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La fluorescencia como técnica de prevención de daños en conservación de fruta en bajo oxígeno

Laia Torregrosa, Joan Garcia, Meritxell Planes y Estanislau Fons


Artículo técnico

Atmósferas dinámicas

La fluorescencia como técnica de prevención de daños en conservación de fruta en bajo oxígeno Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries (IRTA), Lleida Industrial Leridana del Frío S.L. (ILERFRED), Lleida Universitat de Lleida (UdL)

Índice La fluorescencia de la clorofila

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La fluorescencia de la clorofila en campo

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La fluorescencia de la clorofila en poscosecha

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4

Sensores de fluorescencia

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Conclusiones

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Bibliografía……………………………………………………

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Información comercial Ilerfred, empresa dedicada desde hace más de 25 años al diseño, instalación y mantenimiento de instalaciones frigoríficas y de atmósfera controlada.

Isolcell, atmósfera controlada desde 1958, exclusiva para mantener la calidad y control del escaldado en manzana y pera, sin tratamientos químicos poscosecha.

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1.

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La fluorescencia de la clorofila Algunas sustancias tienen la propiedad de ser capaces de absorber

fotones cuando se iluminan con radiación de onda corta, a menudo UV, y liberar parcialmente esta energía en su posterior relajación, emitiendo fotones de mayor longitud de onda. Este fenómeno, que se manifiesta en la emisión en un color menos energético que el que se ha usado para excitar la molécula, es conocido como fluorescencia. Cuando estos fotones corresponden a la radiación visible, pueden detectarse sin necesidad de equipos especiales.

Muchos pigmentos presentes en los seres vivos presentan fluorescencia. Como técnica analítica, la fluorescencia se emplea en los laboratorios para detectar presencia de sustancias que tengan esta propiedad. Es conocida su aplicación para detectar, por ejemplo, aflatoxinas en alimentos.

En las plantas, y en las frutas en concreto, esta propiedad se encuentra en la clorofila. Los procesos de excitación de la clorofila son útiles para medir las condiciones de estrés de los tejidos. Se relacionan con estados de estrés fisiológico que afectan a la maduración, y permiten visualizar las respuestas de un fruto al estrés antes que los síntomas se hagan visibles (Prange et al., 1997, 2002).

Después

de

la

excitación,

la

clorofila

emite

una

radiación

característica, que puede ser detectada y medida con sensores ajustados a su longitud de onda. Cuando la clorofila se encuentra en los cloroplastos funcionales, la fluorescencia muestra una cinética también característica, ya que está influenciada por el equilibrio de oxidaciónreducción dinámica en el cloroplasto y la actividad del Fotosistema II (Schreiber et al., 1975).

A lo largo de los últimos años, el interés por la medición de la fluorescencia de la clorofila ha incrementado de forma notable en el campo de la agricultura. La clorofila puede considerarse como una sonda de fluorescencia intrínseca del sistema fotosintético. En las hojas, en las células o en el conjunto de la planta la fluorescencia es influenciada de

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forma compleja por fenómenos directos o indirectos relacionados con la fotosíntesis. Cabe destacar que la fluorescencia se verá afectada por distintos factores como la temperatura, la humedad o el estado de madurez de un fruto.

2.

La fluorescencia de la clorofila en campo El análisis de la fluorescencia de la clorofila en campo es una técnica

ampliamente utilizada a lo largo de las últimas décadas. En 1960 ya se realizaron los primeros estudios en campo (Kautsky et al., 1960). La energía en forma de luz absorbida por las moléculas de clorofila de las hojas ayuda a la realización de la fotosíntesis. El exceso de energía puede ser disipado como calor o puede ser reemitido como luz. Cabe destacar que del total de la luz absorbida solo entre el 1 y el 2 % es fluorescencia de la clorofila.

Se pueden utilizar los parámetros de fluorescencia para evaluar los cambios de la fotoquímica en el Fotosistema II (PSII), en el flujo lineal de electrones, y en la asimilación de CO2 in vivo. Aunque los parámetros de fluorescencia se pueden medir fácilmente, pueden surgir muchos problemas potenciales cuando se aplican para predecir cambios en el rendimiento fotosintético. Hay que tener en cuenta los problemas asociados con la estimación precisa de la eficiencia operativa del PSII medido por fluorescencia y su relación con las tasas de flujo de electrones y asimilación de CO2.

3.

La fluorescencia de la clorofila en poscosecha En algunas variedades de manzana y pera, el escaldado superficial

es una patología importante en poscosecha, aunque puede no afectar a la calidad interna del fruto, provoca rechazo por parte del consumidor. Se ha descrito el escaldado como una patología originada por fenómenos de oxidación de componentes de la piel de los frutos. Concretamente, el escaldado superficial es consecuencia de la oxidación del compuesto αfarneseno, un hidrocarbono sesquiterpeno acíclico, que está en la superficie de estos frutos.

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Por ello, la lucha contra el escaldado se ha basado tradicionalmente en el uso de sustancias antioxidantes como la etoxiquina y la difenilamina (DPA). Desde los años 60 se aplicaba DPA para combatir este desorden, pero en noviembre de 2009 la Comisión Europea acordó la no inclusión de la substancia activa difenilamina en el anexo I de la Directiva 91/441/CEE.

Tres años más tarde, en setiembre de 2012, entró en vigor la decisión de la Comisión Europea relativa a la no inclusión de la etoxiquina en el Anexo I de la Directiva 91/414/CEE. Este hecho conllevó la prohibición de la utilización de etoxiquina en pera. Además, el 16 de enero de 2015 el límite máximo de residuos (LMR) aplicable en peras descendió a 0.05 mg/kg.

La tendencia a la reducción de residuos de sustancias químicas de síntesis en los productos frescos ha llevado, en los últimos años, la búsqueda de alternativas para evitar el problema.

Una estrategia de la lucha es el uso de Metilciclopropeno (1-MCP), molécula que interfiere el metabolismo del etileno, y por ello inhibe algunas reacciones que favorecen la aparición del escaldado. Sin embargo, en algunas variedades de pera el uso de este producto puede tener algún efecto secundario en cuanto al retraso del proceso de maduración de los frutos durante el periodo de comercialización. Por ello, se han buscado alternativas entre los tratamientos físicos que pueden hacer esta función.

El uso de atmósferas muy empobrecidas en O2 es una de las técnicas aplicadas para evitar el escaldado superficial, sobre todo en manzana. En las últimas dos décadas se han hecho numerosos estudios buscando la combinación óptima de tiempos, temperatura y concentraciones de gases que puedan limitar la aparición del escaldado.

En base a los experimentos que se iniciaron hace más de un siglo, en 1903, la investigación mostró que el escaldado superficial en manzanas y peras se puede evitar con el almacenamiento en muy bajas concentraciones de O2, es decir, entre el 0 y el 1% de O2. (Prange et al., 2015).

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En los años 70 nacen nuevos sistemas de conservación en frío como ILOS (Initial Low Oxygen Stress), que consiste en crear un estrés con bajo oxígeno al principio del almacenamiento seguido por una conservación en atmósfera controlada con muy bajo oxígeno (ULO-CA), y RLOS (Repeated Low Oxygen Stress), que consiste en el uso repetido de estrés con bajo oxigeno analizando el etanol durante el almacenaje en atmósfera controlada (CA).

En 2001 aparece el concepto de atmósfera controlada dinámica (DCA). Consiste en bajar el nivel de oxígeno de la atmósfera de la cámara al mínimo posible tolerado por el fruto según sus circunstancias fisiológicas, manteniéndolo próximo al punto de compensación anaeróbica, pero tratando

de

evitar

siempre

sobrepasar

el

umbral

fermentativo.

Manteniendo el producto a niveles bajos de oxígeno se consigue reducir las reacciones de oxidación y los procesos de senescencia, y se impide el desarrollo de alteraciones fisiológicas como el escaldado superficial y la degradación de la calidad. Este sistema regula de manera dinámica las condiciones durante la conservación de la fruta, teniendo siempre en cuenta su respiración.

No obstante, para poder aplicar este tipo de atmósferas se requiere un control a tiempo real de los niveles de gases en la cámara y el producto. El margen entre el punto de compensación anaeróbica y la fermentación es muy pequeño. Para tal fin se utilizan distintos análisis, como la evaluación del etileno al largo de la conservación, la medida del coeficiente respiratorio de los frutos, evaluación del etanol en una pequeña cámara de test montada dentro de la cámara frigorífica y el análisis de la fluorescencia.

En el presente artículo sólo se discutirán los sistemas que evalúan el estrés del fruto mediante el análisis de la fluorescencia. Tal como se ha citado anteriormente, se trata de una técnica espectroscópica en la que se capturan espectros de emisión del objeto tras su excitación con un rayo de luz de mayor frecuencia.

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4.

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Sensores de fluorescencia En postcosecha se suelen utilizar fluorímetros con amplitud de

pulso modulado (PAM) que permiten determinar el contenido de pigmentos de forma no intrusiva. Estos utilizan tres tipos de luz distintos (modulada, actínica y de saturación) que permiten analizar la cinética de inducción de fluorescencia en organismos fotosintéticos. Puede así combinar el efecto Kautsky, mediante la relación de pulsos de luz saturante, con la medida de la emisión de la fluorescencia (Schreiber 2002, Schreiber et al. 2004). El PAM mide y calcula varios parámetros como la fluorescencia inicial (F0), relacionada con la cantidad de clorofila presente, el máximo de fluorescencia (FP) y la fluorescencia variable (Fv; sensible a los cambios en el Fotosistema II). Estos pueden estar relacionados con el desarrollo de escaldado superficial durante el almacenamiento (DeEll et al. 1996) y con daños por frío y con tratamientos con calor (Abbot et al., 1997).

Actualmente, existen dos sensores comerciales para prevenir el escaldado superficial en ADC mediante la fluorescencia de la clorofila, el FruitObserver (Besseling, Holanda) y el FIRM HarvestWatch (Isolcell, Canada).

Los sensores determinan la condición fisiológica de los frutos midiendo la fluorescencia de la clorofila. Una vez el sensor detecta la señal de estrés se tiene que incrementar el nivel de oxígeno para llegar a su nivel de seguridad.

El FruitObserver, se coloca encima del palox (ver Fig. 1), analizando toda aquella fruta que queda en su campo de visión.

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Fig. 1a Sensor FruitObserver visto en planta 1b y 1c Vista del montaje del sensor en el interior de una cámara en un palox de manzana.

A fin de obtener datos para un mejor ajuste de las condiciones de la cámara el aparato dispone de sensores de CO2, O2, temperatura y humedad relativa.

El FIRM HarvestWatch analiza seis frutos, que tienen que ser representativos de la cámara.

Fig. 2a Sensor HarvestWatch montado en un palox 2b Esquema del sensor

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5.

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Conclusiones Se concluye que la prohibición del DPA y la etoxiquina en el control

del escaldado han creado una necesidad en el sector. Actualmente, las alternativas son el 1-MCP y la aplicación de atmósferas dinámicas. La respuesta de cada sistema depende de la variedad en que se trabaje. Con algunas variedades se tiende a trabajar con una combinación de los dos sistemas.

En la literatura no hay una clara tendencia hacia un sistema concreto, pues todos los sistemas muestran buenos resultados en alguna ocasión. La DCA (atmósfera controlada dinámica), por ser un método físico, tiene mejores perspectivas de continuidad que los métodos alternativos. Con esta técnica, la prevención de los daños por bajo oxígeno se ha convertido en un requisito imprescindible, y se han desarrollado distintas técnicas para ello. En este contexto se observa el interés de la medida de la fluorescencia como método para anticipar, en conservación frigorífica, los daños causados por una exposición prolongada de los frutos a niveles de O2 excesivamente bajos.

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Bibliografía -

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ZANELLA, P. CAZZANELLI, A. PANARESE, M. COSER, M. CECCHINEL, O. ROSSI. 2005. Fruit fluorescence response to low oxygen stress: modern storage technologies compared to 1-MCP treatment of apple. Acta Hort., 682, ISHS.

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DEELL J.R., PRANGE R. K., MURR D. P. 1996. Chlorophyll fluorescence of Delicious apples at harvest as a potential predictor of superficial scald development during storage Postharvest Biology and Technology Volume 9, Issue 1, 1–6

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PRANGE R.K., WRIGHT A.H., DELONG J.M., ZANELLA A. 2015. A review on the successful adoption of dynamic controlled-atmosphere (DCA) storage as a replacement for diphenylamine (DPA), the chemical used for control of superficial scald in apples and pears. Acta Horticulturae Vol. 1071, 389-396

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SCHREIBER, U., MÜLLER, J.F., HAUGG, A., GADEMANN, R. 2002 New type of dualchannel PAM chlorophyll fluorometer for highly sensitive water toxicity biotests. Photosynthesis Research Vol. 74, Issue 3, 317-330

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MAXWELL, K., JOHNSON, G.N. 2000 Chlorophyll fluorescence - A practical guide. Journal of Experimental Botany Vol. 51, Issue 345, 659-668

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VIÑAS I., RECASENS I., USALL J., GRAELL J. 2013 Poscosecha de pera, manzana y melocotón. ISBN: 978-84-8476-549-3

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RECASENS I. 2015 Nuevos retos en investigación en poscosecha de frutas y hortalizas. www.poscosecha.com Consultado: 18/12/2015.

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Torregrosa, Laia Garcia, Joan Planes, Meritxell Fons, Estanislau

IRTA: Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries, Lleida ILERFRED: Industrial Leridana del Frío s.l, Lleida UdL: Universitat de Lleida

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ILERFRED, Atmósfera Controlada

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Una exclusiva de Isolcell, para mantener la calidad y control del escaldado en manzana y pera, sin tratamientos químicos poscosecha Isolcell está especializada en la fabricación de cámaras de Atmósfera Controlada (AC) y cámaras de Atmósfera Controlada Dinámica con sensores de fluorescencia (DCA-CF), para el almacenamiento de pera y manzana sin productos químicos, una tecnología esta última que empezó a utilizarse a nivel comercial en 2003 y que al día de hoy es la única tecnología que puede definirse como fiable y segura, gracias a las experiencias en cámaras comerciales a nivel mundial, que en los últimos 11 años ha llevado a la preservación de más de 2 millones de toneladas con resultados excepcionales. La DCA-CF es la única tecnología “dinámica” que tiene muchas publicaciones científicas de diversos investigadores internacionales independientes, que reconocen su validez y fiabilidad para alcanzar los más altos estándares de calidad. La llamada “Conservación DCA-CF” (Dynamic Controlled Atmosphere with chlorophyll fluorescence sensors, Atmósfera Controlada Dinámica con sensores de fluorescencia) permite evitar el uso de tratamiento poscosecha con antioxidantes químicos, tales como el DPA (difenilamina) y etoxiquina para el control del escaldado. El sistema, patentado por el Gobierno del Canadá y desarrollado por el Dr. Angelo Zanella, lo distribuye en toda Europa exclusivamente ISOLCELL S.p.A. A partir de la prohibición del uso del DPA el uso de esta tecnología de vanguardia se ha disparado; en el caso de España, ya 4 estaciones están equipadas con este sistema para conservación de manzanas y peras; un único cliente tiene 110 cámaras de las cuales 50 de ellas se instalaron en 2014. Este sistema sustituye los parámetros estáticos de conservación por los parámetros dinámicos resultantes de la respuesta proporcionada por la propia fruta. Para esto se utiliza un sensor especial que mide la fluorescencia emitida por la manzana y la pera, identificando de esta manera el umbral mínimo de oxígeno tolerado por la fruta. Se logra así reducción drástica de la actividad metabólica interna, lo que significa un mejor mantenimiento de las características de calidad internas y externas del producto y un aumento de la conservación.

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Con la capacidad de controlar varios lotes de fruta, se superan brillantemente los grandes límites que tienen otras tecnologías DCA que miden solamente la media de toda la cámara. Sólo así se puede garantizar una atmósfera ideal para los lotes más débiles. En última instancia, se trata de un sistema integrado y totalmente informatizado, extremadamente fácil de usar.

DCA-CF de Isolcell

Equipo para medir la fluorescencia de la clorofila

Utilizando esta tecnología se atiende a la prohibición de uso del DPA y a la creciente demanda por parte de los consumidores que requieren cada vez más productos libres de residuos químicos. Otra de las ventajas del DCA-CF es la reducción drástica del pardeamiento interno en las variedades como Granny, Braeburn, Pink Lady y Fuji, un mantenimiento excepcional de la firmeza y del color, así como la exclusión del tratamiento poscosecha “Drencher”, reduciendo significativamente el porcentaje de productos podridos en el almacenamiento, con el consiguiente beneficio para el productor. Teniendo en cuenta la vida útil de los sensores, los costes de mantenimiento prácticamente inexistentes, la calidad de conservación hasta ahora impensable, la reducción del consumo energético, la garantía de los resultados y la ausencia de riesgos, los costes de la tecnología DCA-CF son mínimos.

Pera Blanquilla conservada desde finales de julio 2014 a la apertura de cámara en abril 2015 en la cooperativa Miralcamp; Josep Piñol, responsable técnico de la empresa, a la izquierda, y Gerard Pallás, Director Técnico de SMA, representante de Isolcell en España

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En pera Blanquilla permite conservaciones de siete meses y más manteniendo la firmeza de la pulpa, pedúnculos verdes, piel y pedúnculos sin deshidratar y capacidad de retomar la evolución de la maduración. Gracias a la experiencia en las principales zonas de cultivo de fruta de mundo y a estrecha colaboración entre los institutos de investigación, empresas tecnológicas y clientes, Isolcell está a la vanguardia de la tecnología del almacenamiento de frutas.

Número de cámaras equipadas con DCA, Isostore®, hasta Diciembre, 2014, en Italia (azul), otros países (gris) y la suma (verde)

ISOLCELL Via A. Meucci, 7 39055 Laives (BZ) Italia http://www.isolcell.com Tel. +39 0471 954 050

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Dr. Manuel Candela, 26 11ª - 46021 Valencia, España Tel +34 – 649 485 677 info@poscosecha.com info@bibliotecahorticultura.com http://www.poscosecha.com

http://www.postharvest.biz

http://www.horticulturablog.com http://www.bibliotecahorticultura.com http://www.actualfruveg.com

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