál es la razón de los problemas neurológicos? ¿Se podrían deber en parte a analogías moleculares? ¿A qué se puede deber la falta de especificidad de las determinaciones de anticuerpos en la enfermedad de Lyme? ¿Por qué desarrollan artritis crónica algunos de estos pacientes?


Investigación

Resultado ¡rango normal)

Hemoglobina (g/di)

14,8 (13,5-18,0)

Recuento de leucocitos (x KP/L) Recuento de linfocitos (x KP/L)

12,5 (4,0-11,0) 7,9 (1,6-3,5)

VSG Suero Sodio (mmol/L) Potasio (mmol/L¡ Cloro ( mmol/L) Urea (mmoi/L> Creatinina (gmoi/L) Glucosa sanguínea (mmoi/L)

42 mm/hora

Investigación

Resultado (rango normal)

Proteínas en LCR (mg/L) Glucosa en LCR (mmoi/L)

520 (150-450)

1 38 (134-145) 4,2 (3,5-5,0) 100 (95-105) 6,2 (2,5-6,7) 102 (70-150) 6,2 (<10,0)

Frotis de LCR

3,0 (>60% de la concentración sanguínea de glucosa)

500 linfocitos/mm3 Ausencia de eritrocitos Ausencia de organismos

RESPUESTAS ¿Cuáles son las fases de la borreliosis de Lyme? La enfermedad de Lyme se debe a la infección por la espiroqueta B. burgdorferi, que se transmite mediante las picaduras de garrapatas infectadas. El reservorio habitual del organismo son los ciervos y otros animales. El curso clínico del Sr. Ranger es el clásico de esta enfermedad. Fase 1: infección localizada temprana. Esta fase se denomina eritema migratorio, y consiste en un exantema que se extiende a partir del punto de la picadura. En el borde del eritema migratorio se puede detectar antígeno del organismo. Fase 2: enfermedad diseminada temprana. Entre los síntomas clínicos más frecuentes se encuentran la presencia de eritema migratorio en múltiples zonas, la parálisis debida a los nervios faciales o craneales, la artritis en las articulaciones de los huesos cortos o largos y la carditis. Fase 3: enfermedad persistente tardía. Una pequeña proporción de los pacientes con afectación articular durante la fase 2 puede desarrollar artritis crónica en las articulaciones de los huesos largos. También pueden aparecer una enfermedad cutánea (acrodermatitis crónica atrófica) y una encefalo- mielitis por Borrelia. ¿Por qué empeoró el estado del paciente al poco tiempo de iniciar el tratamiento con penicilina? La penicilina, un agente antibacteriano, actúa sobre la pared celular de la espiroqueta y libera antígenos bacterianos tanto a nivel local como sistémico. La sangre y el LCR de los pacientes con enfermedad de Lyme contienen anticuerpos IgM e IgG. Los complejos antígeno/anticuerpo que se forman fijan el complemento y provocan inflamación allá donde «precipitan». Los pacientes pueden sufrir dolor e inflamación articulares, cefalea, exantema (urticaria) y fiebre, que es un signo característico. El motivo de la fiebre es que los productos bacterianos provocan también la liberación de citocinas (entre las que se encuentra la IL-1) por parte de los macrófagos. Los inmunocomplejos formados con los antígenos de Borrelia son eliminados finalmente por el sistema fagocítico, con lo que los síntomas desaparecen. Esta es una típica reacción de hipersensibilidad de tipo III. ¿Cuál es la razón de los problemas neurológicos? ¿Se podrían deber en parte a analogías moleculares?

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


Los pacientes con enfermedad de Lyme muestran síntomas que reflejan la afectación tanto del sistema nervioso central como del periférico. La infección se puede diseminar hasta el sistema nervioso central y manifestarse en forma de parálisis de origen nervioso. En el estudio del LCR se suele observar un número anormalmente elevado de linfocitos, una ligera elevación de la concentración de proteínas y una concentración normal de glucosa. En algunas ocasiones es posible aislar Borrelia a partir del LCR. Sin embargo, es más sencillo confirmar la infección mediante la detección del ADN, utilizando la RCP. Es probable que los problemas neurológicos centrales sean debidos a la infección del SNC. Algunas veces, los sintomas se alivian tras la administración de antibióticos, lo que apoya la teoría de que son debidos directamente al proceso infeccioso. En diversas enfermedades neurológicas se puede detectar la presencia de anticuerpos frente a antígenos neuronales. En los pacientes con enfermedad de Lyme y afectación del sistema nervioso central se ha observado la presencia de anticuerpos frente a los axones, y se ha demostrado mediante diversos experimentos que estos anticuerpos pueden ser absorbidos tanto por antígeno de Borrelia como por tejido procedente del sistema nervioso cen tral, lo que sugiere que existe un fenómeno de reacción cruzada entre el microorganismo y el tejido del SNC. Los anticuerpos frente a la flagelina se unen a los axones, pero su presencia no implica la existencia de enfermedad de Lyme, ya que también aparecen en otras enfermedades causadas por organismos con flagelos. En cualquier caso, este hecho puede implicar que en el mecanismo de esta enfermedad subyace un fenómeno de analogía molecular. ¿A qué se puede deber la falta de especificidad de las determinaciones de anticuerpos en la enfermedad de Lyme? En la mayoría de los métodos de ELISA utilizados para diagnosticar la enfermedad de Lyme se emplean como antígenos de fase sólida los productos obtenidos mediante sonicación de células intactas. La respuesta de anticuerpos va dirigida contra los flagelos, por lo que también se puede producir una unión inespecífica en caso de infecciones con otras bacterias flageladas, como Borre- lia, Treponema pallidum, espiroquetas de la cavidad oral y otros organismos. También pueden aparecer reacciones cruzadas en presencia de factor reumatoide, anticuerpos antinucleares y en la mononucleosis infecciosa. Los antígenos ante los que ha reaccionado el individuo se pueden determinar mediante la técnica de manchado de Western (Western blot), con lo que se puede confirmar la especificidad de la prueba de ELISA. Este sistema es especialmente útil para el serodiagnóstico o la exclusión de la enfermedad de Lyme tardía, ya que la infección crónica da lugar a un patrón de manchado de Western característico. Si se confía excesivamente en las técnicas serológicas por sí solas, se corre el peligro de llegar a diagnósticos de enfermedad de Lyme falsamente positivos. Los resultados de estas pruebas siempre deben ser interpretados conjuntamente con los síntomas observados y con una historia clínica detallada en la que se aclare si ha existido exposición previa al microorganismo. Los resultados verdaderamente positivos debidos a una infección previa también pueden generar problemas cuando se lleva a cabo el estudio de un individuo para diagnosticar una enfermedad no relacionada. Esto es especialmente cierto en el caso de pacientes procedentes de regiones en las que B. burgdorferi es endémica.


¿Por qué desarrollan artritis crónica algunos de estos pacientes? En los casos de enfermedad de Lyme en los que la enfermedad se ha contraído en América del Norte, las complicaciones artríticas son más frecuentes que en los casos contraídos en Europa. Esto se puede deber, al menos en parte, a la cepa del organismo causante de la infección. Se conocen cuatro subespecies bien definidas de B. burgdorferi, de entre las cuales la más importante está claramente asociada con complicaciones artríticas. En los pacientes con artritis crónica de Lyme se ha observado una respuesta de anticuerpos muy enérgica frente a la proteína A (osp A) de la superficie externa del organismo. En Europa, el panorama es más variado. B. garinii y B. afzelii son más frecuentes que B. burgdorferi y no provocan respuestas tan enérgicas de anticuerpos frente a osp A. Un hecho interesante es que osp A es reconocida preferentemente por líneas de células T procedentes de pacientes con artritis refractaria al tratamiento con antibióticos, mientras que no suele ser reconocida por las células T de los pacientes con artritis que responde al tratamiento. La artritis crónica de Lyme resistente a los antibióticos sólo aparece en una pequeña proporción de pacientes, todos ellos HLA-DR4L Las lesiones sinoviales de la artritis crónica de Lyme son parecidos a las que se observan en la artritis reumatoide. La artritis de Lyme es una de las pocas formas de artritis crónica cuyas causas son desconocidas.

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


LABORATORIO # 6 INMUNOFLUORESCENCIA (IFA) INTRODUCCION Las sustancias fluorescentes poseen la capacidad fisicoquímica de que al absorber luz en el espectro ultravioleta (200-400 nm) pueden emitir luz de un ámbito de longitud de onda de luz visible. La longitud de onda de la luz absorbida y emitida es específica para cada fluorocromo (Fluoresceína. Rhodamina B. DANSYL, etc.). El microscopio de fluorescencia, por medio de una serie de filtros, sólo permite que la luz dentro del espectro de longitud de onda visible atraviese y pueda ser captada por el ojo humano. El principio básico de la inmunofluorescencia radica en la conjugación o marcación de las inmunoglobulinas (Ig) con diferentes fluorocromos sin que los primeros (Ig) pierdan su capacidad de reconocer de manera específica a el inmunógeno que la indujo. Podemos hablar, en grandes rasgos, de 2 tipos de técnicas de inmunofluorescencia: la directa y la indirecta. Inmunofluorescencia directa: utiliza un anticuerpo específico marcado con un fluorocromo para determinar la presencia de un inmunógeno deseado, por ejemplo: para detectar infección por Citomegalovirus, Pneumocystis, etc. Inmunofluorescencia indirecta: Es usada para la detección de anticuerpos, en este caso usamos una antiinmunoglobulina humana marcada con un fluorocromo para detectar la presencia de anticuerpos contra un inmunógeno específico, por ejemplo: Anticuerpo contra Toxoplasma, Leshmania, Treponema, HIV, ANA etc.

Fluorochrome Labeled Ab

Y Fluorochrome Labeled Anti-Ig

Ag Tissue Section Inmunofluorescencia Directa

Tissue Section Inmunofluorescencia Indirecta


Esta técnica presenta dos desventajas muy importantes: la primera es que se debe disponer de un microscopio especial (de fluorescencia) y la segunda es la poca reproducibilidad dado que depende de la subjetividad del operador.

OBJETIVO Familiarizar al estudiante con la técnica de inmunofluorescencia. MATERIALES 1. Placas con taquizoitos de Toxoplasma Gondii fijados con formalina 2. PBS pH 7.4 3. Conjugado anti-Ig humano con FITC. 4. Azul de Evans 5. Tampón de Montaje 6. Sueros Controles 7. Microscopio de Fluorescencia METODOLOGIA 1. Haga diluciones seriadas de los sueros controles en PBS hasta 1:2048 en factores de 2 y volumen final de 50 ul. 2. Cubra solo 6 hoyos de la placa con las últimas diluciones. Deje libre el último de cada fila. 3. Incube en cámara húmeda por 30 min. a temperatura ambiente 4. Lave en PBS por 10 min. sin agitar. 5. Seque con papel de filtro. 6. Agregue el conjugado de anti-Ig humano con fluoresceína. 7. Incube en cámara húmeda por 30 min. a TA. 8. Lave como en paso 4. 9. Seque y cubra la placa usando tampón de montaje. 10. Guarde sus placas a -20ºC hasta el próximo período de laboratorio 11. En este período usted debe dedicarse a observar al microscopio de fluorescencia y reconocer los diferentes patrones de anticuerpos antinucleares.

AUTOFORMACION: l. ¿Qué cambio necesita hacer para usar la técnica de IFA en el diagnóstico de toxoplasmosis congénita? 2. Diagrame y describa todos los materiales para realizar inmunofluorescencia directa para detectar virus de rubéola 3. Diagrame y describa todos los materiales para realizar inmunofluorescencia indirecta para detectar anticuerpos contra el virus de Ebola 4. Diagrame los patrones de anticuerpos antinucleares y mencione los principales autoanticuerpos que forman tales patrones y a que enfermedades autoinmunes se relacionan. Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


CASO CLINICO # 7 INMUNODEFICIENCIA SELECTIVA DE IgA Juan nació a término tras un embarazo sin complicaciones y no padeció ninguna enfermedad importante durante los primeros 18 meses de vida. Fue vacunado según el protocolo habitual para su edad y no presento ningún problema de crecimiento ni de desarrollo. A partir de los dos años de edad comenzó a contraer con frecuencias infecciones del tracto respiratorio superior, algunas de las cuales fueron tratadas con amoxilina por vía oral. Fue ingresado dos veces en el hospital de su localidad con un diagnóstico de bronquiolitis, y en una de las ocasiones se le diagnosticó una neumonía del lóbulo medio. También fue remetido al equipo de ORL debido a una otitis media recurrente asociada a la amigdalitis. A los tres años de edad, Juan acudió a su médico de cabecera aquejado de una Investigación Hemoglobina (g/L) Recuento de leucocitos (x 109/L) Neutrófilos (x 109/L) Eosinófilos (x 109/L) Linfocitos totales (x 109/L) Linfocitos T (x 109/L) Linfocitos B (x 109/L) Inmunoglobulinas séricas IgG (g/L) IgG 1 (g/L) IgG 2 (g/L) IgG 3 (g/L) IgG 4 (g/L) Ig M (g/L) Ig E (g/L) Ig A (g/L) Anticuerpos frente a las vacunaciones Pruebas cutáneas D. pteronyssinus* Gato Mezcla de gramíneas Huevo Leche Sodio en sudor †

Resultado (Ámbito normal) 15.2 (13,5-18,0) 9.8 (6,8-1,0) 5.4 (2,0-7,5) 0,67 (0,4-0,44) 4,3 (2,0-4,1) 2,4 (2,7-5,3) 1,0 (0,6-1,4)

18,9 (4.9-16.1) 14,3 (5,6-11,3) 3,6 (0,4-4,0) 0,6 (0,3-0,8) 0,62 (0,14-0,95) 2,4 ( 0,5-2,0) 235 (3-150) 0,025 (0,4-0,2) Presencia de todos ellos Positivo grado 3 Positivo grado 3 Positivo grado 3 Positivo grado 3 Positivo grado 2 57 mmol/L

rinorrea purulenta unilateral asociada con dolor nasal, goteo posnasal, fiebre y malestar general. En la exploración física resultó evidente que se encontraba enfermo, con una taquicardia de 125 latidos/min y una temperatura de 38.8°C. Su fosa nasal izquierda estaba empapada por exudado, así como sus cornetes nasales, que además estaban enrojecidos e inflamados. Fue ingresado en el hospital, en donde se observó la presencia de líquido en el seno maxilar izquierdo mediante una radiografía frontal de cráneo, hecho que confirmó el


diagnóstico de sinusitis maxilar aguda. La infección desapareció en el plazo de cuatro días, tras la administración de ampicilina por vía intravenosa. A los cinco años de edad, desarrolló tos nocturna persistente acompañada de sibilancias y disnea. Se llevó a cavo una determinación de flujo máximo, que resultó ser inferior al normal para su edad y talla. Se estableció un diagnóstico de asma alérgica y se instauró un tratamiento por vía inhalatoria con cromoglicato sódico (un agente estabilizador de la membrana de los mastocitos) y salbutamol (un agente antagonista de los receptores B2-adrenérgicos). Durante el verano siguiente aparecieron síntomas típicos de la fiebre del heno, como rinorrea acuosa y conjuntivitis pruriginosa, que fueron tratados con antihistamínicos administrados por vía oral. A lo largo del invierno siguiente fue ingresado dos veces en el hospital, debido a asma aguda grave complicada con infecciones torácicas de origen bacteriano. En el cuadro de la próxima página se muestran los resultados de las investigaciones llevadas a cabo durante uno de estos episodios. Se estableció un diagnóstico de déficit selectivo de IgA, y se prescribió la continuación de los tratamientos frente al asma y las infecciones del tracto respiratorio. Algunos meses después fue sometido a una amigdalectomía debido a sus problemas de amigdalitis recurrente. * Ácaro presente en polvo doméstico. † Una concentración de sodio en sudor superior a 70 mmol/L en un niño confirma el diagnóstico de fibrosis quística. PREGUNTAS y RESPUESTAS 1. ¿Cuáles son la etiologías y la patogénesis del déficit selectivo de IgA? El déficit selectivo de IgA es la causa más frecuente de inmunodeficiencia primaria, se presenta con una incidencia de 1 / 700, aunque en algunos países, como Japón, la incidencia es sólo de 1/ 18 500. La mayoría de los casos aparecen esporádicamente, aunque también se han descrito algunas formas hereditarias que, en algunas poblaciones, puede llegar a constituir el 20% de los casos detectados. Al estudiar a estas familias se han observado dos formas de transmisión de la enfermedad: una presenta carácter autonómico dominante y la otra, carácter autosómico recesivo. En los pacientes con déficit de IgA, el haplotipo HLA- B8, -DR3 es más frecuente que en la población general, igual que ocurre en los pacientes con enfermedad celíaca. En el ser humano existen dos tipos de IgA, IgA1 e IgA2. IgA1 es la subclase que predomina en el suero, y se encuentra principalmente forma de monómero. IgA2 es la inmunoglobulina predominante en las secreciones (p.ej., saliva secreciones intestinales, mucosidades respiratorias), donde aparecen en forma de dímero, con las dos regiones Fc de los dos anticuerpos unidas mediante una cadena J. En el proceso de secreción a través de la mucosa interviene un componente secretor específico, que se une a un receptor celular. La mayoría de pacientes con déficit de IgA no produce ninguna de las dos subclases de inmunoglobulina, pero también se han descrito algunos casos de déficit de una sola de ellas. Cabría suponer que en los pacientes con el déficit, los genes que codifican la IgA no son normales, pero en los análisis cromosómicos no ha sido posible detectar delecciones en estos genes que codifican las cadenas pesadas de IgA, ni tampoco en la región encargada del proceso de conmutación necesario para que se produzca IgA. Además, en los pacientes con el déficit, el número de células B que expresan IgA de superficie es normal. Se ha Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


sugerido que estas células no son capaces de diferenciarse y dar lugar a células plasmáticas secretoras de IgA, aunque sí sean capaces de expresar esta inmunoglobulina en su superficie. 2. Con que otras entidades clínicas se asocia este trastorno? Hay tres tipos de trastornos asociados con el déficit de IgA: Infecciones bacterianas y víricas recurrentes de los tractos respiratorio e intestinal, atribuibles a la ausencia de IgA en las secreciones. La mayoría de los pacientes presenta concentraciones elevadas de IgG e IgM en el suero y en las secreciones, lo que puede ser la causa de que la mayoría de los individuos con déficit de IgA sean asintomático. Aquellos en los que no aparece este mecanismo compensador son los más propensos a las infecciones  La incidencia de enfermedades alérgicas es aproximadamente un 25% más alta en los pacientes sintomáticos con déficit de IgA que en la población normal. Es posible que esto sea debido a que la reducida capacidad de eliminación del alérgeno presente en las superficies mucosas aumente el tiempo de contacto con el mismo, pero aún no se ha podido demostrar. Estos pacientes suelen ser más refractarios a los tratamientos habituales de los procesos alérgicos.  El déficit de IgA se suele asociar a enfermedades autoinmunitarias, en diferente medida en cada individuo. También es elevada la incidencia de pacientes asintomático en los que se detectan autoanticuerpos, como factor reumatoide o anti-ADN y anticuerpos antinucleares. En muchos de estos pacientes también se detectan anticuerpos anti-IgA, que suelen ser de la clase IgG, pero que también pueden ser de las clases IgD, IgE o IgM. La incidencia de determinados trastornos inflamatorios también es más elevada en estos pacientes. 

Enfermedades autoinmunitarias sistémicas Lupus eritematoso sistémico, Artritis Rematoide, Dermatomiositis Enfermedades autoinmunitarios que afectan a un órgano concreto Diabetes mellitus insulinodependiente, Miastenia grave, Tiroiditis autoinmunitaria, Anemia perniciosa, Anemia hemolítica autoinmunitaria Enfermedades intestinales Enfermedad de Crohn, Colitis ulcerosa, Enfermedad celiaca

3. ¿Qué otras anomalías de las inmunoglobulinas cursan con concentraciones bajas de IgA, y en qué se diferencian clínicamente del déficit selectivo de IgA? Una cierta proporción de pacientes con déficit de IgA presentan también déficit de IgG2 y/o IgG4. En algunas familias se ha demostrado la existencia de defectos hereditarios de los genes de cadenas pesadas de inmunoglobulinas. Aunque en un individuo normal estas inmunoglobulinas constituyen solamente el 12% y el 5%, respectivamente, de la IgG sérica total, juegan un papel especial en las respuestas inmunitarias. Concretamente, el déficit de IgG2 está asociado con la falta de capacidad para responder frente a los antígenos capsulares polisacarídicos, como los de Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae. Estos dos organismos pueden provocar infecciones del tracto respiratorio y meningitis. Aún no está claro si la asociación del déficit IgA con el de IgG aumenta el riesgo de infección con respecto a los individuos que padecen solamente déficit de IgA, pero algunos casos aislados sugieren que esto puede ser cierto.


4. ¿Qué precauciones se deben tomar cuando se transfunde sangre a un paciente con déficit de IgA? Los pacientes con déficit de IgA pueden poseer anticuerpos anti-IgA.. En ese caso, la administración de transfusiones de sangre completa supone el riesgo de que se desencadene una respuesta anafiláctica grave, que puede incluso resultar mortal. En caso de que sea necesario administrar sangre a una paciente de ese tipo para corregir un estado anémico, se recomienda transfundir concentrados de hematíes y lavados previamente. Lo ideal sería transfundir al paciente su propia sangre previamente almacenada, o sangre compatible con respecto a los grupos ABO y Rh procedente de otro paciente con déficit de IgA. LA eficacia del tratamiento con gammaglobulina administrada por vía intravenosa de los pacientes con déficit de IgA no ha sido demostrada con claridad y conlleva indudables riesgos.

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


CASO CLÍNICO # 9 AGAMMAGLOBULINEMIA LIGADA AL CROMOSOMA X (ENFERMEDAD DE BRUTON) Alex nació a término después de un embarazo sin complicaciones. El parto fue normal y el peso del recién nacido fue de 4 kg. No fue necesaria ninguna maniobra de reanimación y el niño no presentaba anomalías anatómicas. Sus primeros meses de vida transcurrieron sin incidentes, pero a los seis meses de edad contrajo una infección del tracto respiratorio superior que se complicó con una sinusitis por Haemophilus influenzae. Fue ingresado en el hospital y tratado con cefotaxina, a la que respondió adecuadamente. Un mes más tarde volvió a acudir a su médico, aquejado de fiebre de dos días de evolución y problemas de alimentación. En la exploración física se mostró irritable, y se observaron deshidratación y una temperatura corporal de 38,5 °C. Su membrana timpánica izquierda estaba inflamada, pero sin que se apreciase perforación. Se le diagnosticó otitis media aguda y fue ingresado en el hospital para ser sometido a tratamiento antibiótico por vía parenteral y rehidratación. El agente causal, identificado mediante un cultivo de exudado faríngeo, resultó ser H. influenzae. A las 48 horas del ingreso, el estado general de Alex empeoró. Su somnolencia fue en aumento y comenzaron a aparecer episodios de apnea. Se llevó a cabo inmediatamente un estudio exhaustivo para localizar el foco de infección. Los resultados de esta investigación analítica se muestran en la figura 1. A la edad de 12 meses aparecieron enrojecimiento, dolor e inflamación en uno de sus brazos. Se diagnosticó una celulitis, que fue tratada con éxito con bencilpenicilina. A los 15 meses fue ingresado en el hospital debido a un grave episodio de diarrea y a la falta de aumento de peso. El análisis de las heces reveló que el microorganismo causante era Giardia lamblia, por lo que se administró de nuevo un tratamiento antibiótico prolongado para erradicar la infección. En ese momento, su estatura y su peso eran inferiores al tercer percentil, y sus dientes presentaban un deterioro impropio de su edad. La madre de Alex confirmó que había sido vacunado según los protocolos estándar5. Después de estas inmunizaciones no se había observado ninguna reacción anómala. Sus hermanas mayores, de tres y cinco años, habían crecido con normalidad y no habían presentado antecedentes de infecciones recurrentes ni refractarias al tratamiento. En la figura 2 se muestran los resultados de las investigaciones analíticas llevadas a cabo en ese momento. Se estableció el diagnóstico de agammaglobulinemia ligada al cromosoma X (enfermedad de Bruton), y se inició un tratamiento sustitutivo con IgG administrada por vía intravenosa. La inmunoglobulina se obtuvo mediante fraccionamiento con etanol de una mezcla de sueros procedentes de un gran número de donantes, y se administró cada tres o cuatro semanas. Se recomendó a los miembros de la familia que se sometiesen a un estudio genético, que fue llevado a cabo mediante sondas genéticas complementarias del gen causante de la enfermedad. En una revisión llevada a cabo varios años más tarde, el estado de salud de Alex era bueno, habiendo contraído solamente una infección pulmonar desde el momento del diagnóstico de su enfermedad.


Investigación Hemoglobina (g/dl) Recuento de leucocitos (x 109 /L) Glucosa sanguínea (mmol/L) Suero Sodio (mmol/L) Potasio (mmol/L) Cloro (mmol/L) Creatinina (μmol/L) Radiografía de tórax Examen microscópico de orina Organismos aislados

Resultado (rango normal) 14,7 (13,5-18,0) 15,2 (6,4-11,0) 8,1 (< 10,0) 147 (134-145) 4,7 (3,5-5,0) 102 (95-105) 120 (70-150) Normal ~5 leucocitos/ ml Cultivo mixto de <104 organismos/ml Negativo

Hemocultivo LCR obtenido mediante punción lumbar Aspecto Leucocitos polimorfonucleares/mm³ Proteínas (mg/L) Glucosa (mmol/L) Tinción de Gram Cultivo

Turbio 2.500 4,2 (150-450) 4,5 (>60% de la glucosa sanguínea) Bacilos Gram negativos Se aísla H. influenzae

Fig. 1 Resultados de las investigaciones analíticas

Investigación

Resultado (rango normal)

Hemoglobina (g/dl) Recuento de leucocitos (x 109/L) Neutrófilos (x 109/L) Eosinófilo (x 109/L) Linfocitos totales (x 109/L) Linfocitos T (x 109/L) Linfocitos B (x 109/L)

14,4 (13,5-18,0) 8,2 (6,8-10,0) 4,8 (2,0-7,5) 0,31 (0,4-4,4) 3,2 (20-4,1) 3,15 (2,7-5,3) Muy pocos, prácticamente Indetectables

Inmunoglobulinas séricas IgG (g/L) IgM (g/L) IgE (UI/L) IgA (g/L) Anticuerpos frente a las vacunaciones

0,31 (3,0-15,8) 0,03 (0,4-2,2) No se detecta (3-22) No se detecta (0,15-1,3) No se detectan

Fig. 2 Resultados de las investigaciones analíticas. Preguntas 1. ¿Cuáles son las características clínicas de la agammaglobulinemia ligada al cromosoma X (ALX)? 2. ¿Cuáles son las bases moleculares y genéticas de la ALX? 3. ¿Por qué no presentó problemas Alex durante sus primeros meses de vida?

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


Respuestas 1. La ALX se caracteriza por una gran reducción del número de linfocitos B circulantes y por una concentración sérica de inmunoglobulinas muy baja o nula. Las concentraciones de IgG suelen ser inferiores a 2 g/L, y las de las demás clases de inmunoglobulinas también son bajas o indetectables. En ocasiones, la concentración de IgE es normal. La médula ósea de los pacientes con ALX contiene una cantidad normal de células pre-B, lo que sugiere que la causa del defecto es un bloqueo en el proceso de diferenciación. Las formas más leves de la enfermedad, en que el número de células B es mayor, son poco frecuentes. Los individuos afectados suelen desarrollar infecciones recurrentes en su primer año de vida, que suelen ser debidas a Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae o estreptococos β-hemolíticos. Son frecuentes la neumonía, la bronquitis, la faringitis, la sinusitis y la otitis media, y en muchas ocasiones estas infecciones no responden rápida o adecuadamente al tratamiento. También son frecuentes la meningitis bacteriana y la artritis séptica; esta última puede ser causada por organismos poco frecuentes, como Ureaplasma urealyticum (agente etiológico de uretritis en los adultos). La infección por Giardia lamblia es una causa habitual de retraso en el crecimiento de estos niños. En general, los pacientes con ALX responden bien a las infecciones víricas, pero existen tres excepciones:  La vacuna viva atenuada de la polimielitis o el virus de tipo salvaje pueden provocar parálisis, por lo que esta vacunación se debe obviar.  Los enterovirus (p. ej., el virus ECHO 11) pueden provocar meningoencefalitis crónica.  Los virus de la hepatitis pueden provocar una grave hepatitis crónica activa. El tratamiento rápido de las infecciones resulta vital como coadyuvante de las infusiones de gammaglobulinas regulares. Estos últimos pueden añadirse al tratamiento de las infecciones agudas. 2. Recientemente, se ha localizado el locus génico de la ALX en la región Xq22 del brazo largo del cromosoma X. Esta zona ha sido secuenciada, habiéndose observado que presenta una alta homología con los miembros de la familia src de tirosin cinasas. Las tirosincinasas, que catalizan la fosforilación de moléculas de tirosina pertenecientes a proteínas, se presentan de dos formas: hay algunas que se encuentran unidas a la membrana citoplasmáticas. La tirosincinasa de Bruton (btk) pertenece a este último grupo. En la actualidad, está claro que la ALX se debe a alteraciones del gen btk, habiéndose detectado diversas mutaciones y delecciones en diferentes familias. Sin embargo, hasta el momento se desconoce con exactitud la función de la btk, pero su asociación con otras proteincinasas presentes en el receptor de antígeno de las células B sugiere que podría desempeñar un papel en la transmisión de señales en dicho receptor. El complejo receptor está compuesto por dos subestructuras. La primera, a la que se une el antígeno, es una inmunoglobulina de membrana, generalmente de las clases IgM o IgD. Estas inmunoglobulinas difieren de las que son secretadas en la presencia de una región transmembranal en el extremo carboxílico, mediante la cual se unen a la célula. La segunda subestructura, cuya misión es la transducción de la señal, está formada por un heterodímero que se mantiene unido mediante enlaces disulfuro, y que puede estar formado por las subunidades α y β o α y γ.


Blk, lyn, fyn, lck (todas ellas proteincinasas de la familia snc) y Syk (Ptk72syk) están asociadas con el receptor de antígeno de las células B, y se activan cuando éste se une al antígeno. Estas cinasas fosforilan diversas proteínas intracelulares, cada una de las cuales cumple una misión determinada en el proceso de activación celular, Hasta la fecha no se conocen bien las interacciones concretas entre el receptor y las vías efectoras. Recientemente, se ha demostrado que btk interacciona con fyn, lyn y blk. Por tanto, es posible que btk juegue un papel en la vía de transmisión de señales del receptor de antígeno, que da lugar finalmente a la activación de las células B. En este caso, sería lógico que las alteraciones de btk afectasen a este proceso, con el consiguiente bloqueo de la síntesis de inmunoglobulinas. 3. La IgG materna atraviesa la placenta a partir de la decimosexta semana de gestación, proporcionando al lactante unas concentraciones protectoras de inmunoglobulinas durante un período que oscila entre los seis y los nueve meses a partir del parto. Por ello, las complicaciones sólo aparecen cuando desaparecen los anticuerpos procedentes de la madre, momento en que el niño queda privado parcial o totalmente de la protección humoral. Muchos niños presentan un <<mínimo>> en la concentración de inmunoglobulinas séricas a los seis meses de edad, debido a la reducción de las que proceden de la madre y al aumento progresivo de la síntesis endógena. Cuando un niño de esta edad no es capaz de sintetizar IgG, se produce la hipogammaglobulinemia infantil transitoria. Esta entidad se suele distinguir de la ALX por la presencia de IgM, IgA, IgE e IgD, pero a veces existe déficit transitorio de IgM e IgA. En la mayoría de estos pacientes no es necesario el tratamiento con gammaglobulinas.

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


LABORATORIO # 7 ENSAYO DE INMUNOADSORCION LIGADO A ENZIMA (ELISA)

INTRODUCCION El ELISA (Enzimy-Linked Immunosorbent Assay) fue introducido por Engvall y Perlman al inicio de la década de los 70, como una técnica de ensayo inmunoenzimático (EIA) que permite la detección de antígenos y anticuerpos. Existe una amplia variedad de pruebas de ELISA, como son: pruebas directas, indirectas, captura y competencia. En la búsqueda constante de una mayor sensibilidad y especificidad, dan cambios significativos en los reactivos que contribuyen a la detección más temprana del antígeno anticuerpo buscado, de tal manera que este se reconoce como una nueva generación de los reactivos. De allí que existen pruebas de ELISA de primera, segunda, tercera y cuarta generación actualmente. Esta prueba de ELISA también tiene muchas aplicaciones en la detección de otras sustancias (drogas, enzimas, hormonas, antibióticos, marcadores de daño cardiovascular, metabolitos etc.) PRINCIPIO Se basa se fundamenta en la reacción antígeno anticuerpo, utilizando una superficie o fase sólida que pueden ser micropozos o esferas, sobre las cuales se encuentran fijos antígenos o anticuerpos, contra los que actúa un anticuerpo conjugado a una enzima, la cual es capaz de catalizar una reacción con un sustrato que en presencia de un indicador de oxidoreducción se transforma en un producto colorido, para la detección de anticuerpos o antígenos correspondientemente

CARACTERISTICAS Es objetivo, alta sensibilidad y especificidad, los reactivos tienen buena estabilidad, se puede automatizar y no necesita equipos caros ni sofisticados CLASIFICACION


Se conocen diferentes tipos de ELISA como: ELISA directo, ELISA indirecto, ELISA de captura y el ELISA de competencia. ENZIMAS

CROMOGENOS

SUBSTRATOS

Fosfatasa alcalina Peroxidasa

Rojo fijo DAB (Diaminobenzidina) OPD (Ortho-fenilendiamina) TMB (Tetrametilbencidina) ABTS

PNPP (Para-nitrofenil-fosfato) Peróxido

OBJETIVOS l. Demostrar el procedimiento para desarrollar la prueba de ELISA 2. Discutir sobre las utilidades de la técnica MATERIALES l. Kit Vironostika Uni-Form II (Organon Teknika) microELISA para HIV 2. Pipeta ajustable de l0-l00 microlitros 3. Puntillas 4. Lector automático de microELISA 5. Incubadora a 37oC. 6. Lavador automático o bomba de succión. METODOLOGIA l. Dispensar l00ul de diluyente de muestra en los pocillos a usar 2. Dispensar 50ul de muestra o control en los pocillos: l y 2 PBS; 3 y 4 control negativo; 5 y 6 control positivo para HIV-l; 7 y 8 control positivo para HIV-2; 9 y 10 desconocido l; ll y 12 desconocido 2. 3. Incube por l hora a 37oC diez minutos antes de finalizar la incubación prepare la solución reveladora: 1 ml de TMB más 1 ml de peróxido de urea. 4. Lave 6 veces con PBS 5. Adicione l00 ul de solución reveladora en cada pocillo e incube a TA por media hora. 6. Detenga la reacción con l00 ul de ácido sulfúrico l M 7. Lea en el Lector de microELISA a 450 nm AUTOFORMACION 1. Describa los diferentes tipos de microELISA 2. Enumere las ventajas y desventajas del microELISA 3. Diagrame un ELISA directo e indirecto para determinar la concentración de anticuerpos y antígenos de papera. Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


CASO CLINICO # 13 INMUNODEFICIENCIA PRIMARIA (ENFERMEDAD GRANULOMATOSA CRONICA) Justino nació tras un embarazo de 41 semanas que trascurrió sin incidentes, en un parto en el que fue necesaria la utilización del fórceps. Pesaba 3,7 kg. y no presentaba anormalidad alguna a los 13 meses de edad desarrolló una inflamación bilateral en la región inguinal que fue en aumento. Transcurrido varios días, las lesiones empezaron a liberar un líquido purulento a través de múltiples conductos. En la exploración física se mostró febril e irritante, y se observó que su peso y su perímetro craneal eran inferiores a los propios de su edad. En el cultivo de líquido purulento se aisló Staphylococcus aureus, por lo que se instauró un tratamiento con flucloxacilina. A los 15 meses de edad, Justino fue atendido en el servicio de urgencias debido a fiebre alta, irritabilidad, malestar general y rechazo de la alimentación. La exploración física demostró que estaba claramente enfermo, con una temperatura corporal de 39,0 ºC. su peso y su estatura eran inferiores al tercer percentil correspondiente a su edad. El tamaño de su bazo y de su hígado era mayor de lo normal, la palpación resultaba dolorosa y presentaba linfadenopatias inguinales y cervicales. La rodilla de su pierna izquierda presentaba una inflamación fluctuante, estaba enrojecida y resultaba dolorosa. Su madre recordaba que había sido vacunado según los protocolos estándar, sin haber presentado ningún tipo de reacción adversa. En el cuadro inferior se muestra los resultados de las investigaciones analíticas llevadas a cabo. Investigación Hemoglobina Recuento de los leucocitos (x 109/L) Suero Sodio (mmol/L) Potasio (mmol/L) Cloro (mmol/L) Creatinina (µmol/L) Hemocultivos Radiografía del tórax Radiografía abdominal

Resultado (Ámbito normal) 12,4 ( 13,5-18,0) 25,6 (6, 8-10,0)

141 (134-145) 4,3 (3, 5-5, 0) 104 (95-105) 97 (70-105) Negativo Normal Sombreado hepático difuso Involucro y secuestro del extremo Radiografía de las articulaciones de distal del fémur Izquierdo con un las rodillas derrame purulento en la rodilla izquierda Se estableció un diagnóstico de osteomielitis aguda con artritis piógena, y se inició el tratamiento con flucloxacilina y gentamicina administradas por vía parenteral. La hepatosplenomegalia fue investigada más a fondo mediante tomografía computarizada que reveló la presencia de múltiples lesiones hepáticas hiperdensas. En el examen histológico de una biopsia hepática obtenida mediante la ayuda de tomografía computarizada, se observaron microabsesos y granulomas no supurativos de células gigantes. Durante el período de convalecencia en el hospital, en la pared torácica de Justino apareció una inflamación rojiza y fluctuante, que hubo de ser drenada quirúrgicamente y requirió la administración de más antibióticos. El organismo causal fue identificado como


Pseudomonas aeruginosa. Los resultados de las investigaciones llevadas a cabo durante este episodio se muestran en el cuadro inferior Investigación Recuento de los leucocitos (x 109/L) Neutrófilos (x 109/L) Eosinófilos(x 109/L) Linfocitos totales (x 109/L) Linfocitos T (x 109/L) Linfocitos B (x 109/L) Inmunoglobulinas séricas IgG (g/L) IgG 1 (g/L) IgG 2 (g/L) IgG 3 (g/L) IgG 4 (g/L) IgM (g/L) IgE (Ul/L) IgA (g/L) C3 (g/L) C4 (g/L) Anticuerpos frente a las vacunaciones Nitroazul de tetrazolio Incubación in vivo de leucocitos con S. aureus

Resultado (Ámbito normal) 26,3 (6, 8-10,0) 21,2 (2,0-7,5) 0,88 (0,4-0,44) 4,1 (2,0-4,1) 2,1 (2,7-5,3) 0,1 (0,6-1,4) 17,2 (3,0-15,8) 10,6 (1,5-9,8) 4,2 (0,3-3,9) 1,1 (3-22) 0,71 (0,05-0,65) 2,7 (0,4-2,2) 11 (3-22) 1,7 (0,15-1,3) 1,98 (0,75-1,65) 0,80 (0,20-0,65) Todos ellos presentes a concentraciones normales Prueba de reducción del colorante negativa Menor actividad bactericida que la de los controles

Se estableció un diagnóstico de enfermedad granulomatosa crónica, y se mantuvo ingresado a Justin para someterlo a un nuevo tratamiento antibiótico. También se prescribieron agentes profilácticos antibacterianos y antifúngicos. A lo largo del siguiente año fue ingresado en dos ocasiones debido a abscesos estafilocócicos recurrentes, que fueron tratados de forma agresiva mediante la administración de altas dosis de antibióticos por vía parenteral y durante largos períodos de tiempo, así como mediante drenaje quirúrgico. PREGUNTAS 1. ¿Cuál es la patogénesis de la enfermedad granulomatosa crónica (EGC) y cómo se hereda? El término enfermedad granulomatosa crónica engloba a una serie de enfermedades hereditarias poco frecuentes relacionadas con el estallido respiratorio de las células fagocíticas (macrófagos/monocitos y polimorfonucleares). Su incidencia está comprendida entre 1:250.000 y 1:1.100.000 nacimientos/año. El estallido respiratorio se caracteriza por la producción de novo de anión superóxido, según la reacción: NADPH + 2 O2

-----) NADP+ + 2 O2- + H+

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


El anión superóxido O2- se descompone rápidamente, dando lugar a radicales libres hidroxilo, a peróxido de hidrógeno y a ácido hipocloroso, todos ellos con actividad bactericida. Esta reacción es catalizada por una oxidasa dependiente de NADPH que se encuentra en los fagocitos. Esta enzima consta al menos de cinco subunidades, que se unen entre sí cuando la célula es activada por la fagocitosis o por la acción de péptidos quimiotácticos. En el proceso de activación, p47-phox se fosforila, y se produce la migración de p47-phox y p67-phox desde el citosol hasta la membrana celular, en donde se asocian al citocromo b558. Una vez ensambladas las subunidades, el complejo es capaz de catalizar la reacción indicada anteriormente, y se produce el estallido respiratorio. La EGC se debe a mutaciones heredadas de los genes que codifican las subunidades del citocromo. En los pacientes afectados, la fagocitosis se lleva a cabo normalmente, pero los organismos fagocitados sobreviven en el interior de las células, debido a la ausencia de estallido respiratorio. Su presencia estimula la formación de granulomas, que provocan algunos de los síntomas debido al espacio físico que ocupan. Entre los procesos infecciosos que aparecen con frecuencia en estos pacientes se encuentran la neumonía, la linfadenitis supurativa, los abscesos hepáticos, la osteomielitis y la septicemia. Los organismos más habituales que suelen provocar estos procesos son Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Aspergillus y Candida spp. Componentes de la oxidasa dependiente de NADPH y defectos presentes en la EGC Proteínas Subunidad Subunidad α del β del citocromo citocromo b558, p22b558, phox gp91-phox P47-phox P67-phox rac1/rac2 Peso molecular 22 91 47 67 desconocido (Kdal) Localización Integral de Integral de de la citosol citosol citosol membrana membrana proteína GEN 16q24 Xp 21,1 7q11,23 1q25 desconocido Mecanismo Recesivo de herencia Autonómico ligado al Autonómico Autonómico No se conoce recesivo cromosoma recesivo recesivo ninguno X % de los ‹5% -65% -30% ‹5% casos 2. ¿En qué se basan las pruebas diagnósticas de la EGC? Una forma sencilla de detectar selectivamente a los pacientes con EGC es la prueba de nitroazul de tetrazolio (PNT). Este colorante amarillo es reducido a cristales azules en presencia de fagocitos capaces de llevar a cabo el estallido respiratorio. Por tanto, en los pacientes con EGC el resultado de la PNT es negativo. Otra característica de la EGC es la reducción de la capacidad bactericida, por lo que también se puede estudiar a los pacientes mediante incubación conjunta de sus leucocitos con bacterias.


3. ¿Cómo se debe tratar a los pacientes con EGC? La naturaleza potencialmente mortal de las infecciones que contraen los pacientes con EGC hace precisa la utilización de profilaxis antimicrobiana. Un fármaco muy utilizado es el cotrimoxazol (trimetoprima asociada a sulfametoxazol), ya que posee actividad bactericida a nivel intracelular y es activo frente a los estafilococos y las bacterias gramnegativas. Las diferentes especies de Aspergillus también son una causa importante de morbilidad y mortalidad en los pacientes con EGC, por lo que también es aconsejable la administración profiláctica de itraconazol. Las inyecciones intradérmicas de interferón gamma (IFN-γ) también son beneficiosas. La adición de IFN-γ in vitro a fagocitos procedentes de pacientes con EGC corrige parcialmente el defecto de producción de superóxido. Las infecciones agudas deben ser tratadas enérgicamente con fármacos capaces de penetrar en los fagocitos. Puede ser necesaria la cirugía para aliviar la compresión producida por los granulomas (p.ej., a nivel intestinal, donde pueden provocar obstrucciones) y para drenar los abscesos.

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


CASO CLÍNICO # 14 ANGIOEDEMA HEREDITARIO (AEH) DE TIPO I Ángela, de 17 años de edad, acudió a su médico de cabecera debido a una inflamación no dolorosa ni pruriginosa de su mano izquierda. En la exploración física se observó que la zona estaba tensa, pero no había eritema, calor ni dolor. EI médico diagnosticó una urticaria y prescribió antihistamínicos por vía oral. A los tres días la inflamación había desaparecido. Un año más tarde, Ángela fue atendida en el servicio de urgencias tras ocho horas de dolor cólico abdominal, vómitos y anorexia. No existían antecedentes de hematemesis ni de hemorragia rectal. En la exploración física se observó una frecuencia cardiaca de 98 latidos/min, una presión arterial de 95/65 mmHg y una temperatura corporal de 36,8 °C. Su abdomen era blando y no presentaba ninguna cicatriz quirúrgica. Sobre su región umbilical existía cierta sensación de dolor, pero sin efecto de rebote, y sus sonidos intestinales eran normales. En la figura 14.1 se muestran los resultados de las investigaciones realizadas. A los dos días, el dolor abdominal y los vómitos habían desaparecido, y en su lugar se había producido un breve episodio de diarrea. Se consideró que no era necesaria la intervención quirúrgica, y fue tratada mediante rehidratación por vía intravenosa y dieta absoluta. Seis meses más tarde, Ángela volvió a acudir al servicio de urgencias, debido en este caso a una inflamación progresiva de los labios y de la lengua que había aparecido tras una extracción dental. En el plazo de una hora, la inflamación provocó una obstrucción respiratoria, que requirió una intubación inmediata. En la exploración física se observaron una frecuencia cardiaca de 93 latidos/min, una frecuencia respiratoria de 26fmin y una presión arterial de 9565 mmHg. Tanto la faringe como la laringe estaban muy inflamadas y eritematosas. Los resultados de las investigaciones analíticas se muestran en la figura 14.2. Se estableció un diagnostico de angioedema hereditario (AEH) de tipo I, de acuerdo con los antecedentes y los resultados analíticos de los componentes del complemento. Ángela fue remitida a un inmunólogo para ser estudiada más exhaustivamente y tratada adecuadamente.


PREGUNTAS 1 ¿-Cuáles son las funciones del inhibidor de C1 (C1INH)? 2 ¿-Cuál es la etiología y la patogénesis del angioedema hereditario (AEH), y en qué se parece y se diferencia de las formas adquiridas de angioedema? 3 ¿-De qué tratamientos se dispone? RESPUESTAS 1 ¿Cuáles son las funciones del inhibidor de C1 (C1INH)? CIINH es un polipéptido monocatenario de 478 aminoácidos, perteneciente ala superfamilia de las serinproteasas (Serpin) y codificado en el cromosoma II. Se sintetiza fundamentalmente a nivel hepático, pero hay otras células que también lo producen, entre las que destacan los monocitos de sangre periférica. CIINH inhibe diversas proteasas, al presentar una estructura parecida a la de sus sustratos (v. apéndice). 2 ¿Cuál es la etiología y la patogénesis del angioedema hereditario (AEH), y en qué se parece y se diferencia de las formas adquiridas de angioedema? La principal característica clínica del angioedema es la inflamación aguda de los tejidos subcutáneos o submucosos en ausencia de prurito. Los lugares más habituales en los que se produce este fenómeno son las extremidades y el tracto gastrointestinal. Además, dos tercios de los pacientes desarrollan lesiones orofaciales o laríngeas, que pueden llegar a provocar dificultad respiratoria o asfixia. La etiología del angioedema es multifactorial, siendo el déficit de inhibidor de C1 una de las causas menos frecuente. EI déficit de CIINH puede ser de naturaleza hereditaria o adquirida (fig. 14. 3). EI angioedema hereditario se debe al déficit de CIINH. Se conocen dos formas de AEH, ambas transmitidas con carácter autos6mico dominante. Los heterocigotos padecen la enfermedad debido a que su único gen normal no es capaz de mantener las concentraciones séricas por encima del 5-30% de lo normal. En el AEH de tipo I se encuentra alterada la transcripción o la traducción de ClINH, por lo que se observan concentraciones reducidas de proteasa normal, mientras que en el AEH de tipo II las concentraciones séricas de proteasa son normales, pero la proteína no es funcional. También se conocen dos formas de angioedema adquirido. En la mayoría de los pacientes con la enfermedad no es posible identificar ningún agente etiológico, por lo que esta forma se denomina angioedema idiopático. Recientemente, se ha descubierto que los inhibidores de la enzima conversora de la angiotensina (ECA), que se utilizan para el tratamiento de la hipertensión y de la insuficiencia cardíaca, desencadenan un angioedema en el 0,1% de los Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


pacientes, aproximadamente. Es posible que esto sea debido a la capacidad de la ECA para transformar la bradicinina en péptidos inactivos (v. apéndice), aunque no se comprende porque solo resulta afectada una pequeña parte de los pacientes. En cualquier caso, una reducción de la concentración de CIINH menor al 35% del valor normal supone el riesgo de que se produzca un ataque agudo de angioedema. Además de esta predisposición bioquímica, en muchos pacientes los episodios se desencadenan debido a factores como la inserción de tubos endotraqueales o las intervenciones odontológicas. Se cree que los traumatismos endoteliales inducen la activación del factor XII (factor Hageman), con la consiguiente activación de las vías de la coagulación y del complemento. La escasez de CIINH permite que se acumulen los componentes activos de estas vías, lo que puede dar lugar al angioedema. No esta claro si la sustancia clave que interviene en este proceso es la bradicinina o la cinina C2. . 3 ¿De qué tratamientos se dispone? En el caso de ataques agudos en que se vean afectadas la laringe o la región facial lo más importante es mantener abiertas las vías aéreas. Se deben administrar líquidos por vía intravenosa para corregir la hipovolemia, así como analgésicos para aliviar el dolor. Se pueden administrar concentrados de CIINH, que reducen la intensidad de los ataques. Una alternativa más barata y fácil de obtener es el plasma fresco congelado, que contiene CIINH. EI tratamiento para prevenir el AEH se basa en la administración de andrógenos atenuados, como el danazol, que aumentan directamente la transcripción, traducción y secreción de CIINH. También pueden resultar útiles algunos agentes fibrinolíticos, como eI ácido tranexámico, que inhiben a la plasmina. En el AEA de tipo I se debe investigar a fondo la causa del mismo, y el tratamiento preventivo debe ser igual que en el caso del AEH. La utilidad de estos tratamientos en el caso de AEA de tipo II es dudosa, siendo preferibles en estos casos los tratamientos inmunosupresores y la plasmaféresis.


LABORATORIO # 8 INMUNOELECTROTRANSFERENCIA (WESTERN BLOTING) INTRODUCCION La inmunoelectrotransferencia, también conocida como Western blotting, es la técnica por medio de la cual es posible determinar contra cuáles proteínas (por ejemplo: proteínas de un virus, bacteria, parásito u hongo etc.) está reaccionado un anticuerpo determinado. Fue descrita por primera vez en l979 por H. Towbin y colaboradores y se popularizó como método confirmatorio de la infección por el Virus de la Inmunodeficiencia Human (VIH). La inmunoelectrotransferencia consta de tres partes: l. Separación electroforética de las proteínas en base a su peso molecular por medio de la técnica conocida como SDS-PAGE (Sodium Duodecil Sulphate-Poly Acrylamide Gel Electrophoresis). El SDS es un detergente que confiere carga negativa uniforme a las proteínas permitiendo que éstas migren con una velocidad dependiente de su peso molecular y no de su carga, al someterlas a un campo eléctrico. 2. Electrotransferencia de las proteínas a una matriz como nitrocelulosa, nylon, etc. De los geles de Poliacrilamida, las proteínas, previamente separadas por peso molecular, son transferidas a la matriz usando flujo eléctrico y un sistema de soluciones amortiguadoras. 3. Detección de reactividad inmunológica. En esta última fase se determina contra cuáles proteínas (bandas) reaccionan los anticuerpos presentes en un determinado suero. El sistema es muy similar al descrito para inmunoperoxidasa o ELISA: a. Se bloquea las bandas con una solución proteica (BSA, leche descremada, gelatina, etc.). b. Se pone a reaccionar la banda con el suero, en las diluciones óptimas, por un determinado período de tiempo. c. Se lava para eliminar lo que no ha reaccionado con las bandas. d. Se adiciona el anticuerpo anti-Igs humanas conjugado e. Se lava nuevamente f. Se adiciona sustrato y cromógeno hasta observar las bandas g. Se detiene la reacción con agua destilada o por cambio de pH.

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


METODOLOGIA Se demostrarán el SDA-PAGE para diferentes microorganismos y el equipo necesario para todo el procedimiento, se realizará la transferencia y posteriormente la inmunodetección de las tiras de Western blot con sueros controles. AUTOFORMACION 1. Mencione las ventajas y desventajas de WB en comparación con el ELISA 2. Mencione los criterios de positividad de WB para la infección de VIH 3. Si usted fuera el jefe del Banco de Sangre de un hospital ¿usaría el WB como prueba de rutina para determinar presencia de HIV? ¿Por qué? ¿Cuál sería la mejor prueba a usar?


CASO CLINICO # 12 INMUNODEFICIENCIA SECUNDARIA (VIH) El Sr. Boy, un productor de la industria discográfica de 52 años de edad, acudió al servicio de urgencias tras una semana de disnea progresiva acompañada de una tos no productiva, un leve dolor torácico, fiebre y malestar. No tenía antecedentes de angina de pecho y no había fumado nunca. A lo largo de los últimos tres años padecía diarrea persistente, acompañada de una pérdida de peso de 9 Kg, a partir de un peso inicial de 68 Kg. En la última semana había estado aquejado de dolor asociado a la ingestión de alimentos, que él había atribuido a una faringitis. Vivía con un compañero sexual varón, con el que había practicado durante varios años relaciones sexuales sin tomar precauciones. No tenía antecedentes de adicción a drogas por vía parenteral. En la exploración física se observó un peso por debajo de lo normal y febrícula. No presentaba edemas pero sí linfadenopatias cervicales, axilares e inguinales. Sobre la pared de la faringe se observaron placas de Candida albicans. Su frecuencia cardiaca era de 102 latidos/min, mientras que la frecuencia respiratoria era de 25/min en reposo. La capacidad de expansión torácica era inferior a lo normal, y se escuchaban leves crepitantes difusos a lo largo de ambos campos pulmonares. La exploración de fondo de ojo no reveló alguna anomalía. A continuación se muestran los resultados de las investigaciones analíticas llevadas a cabo: Investigación Hemoglobina (g/dl) Recuento de plaquetas (x109/L) Recuento de leucocitos (x109/L) Neutrófilos (x109/L) Linfocitos totales (x109/L) Eosinófilos (x109/L) Linfocitos TCD4+ (x109/L) TCD8+ (x109/L) Linfocitos B (x109/L) Gases en sangre arterial PaO2 (Kpa) PaO2 (Kpa) pH ECG Radiografía de tórax Broncoscopia con lavado broncoalveolar

Resultado 12,8 (13.5-18.0) 128 (150-400) 6,2 (4.0-11.0) 5,4 (2.0-7.5) 0,75 (1.6-3.5) 0,24 (0.4-0.44) 0,12 (0.7-1.1) 0,42 (0.5-0.9) 0,11 (0.2-0.5) 9,0 (>10.6) 5,52 (4.7-6.0) 7,39 (7.35-7.45) normal Sombreado intersticial bilateral difuso Presencia de Pneumocystis jirovenci

Debido a sus antecedentes sexuales, se recomendó al Sr. Boy someterse a una prueba de detección del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), a lo que accedió. La prueba de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA, del inglés, enzyme-linked immunosorbent assay) frente a anticuerpos anti-VIH resultó ser positiva y se detectó directamente la presencia de VIH-1 mediante la reacción en cadena de la polimerasa (RCP). Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


se estableció el diagnostico de síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida) y se sometió al Sr. Boy a tratamiento frente a la neumonía por Pneumocytis jirovenci (NPJ) con oxigeno administrado a través de una mascarilla y cotrimoxazol por vía oral. Al ser dado de alta se le prescribió un tratamiento profiláctico con cotrimoxazol por vía oral. A los tres meses volvió a acudir al servicio de urgencias, aquejando de visión borrosa y de percepción de "centelleos luminosos". Los exámenes del fondo de ojo demostraron la existencia de retinitis por citomegalovirus (CMV), que fue tratada con ganciclovir por vía parenteral. En ese momento, el recuento de linfocitos T CD4 era de 0.04 x 0 9/L. Durante la administración del tratamiento la salud del Sr. Boy empeoró y perdió parcialmente la conciencia. Investigación Hemoglobina (g/dl) Recuento de plaquetas(x109/L) Recuento de leucocitos(x109/L) Neutrófilos (x109/L) Linfocitos totales (x109/L) Eosinófilos (x109/L) Linfocitos TCD4+ (x109/L) TCD8+ (x109/L) Linfocitos B (x109/L) Radiografía del tórax Hemocultivo Glucosa sanguínea (mmol/L) LCR obtenido mediante punción Lumbar Aspecto Leucocitos (PMN/mm3) Proteínas (g/L) Glucosa (mmol/L) Tinción con tinta china

Resultado 10.4 (13.5-18.0) 104 (150-400) 4.1 (4.0-11.0) 4.2 (2.0-7.5) 0.62 (1.6-3.5) 0.24 (0.4-0.44) 0,03 (0.7-1.1) 0,40 (0.5-0.9) 0.09 (0.2-0.5) Escasas zonas con sombreado difuso negativo 7.6 (<10.0)

turbio 2.500 4.2 (0.15-0.45) 4.5 (>60% de la glucosa sanguínea) Presencia de Cryptococcus

Se estableció un diagnóstico de meningitis criptocócica y se inició la administración de anfotericina por vía parenteral. El Sr. Boy no respondió al tratamiento y falleció poco tiempo después. En la autopsia se aisló P. jirovenci a partir de su tejido pulmonar y se observó un linfoma cerebral en fase inicial de desarrollo.

PREGUNTAS Y RESPUESTAS 1. ¿De qué pruebas diagnósticas se dispone para detectar la infección por VIH? Aproximadamente el 95% de los individuos infectados por el VIH presentan una seroconversión en los tres primeros meses después de la infección. Las pruebas mas


utilizadas para la detección de la infección por VIH son los ELISA frente a gp41, un proteína de la superficie del virus y frente a p24, una proteína de núcleo. Se puede llevar a cabo una prueba de manchado de Wertern (Western blot) de confirmación, para reducir el número de resultados falsamente positivos. El criterio recomendado por el centro de control de enfermedades (CDC) para considerar positivo un resultado de manchado de Western es la presencia de al menos dos de las siguientes bandas: p24, gp41 y gp 120/160 (gp160 es el precursor de gp41 y gp120, la proteína de la cubierta). También se pueden utilizar las pruebas de ELISA frente al antígeno p24, aunque el número de resultados falsamente positivos se eleva. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la técnica que permite amplificar secuencias específicas de ADN o ARN, para obtener estos productos en cantidad suficiente como para poder ser detectados con facilidad. En el caso del VIH esta prueba es muy sencilla y específica, pero su coste es mucho mayor que el de las pruebas de ELISA. 2. ¿Cuáles de estas pruebas se deben utilizar para una madre y su hijo, en caso de sospecha de infección vertical? La situación serológica de la madre se debe estudiar mediante la prueba de ELISA y en caso de que esta prueba sea positiva se debe llevar a cabo una prueba de manchado de Western de confirmación. Entre un 20% y 30% de los niños nacidos de madres seropositivas frente al VIH están infectados por el Virus. La transmisión se puede transmitir in útero o mas raramente, durante la lactancia. El diagnóstico constituye un reto, ya que las inmunoglobulinas del VIH procedentes de la madre atraviesan la placenta, por lo que pueden ser detectadas en el recién nacido incluso aunque este no se encuentre infectado. La presencia de anticuerpos específicos frente a VIH de las clases IgA e IgM en el niño implican la existencia de infección, ya que estos anticuerpos nos atraviesan la placenta. Las pruebas de las que se dispone en la actualidad para detectar estos anticuerpos carecen de sensibilidad, aunque se sigue investigando en este sentido. El método de diagnóstico más utilizado en el Reino Unido y en USA es el PCR, que permite detectar directamente el virus. En los lactantes de menos de un mes de edad el PCR puede dar lugar a resultados negativos incluso aunque el niño este infectado. Se ha demostrado que en muchos niños infectados de esta edad, el virus se encuentra confinado en los ganglios linfáticos regionales. La viremia no aparece hasta que la infección se ha asentado en estas zonas. 3. ¿Qué parámetros serológicos y celulares se pueden utilizar para el seguimiento del curso de la infección por VIH? En el momento de la seroconversión, aparece una enfermedad parecida a la mononucleosis infecciosa hasta en el 50 % de los pacientes infectados por el VIH. Los síntomas más frecuentes son fiebre linfadenopatias, faringitis, exantemas y mialgias. En este momento se produce una reducción del número de linfocitos CD4 (y CD8) y un aumento de las concentraciones plasmáticas de virus y de antígeno p24. los anticuerpos frente a las glicoproteínas gp120 y gp41 de la superficie del virus aparecen unas seis semanas después de la infección y al principio son de clase IgM. Tras esta respuesta inicial, se comienzan a producir anticuerpos IgG, que persisten a lo largo de toda la fase de latencia. Durante esta fase, la viremia y la antigenemia p24 suelen ser bajas. La progresión de la enfermedad viene anunciada por una reducción de los linfocitos CD4 y un aumento de la concentración plasmática del virus. El recuento de linfocitos CD4 se ha convertido en el parámetro más utilizado para el seguimiento del curso de esta enfermedad. Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


CASO CLINICO # 6 LEUCEMIA LINFOBLASTICA AGUDA Rashmi, una niña de 5 años, fue atendida en una clínica hematológica tras seis semanas de malestar general, letargo y anorexia. Unas tres semanas antes había sido examinada por su médico de cabecera, quien había diagnosticado una faringitis que se trato con amoxicilina administrada por vía oral. Pese al tratamiento, la infección no había remitido y la niña seguía presentando tos persistente. A 1o largo de la última semana había desarrollado dolores en la espalda y en las extremidades, que no se habían aliviado con analgésicos administrados por vía oral. En los últimos días también había aparecido un exantema violáceo en su muslo izquierdo. No tenia antecedente de hemoptisis ni de dolor torácico, ni había padecido episodios hemorrágicos ni síntomas gastrointestinales ni urinarios. Rashmi nació tras 41 semanas de embarazo y era la tercera hermana de su familia. No tenía antecedentes de infecciones recurrentes ni persistentes, y su estado de salud siempre había sido bueno. Su madre recordaba que había sido inmunizada según un protocolo estándar y que, además, había sido vacunada con BCG debido a la existencia de antecedentes de tuberculosis en su familia. No había presentado problemas de desarrollo y estaba a punto de ingresar en el colegio. Su hermano, su hermana y sus padres disfrutaban de un buen estado de salud. En el examen clínico, Rashmi presento una talla comprendida entre los percentiles 25 y 50, mientras que su peso estaba comprendido entre los percentiles 3 y 10. Su temperatura corporal era de 37,2°C. Y su frecuencia cardiaca de 98 latidos/min. Su aspecto era pálido y presentaba signos clínicos de anemia. No mostraba ictericia, pero si linfadenopatias cervicales, axilares e inguinales. En la exploración del aparato respiratorio, no se detectaron crepitantes ni sibilancias, y los resultados de la exploración del sistema cardiovascular también fueron normales. En la palpación abdominal se detecto hepatoesplenomegalia, pero ningún dolor ni masa palpable. La faringe de Rashmi estaba notablemente inflamada y el tamaño de sus amígdalas era mayor de lo normal. Presentaba hemorragias en varias regiones de sus encías. En la exploración neurológica no se detecto ninguna lesión de los nervios craneales ni periféricos, y el estudio del fondo de ojo también fue normal. La radiografía torácica tampoco revelaba ninguna anomalía. Se estableció un diagnostico de leucemia linfoblástica aguda (LLA) de tipo común, o L1. EI tratamiento inicial, consistente en la administración de transfusiones, tuvo por objeto la recuperación de los valores normales de eritrocitos, plaquetas y neutrofilos. Para provocar la remisión se utilizaron tres agentes: vincristina una vez a la semana durante cuatro semanas, L-asparaginasa entre dos y cuatro veces a la semana durante cuatro semanas y prednisolona oral a diario durante el mismo periodo de tiempo. EI tratamiento de consolidación consistió en 6-mercaptopurina, metotrexato, vincristina y prednisolona. También se realizo profIlaxis craneal mediante irradiación y administración intratecal de metotrexato. Finalmente, se realizo un tratamiento de mantenimiento de dos años de duración, con 6-mercaptopurina y metotrexato administrados por vía oral. EI tratamiento tuvo éxito, y en la revisión llevada a cabo tres años después del diagnostico inicial Rashmi se encontraba bien, por lo que no fue necesario administrar ningún tratamiento adicional.


1. ¿Qué es la leucemia aguda y como se presenta? Las leucemias agudas constituyen un grupo de enfermedades hematológicas malignas que se caracterizan por 1a expansión clonal de células hematopoyeticas inmaduras (blastos), que se acumulan en 1a medula ósea y en la sangre. A grandes rasgos, se pueden dividir en leucemias linfoblásticas agudas (LLA), que se cree que son causadas por células inmaduras de la serie linfoide, y en leucemias mieloides agudas (LMA), en las que es probable que las células originales sean precursores mieloides o células madre pluripotenciales. La incidencia de LLA alcanza un máximo de 7/100.000 entre los tres y cuatro años de edad, pero a partir de entonces disminuye rápidamente hasta que se estabiliza alrededor de 0,5/100.000. Por el contrario, 1a incidencia de LMA aumenta progresivamente con la edad, hasta llegar a 15/100.000 a los 70 años. La presentación refleja las alteraciones de 1a medula ósea debidas a la proliferación excesiva de las células basticas monoclonales. La anemia es frecuente y se manifiesta en forma de malestar, letargo y disnea. Los pacientes suelen presentar neutropenia, por 10 que son susceptibles a infecciones provocadas por la flora indígena normal. También son frecuentes las infecciones víricas (p. ej., herpes simple). La concentración de plaquetas se ve reducida, por 10 que los pacientes pueden presentar hemorragias y hematomas espontáneos. También pueden aparecer síntomas debidos a la infiltración de los órganos con células leucémicas, como, por ejemplo, un dolor sordo debido al depósito de dichas células en el tejido óseo. Otros hallazgos habituales son las linfadenopatias, la hepatosplenomegalia y 1a infiltración gingival. También se puede producir una diseminación hacia el LCR, especialmente en la LLA. 2. ¿Para qué sirve la inmunofenotipificación de las células malignas en el diagnostico de LLA? Los blastos que aparecen en la LLA se clasifican inicialmente de acuerdo con su morfología, mediante una serie de criterios que tienen en cuenta el tamaño celular y las características del citoplasma y del núcleo. En la LLA tipo LI, que es 1a más frecuente en la infancia, se observan pequeñas células con escaso citoplasma y un núcleo de forma regular. El tipo L2, más propio de adultos, se caracteriza por 1a presencia de grandes células, con un citoplasma de tamaño intermedio y un núcleo con forma irregular. En el tipo L3, re1acionado con la enfermedad debida a células B maduras, se observan grandes células con un citoplasma de tamaño intermedio y un núcleo con forma regular. La inmunofenotipificación se lleva a cabo mediante la utilización de anticuerpos monoclonales dirigidos frente a Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


componentes celulares. El perfil antigénico sirve para determinar 1a estirpe a la que pertenecen los blastos. La tipificación de las células leucémicas no se trata simplemente de un capricho te6rico; permite localizar células remanentes después del tratamiento y además sirve para establecer el pronóstico. También se suele investigar de forma rutinaria 1a existencia de alteraciones en el número 0 en la estructura de los cromosomas de los blastos, fenómeno que suele estar presente en más del 80% de los pacientes con LLA. Entre las anomalías que se detectan con más frecuencia se encuentra 1a translocación entre los cromosomas 9 y 22, que da lugar al denominado cromosoma Filadelfia. Esta anomalía solo se observa en el 3% de los niños con LLA, pero aparece en más del 90% de los casos de leucemia mieloide crónica. Las translocaciones suelen estar asociadas con diferentes tipos de LLA. Por ejemplo, 1a translocación t1; 19 (q23; p13.3) suele aparecer en la LLA pre-B. 3. ¿Cuáles son los indicadores pronósticos útiles en la LLA? El factor más importante a la hora de establecer un pronóstico para la LLA es la presencia de una remisión tras el inicio del tratamiento, así como 1a duración de la misma. El pronóstico es considerablemente peor en niños de menos de un año de edad, así como en los varones, independientemente de 1a edad. Esto se debe, en parte, a que en el 10% de los varones se produce una recidiva a nivel testicular, mientras que a nivel ovárico este fenómeno es más raro. La denominada «forma masiva», que se caracteriza por la presencia de linfadenopatias, gran esplenomegalia y la presencia de una masa importante a nivel del mediastino, también conlleva un peor pronóstico. Antes de 1a instauración del tratamiento, el indicador pronostico más valioso, por si solo, es el recuento de leucocitos totales. También son útiles algunos otros parámetros de laboratorio. Las LLA de tipo L2 Y L3 tienen peor pronóstico que la LI, siendo peor el de la de tipo L3. Las variantes de células nulas, T y B, que pueden detectarse por inmunofenotipificacion, tienen peor pronóstico que el tipo común y el de células pre-B. Algunas anomalías genéticas pueden ayudar a establecer el pronóstico. Así, la translocación t1; 19 (q23; p13.3) es de mal pronóstico.


LABORATORIO # 9

CITOMETRIA DE FLUJO INTRODUCCION Las mediciones bioquímicas y biofísica de células aisladas se han llevado a cabo durante años, en principio utilizando análisis visual en diferentes tipos de microscopios. Muchos de los métodos inmunohistoquímicos se han refinado a través del desarrollo de una nueva clase de instrumentos denominados citómetros de flujo. Los citómetros de flujo son instrumentos capaces de analizar las propiedades de una célula única, al pasar a través de un orificio a gran velocidad. Los ejemplos de las medidas que se pueden hacer son: características físicas como tamaño, volumen, índice de refracción y viscosidad; características químicas como contenido de DNA y RNA, proteínas y enzimas.

Estas propiedades se combinan con electrónica sofisticada y computadoras. Sin embargo, una clase aún más sofisticada de instrumentos, (separadores de células) combinan la capacidad analítica con la capacidad de separar células con base en diferentes propiedades preseleccionadas. Un tipo de analizador, el separador de células activado por su importancia, ha encontrado muchas aplicaciones en la investigación de la inmunología. Ya que este tipo de máquina se introduce gradualmente en la inmunología de laboratorio clínico, en particular para análisis de células T, B y otros tipos de células linfoides, aquí se presenta una descripción de los principios de esta operación. ANALISIS POR CITOMETRIA DE FLUJO El citómetro se basa en la medida de la fluorescencia emitida por las células debidamente marcadas, así como también en el reconocimiento de otras propiedades diferenciales de las células en estudio, como el tamaño, densidad, etc. Los citómetros son instrumentos que constan básicamente de un láser que emite luz a una determinada longitud de onda y que posee 3 tipos distintos de detectores: 1. Detector para el tamaño celular (reflexión) o Scatter frontal, es decir luz dispersada hacia delante (Forward Scattered Light, FSC). 2. Detector para la morfología -complejidad- de la célula (refracción) o Scatter lateral, es decir, detecta la luz dispersada lateralmente (Side Scatterred Light, SSC)) Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


3. Uno o más detectores que recogen emisiones fluorescentes a distintas longitudes de onda. El citómetro de flujo está compuesto de tres sistemas principales: óptico, fluídico y electrónico.

La cuenta de células individuales en mezclas complejas, es una técnica tediosa e imprecisa, inclusive con anticuerpos monoclonales fluorescentes y microscopios sofisticados. Con la ayuda de un citómetro de flujo utilizado como instrumento analítico, se puede analizar una suspensión celular para diversas medidas en forma simultánea, a velocidad de casi 5,000 células por segundo. Al combinar el disgregador de luz; y medición del volumen Coulter, con el arma poderosa de anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia, se pueden identificar con facilidad diversas subpoblaciones. El uso de fluorocromos de dos colores distintos acoplado cada uno a un anticuerpo particular, permite la fluorescencia simultánea de dos colores en células individuales. Hace poco, se desarrollaron citómetros de flujo que pueden excitar dos diferentes tinciones que absorben la luz a longitud de onda similar, pero emiten la luz en naranja y verde. Las células más grandes y más pequeñas que los linfocitos se pueden "eliminar" electrónicamente a fin de que el análisis se concentre sólo en los linfocitos. Con la adición de un disgregador de luz de ángulo de 90o, también se pueden identificar los granulocitos y " eliminarse”. Este enfoque ha permitido el desarrollo de métodos de análisis de sangre total para analizar las células linfoides. SEPARADORES DE CELULAS ACTIVADAS POR FLUORESCENCIA Se aísla una suspensión de células de sangre u otros tejidos, y se marca con anticuerpo fluorescente u otro fluorocromo tal como bromuro de etidio, que tiñe específicamente ADN. Se fuerzan las células bajo presión a través de una boquilla en un chorro de líquido rodeado de solución salina o agua. La vibración en la punta de la boquilla provoca que el flujo se rompa en una serie de gotitas y el tamaño de las gotas se pueda regular de manera que cada una contenga sólo una célula. Las gotas se iluminan con un rayo láser de luz monocromática y se analizan por electrónicamente mediante detectores de fluorescencia. Las gotas que emiten señales


fluorescentes apropiadas se cargan eléctricamente en un campo de alto voltaje entre placas de deflexión, y así se separan en tubos colectores. De esta manera se obtiene una separación de células rápida y muy reproducible. Se puede mantener la viabilidad y esterilidad celular, de manera que las células no sólo se analicen sino también se puedan cultivar o hacer un estudio funcional. APLICACIONES CLINICAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO La citometría de flujo ha tenido muchas aplicaciones en inmunología. Una lista parcial puede incluir lo siguiente: l) análisis y separación de subpoblaciones de células T por anticuerpos fluorescentes monoclonales. 2) separación de varias clases de células linfoides por el tamaño y marcador de anticuerpos. 3) análisis de la cinética del ciclo celular mediante diversas tinciones de DNA. Las computadoras se utilizan para analizar los múltiples parámetros que se miden simultáneamente mediante el citómetro de flujo, incluyendo fluorescencia de dos colores, disgregación de la luz de ángulo anterior, y disgregación de la luz de ángulo de 90º. Están disponibles análisis sofisticados de los datos y programas de computadora software para representación para producir información de aplicación clínica.

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


CASO CLÍNICO # 15 HIPERSENSIBILIDAD DE TIPO I (ANAFILAXIS) La Sra., Young, una mujer de 62 años de edad, sufrió una picadura de una abeja de una colmena de su jardín. A lo largo de ese verano había sufrido ya varias picaduras al recoger la miel de la colmena. Unos minutos después de esta última picadura comenzó a sentir una sensación pruriginosa en sus manos, pies e ingle, junto con un dolor cólico abdominal. Al poco rato se sintió débil y comenzó a mostrar síntomas de disnea. Unos instantes después perdió el conocimiento. Su marido, que era médico, observó que su frecuencia respiratoria era elevada, que presentaba sibilancias y que sus párpados y labios se encontraban hinchados. Estaba pálida y en su cuello y brazos se observaba un eritema difuso. En la exploración física se percibía el pulso cardíaco apical, pero el pulso radial era débil. Su marido le administró inmediatamente 0.5 ml de adrenalina al 1/1000 por vía intramuscular y 10mg de clorfeniramina (un antagonista de los receptores H1 de la histamina) con 100mg de hidrocortisona por vía intravenosa. Recupero la consciencia y su frecuencia respiratoria se redujo. Al día siguiente se encontraba totalmente recuperada. Los resultados de las investigaciones llevadas a cabo en ese momento se muestran en el cuadro inferior. Investigación Hemoglobina (g/dl) Recuento de Leucocitos (x109/L) Neutrófilos (x109/L) Eosinófilos (x109/L) Linfocitos totales (x109/L) Recuento de plaquetas (x109/L) Inmunoglobulinas séricas IgG (g/L) IgM (g/L) IgA (g/L) IgE (g/L) RAST Veneno de abeja Veneno de avispa Pruebas cutáneas Veneno de abeja (10µg/ml) Veneno de avispa (10µg/ml)

Resultado (Ámbito normal) 14.2 (11.5-16.0) 7.5 (4.0-11.0) 4.4 (2.0-7.5) 0.40 (0.4-0.44) 2.4 (1.6-3.5) 296 (150-400) 10.2 (5.4-16.1) 0.9 (0.5-1.9) 2.1 (0.8-2.8) 320 (3-150) Clase 4 Clase 0 Induración positiva 3+ Negativo

La Sra. Young no presentaba antecedentes de reacciones adversas frente al veneno de abeja. Alimentos ni antibióticos. Tampoco tenía antecedentes de asma, rinitis alérgica, alergias a los alimentos ni dermatitis atópica. A la vista de la historia clínica y de las investigaciones llevadas a cabo se estableció un diagnóstico de choque anafiláctico debido a sensibilidad frente al veneno de abeja, y se tomó la decisión de iniciar un tratamiento de desensibilización. Se le advirtió del riesgo del procedimiento, y ella dio el consentimiento oportuno. Se le inyectaron por vía subcutánea dosis creciente de veneno de abeja, en un hospital dotado con


equipo de reanimación adecuado. No se produjeron nuevas reacciones alérgicas, y se le siguió inyectando una dosis mensual de veneno de abeja durante un periodo de dos años. Durante el verano siguiente volvió a sufrir una picadura de abeja sin tener reacción adversa alguna. Preguntas 1. ¿Qué mecanismos intervienen en la anafilaxis? Tradicionalmente, el término anafilaxis se ha utilizado para describir un síndrome clínico sistémico debido a la desgranulación de los mastocitos y los basófilos inducida por IgE. Cuando un individuo susceptible resulta expuesto a un antígeno frente al que es sensible, se producen anticuerpos IgE específicos que se unen a los receptores de IgE de alta afinidad de los mastocitos y basófilos. El receptor se una a la región Fc de los anticuerpos, mientras que los puntos de unión de la región Fab quedan libres y son capaces, por tanto, de unirse a su antígeno correspondiente. La avidez de esta reacción de unión a Fc es elevada, por lo que la IgE se disocia lentamente de sus receptores, y la semivida del complejo es la larga. Cuando se produce una nueva exposición al antígeno, este último se une a los complejos IgE/receptor, dando lugar a la activación de las células mediadas por el receptor, con la consiguiente liberación de mediadores almacenados y sintetizados de novo. El proceso de desgranulación es rápido y llega a su término en el plazo de 30 minutos. Cuando la cantidad liberada de estos mediadores es considerable, aparecen las manifestaciones clínicas de la anafilaxis. La patogénesis de diversas reacciones anafilácticas desencadenadas por diversos agentes se ha atribuido a la desgranulación de los mastocitos mediada por IgE. Entre estos agentes se encuentran antibióticos (penicilinas y cefalosporinas), alimentos (leche, nueces, mariscos), proteínas extrañas (insulina, veneno de abeja, látex) y fármacos (estreptocinasas, vacunas). El paciente puede tener antecedentes de atopía o carecer de ellos. De hecho, la exposición de individuos atópicos a alérgenos naturales no es una causa frecuente anafilaxis. La desgranulación de los mastocitos se puede producir también por vías no dependientes de IgE. En este caso, al no intervenir en el proceso anticuerpos IgE específicos, no es necesaria la exposición previa al antígeno. A continuación se describen tres posibles mecanismos de las reacciones anafilactoides: 1. La sangre, los productos derivados de la misma y las inmunoglobulinas pueden dar lugar a una reacción anafilactoide. Se ha sugerido que el mecanismo puede consistir en la formación de inmunocomplejos, con la consiguiente activación del complemento y la formación de C3a y C5a. Estos dos componentes del complemento (anafilotoxinas) son capaces de provocar directamente la desgranulación de los mastocitos. Además, ambos componentes aumentan la permeabilidad vascular y pueden provocar hipotensión. La melitina, un componente mayoritario del veneno, es capaz de activar la vía alternativa del complemento y producir una reacción anafilactoide mediada por anafilotoxinas. 2. Determinados agentes diagnósticos y terapéuticos, como los opiáceos, la ACTH, los relajantes musculares y los medios de contraste radiológico, también son capaces de provocar directamente la desgranulación de los mastocitos la consiguiente reacción anafiláctica. 3. Entre un 5% y un 10% de los individuos con asma experimentan una reacción frente a los antiinflamatorios no esteroideos (AINE), como la aspirina y la indometacina. Los síntomas suelen consistir en broncoespasmos, rinorrea y, con menos frecuencia, colapso vascular. La capacidad de estos agentes para provocar anafilaxis parece estar relacionada Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


con su potencia inhibidora de la síntesis de prostaglandinas. No se conoce al mecanismo de este fenómeno de sensibilidad, pero en algunos pacientes puede estar relacionado con la desgranulación de los mastocitos. 2. ¿Cuáles son las características clínicas y el tratamiento de la anafilaxis aguda? El curso temporal y la naturaleza de los síntomas que aparecen en la anafilaxis son muy variables. La aparición de los mismos se puede producir a los pocos segundos o minutos de la exposición, sitien se han observado tiempos de latencia de hasta una hora. A continuación se enumeran los síntomas más frecuentes, que se pueden presentar individualmente o combinados: 1. Cutáneos: eritema, prurito de las manos, los pies y el abdomen, urticaria, angioedema. 2. Respiratorios: edema laríngeo, que provoca ronquera y puede llegar a producir asfixia; broncoconstricción, que da lugar a sibilancias; rinorrea. 3. Cardiovasculares: hipotensión, arritmias, taquicardia, colapso vascular. 4. Gastrointestinales: dolor cólico abdominal, náuseas, vómitos, diarrea. La mayoría de las reacciones anafilácticas no resultan fatales. Se calcula entre un 1% y un 2% de los tratamientos con penicilina se complican debido a la aparición de reacciones sistémicas pero solo un 10% de estos complicados tienen secuencias graves. En los EE.UU. fallecen anualmente entre 400 y 800 pacientes debido a reacciones anafilácticas frente a la penicilina, y un número parecido lo hacen debido a reacciones frente a medios de contraste radiológico. El 70% de estos fallecimientos se deben a complicaciones respiratorias (edema laríngeo y/o broncospasmo), mientras que el 25% se deben a compilaciones cardiovasculares. El tratamiento precoz de la anafilaxis es esencial, ya que el fallecimiento se puede producir rápidamente. El paciente debe ser colocado en posición de reanimación, se debe administrar oxígeno a través de una mascarilla y se deben inyectar por vía intramuscular 0.51.0 ml de adrenalina. Este fármaco aumenta la presión arterial, relaja la musculatura lisa de los bronquios e impiden que sigan liberando mediadores. También son útiles los agentes antihistamínicos (p. ej., 10 mg de clorfeniramina) administrados por vía intravenosa, ya que la histamina produce vasodilatación, arritmias cardiacas y broncospasmo. Los corticoides (p. ej., 100 mg de hidrocortisona) administrados por vía intravenosa pueden servir para prevenir la aparición de respuestas tardías. 3. ¿Cómo se puede detectar la existencia de sensibilidad y que se puede hacer para desensibilizar a los pacientes? El primer paso es determinar la existencia de reacciones adversas previas. Se deben investigar el curso temporal y la naturaleza de dichas reacciones. Un sistema rápido y sensible para detectar IgE anti-veneno de insecto es la realización de pruebas cutáneas con dicho veneno. La IgE específica frente al veneno también se puede detectar mediante pruebas de radioalergoabsorción, pero estas pruebas solamente son positivas en un 80% de los pacientes que reaccionan en las pruebas cutáneas. La inmunoterapia se debe aplicar solamente en aquellos casos en que las reacciones frente al veneno de insectos pueden poner en peligro la vida del paciente. Se van administrando dosis subcutáneas crecientes y, finalmente, se administra una dosis mensual de mantenimiento de 100 µg. Mediante este sistema, en el 98% de los pacientes se consigue un efecto protector, ya sean adultos o niños.


CASO CLÍNICO # 16 HIPERSENSIBILIDAD TIPO I El Sr. Núñez se sorprendió cuando, después de muchos años de gozar de una buena salud, comenzó a padecer obstrucciones nasales a la edad de 28 años. Todos sus amigos y compañeros de trabajo pensaban que estaba permanentemente resfriado. De hecho, padecía una sinusitis recurrente, con dolor facial y emisión de un exudado nasal purulento. Su médico de cabecera le prescribió varios tratamientos antibióticos, que aliviaban los síntomas durante un cierto tiempo. Parecía encontrarse algo mejor durante los meses de verano. Tras uno de sus ataques de sinusitis, el Sr. Núñez acudió a un cirujano ORL. Las investigaciones analíticas llevadas a cabo en aquel momento se muestran en la figura 16.1. Se estableció un diagnóstico de sinusitis maxilar crónica, y el cirujano ORL le recomendó que se sometiese a una punción y a un lavado antral. Durante la intervención se procedió a la limpieza de los antros y a su posterior drenaje. También se llevó a cabo una diatermia sub mucosal. El período postoperatorio transcurrió sin incidentes. El cirujano le comentó que se encontraría mucho mejor después de la intervención. Transcurridos solamente tres meses desde la intervención, los síntomas iniciales volvieron a aparecer, incluido un nuevo episodio de sinusitis que fue tratado con antibióticos. A raíz de ello, fue remitido a un alergólogo para ser sometido a un estudio en profundidad. Presentaba congestión nasal y los cornetes estaban recubiertos de secreciones excesivas. No había signos de infección. En la figura 16.2 se muestran los resultados de las investigaciones analíticas llevadas a cabo en ese momento. Se instauró un tratamiento nasal por vía tópica con corticoides en forma de aerosol, junto con inmunoterapia específica para su alergia a los ácaros domésticos. Respondió extraordinariamente bien y no volvió a presentar síntomas. investigación

Hemoglobina (g/di)

Resultado (rango normal)

14,2 (13,5-18,0) Recuento de leucocitos (x ia>/L) 10,8 (4,0-11,0) Suero

Sodio (mmol/L) Potasio (mmol/L) Cloro (mmol/L) Urea (mmol/L) Inmunoglobulinas séricas IgG (g/L) IgM (g/L) IgA (g/L)

138 (134-145) 4,2 (3,5-5,0) 100 (95-105) 3,6 (2,5-6,7) 10,5 (5,4-16,1) 1,2 (0,5-1,9) 2,1 (0,8-2,8)

Radiografía de los senos Engrosamiento de la mucosa con presencia de líquido en el antro maxilar izquierdo

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


Investigación

IgE total (Ui/mi) Pruebas cutáneas frente a: Acaras domésticos Polen de gramíneas RAST Acaras domésticos Polen de gramíneas Depuración mucociliar Radiografía de tórax

Resultado (rango normal)

540 (3-150) Positivo Positivo 4+ 2+ Normal Normal

PREGUNTAS ¿Qué ocurre cuando las vías nasales son expuestas a alérgenos? ¿Qué factores genéticos están relacionados con la atopia? ¿Qué papel desempeñan los eosinófilos en la rinitis alérgica? ¿De qué técnicas se dispone para la hiposensibilización? RESPUESTAS ¿Qué ocurre cuando las vías nasales son expuestas a alérgenos? La mucosa nasal está poblada por mastocitos que expresan el receptor de IgE de alta afinidad (RFcel). El número de mastocitos aumenta durante la estación en que abunda el alérgeno, debido a una mayor migración de estas células desde la lámina propia hasta el epitelio, así como a la proliferación de los mastocitos en la propia mucosa nasal. Tras la exposición al alérgeno durante dicha estación se produce inmediatamente una liberación de los mediadores almacenados, como la histamina, que provocan prurito, estornudos y rinorrea, así como la síntesis de nuevos mediadores a partir del ácido araquidónico. La fase tardía de esta reacción se produce entre 5 y 8 horas después de la exposición, y consiste en una recurrencia de los síntomas, siendo más prominente la obstrucción nasal que los estornudos. Durante la fase inicial, en los líquidos obtenidos a partir de lavados nasales se detectan histamina, PGD2 y cininas, todos ellos mediadores procedentes de mastocitos. Durante la fase tardía de la reacción, se encuentran prácticamente los mismos mediadores, con la excepción de la PGD2, que está ausente. Esto implica que los basófilos intervienen en la fase tardía de la reacción. El cromoglicato de sodio bloquea tanto la reacción inmediata como la fase tardía de la respuesta. Los corticosteroides solamente bloquean la fase tardía de la reacción. Tanto la rinitis como el asma responden a los corticosteroides, lo que sugiere que la fase tardía de la reacción es la más importante clínicamente. ¿Qué factores genéticos están relacionados con la atopía? Las reacciones alérgicas se producen debido a una conjunción entre factores intrínsecos del individuo y factores ambientales. La importancia de los factores genéticos se puede evaluar especialmente bien cuando el alérgeno está identificado exactamente y es de bajo peso molecular. La ambrosía contiene al menos 55 alérgenos, de los que sólo la mitad tiene importancia clínica. El principal alérgeno, Amb a 1, presenta un peso molecular de 35 kdal, mientras que Amb a 5 es el más


pequeño que se ha identificado, con tan sólo 4,5 kdal. Hay una intensa asociación entre las respuestas a Amb a 5 y el genotipo HLA DR2*1500, que regula tanto las respuestas de IgE como las de IgG. La alergia al centeno (Lol P 1) también está asociada al genotipo HLA DR2. Además, en estudios llevados a cabo en grupos, familiares y en hermanos gemelos se ha observado que las concentraciones séricas de IgE también tienen carácter hereditario, si bien no se ha podido localizar todavía el gen del que dependen. Estos factores son relativamente simples en comparación con las manifestaciones de los síntomas de alergia (atopia) en un paciente determinado. Desde un punto de vista muy simplificado, Cookson y cois, han definido a un paciente atópico como aquel que presenta concentraciones elevadas de IgE y presencia de IgE específica, detectable mediante RAST o pruebas cutáneas. Sus estudios sugieren que existe una relación entre la atopia y el locus 11 q 13, y que el gen de la atopia se hereda preferentemente a partir de la madre. Unos datos más recientes publicados por Marsh sugieren que los genes relacionados con la atopia pueden intervenir en el proceso de síntesis de IL-4. ¿Qué papel desempeñan los eosinófilos en la rinitis alérgica? Los cambios que se producen en la mucosa nasal inmediatamente después de la exposición al alérgeno son consecuencia de la desgranulación de los mastocitos en presencia de una pequeña cantidad de células. Si se procede a lavar la misma zona 48 ho ras después, se observa un notable aumento de la cantidad de eosinófilos y de otros tipos celulares. Cuanto mayor sea la dosis de alérgeno, más eosinófilos aparecen, y se detecta mayor cantidad de sus productos, entre los que se encuentra la proteína básica principal (PBP). La citocina predominante en el líquido procedente del lavado es la IL-5. Tiene propiedades quimiotácticas sobre los eosinófilos y prolonga la vida de las células. El ligando mediante el que los eosinófilos se unen al endotelio es VCAM-1: este ligando se une a la molécula de adherencia celular VLA-4. En estudios llevados a cabo en ovejas alérgicas se ha conseguido demostrar que el tratamiento previo con un anticuerpo monoclonal frente a VLA-4 reduce significativamente la intensidad de la fase tardía de la reacción provocada por la exposición bronquial al alérgeno, pero no afecta a la reacción inmediata. Estas observaciones demuestran claramente que los eosinófilos intervienen en cierta forma en las reacciones alérgicas que afectan a las vías nasales y pulmonares. 4 ¿De qué técnicas se dispone para la hiposensibilización? El método clásico fue aplicado por primera vez por Noon y Freeman en 1911, y consistía en administrar por vía subcutánea dosis creciente del alérgeno pertinente, hasta alcanzar una dosis arbitraria fijada previamente como máxima. Para comprobar la respuesta al tratamiento, sometían al paciente a exposiciones oculares al alérgeno, con objeto de detectar cambios de la sensibilidad. Desde entonces, la inmunoterapia mediante la administración de dosis crecientes de alérgeno (IDCA) ha constituido la base del tratamiento. Hay otras técnicas, en las que se utilizan dosis bajas del alérgeno, que también han demostrado ser eficaces y seguras. Aún no se conocen los mecanismos mediante los cuales la IDCA provoca la mejoría clínica. Las técnicas de clonación molecular han permitido obtener alérgenos recombinantes. Esto ha sido de gran utilidad, ya que ha permitido demostrar que muchos alérgenos presentan reacciones cruzadas, por lo que el número de alérgenos necesario para el diagnóstico de la hipersensibilidad de tipo I, e incluso para su tratamiento, se ha podido reducir en gran medida. Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


Hay tres formas diferentes de abordar la IDCA:  Interferir en la interacción que se establece entre el alérgeno y la IgE. Se basa en la presencia de anticuerpos bloqueadores, independientemente del hecho de que sean producidos por el propio paciente o procedan de fragmentos Fab recombinantes de origen humano o murino.  Prevención de la desgranulación de los mastocitos y los basó- filos inducida por el alérgeno. El entrecruzamiento de las IgE de la célula efectora es el acontecimiento clave que desencadena el proceso de desgranulación. Teóricamente, la aplicación local del hapteno podría saturar los fragmentos Fab libres de las IgE, con lo que el proceso de entrecruzamiento y la consiguiente desgranulación quedarían bloqueados.  Modulación de la IgE mediante IDCA. La concentración de IgE específica se tiende a reducir después de la IDCA, pero en muchos casos el extracto alergénico contiene múltiples compuestos. El aislamiento del epítopo del alérgeno que reacciona con las células T, de tal manera que no fuese capaz de unirse a las IgE, presentaría muchas ventajas. Su administración sería completamente segura, sin peligro de efectos secundarios de tipo anafiláctico. También podría servir para inducir tolerancia frente a dicho alérgeno por parte de las células T. Un campo de investigación especialmente interesante es el dedicado a la expresión de alérgenos en cepas vivas de vacuna. Estas cepas provocarían intensas respuestas T H1, por lo que podrían ser utilizadas como agentes terapéuticos para tratar la atopia.


LABORATORIO # lO.1 PRUEBAS SEROLOGICAS PARA DETECTAR IgE TOTAL 1. PRUEBAS PARA DETECTAR IgE TOTAL EN SUERO La selección de una prueba para cuantificar IgE en suero humano exige una alta sensibilidad y especificidad que permita su detección a concentraciones de nanogramos/ml en presencia de otras Ig que se encuentran en concentraciones de miligramos/ml. Las primeras metodologías implementaron el uso de compuestos radiactivos para el marcado del conjugado que utilizaban pero en la actualidad su uso se ha reemplazado por enzimas o fluorocromos. Las técnicas usando enzimas incluyen variantes de ELISA como son los de competencia y los de sándwich. Este último es el diseño de preferencia para cuantificar Ig E total en suero. Consiste en la utilización de un monoclonal específico para IgE humana fijado a la fase sólida al cual se expone un volumen de suero, luego de la incubación y lavado se agrega un segundo monoclonal marcado con biotina que reconoce a la IgE en otro punto, luego de un segundo periodo de incubación y lavado se pasa a la fase de detección usando una enzima (peroxidasa) unida a avidina (compuesto con afinidad a la biotina). Aplicamos otro periodo de incubación y lavado seguido de la adición del cromógeno con el sustrato; se espera unos minutos y se mide el desarrollo de color. Con el uso de curvas de calibración se determina la concentración. El valor de IgE en suero es común expresarlo en unidades internacionales (IU)/ml. Se puede hacer una conversión a nanogramos usando la relación de 1 UI= 2.4 ng. Recientemente se ha introducido unidades de Sistema Internacional (SI) en la cual 1SI = 1 ug/L No olvide que al igual que las otras clases de Ig las concentraciones en suero son dependientes de la edad. Detección de Ig E total Significado clínico La IgE actúa en la anafilaxia y la atopia, entre otras cosas. La IgE se produce, principalmente, en el revestimiento de las vías respiratorias y del tubo intestinal. El 50% es intravascular y se encuentra también en secreciones. El asma bronquial alérgica depende de una reacción de IgE por medio de linfocitos T y B y activados por la interacción del antígeno con las moléculas de lgE situadas en las células cebadas. De las diversas clases de inmunoglobulinas, IgE es la que se encuentra a concentraciones más bajas. La IgE puede unirse, por medio de la región Fc, a los basófilos y a los mastocitos. Unida a mastocitos y en presencia del alérgeno produce la liberación de histamina, leucotrienos y otras sustancias bioactivas. La porción Fc se une a las células diana y la Fab al alérgeno. La IgE puede ser importante en la respuesta inmune humoral frente a la enfermedad parasitaria. Se cree que permite que los leucocitos, los anticuerpos y los componentes del complemento lleguen a los lugares en que tiene lugar la inflamación, lo que conduciría a una reacción de hipersensibilidad inmediata. La lgE no atraviesa la placenta. Utilidad clínica 1. Evaluación de atopía: La IgE total, aunque es útil en el diagnóstico de procesos alérgicos de tipo I (hipersensibilidad inmediata), puede estar aumentada por otros motivos. 2. Variabilidad por enfermedad Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


2.1Aumentada: Aumento policlonal en enfermedades alérgicas y aumento monoclonal en mieloma múltiple a IgE; asma bronquial; dermatitis atópica, mononucleosis infecciosa, aspergilosis, schistosomiasis, hidatidosis, triquinosis, ascartasis, glomerulonefritis, síndrome nefrótico. 2.2 Disminuida: Neoplasias avanzadas, algunas agammaglobulinemias, ataxiatelangiectasia. 3. Variabilidad por drogas 3.1Aumentada: Penicilina G, aztreonam. 3.2Disminuida: Fenitoína 4. Variabilidad preanaliticas 4.1 Aumentada: Preeclampsia. Fumadores. 4.2 Disminuida: Tratamiento con calor. Método de Detección: Radioinmunoanálisis, muestra de suero o plasma (Refrigerar sí no se utiliza de inmediato) Nota: los valores superiores a 100 U/ml se consideran como altamente probables de origen atópíco. 2. PRUEBAS PARA DETECTAR IgE ESPECÍFICA EN SUERO La medición cuantitativa en suero de anticuerpos IgE específicos para alérgenos, requiere métodos especiales para detectar las cantidades extremadamente pequeñas (picogramos por mililitros) que se encuentran en los pacientes alérgicos. La técnica estándar es la prueba radioalergoabsorbente (RAST). Es un sistema de dos fases (sólida/líquida) que utiliza un alérgeno insolubilizado que se incuba primero con el suero de prueba para reaccionar con los anticuerpos específicos para el alérgeno, y después con anti- lgE humana radiomarcada para detectar los anticuerpos específicos del isotipo lgE. Detección de IgE específica Significado clínico Ver lgE total. Tiene mayor interés detectar lgE específica en contra de un determinado alérgeno que IgE total, ya que esta última puede estar aumentada por otros motivos. Por ello, se hacen RAST (radio-alergo-sorben-test) a diversos alérgenos: pólenes de gramíneas, plantas herbáceas, árboles, ácaros, animales, polvo de casa, alimentos, hongos, insectos, medicamentos, etc. En procesos alérgicos puede estar aumentada la IgG4. Para el diagnóstico e identificación del alérgeno a veces no es suficiente o adecuada la determinación del RAST. La IgE que interesa es, principalmente, la unida a mastocitos o basófilos. El proceso puede cursar sin aumento de lgE. Pruebas alternativas o complementarias son: intradermorreacción, prueba de provocación directa, TEL (test de estimulación linfoblástica), desgranulación de basófilos Utilidad clínica Permite la identificación de los alérgenos específicos involucrados en la atopía Métodos de Detección: Radioinmunoanálisis y Electroquimioluminiscencia, muestra de suero o plasma. (Refrigerar sí no se utiliza de inmediato)


Valor de referencia Clase 0: Concentraciones no detectables Clase 1: Bajos Clase 2: Moderados Clase 3: Altos Clase 4: Muy altos

0,00 - 0,35 PRU/ml 0,36 - 0,70 PRU/ml 0,71 - 3,50 PRU/ml 3,51 - 17,50 PRU/ml >17,51 PRU/mI

Autores: Manuel MarĂ­a Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


LABORATORIO # lO.2 PRUEBA DE HIPERSENSIBILLDAD CUTÁNEA TARDIA INTRODUCCIÓN Las células inmunocompetentes, como linfocitos, monocitos, macrófagos y granulocitos, todas participan en las reacciones de hipersensibilidad tardía, que son muy importantes en la inmunidad a infecciones intradérmicas, inmunidad a tumores y rechazo de injertos. A pesar del desarrollo de múltiples procedimientos para la evaluación de la inmunidad celular, la prueba intradérmica de hipersensibilidad cutánea tardía permanece como un arma muy útil para evaluar la rama de la inmunidad celular y en algunos casos permite establecer el diagnóstico. La prueba de hipersensibilidad cutánea tardía detecta hipersensibilidad cutánea a un antígeno o grupo de antígenos. Sin embargo, cuando se efectúan pruebas para una enfermedad infecciosa, una respuesta positiva no indica una infección activa con el microorganismo de prueba. La incapacidad para reaccionar contra un conjunto de antígenos cutáneos habituales se denomina anergia. TÉCNICA DE LA PRUEBA CUTÁNEA 1. Se deben almacenar los antígenos estériles liofilizados a 4°C, protegidos de la luz. Reconstituirlos poca antes de ser usados. 2. Usar jeringuillas con aguja 25 ó 27, por lo general, asegura una inyección de antígeno intradérmica en vez de subcutánea. La inyección subcutánea puede dar una prueba negativa falsa. 3. Las dimensiones más grandes de eritema e induración deben medirse con regla y registrarse a las 24 y 48 horas. Valores de induración mayores de 5 mm por lo general son aceptados como criterio de una prueba positiva. Autoevaluación 1. Nombre 4 pruebas clínica que evalúan la hipersensibilidad cutánea tardía


CASO CLÍNICO # 22 HIPERSENSIBILIDAD TIPO II La Sra. Lake, una mujer de 30 años embarazada por cuarta vez, acudió a una clínica obstétrica a las seis semanas de gestación. Su primer embarazo había transcurrido sin incidentes, habiendo dado a luz a un niño que en aquel momento era ya un adolescente. Su segundo y su tercer embarazos tuvieron como consecuencia el nacimiento a las 32 semanas de gestación de un niño muerto y un aborto espontáneo a las 22 semanas, respectivamente. La Sra. Lake ignoraba las razones por las que estos embarazos habían fracasado. Posteriormente se había desplazado desde Nigeria hasta el Reino Unido. Entre sus antecedentes clínicos destacaba un paludismo que padeció alrededor de los veinte años de edad, que había cursado sin complicaciones. Nunca había recibido transfusiones sanguíneas. En el examen llevado a cabo con el espéculo se observó un cuello cervical normal y grávido, y en la palpación bimanual no se detectó masa alguna. Su presión arterial era de 135/85 mm Hg, y las restantes exploraciones cardiovasculares y respiratorias no revelaron ninguna anomalía. En la figura 22.1 se muestran los resultados de las investigaciones analíticas llevadas a cabo, incluidas las determinaciones de los grupos sanguíneos de la paciente y de su pareja. Estos resultados implicaban que el feto era heterocigótico con respecto al antígeno D y, por tanto, positivo con respecto a dicho antigeno (CDe/cde). Como la determinación de anticuerpos frente a la rubéola fue negativa, se recomendó a la Sra. Lake la vacunación durante el puerperio. Los antecedentes de la Sra. Lake, junto con la situación con respecto al grupo Rh, hicieron precisa la monitorización de las concentraciones maternas de anticuerpos anti-D y de la hemoglobina del feto a lo largo de todo el embarazo, para prevenir la enfermedad hemolítica del recién nacido (EHN). Se obtuvieron muestras de suero a intervalos de tres semanas, en las que se observó un aumento de las concentraciones maternas de anti-D, hasta alcanzar 1,4 pg/ml a las 17 semanas. Se llevó a cabo una amniocentesis, en la que se obtuvo una muestra para la estimación espectroscópica de los pigmentos biliares. Esta determinación reveló la existencia de una intensa hemolisis, por lo que se practicó al feto una transfusión intrauterina de sangre fresca (de menos de 7 días), lavada, exenta de CMV, del grupo O y, negativa con respecto al antígeno Rh D. Dado el riesgo persistente que corría el feto, estaba indicada una cesárea, que fue practicada a las 34 semanas de gestación. La decisión se tomó de acuerdo con los resultados de las pruebas de madurez pulmonar fetal, basadas en la determinación de las concentraciones de surfactante en el líquido amniótico. Mediante la cesárea se extrajo un niño varón vivo, con signos de ictericia y anemia. Los resultados de las determinaciones realizadas después del parto se muestran en la figura 22.2. Tras la cesárea se administraron a la madre 100 pg de anticuerpos anti-D por vía intramuscular. Más adelante se le administró más anticuerpo anti-D, ya que en la prueba de Kleihauer se detectó la presencia de más de 1 eritrocito fetal por cada 600 eritrocitos matemos circulantes. La anemia y la bilirrubinemia del recién nacido hicieron necesaria una exanguinotransfusión. Se transfundió medio litro de sangre negativa con respecto al antígeno Rh D, exenta de CMV y del mismo grupo ABO que el del recién nacido. Para degradar la bilirrubina depositada en la piel se sometió al niño a fototerapia. Todavía fue necesaria una nueva transfusión, pero a partir de ese momento el niño se desarrolló normalmente, sin presentar signos de querníctero. Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


Investigación Hemoglobina (g/di) Recuento de leucocitos

Resultado fmngo normal) 14,2 (11,5-16,0) 7,6 (4,0-11,0)

(x ia>/L)

Grupo sanguíneo de la Sra. Lake

A positivo; Rh D negativo

Anticuerpos anti-D Anticuerpos anti-C

0,8 (gg/mi) Negativo

Anticuerpos anti-E Anticuerpos anti-Kell Anticuerpos anti-Duffy Anticuerpos anti-Kidd Anticuerpos anti-B

Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

Grupo sanguíneo del compañero

A positivo; Rh D positivo (CDe/CDe)

Prueba de detección de drepanocitos

Negativa

Anticuerpos frente a rubéola

Negativo

Orina Glucosa Cuerpos cetónicos Microscopía Urocultivo Ecografía

Negativo Negativo ~5 leucocitos/ml Cultivo mixto de < 104 organismos/ml Embarazo uterino normal y sencillo, con contracciones cardíacas visibles

Investigación

Resultado (rango normal)

Sangre del cordón Hemoglobina (g/di) Prueba directa de la

11,9 016,0) Positivo

antiglobulina Grupo sanguíneo

Grupo A Rh D positivo

Recién nacido Bilirrubina sérica (gmoi/u

325

Madre Prueba de Kleihauer para detectar eritrocitos fetales

1 por 450 (< 1 por 600)

PREGUNTAS ¿Cuál es el mecanismo de la enfermedad hemolítica del recién nacido (EHN)? De cada 20 embarazos en los que existe incompatibilidad Rh, solamente en uno o dos se produce la EHN. ¿Por qué? ¿Por qué se administran anticuerpos anti-D a la madre? ¿Por qué es mucho menor la incidencia de EHN relacionada con el grupo ABO que la incompatibilidad ABO maternofetal?


1 ¿Cuál es el mecanismo de la enfermedad hemolítica del recién nacido (EHN)? Cuando las IgG maternas específicas de epítopos de los eritrocitos fetales atraviesan la placenta, se puede producir la destrucción de dichos eritrocitos. Las células quedan recubiertas de anticuerpos y son destruidas por el sistema fagocítico fetal. En el 90% de los casos de EHN, los anticuerpos están dirigidos contra los antígenos Rhésus (Rh). En este sistema se incluyen tres grupos de antígenos localizados en un loci genético que presenta un estrecho ligamiento. C, c, E, e y D codifican distintos antígenos, mientras que d denota la ausencia de antígeno D. Cada individuo hereda los tres grupos procedentes de cada uno de sus progenitores, por ejemplo, cde de la madre y CDe del padre, para dar lugar a un genotipo cde/CDe. En la práctica, la mayoría de las incompatibilidades Rh se debe al antígeno D, aunque los anticuerpos frente a C, E y e también pueden provocar la EHN. Es más rara la aparición de anticuerpos contra los sistemas ABO, Kell, Duffy y Kidd. La sensibilización frente a cualquier grupo de antígenos se puede producir cuando la madre se expone a los eritrocitos fetales tras una hemorragia transplacentaria, es decir, durante una amniocentesis o durante el parto. También pueden aparecer cuando una mujer negativa con respecto al antígeno Rh recibe una transfusión de sangre positiva con respecto al mismo antígeno. En el caso del antígeno Rh D, el niño corre peligro cuando la madre es negativa con respecto a Rh D (cde/cde) y el feto es positivo con respecto a dicho antígeno. La exposición inicial de la madre a los eritrocitos fetales induce una respuesta primaria de anticuerpos IgM, que se suele producir en el momento del parto. Por ello, el primer hijo no suele resultar afectado, y la EHN en el primer embarazo es poco frecuente incluso aunque exista una exposición continuada de la madre a las células fetales durante la gestación. En subsiguientes embarazos, los niños positivos con respecto al antígeno Rh D sí que corren riesgo de EHN, ya que entonces los anticuerpos son de clase IgG y atraviesan libremente la placenta. Las consecuencias de la enfermedad debida a esta incompatibilidad son variables. Cuando la hemolisis es intensa, se puede producir la muerte fetal debido a hidropesía fetal (edema fetal grave) in útero. Los niños con afectación moderada pueden sufrir hipoxia in útero, o pueden nacer con síntomas de anemia, ictericia o insuficiencia cardíaca. La bilirrubina sérica no conjugada se puede depositar en los ganglios básales del cerebro, provocando unas lesiones cerebrales denominadas quernictero. Los niños afectados suelen presentar problemas de crecimiento y se pueden producir episodios epilépticos. Las secuelas, entre las que se encuentran el retraso mental, la sordera para los tonos agudos y la coreoatetosis, son frecuentes. La detección selectiva de la EHN comienza con la determinación del grupo sanguíneo materno durante las fases precoces del embarazo. En las mujeres Rh negativas (el 15% de la población) se debe monitorizar la concentración de anticuerpos anti-D a lo largo de todo el período de gestación. Si la concentración alcanza los 2 pg/ml o si se detecta un aumento súbito del título, se debe llevar a cabo una amniocentesis. Durante las 16 primeras semanas del embarazo, las pacientes deben ser examinadas mediante ecografía, para detectar la presencia de edema fetal. Se puede transfundir sangre al feto in útero, y es costumbre provocar el parto a partir de la semana 32 de gestación si la anemia persiste. Los títulos de anticuerpos no presentan una buena correlación con la intensidad de la EHN, por lo que la monitorización directa del feto es más fiable. Entre los factores que se cree que influyen en la gravedad de la enfermedad se encuentran los antecedentes de la paciente y la subclase de los anticuerpos IgG. Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


2. De cada 20 embarazos en los que existe incompatibilidad Rh, solamente en uno o dos se produce la EHN. ¿Por qué? Se cree que muchas madres no resultan sensibilizadas frente al antígeno D debido a la incompatibilidad maternofetal con respecto al grupo ABO. Cuando existe dicha incompatibilidad, los eritrocitos fetales que penetran en la circulación materna quedan recubiertos con anticuerpos y son destruidos antes de que tengan la oportunidad de inducir una respuesta de anticuerpos específicos frente al antígeno D. Los anticuerpos anti-ABO siempre están presentes, aunque no haya existido exposición previa a células incompatibles. Se supone que esto es debido a un fenómeno de sensibilización cruzada con antígenos de origen bacteriano. 3. ¿Por qué se administran anticuerpos anti-D a la madre? Inmediatamente después del nacimiento de un niño positivo con respecto al antígeno Rh D, si la madre es negativa con respecto a dicho antígeno se le administran anticuerpos antiD. Aunque no se conoce bien el mecanismo de acción exacto, se cree que estos anticuerpos recubren las células positivas con respecto al antígeno D y promueven su eliminación, antes de que se pueda producir una respuesta de anticuerpos frente a las mismas. La eficacia de este procedimiento queda demostrada por la espectacular disminución del número de fallecimientos por EHN en el Reino Unido, tras la introducción de la profilaxis anti-D en 1967. Hasta entonces se producían anualmente unos 850 fallecimientos debidos a la EHN. En la actualidad se administra anti-D después del parto, del aborto (espontáneo o inducido) y de cualquier otro procedimiento en el que se pueda producir una hemorragia transplacentaria, como la amniocentesis, a todas las mujeres Rh negativas. Los tratamientos anti-D han modificado la etiología de la EHN, que antes se debía esencialmente a la sensibilización antiD, y en la actualidad se debe en una mayor proporción de casos a anticuerpos frente a los antígenos C, E, e y ABO. 4. ¿Por qué es mucho menor la incidencia de EHN relacionada con el grupo ABO que la incompatibilidad ABO maternofetal? Aproximadamente en un 20% de los embarazos existe incompatibilidad ABO maternofetal, pero la EHN aparece solamente en una pequeña proporción de estos embarazos. Las madres del grupo A y del grupo B poseen anticuerpos anti-B y anti-A, respectivamente, pero suelen ser de la clase IgM, por lo que no atraviesan la placenta. La mayoría de los casos de EHN provocada por incompatibilidad ABO aparecen en madres del grupo O, en las que es más frecuente la presencia de anticuerpos anti-B y anti-A de la clase IgG. La anemia que presentan la mayoría de los niños con EHN debida a incompatibilidad ABO es leve, y las exanguinotransfusiones sólo son necesarias en menos de un 0,05% de los casos.


CASO CLINICO # 23 HIPERSENSIBILIDAD TIPO II (ANEMIAS HEMOLITICAS AUTOINMUNES) El Sr. Joaquín, de 65 años de edad, acudió a su médico a primeros de enero con malestar general y sensación de frío en sus extremidades. Había observado que, cuando la temperatura era baja, su nariz, orejas, pies y manos adquirían una coloración azul y perdían la sensibilidad, Algunas semanas antes había desarrollado una pequeña úlcera en su dedo corazón izquierdo, que ya bahía cicatrizado. Durante la entrevista afirmó que los síntomas habían comenzado varios años antes y que siempre se presentaban durante los meses de invierno. Había acudido al médico debido a la rigidez creciente y al dolor que experimentaba en los dedos de las manos y de los pies. Recientemente había observado que su orina y heces eran anormalmente oscuras, especialmente cuando la temperatura era baja. El Sr. Joaquín no era diabético ni tenía antecedentes de claudicación con el ejercicio ni en reposo. Cuando se le preguntó al respecto no refirió ningún síntoma torácico reciente, ni fiebre, pérdida de peso, sudoración nocturna o dolor relacionado con el alcohol. No tenía ningún antecedente clínico notable y no estaba sometida a tratamiento alguno. No fumaba y era un bebedor social moderado. En la exploración física se observaron una ligera ictericia y acrocianosis (coloración violácea) en el extremo de la nariz. Los lechos ungueales y las conjuntivas presentaban un aspecto pálido. Las manos y pies también estaban pálidos y fríos, pero se podían percibir los pulsos periféricos. No presentaba ulceraciones y la sensibilidad era normal. Tampoco se observaban edemas ni linfadenopatias. El hígado y el bazo se podían palpar hasta 1cm. por debajo de la caja torácica, pero ninguno de los dos órganos resultaba doloroso al tacto. No se detectó ninguna otra masa abdominal. Su presión arterial era de 145/85 y no se escuchaba ningún soplo cardiaco. La exploración respiratoria fue normal y no presentaba signos de enfermedad hepática. Se estableció un diagnóstico de crioglohulinemia (CG) primaria (idiopática), ya que los antecedentes y las investigaciones llevadas a cabo no aportaron datos suficientes para asociar la enfermedad a alguna otra causa. En el cuadro siguiente se muestran los resultados de las determinaciones analíticas llevadas a cabo.

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


Investigación

Resultado (Ámbito normal)

Hemoglobina (g/dl) VCM (fl) CHCM (%) TIBC (mmolL) Hierro sérico (mmol/L) Folato eritrocitario (ng/L) Vitamina B 12 (sérica ng/L) Recuento de leucocitos (1.0x10 9/L)

7,9 (13.5-18) 102 (7,8-96) 33 (30-34) 61 (45-72) 25 (12-32) 3 54 (160-640) 750 (150-400)

Recuento de plaquetas (1.0x10 9L) Frotis sanguíneo a 37 'C Frotis sanguíneo a temperatura ambiente Prueba directa de la antiglobulina (PDA) VSG Proteínas séricas totales Electroforesis de proteínas séricas Inmunoglobulinas séricas IgG (g/L) IgM (g/l) Anticuerpos específicos del antígeno eritrocitario «I» Complemento sérico C3 (g/L) C4 /g,c¡ lbúmina sérica (g/l)

8.6 (40-11,0) 195 (150-400) Ligera anisocitosis Ligera reticulocitosis Ligera esferocitosis Ausencia de aglutinación Autoaglutinación masiva Ligeramente positiva sólo para C3 de superficie a 37 C. Aumento de la aglutinación a temperatura ambiente 79 mm/hora 71 g/1 Gran pico en la región de las y-globulinas 12,1 (5.4-16,1) 5 ,8 (0.5-1.9) IgM monoclonal kappa, que reaccionaba óptimamente a 4 "C (título 64.000) 0,31 (o,75-1,65) 0,39 (0,20-0.65) 41 (35-50) 56 (30-300)

Fosfatasa alcalina (UI/L) Aspartato aminotransferasa(U1,/L) Bilirrubina sérica (umol/L) Hemoglobinuria Radiografia de tórax Radiografía abdominal

21 (5-35) 20 (3-17) Positivo normal normal


RESPUESTAS 1 ¿Qué significado tiene la prueba directa de la antiglobulina (PDA)? La prueba directa de la antiglobulina IPDA1 sirve para detectar anticuerpos y complemento unido in vivo a la superficie de los eritrocitos. El reactivo de antiglobulina, que consiste en una mezcla de anticuerpos frente a inmunoglobulina y complemento, se añade a una muestra de eritrocitos lavados procedentes del paciente. Cuando las células aglutinan, el resultado se considera positivo. Entre los trastornos en que la PDA es positiva se encuentran la enfermedad hemolítica del recién nacido, la anemia hemolítica autoinmunitaria y las reacciones hemolíticas transfusionales. Se puede determinar qué clase de inmunoglobulina se encuentra lijada a los eritrocitos utilizando antiglobulina con diferente especificidad (ej.: frente a IgG o IgM solamente). Esta misma técnica se puede utilizar para detectar el complemento unido a la membrana. La prueba indirecta de la antiglobulina se utiliza para detectar la presencia de anticuerpos libres. Se incuban eritrocitos en presencia de suero del paciente y, a continuación, se lavan para eliminar el exceso de anticuerpos. Se añade entonces el reactivo de antiglobulina y se comprueba si se produce aglutinación. Esta técnica se emplea sobre todo para llevar a cabo pruebas cruzadas de sangre, en las que los eritrocitos del posible donante se incuban en presencia de suero del receptor. 2 ¿Cómo se clasifican las anemias hemolíticas autoinmunitarias (AHAI)? En el cuadro inferior se comparan las AHAI debidas a anticuerpos calientes y las debidas a la presencia de crioaglutininas. Características

Edad del paciente Distribución según sexo

AHAI por anticuerpos calientes

AHAI por anticuerpos fríos. Criohemoglobinuria paroxística

Generalmente >35

Generalmente >60

Cualquier edad

mujeres > varones

Mujeres = varones

Mujeres = varones

Mecanismo de destrucción de eritrocitos

Hemólisis extravascular en el hígado y el bazo

Clase de anticuerpo.

IG, general mente IgG1 (raramente IgM, IgA)

Tipo de respuesta de inmunoglobulina

CG

Policlonales

Hemólisis extra e intravascular IgM

Monoclonal/policlonales

IgG

Poligonal

Especificidad de los anticuerpos

Antígeno Rh (a veces, otros, p. ej., U, LW)

Efecto del anticuerpo in Vitro.

Aglutinación parcial

Aglutinación total

Hemólisis bifásica

+37 `'C

0----- +4°C

0-----+4 'C

Temperatura óptima de reacción Proteínas sobre la superficie del eritrocito

IgG IgG + C3 C3

35% 55% l0%

Antígeno 1 (antígeno i en la infección por VEB)

Hemólisis intravascular

C3 100%

Antígeno P

C 3 100%

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


3. ¿Cuál es la etiología y patogénesis de la AHAI? La AHAI por anticuerpos calientes puede ser idiopática (55%de los casos) o secundaria a otros procesos. Entre estos últimos se encuentran neoplasias malignas, como el linfoma o la leucemia linfocítica crónica (18%), el lupus eritematoso sistémico las infecciones (6 %) y los tratamientos con ciertos fármacos, como la metildopa o el ácido mefenámico (5%). La CG también es idiopática en el 55% de los casos. En el resto, es secundaria a neumonías por Micoplasmas (32%), linfomas (10%) o mononucleosis infecciosa (3%). En casos idiopáticos y secundarios a neoplasias, los anticuerpos son de naturaleza monoclonal, y en el resto, policlonales. El 50% de casos de criohemoglobinuria paroxística (CHP) son idiopáticos y el 50% restante, debidos al sarampión, la parotiditis o la gripe. La .AHAI por anticuerpos calientes se caracteriza por la formación de anticuerpos de clase IgG frente a antígenos del sistema Rhesus, generalmente frente al antígeno e. Los macrófagos esplénicos se unen a los autoanticuerpos a través de sus receptores Fc, y fagocitan los eritrocitos. Los eritrocitos portadores de C3 en su superficie también se pueden unir a los macrófagos a través del receptor de C3b de estos últimos. Una pequeña cantidad de eritrocitos son lisados en el compartimento intravascular, mediante la activación de la cascada del complemento y la formación de complejos de ataque a la membrana (CAT). La CG se caracteriza por la producción de anticuerpos de clase IgM frente al antígeno 1 de los eritrocitos. Estos anticuerpos aglutinan las células con mayor intensidad cuanto menor sea la temperatura, siendo la temperatura óptima de unión de unos 4 °C. Las IgM unidas a los eritrocitos fijan el complemento en la circulación periférica, en donde la temperatura es más baja (especialmente cuando el clima es frío) . Cuando las células circulan hasta regiones más calientes del organismo, los an ticuerpos se disocian, pero C3 permanece unido. En consecuencia, los macrófagos destruyen los eritrocitos, de la misma forma quien el caso de la AHAI por anticuerpos calientes. La aglutinación de los eritrocitos en un espasmo arteriolar periférico que provoca palidez y frío en las extremidades. La CG secundaria suele ser debida a la infección por Mycoplasma pneumoniae, en la que se producen anticuerpos con actividad anti-I. La CHP se caracteriza por la producción de unos anticuerpos IgG denominados anticuerpos de Donath-Landsteiner, dirigidos contra el antígeno eritrocitario P. Al igual que en la CG, estos anticuerpos se unen y fijan el complemento mejor a bajas temperaturas. Por consiguiente, cuando las células adquieren una temperatura de 37Centigrados son lisadas en el compartimento intravascular, debido ala activación de la cascada del complemento. 4 ¿Qué tratamiento se debe recomendar para la CG? El tratamiento primario es evitar pasar frío, lo que suele ser suficiente para aliviar los síntomas. En algunos casos también pueden resultar útiles los agentes alquilantes como el clorambucil.


LABORATORIO # 11 SEPARACION DE CELULAS MONONUCLEARES USANDO UN GRADIENTE DE FICOLL-DIATRIZOATO INTRODUCCION Al estratificar una muestra de sangre sobre el Ficoll-Diatrizoato y centrifugar, las células mononucleares se separan del resto, debido a diferencias de densidad. El Ficoll aglutina los eritrocitos, por lo que estos pasan a través del medio y sedimentan al fondo. Los granulocitos también sedimentan por su tamaño, densidad y por la tendencia a formar agregados. Los mononucleares (linfocitos y monocitos), por su menor densidad se quedan en la interfase, entre el plasma y el medio con una contaminación relativamente baja de plaquetas y otros tipos celulares. Los mononucleares se recogen del anillo blanco que queda en la interfase, después de haber retirado el plasma de la capa superior. Este procedimiento da un rendimiento de alrededor del 50% de los linfocitos presentes en la muestra, con una viabilidad de por lo menos un 90% (determinada por exclusión de azul de tripan). MATERIALES l. Jeringuillas 3. Heparina sódica 5000 U/ml 5. Pipetas Pasteur 7. Ficoll-Diatrizoato

2. Tubos cónicos para centrifugación 4. Medio RPMI l640 6. Azul de tripán 8. Cámara de Neubauer

PROCEDIMIENTO l. Extraiga 3ml de sangre venosa periférica, viértalo en un tubo con 3 ml de RPMI l640 (que contiene l00 Unidades de Heparina sódica/ml) y mezcle gentilmente. 2. Agregue a un tubo cónico de l3 ml de capacidad 4 ml de Ficoll-Diatrizoato (F-D). 3. Lentamente e inclinando el tubo unos 30 grados, vierta sobre el F-D la sangre del paso l. NO MEZCLAR 4. Centrifugue a 400 x g por 30 min. a 20oC 5. Aspire el anillo blanco de células mononucleares con una pipeta Pasteur 6. Deposite el anillo en un tubo plástico y agregar medio de cultivo hasta la marca del tubo (aproximadamente 10 cc) 7. Centrifugue a l35 x g por l0 min. a 20oC. 8. Resuspenda el paquete celular en 1 ml de medio de cultivo. Mezcle una gota de esta suspensión con una gota de azul de tripan y determine el % de células viables en una placa (cuente 100 células mononucleares y luego reste las células claras - células azules). 9. Haga un recuento de células/ml en la cámara de Neubauer. AUTOFORMACION l. Mencione los usos más frecuentes de esta técnica en Inmunología. 2. Investigue los factores que podrían alterar la eficiencia de la técnica.

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


CASO CLINICO # 28 HIPERSENSIBILIDAD DE TIPO III (ALERGIA A DROGAS) Maritza había padecido de niña varios episodios de faringitis, que habían sido tratados con antibióticos, sobre todo con penicilina. Después de unos cuantos tratamientos de este tipo desarrolló un exantema. Por lo que se le indicó que padecía alergia a la penicilina y que debía evitar su utilización en el futuro. Afortunadamente, una vez que terminó su periodo escolar, contrajo muy pocas infecciones que hiciesen necesaria la administración de antibióticos. Al final de unas vacaciones que disfrutó en el extranjero a la edad de 28 años, Maritza padeció una cistitis aguda, con disuria y polaquiuria. Cuando regresó a su ciudad, acudió a su médico de cabecera, que le prescribió un tratamiento antibiótico de 8 días de duración con trimetoprima. Por supuesto, se evitó la utilización de penicilina. Maritza completó su tratamiento y, tres días después, desarrolló cefalea y aparecieron unos abultamientos pruriginosos en distintas zonas de su piel. Al día siguiente, sus articulaciones estaban adoloridas e hinchadas, especialmente las de las muñecas y las rodillas, aunque sus manos también se encontraban afectadas. En ningún momento relacionando estos síntomas con el fármaco, ya que había interrumpido el tratamiento unos días atrás. Acudió al médico, que confirmó que el exantema era una urticaria, pero que observo que además presentaba fiebre e inflamación de los ganglios cervicales. En el análisis de orina se detectó la presencia de proteínas. El médico solicitó una serie de determinaciones adicionales, pero, entre tanto, instauró un tratamiento con antihistamínicos, advirtiendo a Maritza que en caso de que no resultaran eficaces debería ser tratada con corticoesteroides. El diagnóstico fue alergia a los medicamentos. Sus síntomas no desaparecieron, por lo que se inició un tratamiento por vía oral con prednisona. Se estudió la posibilidad de llevar a cabo una biopsia renal, pero esta idea se desechó ante la buena respuesta que presentó al tratamiento con corticoesteroides. Tres semanas después, Maritza acudió a una revisión en la que se comprobó que todos sus parámetros habían vuelto a la normalidad. Investigación Hemoglobina (g/dl) Recuento de leucocitos Eosinófilos (x 109/L) Linfocitos totales (x 109/L) VSG C3 (g/L) C4 (g/L) Anticuerpos antinucleares Factor reumatoide

Resultado (Ámbito normal) 14,1 (11,5-16,0) 10,1 (4,0-11,0) 1,45 (0,4-0,44) 2,2 (1,6-3,5) 34 mm/hora 0,41 (0,75-1,65) 0,09 (0,20-0,65) Negativo Negativo

RESPUESTAS 1. ¿Cuál es el mecanismo más probable de la reacción? Los síntomas de exantema, artralgia y cefalea son muy sugestivos de una respuesta alérgica a fármacos. Sin embargo, estos síntomas aparecieron una vez que se había


interrumpido el tratamiento con el fármaco, lo que podría plantear algunas dudas sobre la relación causal entre la ingestión del fármaco y los efectos adversos observados. En el síndrome <<postinfección>> también aparece un conjunto de síntomas parecido, que no son debidos a una reacción frente a un fármaco. El retraso en la aparición de los síntomas se debe a que es necesario que el anfígeno circule durante un largo período de tiempo, de tal manera que, cuando se haya sintetizado una cantidad suficiente de anticuerpos, los complejos anfígeno-anticuerpo formados precipiten en los diversos tejidos diana. Independientemente del lugar en donde se depositen estos complejos, fijarán el complemento y provocarán lesiones a nivel local. En el caso de esta paciente, probablemente se produjeron lesiones a nivel del glomérulo renal, como demuestra la proteinuria observada, así como en las articulaciones y en la piel, en donde se observó inflamación. También es posible que la infección urinaria no hubiese remitido del todo, siendo ésta la razón de la proteinuria. La paciente también presentaba anomalías que indicaban que existía consumo del complemento (bajas concentraciones de C3 y C4) así como un aumento de la concentración de los productos de la activación del mismo, en concreto de C3a. C3a y C5a, compuestos denominados anafilotoxinas, son capaces de inducir directamente la liberación de histamina por parte de los mastocitos. Esto puede hacer que una reacción de hipersensibilidad de tipo III se confunda con un choque anafiláctico. Antiguamente, las inyecciones de proteínas extrañas como el suero antitetánico (SAT) obtenido a partir de caballo daban lugar a la enfermedad del suero. El SAT se administraba cuando existía peligro de contraer el tétano, para inmunizar pasivamente al paciente, al mismo tiempo que se llevaba a cabo una inmunización activa. Los productos derivados de la sangre también pueden dar lugar a la enfermedad del suero. 2. ¿Qué fenómenos de la naturaleza no inmunitaria pueden desencadenar reacciones frente a los fármacos? Hay diversos fármacos que pueden dar lugar a determinadas reacciones, al activar algunas vías efectoras mediante mecanismos no inmunitarios. Algunos fármacos, como los opiáceos, provocan la liberación de mediadores a partir de los mastocitos mediante una acción directa sobre estas células, sin que el proceso intervenga las IgE. Otros compuestos, como las sustancias utilizadas en radiología como medio de contraste intravenoso para determinar el patrón de excreción renal, activan la vía alternativa del complemento, por lo que inducen la formación de anafilotoxinas C3a y C5a. Como se ha indicado anteriormente, esto puede provocar un choque anafiláctico. Otros fármacos, como la aspirina y los antiinflamatorios no esteroideos (AINE), interaccionan con las vías del ácido araquidónico, por lo que también pueden dar lugar a un choque anafiláctico. Hay una entidad clínica bien definida, que se caracteriza por la presencia de la tríada de asma, pólipos nasales y sensibilidad a la aspirina. Estos pacientes corren el riesgo de sufrir un episodio de asma aguda ante la ingestión de aspirina u otro AINE. También hay reacciones que se producen debido a sobredosis, aunque en estos casos los síntomas son predecibles y se deben al mecanismo principal de acción del fármaco. Esta sobredosificación no tiene por qué ser voluntaria, sino que puede ser debida a una excreción o degradación lenta del fármaco por parte del paciente. También es frecuente que los fármacos provoquen efectos secundarios, que se definen como aquellos efectos distintos a los pretendidos al administrar el fármaco. Ejemplos son la alopecia, los problemas gastrointestinales y los efectos tóxicos sobre la médula ósea que causan los compuestos inmunosupresores. Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


Otros fármacos están relacionados con el entorno ecológico del paciente al que se administra el fármaco. Los antibióticos de amplio espectro modifican la flora bacteriana intestinal, lo que en muchas ocasiones provoca un sobrecrecimiento de Candida spp. En la cavidad oral, el tracto gastrointestinal o la vagina. Las interacciones farmacológicas también pueden dar lugar a problemas. El probenecid administrado para el tratamiento de la gota inhibe la excreción renal de penicilina. La fenitoína administrada para el tratamiento de la epilepsia interfiere en el metabolismo del folato. También se ha observado que los tratamientos prolongados pueden disminuir las concentraciones de IgA. Algunos fármacos pueden llegar a agravar enfermedades preexistentes. Es el caso del litio, que se administra para el tratamiento de enfermedades maníaco-depresivas, pero que puede provocar exacerbaciones de un acné o de una psoriasis preexistente. 3. ¿Es más probable que un paciente sea alérgico a un fármaco si se ha detectado anteriormente alergia a otros fármacos? Si un paciente ha experimentado previamente una reacción alérgica a la penicilina, la probabilidad de que presente alergia a otros antibióticos es de 10 veces mayor que en el caso de un individuo normal. La afirmación inversa también es cierta, es decir, si un paciente ha presentado previamente una reacción frente algún agente antimicrobiano, la probabilidad de que presente una reacción alérgica a la penicilina también es mayor. Hay determinados factores que aumentan el riesgo de alergia a los medicamentos, como el trasfondo genético, el estado metabólico, los tratamientos farmacológicos simultáneos y algunas enfermedades, como la infección por el VIH o las enfermedades autoinmunitarias, que modifican la farmacocinética de los fármacos: Un ejemplo son los asmáticos tratados con aminofilina que padecen infección vírica. El virus reduce la actividad del sistema enzimático del citocromo P450, que degrada la aminofilina, por lo que la semivida del fármaco aumenta y se pueden producir efectos tóxicos. 4. ¿Por qué se solicitó la determinación de autoanticuerpos? La paciente se presentó con exantema, dolores articulares y una anomalía renal evidente, como demostraba la proteinuria. Un posible diagnóstico hubiese sido lupus eritematoso sistémico. En este caso, podría haber sido inducido por el fármaco, en cuyo caso se hubiese detectado la presencia de anticuerpos antinucleares. Hay ciertos fármacos, como la hidralazina y la procainamida, capaces de inducir la formación de anticuerpos antinucleares en cierta proporción de los pacientes que los utilizan (aproximadamente un 60%). En la mayoría de los pacientes estos anticuerpos son inofensivos, pero su título puede elevarse incluso años después de interrumpir el tratamiento con el fármaco. En una pequeña proporción de pacientes se desarrolla un síndrome parecido al LES. En estos casos, los síntomas principales son la poliserositis y la afectación pulmonar, pero es raro que resulten implicados los riñones y el sistema nervioso. Desde un punto de vista clínico, sería poco probable que Maritza padeciera LES inducido y que no se detectasen anticuerpos antinucleares. No se conoce el mecanismo mediante el que estos fármacos inducen la formación de los anticuerpos. Los fármacos inductores de lupus se pueden administrar a pacientes con LES previo sin que su estado se agrave.


CASO CLINICO # 31 HIPERSENSIBILIDAD DE TIPO IV (DERMATITIS DE CONTACTO) La Srta. Nora, de 25 años de edad, trabajaba muy activamente en una compañía industrial y además se encargaba de cuidar la casa de sus padres, ambos inválidos. Estaba muy orgullosa de cómo llevaba a cabo esta última tarea y mantenía la casa escrupulosamente limpia. Desde hacía algunas semanas, en distintas partes de su cuerpo había aparecido un exantema, especialmente en las manos y en las muñecas, el contorno del cuello y los lóbulos de las orejas. El exantema se fue agravando progresivamente, por lo que acudió a un dermatólogo. De niña había padecido un eccema atópico, y en su adolescencia sufrió acné juvenil, que fue tratado con tetraciclinas; no tenía ningún otro antecedente clínico de interés. En la exploración física se observó que el examen consistía en un eritema asociado a la presencia de pequeñas ampollas. Debido al prurito, se había producido de una notable excoriación. Las manos estaban enrojecidas, escamosas y secas, y el exantema que se observaba en ellas era bastante diferente al del cuello y los lóbulos de las orejas. El dermatólogo sospechó que se trataba de una dermatitis por contacto, por lo que aplicó una serie de parches con agentes sensibilizadores estándar, y examinó las reacciones producidas a los 2 y 4 días. Entre los agentes investigados se encontraban la goma, los cosméticos, los extractos de plantas, los perfumes, los metales y el maquillaje y algunos otros. La paciente presentó reacciones fuertemente positivas frente a la goma y al níquel. Se aconsejó a la Srta. Nora que dejase de utilizar guantes de goma para lavar y fregar, que en su lugar utilizase unos forrados con algodón. Cuando se le preguntó acerca de las joyas que utilizaba, afirmó haber recibido recientemente un regalo de su novio, consistente en un juego de pendientes, collar y reloj, a los que se atribuyó su dermatitis de contacto. Se prescribió una crema con bajo contenido de corticosteroides y se le aconsejó que dejase de utilizar las joyas mencionadas. A partir de ese momento no volvió a padecer nuevos episodios de alergia cutánea. ¡se le indicó que en el futuro utilizase joyas de alta calidad! Preguntas 1. ¿Qué características presenta el antígeno que contiene las joyas? La reacción alérgica por contacto es un ejemplo clásico de hipersensibilidad tipo IV. La reacción en sí consiste en un eccema que aparece cuando un agente externo entra en contacto con la piel. Los agentes causales más frecuentes son haptenos, como los metales, los cromados y el níquel, así como los agentes químicos, la hiedra venenosa y el roble venenosos. La administración tópica de fármacos también puede dar lugar a reacciones por contacto. Los haptenos son moléculas que resultan demasiado pequeñas como para iniciar por sí solas una respuesta inmunitaria. Su peso molecular suele ser del orden de 1 Kdal. Cuando estas moléculas penetran en la epidermis, forman enlaces covalentes con proteínas del organismo, dándolo lugar a un complejo hapteno-portador con actividad inmunógena. Solamente una pequeña proporción de los individuos que entran en contacto con el níquel quedan sensibilizados, siendo muy difícil poder presidir la capacidad sensibilizadora de un hapteno determinado a partir de su estructura química. Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


En este sentido, existe una cierta correlación con el número de moléculas de hapteno que se unen a cada molécula de portador, con la capacidad de l a molécula de hapteno para penetrara en la piel y con la existencia de enlaces no saturados entre átomos de carbono, que se pueden oxidar y dar lugar a puntos de formación de nuevos enlaces. Algunos agentes, como el dinitroclorobenceno (DNCB), son capaces de sensibilizar prácticamente a cualquier individuo, por lo que se pueden utilizar para determinar la capacidad inmunitaria mediada por células de pacientes en los que se sospecha un deterioro del sistema inmunitario. Prácticamente todo el DNCB aplicado que da unido a las células epidérmicas a través de grupos –NH2 de las moléculas de lisina. El reconocimiento del complejo haptenoportador por parte de las células T es específico frente al propio conjugado, y no implica un reconocimiento por separado del hapteno y del portador, como en el caso de la formación de anticuerpos. 2. ¿Qué datos demuestran que en el eccema de de contacto se produce una reacción de hipersensibilidad de tipo IV? Se ha investigado intensamente la patología del eccema de contacto, y una serie de datos indican claramente la participación de las reacciones mediadas por células en las lesiones cutáneas que se producen.  Los vasos linfáticos son necesarios para la inducción del eccema de contacto en la piel. Si se elimina el riego linfático de una región de la piel, no se produce sensibilización frente a agentes aplicados por vía epicutánea.  Al igual que ocurre en otras reacciones mediadas por células, la sensibilidad puede ser transferida desde un animal inmunizado a uno normal a través de células, pero no a través de suero.  Para que se produzca una reacción de hipersensibilidad por contacto es necesaria la existencia de riego vascular en la zona expuesta al alérgeno. Solamente se producirá un eccema de contacto en determinado punto cutáneo si el animal ha sido sensibilizado previamente en otra zona diferente.  Si se obtienen biopsias de una región cutánea tras la aplicación de un agente químico sensibilizador, se observa un aumento del número de células reticulares existentes en el ganglio linfático colector y un considerable aumento del número de células de Langerhans en la zona paracortical de dichos ganglios.  Cuando se activan in vitro los linfocitos, las células de Langerhans de la epidermis pueden actuar como células presentadoras de antígeno frente a los linfocitos T de individuos alérgicos. Es interesante el hecho que si se trata previamente la zona de la piel en que se va a llevar a cabo la sensibilización con radiación ultravioleta (UV), dicha sensibilización no se produce, y el número de células de Langerhans queda drásticamente reducido. Además, cuando se cultivan estas células, no son capaces de actuar como CPA, lo que explica los efectos de radiación UV. Todos los datos expuestos demuestran que las lesiones que aparecen en el eccema de contacto son debidas a una respuesta de tipo celular. 3. ¿Cuál es el mecanismo de aparición del eccema de contacto? La reacción de hipersensibilidad por contacto consta de dos fases diferentes. En primer lugar se produce la sensibilización, proceso que puede durar hasta dos semanas. Durante esta fase, el hapteno se combina con la proteína portadora y es procesado por las células de Langerhans de la epidermis. A continuación, éstas migran hacia las regiones


paracorticales del ganglio linfático colector, donde las moléculas CPH de clase II presentan el antígeno a los linfocitos CD4+, provocando la proliferación clonal. En segundo lugar se produce la fase de reacción, en la que participan también las células de Langerhans. Tras la aplicación del alérgeno de contacto sobre la piel, se produce una reducción del número de células de Langerhans en la epidermis. La presentación del antígeno se produce en la piel y en los ganglios linfáticos regionales, dando lugar a la liberación de citocinas procedentes de muchos tipos de células diferentes. También existen datos que indican que, después del contacto con el alérgeno, se produce la desgranulación de los mastocitos, lo que no sólo tiene como consecuencia la liberación de mediadores, sino que también induce la formación de citocinas. El TNF α y la IL-1 inducen la expresión de moléculas de adherencia en las células endoteliales, lo que constituye una señal que promueve la migración de células mononucleares hacia la piel. Uno de los primeros cambios celulares que se observa es la presencia de células mononucleares en la epidermis, siendo máxima esta filtración 48-72 horas después de la exposición. Los linfocitos que aparecen son principalmente CD4+, aunque también hay algunos CD8+. Debido al fenómeno de amplificación de la infiltración celular que provocan las citocinas, la acumulación celular que se produce no es específica del antígeno implicado. 4. ¿Cuál es el mecanismo de regulación negativa de la respuesta a los alérgenos de contacto? La reacción clínica que se produce tras la aplicación del alérgeno de contacto comienza a remitir unos dos días después, y desparece completamente en el plazo de una semana. Este fenómeno es consecuencia de un conjunto de procesos que se producen a nivel cutáneo. Transcurridos unos días, los complejos hapteno-portador se degradan, por lo que la cantidad de antígeno presente se reduce. Los queratinocitos y los macrófagos cutáneos producen prostaglandinas de tipo E, que regulan negativamente la producción de IL-1 e IL-2. El TGF β también regula negativamente los efectos estimulantes de la IL-1 y la IL-2. Además, las citocinas inhiben la migración de los macrófagos desde el punto de contacto, para evitar la diseminación de la respuesta alérgica. La expresión de moléculas de clase II, que también se ve afectada por la IL-10, amplifica la supresión de producción de citocinas, inhibiendo más la proliferación de las células T H1.

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


CASO CLINICO # 30 GRANULOMATOSIS DE WEGENER La Srta. Lees, de 33 años de edad, acudió al el servicio de urgencias tras ocho meses de padecer de obstrucción nasal y dos meses de dolor en los muslos. A lo largo de las tres semanas anteriores, su muñeca derecha, en primer lugar, y después su rodilla derecha y ambos pies se habían hinchado y habían comenzado a dolerle. Además, su ojo izquierdo se había enrojecido súbitamente la semana anterior, sus pabellones auriculares habían compensado a dolerle y habían aparecido úlceras en su boca. También había comenzado a expulsar mucosidades sanguinolentas por la nariz. Había pasado de orinar una vez durante la noche a hacerlo al menos tres o cuatro veces. Su sinusitis no había mejorado, pese a un tratamiento de una semana con antibióticos. No tenía antecedentes médicos de importancia, excepto una sensibilidad a la luz solar que padecía desde hace mucho tiempo. En su familia tampoco había ningún antecedente interesante. En la exploración física se apreció que estaba claramente enferma, con un dolor intenso de sus articulaciones, que se encontraba hinchadas, y en sus orejas, aunque no presentaba fiebre. Fue ingresada para proceder a un estudio más detallado. (fig. 30.1). Fue remitida a los nefrólogos para la evaluación de su insuficiencia renal, y a los cirujanos ORL para que emitiera su opinión sobre su sinusitis. Se solicitó la determinación de anticuerpo ANCA y anti-MBG. También se obtuvo una biopsia de sus lesiones nasales (fig. 30.2).

INVESTIGACIÓN

RESULTADO (rango normal)

Hemoglobina (g/d) Recuento de leucocitos (x 10 /L) Neutrófilos (x 10 /L) Plaquetas (x 10 /L) VSG PCR Creatincinasa Inmunoglobulinas séricas lgG (g/L) lgM (g / L) lgA (g /L) lgE (UI / L) Autoanticuerpos: ANA y factor reumatoide Antígenos nucleare extraíbles

10,9 (11,5-16,0) 18,4 (4,0 –11,0) 14,0 (2,0 –7,5) 720 (150-400) 68 mm/hora 300 58 IU/L

Aclaración de creatinina Creatinina sérica (umol/L) Albúmina sérica (g / L) Análisis de orina Proteínas Urocultivo Radiografía de tórax

40 (ml/ min) 450 (70 –150) 29 (35 – 50)

Fig. 30.1 Resultado de las investigaciones analíticas.

13,9 (5,4-16,1) 2,1 (0,5 – 1,9) 1,4 (0,8 –2,8) 291 (3 –150) negativo negativo

++ Negativo Normal


Se estableció su diagnostico de granulomatosis de Wegener, y se inicio un tratamiento con prednisolona (60 mg/día) y azatioprina (100 mg/día). Transcurrido un mes, su función renal volvía a ser normal , y sus senos nasales no contenían líquidos. El titulo de ANCA se había reducido hasta 1:30. Se mantuvo el tratamiento con la dosis inicial de azatioprina durante un año. A lo largo de ese período, la dosis de prednisolona se fue reduciendo gradualmente hasta 20 mg/día. Su titulo de ANCA se mantuvo estable en 1:30, y los síntomas no se volvieron a presentar.

PREGUNTAS 1 ¿Cuáles son los dos antígenos principales que reconocen los ANCA? El antígeno primario que reconocen los c-ANCA es la serinproteasa 3 (SP3); se trata de una enzima proteolítica de29 kdal que se encuentra en los neutrófilos y en los monocítos, así como en las células mieloides de la médula ósea, en donde ejerce el papel de hormona inductora de la maduración de los granulositos, por lo que también se denomina mieloblastina. Se ha detectado además en cultivos de células endoteliales procedente de la vena umbilical. El inhibidor natural de la SP3 es la -1-antitripsina. En algunas ocasiones, los c-ANCA reconocen también a la elastasa de los neutrófilos (29kdal) y a CAP-57 (una vitamina con actividad antimícrobiana). Los p-ANCA que aparecen en el suero de pacientes con vasculitis suelen reconocer la mieloperoxidasa (MPO). En otras enfermedades hepáticas de naturaleza autoinmunitaria, la infección por el VIH y la artritis reumatoides, los p-ANCA reconocen otras proteínas presentes en los gránulos de los neutrofilos, como la lactoferina o la captresina G. La MPO canaliza la transformación de peróxido de hidrógeno en hipohaluros, sobre todo HOCL. También pueden intervenir en otras reacciones en las que se generan radicales libres. La MPO es una proteína muy básica (pH=11,0), cuyo peso molecular es de 145kdal, aproximadamente. 2 ¿Cuál es la especificidad diagnostica para cada uno e los diferentes antójenos reconocidos? Los c-ANCA o anti-SP3 aparecen en el suero de alrededor del 90% de los pacientes con vasculitis sistémica activa, confirmando el diagnostico de granulomatosis de Wegener (GW). Algunos pacientes con GW generalizada no presentan anticuerpo frente a SP3, pero si frente a la elastasa de los neutrófilos o la MPO. La sensibilidad de esta prueba se reduce hasta un 60% en el caso de GW eliminada , es decir, la forma de la enfermedad de la que no existe vasculitis renal. También se puede detectar c-ANCA específicos de SP3 en el suero de pacientes con vasculitis exclusivamente renal (20%), así como en la poliangitis microscópica (40%). Los antígenos relacionados con el ANCA se han encontrado también en el suero de pacientes con amebiasis invasiva y con vasculitis inducida por fármacos. Los p-ANCA específicos de la MPO aparecen en el suero de hasta un 60% de los pacientes con vasculitis exclusivamente renal, así como en el 40% de los pacientes con dicha enfermedad asociada a síntomas sistemáticos (poliangitis microscópica; v. Más arriba de la situación serológica de estos pacientes con respecto a los c-ANCA). Los anticuerpos frente a la MPO se encuentran solamente en un pequeño número de pacientes (Aproximadamente el 10%) con poliarteritis nudosa. Los anticuerpos p-ANCA y Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


anti-MPO también aparecen hasta en un 60% de los pacientes con síndrome de ChurgStrauss, hasta en un 90% de aquellos con lupus inducidos por fármacos , un trastorno leve en que los riñones no suelen resultar afectados, y en la vasculitis sistemática inducida por fármacos, en la que la afectación renal si que es importante. Los fármacos que presentan mayor tendencia a desencadenar estas reacciones son la hidralazina y la D-penicilamina. Estos autoanticuerpo se encuentran hasta en un 10% de los pacientes con LES o AR, pero no suele estar relacionada con la presencia de vasculitis activa. En el suero de los pacientes en fase de remisión se puede seguir detectando altos titulos de anticuerpos circulantes anti-MPO. Hasta un 50% de los pacientes con colitis ulcerosa presentan P-ANCA atípicos (tinción perinuclear ligeramente difusa ), pero este fenómeno solamente se observa en el 5% de los pacientes con enfermedad de Crohn. Estos anticuerpos se detectan en la mayoría de los pacientes con cirrosis biliar primaria y hasta en un 70% de los que padecen hepatitis crónica activa. No se han identificado exactamente los antígenos que reconocen los ANCA atípicos. 3 ¿Qué papel pato fisiológico se suponen que ejercen los ANCA in vivo? Se ha sugerido que los ANCA pueden desempeñar un papel en la patogénesis de la vasculitis, al activar directamente neutrófilos y, posiblemente, a los monocitos, en regiones en que las células endoteliales expresan la moléculas de adherencia adecuadas. Tras una primera fase de inducción ejercida por citocinas (como el TNF-α),las encimas de los gránulos son expresadas sobre la superficie de los neutrófilos, de tal forma que los anticuerpos se pueden unir a las mismas. Se ha demostrado in vitro que los anticuerpos frente a frente a SP3 y MPO obtenidos a partir de suero de pacientes pueden provocar el estallido respiratorio y la desgranulación de los neutrófilos, lo que puede dañar alas células endoteliales. El mecanismo de transducción de la señal a través de la membrana del neutrófilo está basada en el entrecruzamiento de SP3 o MPO con los receptores FcyRlla (ambos presente en la superficie celular), mediante su unión a anticuerpos específicos. Puede que exista otros mecanismo de activación de los neutrófilos mediados por los ANCA , pero hasta la fecha no se conocen. 4 ¿Qué otras características de estos autoanticuerpos pueden influir en los procesos inflamatorios? La respuesta a esta pregunta es todavía incierta. Al haberse encontrado altas concentraciones de anticuerpos circulantes frente a SP3 y MPO en pacientes en la fase de remisión clínica, se han iniciado estudios para determinar si existe alguna diferencia entre los ANCA que se encuentran en la fase activa y latente de la enfermedad:  Subclase de ANCA: en la mayoría de los estudios la enfermedad activa está asociada con anticuerpo frente a SP3 y MPO de la subclase IgG4 e IgG3.  Aunque no se conoce exactamente los epítopos con los que reacciona los anticuerpos, existen algunos datos que indican que estos anticuerpos reconocen los mismos epítopos en los diferentes pacientes.  Hay algunos datos que sugieren la diferencia de anticuerpos reguladores anti-idiotipo en el suero de pacientes convalecientes.


Investigación

Resultados (rango normal

ANCA

Positivo; patrón c-ANCA; Titulo 1:120

Anti-MBG

Negativo

Biopsia nasal

Tejido granulomatoso con Necrosis, inflamación con Eosinófilo, linfocitos, y algunas Células gigantes.

Fig.30.2. Resultados de las investigaciones analíticas

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


LABORATORIO # 12 LINFOPROLIFERACION DE MONONUCLEARES INTRODUCCION Para la determinación de la proliferación linfociticas, tradicionalmente se han utilizado métodos radioactivos; Estos se basan en la incorporación de isótopos como la timidina tritiada en las nuevas cadenas de ADN que se duplican durante la proliferación celular. La cantidad de timidina tritiada incorporada es luego determinada por conteo en líquido de centelleo. Recientemente usando métodos colorimétricos, se han desarrollado nuevas técnicas para medir la proliferación linfociticas. Entre estos últimos métodos colorimétricos se encuentra el de sulforodamina B, que permite cuantificar la linfoproliferación por medio de una medición espectrofotométrica directa en un lector de ELISA.

MATERIAL Y METODOS 1. Cultivo de mononucleares en microplatos. 2. Acido tricloro acético (TCA) al 50 % en agua a 4ºC. 3. Acido acético al 1%. 4. Tinte de Sulforodamina B (SRB) al 0.4% en 1% Ac. Acético. 5. Tris base 10 mM pH 10. 6. Lector de ELISA PROCEDIMIENTO 1. A las 96 horas tomar un plato de mononucleares preparado en el laboratorio #1, aspirar el sobrenadante y agregar a cada pozo 100 ul de TCA al 50% frío. 2. Dejar a temperatura de 4º C por 30 min. 3. Lavar con agua de la pluma 4 veces y dejar que se sequen al aire hasta que no se note nada de humedad en el plato. 4. Teñir con 100 ul de SRB por pozo por 30 min. 5. Lavar y aspirar con 200 ul de Ac. Acético al 1% 4 veces. 6. Secar el plato al aire. 7. Solubilizar el tinte unido a las proteínas con 200 ul de Tris base 10 mM a pH 10, por pozo por 5 min, colocando el microplato sobre un agitador. 8. Hacer lectura de la DO a 515 nm. 9. Determinar las diferencias entre las absorbancias de linfocitos estimulados y controles


10. Informar el indice de estimulaci贸n: IE= absorbancias de linfocitos estimulados/ absorbancias de linfocitos no estimulados a las 96 horas AUTOFORMACION Diagrame la curva de proliferaci贸n para determinar la concentraci贸n

Autores: Manuel Mar铆a Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


CASO CLINICO # 34 SARCOIDOSIS La Sra. Roberta, de 32 años de edad, fue atendida por un neumólogo tras dos meses de letargo, debilidad y malestar general progresivos, unidos a una pérdida de 3 Kg. de peso. Desde hacía poco tiempo sufría sudoración nocturna, y a lo largo del día se sentía congestionada. Durante los 15 días había padecido una ligera disnea tras el ejercicio físico, y había aparecido una tos seca y persistente. El motivo por el que acudió al médico fue la aparición de un exantema rojizo, caliente y doloroso, en las crestas tibiales, la parte superior de los brazos y el cuello. También presentaba dolores articulares, así como prurito e inflamaciones oculares. Sus únicos antecedentes clínicos de interés eran dos embarazos normales a las edades de los 24 y 29 años. No había padecido de tuberculosis ni ninguna enfermedad neoplásica, y no estaba sometida a tratamiento alguno. En un interrogatorio exhaustivo acerca de los demás sistemas corporales afirmó no padecer ningún otro síntoma. En la exploración física se observó que su temperatura corporal era de 38.2 ºC, pero no presentaba ictericia, anemia, dedos en “palillo de tambor”, cianosis, edemas, ni linfadenopatías. El médico clasificó el exantema rojizo, caliente y doloroso de las crestas tíbiales, la parte superior de los brazos y el cuello como un eritema nudoso. Las articulaciones menores de las manos estaban ligeramente doloridas, pero no se observaba hinchazón. Presentaba conjuntivitis bilateral, aunque ambos fondos de ojo eran normales. Su frecuencia cardiaca era de 85 latidos/minuto y su presión arterial de 175/75 mm de Hg. No presentaba desviación traqueal y su expansión torácica era normal. Los sonidos respiratorios estaban reducidos bilateralmente en todas las zonas pulmonares, e iban acompañados de crepitantes diseminados. El pulso apical era palpable y no representaba desviaciones, y ambos sonidos cardíacos eran normales, sin soplos. Las exploraciones abdominal y neurológica no aportaron datos de interés, y no existían hepatomegalia ni esplenomegalia. Los resultados de las investigaciones realizadas se muestran en la figura 34.1. Se estableció un diagnóstico de sarcoidosis en estadio II, y se inició un tratamiento con prednisolona por vía oral. En una revisión posterior se observó que sus síntomas habían mejorado notablemente y que el eritema nudoso y la conjuntivitis habían desaparecido totalmente, por lo que se interrumpió el tratamiento. Preguntas: 1. ¿Cuáles son la etiología y la patogénesis de la sarcoidosis? La sarcoidosis se puede definir como una enfermedad multisistémica que se caracteriza por el desarrollo de granulomas no caseosos de naturaleza epiteloides. La incidencia en el Reino Unido es de alrededor del 20/ 100 000, siendo especialmente elevada en los inmigrantes irlandeses y nativos americanos 150-180/ 150 000. no se conoce la etiología de la enfermedad, aunque se ha sugerido que podía estar causada por micobacterias, virus, hongos y otros agentes como el berilio. La infección previa por micobacterias es más frecuente entre los pacientes con sarcoidosis que en la población normal, pero este hecho puede conducir a equívocos. Hay ciertos expertos que opinan que la sarcoidosis no es una única entidad clínica, sino un síndrome provocado por diversos agentes.


Las lesiones típicas de la sarcoidosis consisten en granulomas bien definidos de células epiteloides, rodeados por una capa de linfocitos, principalmente por el subtipo CD 4+. En ciertas ocasiones, también se observan células gigantes multinucleadas. En la sangre periférica de los pacientes con sarcoidosis escasean las células CD4+, probablemente debido a su acumulación en los granulomas de la sarcoidosis están formados por células epiteloides procedentes de macrófago y monocitos circulantes que se han acumulado en el lugar de la lesión. Sin embargo, al contrario que en el caso de la tuberculosis, las lesiones no son caseosas. Se cree que en la patogénesis de la tuberculosis desempeña un papel especialmente importante un desequilibrio existente entre el número de células T colaboradoras y supresoras, aunque no se sabe si el problema surge por un aumento del número de las primeras o por una disminución del número de las segundas. El estudio de las muestras obtenidas mediante LBA a partir de paciente con sarcoidosis demuestra que existe una reducción del número de receptores αβ en las células T pulmonares, pese a que se detecta un aumento de mARN del RCT. No se sabe hasta qué punto está implicada la regulación de las células T. en la fase activa de la enfermedad, la concentración de los receptores de IL-2 en suero, en los macrófagos pulmonares y en los monocitos son más elevadas de lo normal, lo que sugiere que la IL-2 juega un papel central. Las lesiones pulmonares activas también contienen grandes cantidades de linfocitos B. La secreción de IL-2 e IL-4 por parte de las células T que se encuentran en las lesiones de la sarcoidosis induce la proliferación de las células B, y puede ser la causa de la hipergamaglobulinemia que puede observarse en estos pacientes. 2. ¿Cómo se puede clasificar la sarcoidosis desde un punto de vista clínico? La sarcoidosis puede afectar prácticamente a cualquier órgano o tejido corporal. La afectación pulmonar es las más frecuente, encontrándose lesiones en este órgano en el 85% de los casos. El diagnostico inicial en ausencia de síntomas se establece muchas veces a raíz de una radiografía torácicas rutinaria. El eritema nodular aparece en el 20-30% de los casos, con lesiones cutáneas en el 15% de los casos y quistes óseos en el 5%. La afectación ocular que se presenta en un 25% de los pacientes, puede provocar ceguera. También son frecuentes las linfadenopatías y la hipertrofia de las glándulas salivales. La sarcoidosis torácica se puede clasificar en tres estadios, de acuerdo con la radiografía. La mitad de los pacientes se presenta en el estadio, que se caracteriza por una linfadenopatía hiliar. La mayoría se encuentran asintomáticos aunque algunos pueden padecer tos seca y un ligero dolor torácico. Un 30% de los pacientes se presentan en el estadio II, en el que se observan linfadenopatía hiliar e infiltración parenquimatosa. Entre estos pacientes, el número de los que presentan sintomatología es mayor que los pacientes en estadio , y en la espirometría se observa un defecto pulmonar de tipo restrictivo. El estadía III de la enfermedad se caracteriza por fibrosis pulmonar asociada a disnea, que puede progresar hacia hipertensión pulmonar. 3. ¿A qué son debidos la hipercalcemia y el aumento de la concentración sérica de ECA? Entre el 10% y 50% de los pacientes presentan hipercalcemia durante la fase activa de la enfermedad. Esto se debe a un aumento en la conversión de 25-hidroxi-colecalciferol en 1,25 dihidroxicolecarciferool(calcitriol) por parte de los macrófagos alveolares. El calcitriol promueve la absorción intestinal de calcio y de fosfato, por lo que aumenta la concentración sérica de calcio. La concentración sérica de ECA, que también es producida por los macrófagos de las lesiones sarcoideas, presentan correlación con la actividad de la Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


enfermedad, determina mediante el número de linfocitos presentes en el LBA. Sin embargo, esta prueba no tiene valor diagnóstico, ya que se pueden encontrar concentraciones elevadas en pacientes sin sarcoidosis. 4.¿ Qué pronostico tiene la sarcoidosis? La sarcoidosis torácica desaparece sin necesidad de tratamiento en el plazo de dos años en más de la mitad de los pacientes afectados. Otra cuarta parte de éstos se curan mediante tratamiento con corticoesteroides administrados por vía oral. En más del 95% de los casos de sarcoidosis en estadio I, la enfermedad desaparece en plazos de dos años, mientras que esto sólo ocurre en el 50% de los pacientes en estadio II. Sólo un 30% de los pacientes en estadio III presentan respuesta frente a los esteroides. Se recomienda el tratamiento de todos los pacientes en estadios II o III que presentan concentraciones elevadas de ECA. El tratamiento también está indicado en casos en que exista afectación ocular, cardiaca, del sistema nervioso o de las glándulas salivales, así como cuando existen hipercalcemia o disnea. Resultado de las investigaciones analíticas Investigación Hemoglobina (g/dl) Recuento de Leucocitos (x 109/L) Neutrofilo (x 109/L) Eosinófilo (x 109/L) Basófilos (x 109/L) Inmunoglobulinas séricas Ig G(g/L) Ig M(g/L) Ig A(g/L) Ig E (Ul/L) Suero Sodio (mmol/L) Potasio (mmol/L) Cloro(mmol/L) Calcio (total) (mmol/L) Fósforo(mmol/L) Creatinina Mmol/ L Urea(mmol/L) VSG ECA Sérica ( Ul /L) Prueba e Mantoux 10 unidades de tuberculina 100 unidades de tuberculina Radiografía del Tórax Radiografía abdominal Biopsia hepática Lavado broncoalveolar Prueba de función pulmonar

Resultado (rango normal) 12.1 (11.5 – 16) 15.5 (4.0 – 11.0) 8.2 ( 2-7.5) 0.46 (0.4- 0.44) 10.6 ( 1.6 – 3.5) 18.3 ( 5.4 – 16.1) 2.7 ( 0.5 – 1.9) 3.8 (0.8 – 2.8) 51 ( 3 - 150) 1.8 ( 134- 145) 4.2 ( 3.5 – 5 ) 101 (95-105) 2.82 ( 2.12 – 2.65) 1.25 ( 0.8- 1.145) 101 ( 70 – 150 ) 3.4 ( 2.5 – 6.7) 49 mm / h 123 (25 – 69) Negativo Negativo Linfadenopatía biliar lateral. Amplio sombreado intersticial bilateral. Normal Múltiples granulomas epiteloides Alveolitos linfocitaria con Cd4+ : Cd 8+= 10 : 1 Disminución de la FVC Disminución de FEV 1 Cociente normal.


LABORATORIO # 13 EXTRACCIÓN DE ADN INTRODUCCIÓN La extracción de ADN se puede realizar a partir de cualquier célula eucariota. En los humanos es muy fácil utilizar las células sanguíneas para dicho fin. La extracción de ADN requiere una serie de etapas básicas: ruptura de la pared celular y la membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula, ruptura de la membrana nuclear para dejar libre el ADN, proteger el ADN de enzimas que puedan degradarlo y para aislarlo hay que hacer que precipite en alcohol. Existe un amplia variedad de metodologías, entre las cuales pueden o no utilizar algún tipo de soporte (sílica, columnas, etc.) y ejecutarse de forma manual o automatizada. En este laboratorio vamos a utilizar un protocolo para la extracción de ADN a partir de sangre completa. REACTIVOS: 1. Solución de lisis de Glóbulos Rojos (RBC Lysis Solution) 2. Solución de Lisis de ADN Genómico (Genomic DNA Lysis Solution) 3. Solución de Precipitación de Proteínas (Protein Precipitation Solution) 4. Solución de Hidratación de ADN (DNA Hydration Solution 5. Isopropanol al 100% 6. Etanol al 70% PROCEDIMIENTO: Obtención de la muestra: 1. Extraiga por punción venosa dos tubos con aproximadamente 5 ml de sangre en un tubo con EDTA como anticoagulante. 2. Mezclar varias veces por inversión 3. Tomar 300 ul de la sangre de cada tubo y colocarlo en dos microtubo limpio libre de nucleasas, respectivamente. 4. Centrifugar el resto de la sangre a 5000 rpm por 10 minutos 5. Tomar 100 ul del paquete de glóbulos blancos (Buffy Coat) de cada uno de los tubos y colocarlos en dos tubos respectivos. Lisis celular: 1. Agregar 900 ul de RBC Lysis Solution a los 300 ul de sangre completa (con EDTA) y a los 100 ul de Buffy Coat que están en sus respectivos microtubos de 1.5 ml. 2. Mezclar por inversión e incube 10 minutos a temperatura ambiente invirtiendo al menos una vez más durante la incubación. 3. Centrifugar 20 segundos a 13,000-16,000 x g. 4. Remover el sobrenadante con una pipeta de punta fina sin tocar el pellet dejando aproximadamente de 10 a 20 ul de líquido residual. 5. Mezclar por vórtex para resuspender el pellet en el líquido residual. 6. Agregar 300 ul de Genomic DNA Lysis Solution para resuspender las células y mezclar varias veces por pipeteo (up and down) para lisar las células. No se requiere incubación, pero si se observa grumos se puede incubar 30 minutos a 37°C o a temperatura ambiente hasta que la solución sea homogénea. En este punto las muestras son estables 18 meses a temperatura ambiente. Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


Precipitación de proteínas: 1. Agregar 100 ul de Protein Precipitation Solution 2. Mezclar por vórtex por 20 segundos 3. Centrifugar 3 minutos a 13,000-16,000 x g. En caso de que no se forme un pellet se deberá mezclar todo nuevamente por 20 segundos con vortex e incubar 5 minutos en hielo. Precipitación de ADN: 1. Colocar el sobrenadante (contiene el ADN) dentro de un tubo de microcentrifuga de 1.5 ml y mezclar con 300 ul de Isopropanol al 100%. 2. Mezclar suavemente por inversión unas 50 veces. Se puede visualizar la hebra de ADN resuspendida. 3. Centrifugar por 1 minuto a 13,000-15,000 x g. Se debe formar un pequeño pellet blanco visible conteniendo el DNA. 4. Descartar el sobrenadante y escurrir el tubo sobre un papel absorbente. 5. Agregar 300 ul de Etanol al 70% e invertir el tubo varias veces para lavar el pellet de ADN 6. Centrifugar por 1 minuto a 13,000-15,000 x g 7. Descartar el etanol al 70% 8. Invertir el tubo sobre un papel absorbente y dejar secar al aire de 10 a 15 minutos. Hidratación de ADN: 1. Agregar 50-100 ul de DNA Hydration Solution. 2. Incubar la muestra por 5 minutos a 65°C (hasta 1 hora) para acelerar la hidratación o incubar toda la noche a temperatura ambiente. 3. Mezclar por 5 segundos y almacenar a 4° o de -20°C a -80°C para periodos más largos de almacenamiento. AUTOFORMACION 1. Mencione otros tipos de muestras que pueden ser utilizados para la extracción de ADN 2. Describa otros tipos de metodologías para la extracción de ADN 3. Cómo podemos evaluar el proceso


LABORATORIO # 14 REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA INTRODUCCION La PCR es un método automatizado para la amplificación de una secuencia conocida específica de DNA, que se puede aplicar al sistema de los genes HLA. Un segmento de DNA que contiene el gen de interés es secuenciado. Entonces, se sintetizan dos marcadores oligonucleótidos complementarios a las dos regiones que flanquean el segmento DNA a amplificar. Los marcadores superior e inferior, por lo general, son distintos uno de otro y pueden variar de 20 a 30 pares de bases de longitud. Los oligonucleótidos se hibridizarán con las regiones que flanquean el gen y servirán como marcadores para la replicación del gen seleccionado. El procedimiento de PCR comprende la repetición de tres pasos: l) Desnaturalización de la muestra de DNA en tiras sencillas; 2) fijación de los marcadores oligonucleótidos de secuencia específica, a los bordes del segmento y 3) extensión de los marcadores mediante la polimerasa del DNA, para formar nuevo DNA de doble cadena a lo largo del segmento. Es una reacción en cadena, ya que los productos de la reacción se convierten en las plantillas para el siguiente ciclo del proceso. La repetición del PCR llevará rápidamente a la acumulación exponencial de miles de copias del segmento de gen comprendido entre los extremos 5' de los dos marcadores. En unas pocas horas, cerca de 25 a 30 ciclos producen más de l millón de copias de la secuencia escogida, mediante el PCR. La mezcla de la reacción incluye plantilla de DNA, mezcla de nucleótidos (desoxirribonucleosido trifosfato), los dos marcadores de PCR, polimerasa Taq y amortiguador. Por medio de la amplificación por PCR, se ponen a disposición las secuencias presentes en cantidades de picogramos, para identificar mediante pruebas moleculares, pruebas de histocompatibilidad y otros propósitos de diagnóstico e investigación. En el trasplante de médula ósea, en el cual el material del paciente puede ser muy escaso, o ser anormales las células periféricas, el PCR tiene el potencial de proporcionar suficiente muestra para la tipificación de HLA y para hacer la prueba para el trasplante. La investigación de la asociación entre HLA y enfermedad se puede enfocar a secuencias conspicuas en el complejo mayor de histocompatibilidad, y detectado en el material amplificado derivado del líquido amniótico y muestras fetales de vello coriónico. Por ejemplo, las sondas de cDNA para deficiencia de 21- hidroxilasa, ya están disponibles para determinar el genotipo. Los marcadores oligoméricos utilizados junto al análisis del sitio de restricción con material generado con PCR, puede detectar el gen para la anemia de células falciformes. Se debe enfatizar que hasta el momento la prueba de histocompatibilidad por métodos moleculares sólo está disponible en algunos laboratorios. Sin embargo, es un arma poderosa que, sin duda, será más ampliamente aplicada en el futuro. Sistemas de amplificaciones de secuencias específicas son métodos in vitro que por replicación enzimática de secuencias específicas producen fragmentos a niveles detectables. El mejor estudiado y el más usado de estas técnicas es la replicación por la enzima Thermus aquaticus (Taq) polimerasa de ADN (PCR). Cebadores oligonucleótidos definen el segmento de ADN de interés y la ADN polimerasa en una serie automáticas de ciclos de elevación de temperatura y reducción de temperatura van formando copias de la secuencia a de interés. Los tres pasos básicos de los ciclos para el proceso de amplificación son: Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


1. Desnaturalización de ADN: La mezcla de reacción se eleva a 94ºC para que se separen las dobles bandas del ADN. 2. Hibridación: Enfriando la reacción a 60ºC se permite que se formen las dobles bandas con características de complementaridad para la región de interés. 3. Extensión: La temperatura se eleva a 72ºC y la Taq polimerasa cataliza la síntesis de nuevas bandas, prolongando a partir de los cebadores en dirección de 5’-3’.

35 ciclos

236

=

68 billones de copias

PROCEDIMIENTO 1. Encienda el Termociclador y cargue el programa para amplificación de HLA DQA. 2. Determine el número de muestras a ser amplificadas e incluya un control positivo y uno negativo. 3. Transfiera los reactivos utilizados en la amplificación al área designada para esta y coloque los tubos de reacción de 200 ul con 25 ul de la mezcla de reacción de PCR para HLA DQA en la microgradilla. 4. Coloque la microgradilla con los tubos sobre plato de calor a 80ºC. Asegúrese que la mezcla está en el fondo de los tubos. Puede lograrlo con una breve centrifugación en la microcentrifuga. 5. Rotule los tubos por las tapas. Evite tocar el interior de las tapas. 6. Dispense 25 ul de solución de MgCl2 utilizando una punta estéril. Dispense el MgCl cuidadosamente, colocando la puntilla ligeramente inclinada y así minimizar la


contaminación de los reactivos y evitar aerosoles. A partir de este punto el inicio de la amplificación deberá ser antes de 30 min. 7. Cuidadosamente abra los tubos con las muestras que se amplificaran y tome 20 ul y transfiéralo a su respectivo tubo de reacción. Si conoce la concentración de ADN de su desconocido puede añadir 1 ng de ADN sin excederse del volumen de 20 ul. 8. Coloque los tubos en el bloque del termociclador y presiónelos hacia bajo para tener buen contacto con el pozo. (Registre en una hoja de notas la posición de cada tubo en el bloque para reconocerlos en cazo de que perdieran la identificación durante la amplificación). 9. Baje la tapa del termociclador e inicie el programa de amplificación. Programa: ETAPA

TIEMPO

TEMPERATURA

Desnaturalización

60 sec.

94ºC

Hibridación

30 sec.

60ºC

Extensión

30 sec.

72ºC

AUTOFORMACION 1. Mencione algunas aplicaciones clínicas de la PCR. 2. Discuta sobre algunas variaciones de la PCR 3. Qué procedimientos pueden utilizarse para la detección de PCR

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


CASO CLINICO # 37 AUTOINMUNIDAD (TIROIDITIS DE HASHIMOTO) La Sra. Mayra de 45 años de edad acudió a su médico debido a una inflamación indolora en la parte superior de su cuello. Afirmó que dicho abultamiento había tardado entre dos y tres años en alcanzar el tamaño que presentaba en dicho momento. Por lo demás su estado de salud era bueno. En la exploración física se observo un aumento difuso del tamaño de la tiroides, que era firme al tacto. Dicho aumento de tamaño afectaba también al istmo del tiroides, lo que le confería un aspecto de “mariposa”. Aparte de este abultamiento en el cuello, la paciente se encontraba bastante bien. En concreto, no se sentía cansada ni letárgica. Los resultados obtenidos en la determinación de las concentraciones séricas de T3 y T4 y hormonas estimulante del tiroides (TSH) mediante radioinmunoanálisis específicos fueron normales, lo que indicaba que la función tiroidea de la Sra. Mayra era normal. Las pruebas para detectar autoanticuerpos fueron positivas, concretamente para anticuerpos antiroglobulina y antimicrosomales (peroxidasa tiroidea o TPO). Su estado general siguió siendo bueno, paro se médico decidió someterla a revisión periódica. A lo largo de los tres o cuatro años siguientes se comenzó a sentir más cansada, y dejo de ser la mujer extraordinariamente activa del pasado, optando por dormitar en un sillón cuando llegaba a su casa. Sus movimientos s e hicieron mas lentos, y su marido observo que su memoria se estaba se estaba deteriorando y cada vez se movía con más torpeza. Su peso aumentó y sus parientes notaron que su voz era más ronca y de menor volumen. Además, su piel estaba reseca y su rostro hinchado. Volvió a acudir a su médico para proceder a un nuevo estudio. En la evaluación clínica mostró una frecuencia cardiaca de 55 latidos/min. El tamaño del bocio no había aumentado. El pelo se había vuelto más fino, y el borde externo de sus cejas había desaparecido. Presentaba dolores articulares, sentía pinchazos en los dedos, y en el examen de sus reflejos, se observó un retraso en la relajación. La concentración de de autoanticuerpos frente al tiroides era mayor que en la primera ocasión. Se estableció un diagnóstico de tiroiditis de Hashimoto (TH). La paciente recordaba que un pariente de primer grado había padecido anemia perniciosa. Investigación

Resultados

Hemoglobina (g/dl) Recuento de leucocitos (x 109/L) Linfocitos (x 109/L) Suero Urea (mmol/L) Sodio (mmol/L) Potasio (mmol/L) Cloro (mmol/L) Tiroxina sérica libre (pmol/L) T3 sérica libre (nmol/L) TSH (mU/L) Autoanticuerpos Tiroglobulina Microsomas tiroideos Células parietales gástricas

14,3 (11,5-16,0) 6,4 (4,0-11,0) 2,1 (1,6-3,5) 3,2 (2,5-6,7) 141 (134-145) 4,0(3,5-5,0) 101(95-105) 6,8 (9-22) 0,8 (1,2-3,0) 16,4 (0,5-5,7) 1:640 1:32.000 1:320


ANA

Negativo

PREGUNTAS 1. ¿Existe una predisposición genética a las enfermedades autoinmunitarias? No cabe duda de que la incidencia de autoanticuepos en los parientes de pacientes con TH es mayor que en la población normal. Además existe una relación entre la TH y la anemia perniciosa, una enfermedad en la que los anticuerpos frente a las células parietales y el factor intrínseco impide la absorción de vitamina B12. Los pacientes con anemia perniciosa presentan una mayor incidencia de TH que los controles. Estos hechos, observados en estudios llevados a cabo en grupos familiares, sugieren fuertemente la existencia de una predisposición genética a la enfermedad. En los primeros estudios se detectó una asociación del haplotipo HLA-DR5 con la TH, y de HLA-DR3 con el mixedema primario Sin embargo, no siempre ocurre así, ya que en determinadas poblaciones, HLA-DR3 está asociado con la TH. A] examinar mediante la RCP el tejido tiroideo de un paciente con TH, se observa un aumento tanto de DQAI*0301 (en desequilibrio de ligamiento con HLA-DR4) como de DQB 1 *0201 (en desequilibrio de ligamiento con HLA-DR3), por lo que los riesgos relativos son parecidos. Se han estudiado poblaciones de diverso origen étnico, por lo que no es extraño que se hayan detectado diferencias en ]as asociaciones con el sistema HLA. En estudios recientes llevados a cabo en Japón no se han detectado asociaciones entre los antígenos HLA y la TH. En resumen, los genes codificados en el locus HLA no confieren una gran susceptibilidad frente a la TH, y existe una considerable variabilidad en las asociaciones con el sistema HLA en diferentes poblaciones. Esto sugiere que la susceptibilidad depende en gran medida de otros factores endógenos o exógenos. 2. ¿Cuáles son los mecanismos inmunitarios que provocan las lesiones tiroideas? Como ocurre con muchas enfermedades autoinmunitarias, los mecanismos nocivos para la glándula pueden ser de diversos tipos. La característica fundamental de la TH es la presencia de autoanticuerpos circulantes que pueden provocar lesiones mediante reacciones de hipersensibilidad de tipo 11. Sin embargo, los anticuerpos frente a tiroglobulina no fijan el complemento, mientras que los anticuerpos frente a la peroxidasa tiroidea (TPO) sí que pueden activar la vía del complemento. Puede que existan otros autoanticuerpos desconocidos que también sean capaces de fijar el complemento. Entre los datos que avalan la participación de mecanismos de hipersensibilidad de tipo II se encuentran la presencia de complemento en la superficie de las células tiroideas, así como la reciente detección de complejos de ataque a la membrana en los folículos tiroideos. Cuando el complemento ataca las células tiroideas se produce la liberación de PGE2, IL-1 e ILA así como de compuestos reactivos de oxigeno. Estos pueden provocar directamente lesiones del tirocito, así como promover una mayor infiltración y activación de linfocitos. El anticuerpo clásico de la TH también puede provocar daños mediante su unión a la superficie de la célula tiroidea, promoviendo la unión de células NK a través de su receptor de Fc (citotoxicidad mediada por células y dependiente de anticuerpos o ADCC, del inglés antibody dependent cell cytotoxicity). La eficacia de este mecanismo se puede comprobar in vitro, mediante la utilización de células tiroideas normales, autoanticuerpos y linfocitos, como células efectoras. 3. ¿Implica la presencia de autoanticuerpos la existencia de la enfermedad? Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


Parece que la prevalencia de TH va en aumento. Esto puede reflejar el aumento de la sensibilidad de los sistemas de análisis, o puede ser que de hecho, la enfermedad se esté haciendo más frecuente. Lo que está claro es que hay una serie de individuos que no presentan síntomas y, sin embargo, poseen cantidades detectables de anticuerpos circulantes frente a tiroglobulina. (aTG). La prevalencia de aTG es del 10% en individuos jóvenes (18-24 años), mientras que en las cohortes de individuos de edad más avanzada (55-64 años) alcanza el 30%. Mediante estudios de seguimiento a largo plazo se ha comprobado que los pacientes pueden presentar anticuerpos durante muchos años sin que exista progresión hacia TH clínica. Una posibilidad es que la tiroglobulina de los pacientes con TH sea diferente de ]a de los individuos normales, hecho que podría explicar ]a aparición de la enfermedad. Sin embargo, no se han detectado diferencias en la estructura de la tiroglobulina, aunque los efectos de ]a yodación en la inmunogenicidad no se conocen con detalle. Probablemente, el factor de riesgo más importante de la enfermedad de Hashimoto es la existencia de antecedentes familiares. 4. ¿Cuáles son los autoantígenos en la enfermedad de Hashimoto? El concepto de enfermedad autoinmunitaria especifica de órgano fue introducido por Roitt Doniach y Campbell hace más de 30 años Consiguieron demostrar la existencia de anticuerpos frente a tiroglobulina en el suero de pacientes con TH, mediante una técnica muy sencilla de precipitación en agar. La tiroglobulina (660 kdal puede presentar hasta siete epítopos lineales capaces de ser reconocidos por los aTG, aunque el perfil de respuesta en cada paciente concreto es muy variable. La tiroglobulina se expresa en la superficie de ]as células tiroideas, pero no es fácil de detectar. La afinidad de los aTG por el antígeno es variable, y es probable que se modifique a lo largo de la enfermedad. El segundo autoantígeno, se denominó originalmente antígeno microsomal tiroideo, y hoy en día se conoce como peroxidasa tiroidea (TPO). Es una proteína de membrana de 100-105 kdal. Se han detectado varios puntos antigénicos en la molécula, existiendo a] menos seis epítopos de células B y uno o dos epítopos lineales. En algunos pacientes existen anticuerpos que presentan reacciones cruzadas con TG y con TPO. No se conoce la actividad funcional de estos anticuerpos. Probablemente, el <<antígeno>> más importante desde el punto de vista de ]a función tiroidea sea el receptor de la hormona estimulante del tiroides (TSH-R). Los anticuerpos frente a este receptor se pueden comportar como la propia TSH y estimular la glándula, como sucede en la enfermedad de Graves (EG), o bloquear los receptores y provocar hipotiroidismo. Los anticuerpos frente a los TSH-R se encuentran presentes en la mayor parte de los pacientes con EG. Al contrario que los anticuerpos frente a la tiroglobulina, cuya presencia no implica la existencia de tiroiditis, la probabilidad de desarrollar la enfermedad de Graves en presencia de anticuerpos frente a TSH-R es muy elevada.


CASO CLINICO # 39 AUTOINMUNIDAD La Sra. María, una mujer de 35 años de edad, acudió a un reumatólogo por dolores y rigidez en los dedos y las muñecas, que iban en aumento. Dos años atrás, antes de su último embarazo, había experimentado unos síntomas parecidos, pero habían desaparecido desde el momento de la concepción. A partir del nacimiento de su hijo se había ido sintiendo cada vez más torpe para llevar a cabo determinadas tareas que exigían una coordinación fina de los dedos, como hacer punto, que era su pasatiempo favorito. Los síntomas se agravaban por las mañanas, aunque su habilidad manual estaba reducida a lo largo de todo el día. Cuando daba descanso a sus manos, parecía que la rigidez aumentaba. En los últimos tiempos sentía pinchazos en los dedos pulgar, índice y corazón de ambas manos, que se intensificaban en las noches. No padecía problemas en ninguna otra articulación, y no presentaba alteraciones visuales, ni exantemas cutáneos. No tenía antecedentes de fiebre reumática y, por lo demás, gozaba de un buen estado de salud. Su madre padecía artritis reumatoide, mientras que su padre era una persona sana. En la exploración clínica se detectó anemia clínica, pero ausencia de ictericia, edema, linfadenopatias y fiebre. Presentaba una inflamación dolorosa al tacto, bilateral y simétrica en las muñecas y en las articulaciones interfalángicas proximales y metacarpofalángicas, siendo especialmente intensa la inflamación de estas últimas. También se observaba desviación cubital de los dedos, y era incapaz de cerrar totalmente el puño de ambas manos. No había signos de reducción de la masa muscular de las manos y de los brazos. No se detecto inflamación ni dolor en los codos, hombros, caderas, rodillas ni tobillos, y todas estas articulaciones presentaban una amplitud de movimiento normal. La columna vertebral tampoco estaba afectada. En las exploraciones respiratoria y cardiovascular no se encontró ninguna anomalía digna de mención. La fuerza de los músculos intrínsecos de la mano era de 4+, y la sensibilidad era completamente normal. En la exploración abdominal no se detecto esplenomegalia. Los resultados de las investigaciones llevadas a cabo se muestran en el cuadro siguiente. Investigación

Resultado (Ámbito normal)

Hemoglobina (g/dL) Recuento de plaquetas (x109/L) Recuento de leucocitos (x109/L) Neutrófilos (x109/L) Linfocitos totales (x109/L) Inmunoglobulinas séricas Albúmina sérica (g/dL) VSG PCR (mg/L) Factor reumatoide IgM ANA Anticuerpos frente a antígenos extraíbles del núcleo (ENA) Capacidad de unión de ADNds Complemento sérico C3 (g/dL) C4 (g/dL) Radiografía de las manos

10.1 (11.5-16.0) 245 (150-400) 8.8 (4.0-11.0) 8.2 (2.0-7.5) 2.1 (1.6-3.5) Normal 32 (35-50) 41 mm/hora 25 (<5) Positivo Negativo Negativo 15% 1.02 (0.75-1.65) 0.30 (0.20-0.65) Osteopenia en los metacarpianos y las falanges

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


Se estableció un diagnóstico de artritis reumatoide, y se prescribió un tratamiento diario con aspirina por vía oral. Este tratamiento alivio inicialmente los síntomas, pero provocó irritación gástrica. Volvió a acudir al médico tres meses más tarde, con un agravamiento de los síntomas de las manos y la aparición de síntomas parecidos en ambas rodillas. En la exploración se aprecio dolor e inflamación de las articulaciones metacarpofalángicas. Presentaba derrames en ambas rodillas. Se instauró un tratamiento con indometacina para controlar los derrames, y se interrumpió el tratamiento con aspirina. Nueve meses después de su primera visita, la Sra. María desarrolló nódulos subcutáneos bilaterales en las superficies extensoras de sus antebrazos, de 1 cm de diámetro, firmes, móviles e indoloros. Las sensaciones punzantes que había descrito en su primera visita al médico se habían en unos dolores de aparición súbita, entre los que atravesaba por fases de pérdida de sensibilidad. La fuerza de los músculos de sus dedos pulgares era muy reducida, con una evidente disminución de la masa muscular. Se observaba un eritema palmar bilateral. Los resultados de las investigaciones complementarias llevadas a cabo en ese momento se muestran en el cuadro siguiente: Investigación Hemoglobina (g/dL) Recuento de leucocitos (x109/L) VSG PCR (mg/L) Factor reumatoide IgM ANA ENA Capacidad de unión de ADNds Complemento sérico C3 (g/dL) C4 (g/dL) Radiografía de las manos

Resultado (Ámbito normal) 10.4 (11.5-16.0) 9.3 (4.0-11.0) 52 mm/hora 45 (<5) Positivo Negativo Negativo 15% 0.98 (0.75-1.65) 0.35 (0.20-0.65) Erosiones en la porción distal del radio y en las articulaciones metacarpofalángicas

Se estableció un diagnostico de artritis reumatoide progresiva con síndrome del túnel carpiano bilateral. Se aumento la dosis de indometacina y se remitió a la Sra. María a un fisioterapeuta. PREGUNTAS 1. ¿Cómo se puede definir la artritis reumatoide? El término “reuma” procede de una palabra griega que significa arroyo o flujo. Se utilizo por primera vez en la edad media para describir un dolor atribuido al flujo anómalo de uno de los “humores” principales. El término “artritis reumatoide” (AR) fue acuñado por Garrod, en 1859. La enfermedad se puede definir como una poliartritis crónica, simétrica, de naturaleza inflamatoria y de origen desconocido, que afecta a las articulaciones periféricas y que presenta, en una cierta parte de los pacientes, manifestaciones extraarticulares. Las estimaciones de la prevalencia de la enfermedad varían según la región geográfica, desde un 0.3 % en Japón hasta un 5.0% en Alemania, y en el Reino Unido corresponde al 1.0%


aproximadamente. En cuanto al sexo, la relación mujer: varón en cuanto a casos de AR es de 3:1 (comparado con 9:1 en el lupus eritematoso sistémico y 25:1 en la tiroiditis de Hashimoto). Puede que los estrógenos desempeñen algún papel en la patogénesis de la AR. Por ejemplo, se sabe que la gestación produce un efecto protector o atenuante, que se observa en el 75% de las pacientes embarazadas, generalmente a lo largo del tercer trimestre. 2. ¿Qué asociaciones genéticas existen con la artritis reumatoide? La AR es una enfermedad autoinmunitaria asociada con los haplotipos HLA-DR4 y DR1. El estudio detallado de la estructura molecular de la glucoproteína CPH II ha demostrado que la susceptibilidad se debe, al menos en parte, a una secuencia de cinco aminoácidos situados en las posiciones 70-74 del dominio del extremo amino de la cadena HLA-DR. Esta secuencia está formada por glutamina-leucina-arginina-alanina-alanina o glutaminaarginina-arginina-alanina-alanina. Dos de los cinco subtipos de HLA-DR4, Dw4 y Dw14 poseen estas secuencias, al igual que el haplotipo DR1. Por el contrario, Dw10, que contiene diferentes aminoácidos en las posiciones 70-71, no constituye un factor de riesgo para la AR. Algunos haplotipos, en concreto DR2, DR2+DR3 y DR3+DR7, ejercen un efecto protector frente a la AR. 3. ¿Qué lesiones articulares se producen en la artritis reumatoide? La membrana sinovial de las articulaciones de los pacientes con AR, en lugar de ser una estructura realmente acelular, se transforma en una lesión proliferativa e hipervascularizada. Se encuentra infiltrada por células inmunitarias y forma un pannus invasivo, consistente en una mezcla de macrófagos, mastocitos, fibroblastos y células con largas prolongaciones. La unión entre el pannus invasivo y el cartílago articular es un foco de degradación enzimática. Parece que muchas de las células presentes intervienen en la destrucción del cartílago que se produce en la AR. Además del pannus, existe tejido linfoide que se acumula alrededor de los vasos sanguíneos sinoviales. En la periferia de estos vasos se observa linfocitos, rodeados a su vez por una zona de transición que contiene macrófagos, linfocitos y células B en fase de diferenciación. La mayoría de los linfocitos que se encuentran en la proximidad del vaso sanguíneo son del subtipo CD4+, mientras que en la zona de transición existe una mezcla de CD4+ y CD8+. Las células CD4+,B y HLA-DR+ se encuentran en contacto, estableciendo interdigitaciones y llevando a cabo una actividad de presentación de antígenos. Este hecho sugiere la existencia en la membrana sinovial de un proceso de expansión clonal mediado por células CD4+. El líquido sinovial de los pacientes con AR contiene grandes cantidades de leucocitos polimorfonucleares (PMN) (hasta 105/ml). Estos PMN se activan tras la fagocitosis, principalmente de sustancias unidas a IgG, con la consiguiente liberación de radicales de oxígeno, metabolitos del ácido araquidónico e IL-1. 4. ¿Cuál es la inmunopatogénesis de la enfermedad? La especificidad de la respuesta de las células T en la AR no se conoce. El antígeno puede ser un autoantígeno, un autoantígeno modificado, un antígeno extraño o un superantígeno. Una alta proporción de los pacientes con AR (70-90%) poseen anticuerpos frente a una proteína del virus de Epstein-Barr (VEB). Estos anticuerpos, denominados precipitinas de las artritis reumatoide (RAP, del inglés rheumatoid artritis precipitin), presentan reacción cruzada con una proteína que se encuentra en pacientes con AR, denominada antígeno nuclear de la artritis reumatoide (RANA, del inglés rheumatoid artritis Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


nuclear antigen). Los pacientes con AR también presentan un número anormalmente elevado de células B infectadas con el VEB, en comparación con individuos normales. Además, la gp110, una glucoproteína de la superficie del VEB, contiene epítopos que presentan reacciones cruzadas con las cadenas  de las moléculas CPH II HLA-Dw4, -Dw14 y –DR1. Estos aminoácidos son idénticos a los de las secuencias HLA que confieren susceptibilidad a la AR. Teóricamente, infección con el VEB de un paciente susceptible podría desencadenar una expansión clonal de células T dirigidas contra antígenos CPH II propios. Otras moléculas que pueden jugar algún papel son algunos miembros de las familias de proteínas del shock térmico (HSP). Se han aislado ciertas líneas de células T que reconocen HSP en pacientes con AR. Recientemente se han obtenido datos que sugieren la existencia de una secuencia de aminoácidos común entre DR4, el colágeno tipo XI y Proteus mirabilis. Esto podría constituir otro mecanismo de producción de enfermedad, basado en un fenómeno de similitud molecular. 5. ¿Qué es el factor reumatoide? Los factores reumatoides (FR) son autoanticuerpos capaces de unirse a las IgG. Los FR pueden pertenecer a cualquiera de las 5 clases de inmunoglobulinas, aunque los que mejor se conocen son los de las clases IgG e IgM. La mayoría de los FR se unen a la región Fc de los anticuerpos, generalmente a los dominios CH2 y CH3, aunque hay algunos que reacciona con las regiones Fab. Alrededor del 70% de los pacientes con AR presentan FR en suero. En este subgrupo de pacientes, la enfermedad tiende a ser más agresiva. Hay estudios recientes que sugieren que la autoagregación de los FR IgG que se ha observado puede ser debida a un déficit de las moléculas de galactosa que, en condiciones normales, se encuentran unidas a un punto de N-glucosilación del dominio CH2 de la región Fc, a través de moléculas de N-acetilglucosamina (GlcNAc) y manosa. Se ha propuesto que la ausencia de estas moléculas de azúcar podría generar un “bolsillo” de galactosa en la región Fc de FR de clase IgG, promoviendo la autoagregación. Hay estudios en los que se ha observado que la prevalencia de Gal (0) IgG, que es como se ha denominado a esta moléculas, es mayor en pacientes con AR. Además, parece que su presencia constituye un marcador de la actividad de la enfermedad, reduciéndose su concentración en las fases de remisión como puede ser, por ejemplo, la que se produce durante los embarazos.


LABORATORIO # 15 UTILIDAD DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN EN BIOMEDICINA Introducción Las enzimas de restricción en las bacterias las protegen de las infecciones por bacteriófagos al cortar el ADN exógeno e inactivarlo. El ADN de la bacteria se protege de la acción de las enzimas de restricción por tener grupos metilo unidos a sus nucleótidos específicos. Las enzimas de restricción pueden ser agrupadas en dos clases: exonucleasas: Cortan fragmentos al final de la molécula de ADN y las endonucleasas: Cortan el ADN a lo largo de la molécula por ruptura de las uniones entre nucleótidos adyacentes. Las enzimas de restricción se nombran usando las letras de su género, especies, cepas y el orden de descubrimiento de donde se extrae. Las endonucleasas pueden romper el ADN en dos formas: Una formando bordes romos quedando las dos cadenas de igual tamaño (ej. Hae III) y dos dejando una cadena más larga que la otra, lo que se denomina bordes adhesivos o pegajosos (ej. Hind III). La mayoría de los intrones consisten de secuencias que se repiten muchas veces a lo largo del ADN. Estas secuencias repetitivas son utilizadas para generar patrones conocidos como: Polimorfismo encontrados a lo largo de los fragmentos producidos por enzimas de restricción que en inglés se abrevia como RFLPs. Mutaciones dentro de las secuencias de RFLPs causan variaciones de una persona a otra. Cuando utilizamos enzimas de restricción para cortar las secuencias de RFLPs una colección de fragmentos característicos para cada individuo son producidos. La secuencia, la longitud y el número de estas secuencias repetidas son únicos para cada persona, por lo cual tiene como utilidad la identificación de las personas y es común su aplicación en medicina legal y forence. Con las enzimas de restricción puede cortar con tal exactitud que genes individuales se pueden aislar y manipular.

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


Aplicación en el diagnóstico molecular de Hb SS. El gen que codifica para la beta globina está localizada en el cromosoma 11p15.5. Este gen posee alrededor de 475 variantes alélicas y una de estas variantes es la hemoglobina S responsable de la anemia falciforme. La mutación en esta variante es un cambio de adenina por timina en el codón que codifica para el 6° aminoácido de la cadena de beta globina (GAG – GTG). Usando enzimas de restricción que reconocen la secuencia no mutada de la beta globina se puede determinar la presencia del gen mutado.

REACTIVOS 1. Producto de PCR de gen de la beta globina. 2. Enzima de restricción Bsu 36 y tampón E con BSA. 3. Equipo de electroforesis para agarosa. PROCEDIMIENTO 1. Rotular tubos de 200 ul para cada muestra a digerir. 2. Añadir 2.5 ul de agua libre de ADNasa y RNAasa. 3. Agregarle a cada tubo 1 ul de Tampón E 10X. 4. Añadir 1 ul de BSA 10X 5. Ahora agregar 0.5 ul de Bsu36 a cada tubo y 5 ul de producto de PCR a su respectivo tubo. 6. Incubar los tubos por 2 h a 37° C en baño María. 7. Terminada la incubación hacer electroforesis en agarosa al 2% con EtBr. AUTOFORMACIÓN Discutir la interpretación de las bandas que se forman para los casos de hemoglobina AS y SS.


LABORATORIO # 15 SECUENCIACIÓN DE ADN INTRODUCCIÓN La estructura de un determinado ADN está definida por la ordenación o "secuencia" de las bases nitrogenadas en la cadena de polinucleótidos, residiendo precisamente en esta secuencia de bases la información genética del ADN. La estructura en doble hélice del ADN, con el apareamiento de bases limitado (A-T; GC), implica que el orden o secuencia de bases de una de las cadenas determina automáticamente el orden de la otra, por ello se dice que las cadenas son complementarias. El análisis más detallado de la estructura del ADN consiste en averiguar la secuencia de nucleótidos. A lo largo del tiempo se han desarrollado diferentes métodos para obtener la secuencia de nucleótidos del ADN, sin embargo, actualmente los métodos más utilizados son el de secuenciación automática y el método enzimático de terminación de cadena de Sanger también conocido por el método didesoxi. Método enzimático de terminación de cadena o método didesoxi de Sanger Para obtener la secuencia de bases nitrogenadas de un segmento de ADN por el método enzimático de terminación de cadena, se necesitan los siguientes compuestos: 

El ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar. Para poder secuenciar un segmento de ADN, previamente se necesita tener gran cantidad de ese fragmento, y por tanto, hay que clonarlo en un vector apropiado. Además, debe estar en estado de hélice sencilla. Un enzima que replique el ADN, normalmente la ADN Polimerasa I del bacteriofago T4. La ADN Polimersa I del fago T4 emplea como molde ADN de hélice sencilla y siguiendo las reglas de complementaridad de las bases nitrogenadas va añadiendo nucleótidos a partir de un cebador o "primer". Un cebador o "primer" que suele ser un oligonucleótido corto de alrededor de 20 bases de longitud necesario para que la ADN polimerasa I comience a añadir nucleótidos por el extremo 3' OH. Este cebador debe poseer una secuencia de bases complementaria a la del fragmento de ADN que se desea secuenciar. Debido a que la secuencia de nucleótidos del segmento que se quiere secuenciar es desconocida, se emplea un "primer" con secuencia complementaria al vector empleado para clonar el fragmento de ADN, además, este cebador procede de una región del vector muy cercana al punto de inserción del ADN problema cuya secuencia se conoce. El "primer" utilizado suele marcarse radiactivamente. Los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). A veces en vez de marcar radiactivamente el cebador, se marca radiactivamente uno de los cuatro nucleótidos trifosfato en cada reacción. Por último, se necesitan nucleótidos didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP). Los nucleótidos didesoxi son nucleótidos modificados que han perdido el grupo hidroxilo

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


de la posición 3' de la desoxirribosa. Estos nucleótidos pueden incorporarse a la cadena de ADN naciente, pero no es posible que se una a ellos ningún otro nucleótido por el extremo 3'. Por tanto, una vez incorporado un nucleótido didesoxi se termina la síntesis de la cadena de ADN.

Método enzimático de terminación de cadena 

En primer lugar, deben realizarse en cuatro tubos diferentes, cuatro mezclas de reacción. Cada mezcla de reacción contiene los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, de dTTP y dGTP), ADN polimerasa I, un cebador marcado radiactivamente y un nucleótido didesoxi, por ejemplo ddATP, a una concentración baja. El nucleótido didesoxi utilizado (ddATP en este ejemplo) competirá con su homólogo (dATP) por incorporarse a la cadena de ADN que se está sintetizando, produciendo la terminación de la síntesis en el momento y lugar donde se incorpora. Por este sistema, en cada mezcla de reacción se producen una serie de moléculas de ADN de nueva síntesis de diferente longitud que terminan todas en el mismo nucleótido y marcadas todas radiactivamente por el extremo 5' (todas contienen en el extremo 5' el cebador utilizado).


Los fragmentos de ADN de nueva síntesis obtenidos en cada mezcla de reacción se separan por tamaños mediante electroforesis en geles verticales de acrilamida muy finos (0,5 mm de espesor) y de gran longitud (cerca de 50 cm) que permiten distinguir fragmentos de ADN que se diferencian en un solo nucleótido.Los productos de cada una de las cuatro mezclas de reacción se insertan en cuatro calles o carriles diferentes del gel. Una vez terminada la electroforesis, el gel se pone en contacto con una película fotográfica de autorradiografía. La aparición de una banda en una posición concreta de la autorradiografía en una de las cuatro calles nos indica que en ese punto de la secuencia del ADN de nueva síntesis (complementario al ADN molde) está la base correspondiente al nucleótido didesoxi utilizado en la mezcla de reacción correspondiente.

Teniendo en cuenta que el ADN de nueva síntesis crece en la dirección 5'  3', si comenzamos a leer el gel por los fragmentos de menor tamaño (extremo 5') y avanzamos aumentando el tamaño de los fragmentos (hacia 3'), obtendremos la secuencia del ADN de nueva síntesis en la dirección 5'  3'. enzimático comparten etapas comunes.

Breve descripción del método automático de secuenciación 

La principal diferencia entre método enzimático de terminación de cadena y el método automático de secuenciación radica, en primer lugar en el tipo de marcaje. En el método automático en vez de radiactividad se utiliza fluorescencia y lo habitual es realizar cuatro mezclas de reacción, cada una con nucleótido trifosfato (dTTP) marcado con un fluorocromo distinto. Este sistema permite automatizar el proceso de manera que es posible leer al mismo tiempo los ADNs de nueva síntesis producto de las cuatro mezclas de reacción. La segunda diferencia radica en el sistema de detección de los fragmentos de ADN. La detección del tipo de fluorescencia correspondiente a cada reacción se lleva a cabo al mismo tiempo que la electroforesis, de manera que los fragmentos de ADN de menor tamaño que ya han sido detectados se dejan escapar del gel, permitiendo este

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.


sistema aumentar el número de nucleótidos que se pueden determinar en cada electroforesis y, por consiguiente, en cada secuenciación. El siguiente esquema representa de forma abreviada el método automático de secuenciación.

En la siguiente figura se muestra un ejemplo de una secuencia obtenida por el método automático de secuenciación. Cuando aparece la letra N significa que no ha sido posible determinar el nucleótido existente en esa posición de la secuencia.

La información presentada en esta guía fue http://www.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/secuencia/Secuencia.htm Se recomienda visitarla para revisar las prácticas de secuenciación.

tomada

de:


ACTIVIDADES: 1. Investigue las aplicaciones clínicas de la técnica de secuenciación en la falla del tratamiento a los pacientes con SIDA. 2. Revise las prácticas que aparecen en la dirección web proporcionada.

Autores: Manuel María Adames M.D. M.Sc., Griselda Arteaga M.T. M.Sc., Dalys Mojica M.T M.Sc.

Inmunología Básica  
Inmunología Básica  

Cronogrma de actividades Segundo Semestre

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