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MicrobiologĂ­a General 2007 - 2008 MicrobiologĂ­a Industrial - I 17 abril 2008

MG2007


BLOQUE III.- MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Tema 15.- Microorganismos y productos industriales Tema 16.- Aislamiento y caracterización de productos de origen microbiano Tema 17.- Producción microbiana de alimentos Tema 18.- Utilización de microorganismos en procesos ambientales

Bibliografía: Biología de los Microorganismos de Brock, capítulo 12 en la 8ª edición Biología de los Microorganismos de Brock, capítulo 30 en la 10ª edición MG2007


Tema 15.- Microorganismos y productos industriales

Origen de las cepas industriales. Propiedades de un microorganismo industrial Productos industriales de origen microbiano Trofofase e idiofase Caracter铆sticas de los fermentadores a gran escala Cambio de escala en la fermentaci贸n: escalado

MG2007


Tema 16.- Aislamiento y caracterización de productos de origen microbiano

Antibióticos β-lactámicos Producción de vitaminas y aminoácidos Bioconversión microbiana Producción microbiana de enzimas Células inmovilizadas Producción de ácido cítrico

MG2007


Producción industrial de penicilina Microbiología General Curso 2007 – 2008 21 de abril de 2008


INTRODUCCION Los antibióticos son productos del metabolismo microbiano que son capaces de matar o inhibir el crecimiento de otros microorganismos a bajas concentraciones. Durante la II Guerra Mundial la demanda de agentes quimioterapéuticos para tratar las infecciones de las heridas condujo al desarrollo de un proceso de producción para la penicilina y al inicio de la era de investigación sobre los antibióticos. En la actualidad continua siendo una de las áreas más importante de investigación dentro de la Microbiología Industrial. 1900-15

Ehrlich concibe la idea de usar compuestos químicos de síntesis como “balas mágicas” selectivas hacia microorganismos, pero inofensivas para las personas o animales superiores. En 1909 descubre que el salvarsán es efectivo contra la sífilis. Acuña el término “quimioterapia”.

1932-35

Domagk, siguiendo los pasos de Ehrlich, descubre la acción del rojo de prontosilo (la primera sulfamida) sobre el neumococo y otros estreptococos in vivo

1940

Woods descubre el mecanismo de acción de las sulfamidas. Estamos en plena “Edad de oro de la Quimioterapia de síntesis”.

1929

Fleming descubre la penicilina, el primer antibiótico natural, pero fracasa en su intento de purificarlo. La industria farmacéutica se muestra “"indiferente”.

1940

Chain y Florey purifican la penicilina. Se usa en la 2ª Guerra Mundial. Comienza la era de los antibióticos naturales

1944

Waksman, un microbiólogo de suelos, ha iniciado una búsqueda de microorganismos productores de antibióticos. Descubre la estreptomicina. Comienza la época dorada de los antibióticos (quimioterápicos naturales), y la búsqueda racional rinde decenas de nuevos antimicrobianos procedentes de Actinomicetos, otras bacterias y hongos.


INTRODUCCION Los antibióticos son productos del metabolismo microbiano que son capaces de matar o inhibir el crecimiento de otros microorganismos a bajas concentraciones. Durante la II Guerra Mundial la demanda de agentes quimioterapéuticos para tratar las infecciones de las heridas condujo al desarrollo de un proceso de producción para la penicilina y al inicio de la era de investigación sobre los antibióticos. En la actualidad continua siendo una de las áreas más importante de investigación dentro de la Microbiología Industrial. El número de antibióticos descritos continúa aumentando debido a los programas intensivos de búsqueda en todos los países industriales. En 1961 eran conocidos 513 antibióticos, 4076 en 1972, 7650 en 1985 y en 1990 alrededor de 8000. Cada año se detectan aproximadamente 300 nuevas sustancias con actividad antibiótica, de las que el 30-35% son componentes secundarios de las fermentaciones de antibióticos conocidos. Del gran número de antibióticos conocidos de origen microbiano, solamente 123 se producían por fermentación en 1984. Además, más de 50 antibióticos se producían como compuestos semisintéticos y 3 antibióticos (cloranfenicol, fosfomicina y pirrolnitrina) se producen en forma completamente sintética.


INTRODUCCION Los antibióticos son producidos por bacterias y hongos. Entre los hongos, solamente 10 de los antibióticos conocidos se producen comercialmente y solamente las penicilinas, cefalosporina C, griseofulvina y ácido fusídico tienen importancia clínica. En las bacterias existen muchos grupos taxonómicos que producen antibióticos. La mayor variedad en estructura y número de antibióticos se encuentra en los actinomicetos, especialmente en el género Streptomyces. La producción mundial de antibióticos en 1979 estaba por encima de las 100.000 toneladas por año. Las ventas brutas anuales, sólo en USA, eran de 1000 millones de dólares, con la cefalosporina en la posición de cabeza, seguida de la ampicilina y las tetraciclinas.

Porcentajes de producción de diversas familias de quimioterápicos


INTRODUCCION Los antibióticos son producidos por bacterias y hongos. Entre los hongos, solamente 10 de los antibióticos conocidos se producen comercialmente y solamente las penicilinas, cefalosporina C, griseofulvina y ácido fusídico tienen importancia clínica. En las bacterias existen muchos grupos taxonómicos que producen antibióticos. La mayor variedad en estructura y número de antibióticos se encuentra en los actinomicetos, especialmente en el género Streptomyces. La producción mundial de antibióticos en 1979 estaba por encima de las 100.000 toneladas por año. Las ventas brutas anuales, sólo en USA, eran de 1000 millones de dólares, con la cefalosporina en la posición de cabeza, seguida de la ampicilina y las tetraciclinas. Antes de 1960 aproximadamente el 5% de los antibióticos recientemente aislados eran útiles terapéuticamente. En los años siguientes fueron descubiertos nuevos antibióticos a una velocidad aproximadamente constante, pero el porcentaje de los nuevos antibióticos que realmente llegaban al mercado descendió desde el 2,6% entre 1961-1965 al 1% entre 1966-1971. Esto se debe fundamentalmente a un aumento severo en los costes del desarrollo y de las pruebas clínicas, de forma que muchos fabricantes producen solamente aquellos compuestos que claramente muestran un progreso terapéutico prometedor. Por término medio se necesitan alrededor de 8-10 años para desarrollar un nuevo antibiótico a un coste medio de 10x106 - 20x106 dólares (6 – 12x106 €). La obtención de mejores antibióticos se lleva a cabo por modificación de los compuestos conocidos utilizando medios químicos o genéticos (mutasíntesis, fusión de protoplastos, tecnología del DNA recombinante). Sin embargo, solamente por procesos de Screening pueden esperarse encontrar antibióticos con estructuras básicas enteramente nuevas, especialmente por la utilización de nuevos procedimientos de prueba y por la investigación en nuevos grupos de microorganismos.


PRODUCCION DE PENICILINAS

Los antibióticos ß-lactámicos son metabolitos secundarios Los antibióticos ß-lactámicos se caracterizan por poseer en su estructura el anillo ß-lactámico que está compuesto por 3 átomos de carbono y 1 átomo de nitrógeno. Los antibióticos ßlactámicos se pueden dividir en cinco clases diferentes: · Penicilinas · Clavamas · Cefalosporinas · Monobactamas · Carbapenemas Las penicilinas y cefalosporinas pertenecen a los más efectivos de todos los agentes terapéuticos usados en el control de las enfermedades infecciosas.


PRODUCCION DE PENICILINAS La penicilina fue descrita por Fleming en 1929. Un grupo de investigación en Oxford, bajo la dirección de Florey y Chain, la aisló a partir de cultivos de Penicillium notatum en 1940 y la primera aplicación clínica de la penicilina se realizó en 1941. Las penicilinas son producidas por muchos hongos, particularmente especies de Penicillium y Aspergillus.

Penicillium notatum Sir Alexander Fleming, 1952 Photograph courtesy of Associated Press


PRODUCCION DE PENICILINAS La penicilina fue descrita por Fleming en 1929. Un grupo de investigación en Oxford, bajo la dirección de Florey y Chain, la aisló a partir de cultivos de Penicillium notatum en 1940 y la primera aplicación clínica de la penicilina se realizó en 1941. Las penicilinas son producidas por muchos hongos, particularmente especies de Penicillium y Aspergillus.

Penicillium notatum Placa de Petri sembrada con Staphylococcus aureus y contaminada con P. notatum


PRODUCCION DE PENICILINAS La penicilina fue descrita por Fleming en 1929. Un grupo de investigación en Oxford, bajo la dirección de Florey y Chain, la aisló a partir de cultivos de Penicillium notatum en 1940 y la primera aplicación clínica de la penicilina se realizó en 1941. Las penicilinas son producidas por muchos hongos, particularmente especies de Penicillium y Aspergillus.

Fleming

Chain

Florey


PRODUCCION DE PENICILINAS

Las penicilinas naturales son efectivas contra numerosas bacterias Gram +. Son lábiles en medio ácido y pueden ser inactivadas por hidrólisis del anillo ß-lactámico con penicilinasas. Debido a su baja toxicidad pueden ser utilizadas grandes dosis de penicilina, solamente un pequeño porcentaje de pacientes desarrollan alergia (0,5-2%). Los antibióticos ß-lactámicos son inhibidores específicos de la síntesis de peptidoglicano, componente de la pared celular bacteriana. Son análogos estructurales de la D-alanil-D-alanina y por ello se considera que estos fármacos se unen a las transpeptidasas a las que inactivan irreversiblemente. Algunas penicilinas son menos efectivas frente a Bacterias G - debido a que la membrana externa bloquea su paso al interior, aunque las penicilinas sintéticas y cefalosporinas tienen efecto también frente a Bacterias G -.


SITIO DE ACCIÓN DE LAS PENICILINAS


1.- Estructura química La estructura básica de las penicilinas es el ácido 6-aminopenicilánico (6-APA), que consiste en un anillo tiazolidínico con un anillo ß-lactámico condensado. El 6-APA lleva una parte variable acilada en la posición 6.


1.- Estructura química La estructura básica de las penicilinas es el ácido 6-aminopenicilánico (6-APA), que consiste en un anillo tiazolidínico con un anillo ß-lactámico condensado. El 6-APA lleva una parte variable acilada en la posición 6.


2.- Biosíntesis y regulación

El anillo ß-lactámico-tiazolidínico de la penicilina se produce a partir de L-cisteína y Lvalina. La biosíntesis se produce por medio de un dipéptido compuesto de ácido L-a-aminoadípico (L-a-AAA) y L-cisteína. Subsecuentemente se conecta la L-valina mediante una reacción de epimerización, dando lugar a la formación del tripéptido d-(L-a-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina. El primer producto de la ciclación del tripéptido que puede ser aislado es la isopenicilina N, pero no se conocen las reacciones bioquímicas que conducen a este intermediario. La bencilpenicilina se produce en el intercambio de L-a-AAA (L-a-aminoadípico) con ácido fenilacético activado. El 6APA, que no es un producto intermediario de biosíntesis, se excreta en ausencia de un precursor de la cadena lateral.


Metabolito secundario


2.- Bios铆ntesis y regulaci贸n

Ruta de producci贸n de penicilina en Penicillium chrysogenum


2.- Biosíntesis y regulación

SÍNTESIS DE PENICILINA G Ruta de producción de penicilina en Penicillium chrysogenum


2.- Biosíntesis y regulación

Se conocen varios mecanismos reguladores en la biosíntesis de la penicilina. El aminoácido lisina es sintetizado a partir de la vía que origina el ácido L-a-aminoadípico de forma que la penicilina y la lisina comparten una ruta biosintética ramificada común. La lisina inhibe la síntesis de penicilina debido a que inhibe por retroalimentación a la homocitrato sintasa, un enzima implicado en la síntesis de L-a-AAA. Si el L-a-AAA es deficiente, no puede sintetizarse penicilina. Sin embargo, la retrorregulación por lisina no parece ser una etapa limitante en la biosíntesis de penicilina. La biosíntesis de penicilina se ve afectada por la concentración de fosfato y también muestra una clara represión catabólica, particularmente por glucosa.


2.- Penicilinas naturales, semisintéticas y biosintéticas La estructura básica de las penicilinas es el ácido 6-aminopenicilánico (6-APA), que consiste en un anillo tiazolidínico con un anillo ß-lactámico condensado. El 6-APA lleva una parte variable acilada en la posición 6. Si la fermentación de penicilina se lleva a cabo sin adición de precursores de la cadena lateral se producen las penicilinas naturales. A partir de esta mezcla solamente es útil terapéuticamente la bencilpenicilina; los otros compuestos deben ser eliminados durante la etapa de recuperación del producto. La fermentación puede ser controlada mejor añadiendo un precursor de la cadena lateral, de forma que solamente se produzca una penicilina deseada. Más de 100 penicilinas biosintéticas han sido producidas de esta forma. En los procesos comerciales, sin embargo, solamente han sido producidas la penicilina G y la penicilina V, y cantidades muy limitadas de penicilina O. Utilizando el ácido fenoxiacético, como precursor de la cadena lateral, se consiguió la obtención de penicilina V (fenoximetilpenicilina), penicilina que es particularmente estable en medio ácido y que puede, por tanto, suministrarse por vía oral al contrario de lo que ocurre con la penicilina G ya que debido a su sensibilidad a los ácidos no se puede administrar oralmente puesto que es hidrolizada en el estómago.


2.- Penicilinas naturales, semisintĂŠticas y biosintĂŠticas


PRODUCCION DE PENICILINAS


PRODUCCION DE PENICILINAS Amoxicilina

Ampicilina

Núcleo central de la penicilina Núcleo central de las cefalosporinas


2.- Penicilinas naturales, semisintéticas y biosintéticas A diferencia de las anteriores, las penicilinas semisintéticas incluyen diversas penicilinas obtenidas al añadir químicamente una gran variedad de cadenas laterales al ácido 6-APA. Penicillium chrysogenum puede sintetizar este ácido si el medio de cultivo carece de precursores de la cadena lateral. Sin embargo, la producción de 6-APA en estas condiciones es tan pequeña que hace inviable este procedimiento. La deacilación química tampoco es rentable pues este proceso comprende tres etapas que deben llevarse a cabo a baja temperatura y en condiciones anhidras estrictas, requiriéndose además varios solventes químicos. Por estas razones, la producción industrial del 6-APA necesario para la fabricación de penicilinas semisintéticas se realiza por deacilación enzimática de la penicilina G. Este proceso biológico se basa en la producción por ciertas bacterias de acilasas que eliminan el grupo bencilo. La deacilación se realiza en H2O a 37°C, lo que reduce considerablemente los costes. Después de la deacilación se obtiene una solución de sales sódicas del ácido fenilacético y 6-APA. El fenilacético recuperado se puede utilizar posteriormente para la producción de penicilina G. Debido a sus mejores características (estabilidad a la acidez, resistencia a ß-lactamasas, mayor espectro antimicrobiano), las penicilinas semisintéticas han llegado a ser extensamente utilizadas en terapia. Aproximadamente el 38% de las penicilinas naturales producidas comercialmente se utilizan en medicina humana, el 12% en veterinaria y el 43% como material de partida para la producción de penicilinas semisintéticas.


2.- Penicilinas semisintĂŠticas


3.- Desarrollo de cepas y de técnicas de cultivo

La producción de penicilina por la cepa aislada por Fleming era de aproximadamente 2 u.i./ml; los procesos actuales producen un título de penicilina de aproximadamente 85.000 u.i./ml. Este es un aumento desde 0,0012 g/l hasta 50 g/l e ilustra bien el valor y el poder de un programa de selección de cepas. Los primeros procesos para la producción de penicilina implicaban el crecimiento de Penicillium notatum sobre la superficie de un medio líquido (Czapek-Dox-glucosa). El período de incubación era usualmente de 6-12 días y posteriormente la penicilina se extraía con solventes previa separación del micelio


3.- Desarrollo de cepas y de técnicas de cultivo

La mejora del cultivo inicial se produjo en 1943 con el aislamiento de la cepa Penicillium chrysogenum NRRL1951. Este microorganismo era más adecuado para la producción en cultivo sumergido que la cepa original, Penicillium notatum.

P. Chrysogenum permitió trabajar en cultivo sumergido empleando lactosa como fuente de carbono y energía, y agua de macerado de maíz (corn-steep liquor) como fuente de nitrógeno. Mediante posterior mutagénesis fue aislada la cepa WisQ176, la cepa original de la línea de cultivos Wisconsin. WisQ176 fue adoptada por la mayor parte de los fabricantes de penicilina y fue utilizada como cepa original en los distintos programas comerciales de mejora de cepas, acerca de los que se ha publicado poco (secreto industrial). Si bien los aumentos de rendimiento han sido el objetivo principal del desarrollo de las cepas, también han sido optimizados otros factores que tienen un efecto sobre la fermentación y la eficiencia de recuperación del producto.


3.- Desarrollo de cepas Los principales avances en el procesamiento han sido obtenidos a través del screening empírico de mutantes. Hasta mitad de los años 60 los mutágenos utilizados más frecuentemente eran los rayos X, mostaza nitrogenada y radiaciones de longitud de onda corta. Más recientemente han sido utilizados como mutágenos la nitrosoguanidina, los agentes alquilantes y los nitritos. A principios de los 70 la mejora de cepas por el mero uso de la mutación había alcanzado su límite. El descubrimiento de un ciclo parasexual en Penicillium chrysogenum proporcionó una forma de utilizar la recombinación genética para el desarrollo de cepas. Se describieron diploides heterozigóticos que tenían títulos de penicilina superiores a los de las cepas haploides parentales. Sin embargo, el mayor porcentaje de cepas con producción superior de penicilina se produjo a partir de los haploides segregantes de los cruces entre mutantes de diferentes líneas. La técnica de fusión de protoplastos abrió un nuevo enfoque en el desarrollo de cepas de alta producción obteniéndose rendimientos del 8% superiores a los obtenidos por mutación y selección. Además, algunas de las cepas resultantes han tenido mejores características de crecimiento, como esporulación más estable y mejor crecimiento para la producción del inóculo. El uso de la ingeniería genética para aumentar la síntesis de enzimas que catalizan pasos limitantes, mediante la amplificación génica o mejora de la transcripción, no ha sido todavía posible en Penicillium chrysogenum debido a la ausencia de datos biosintéticos precisos y a la ausencia de buenos sistemas vector-hospedador. Sin embargo, se ha construido un banco de genes para Penicillium chrysogenum y se ha desarrollado un sistema de transformación


4.- Métodos de producción La penicilina G y la penicilina V son producidas utilizando procesos sumergidos en fermentadores de 40.000-200.000 litros. Debido a las dificultades en el suministro de oxígeno no pueden ser empleados tanques mayores. La fermentación de penicilina es un proceso aeróbico con una velocidad de absorción volumétrica de oxígeno de 0,4-0,8 mM/l min. La velocidad de aireación requerida está entre 0,5-1,0 volúmenes de aire (volumen de líquido)-1 min-1 dependiendo de la cepa, del biorreactor y del tipo de impulsor. Para el mezclado se suelen utilizar varios impulsores de tipo turbina (120-150 rpm). El rango de temperatura óptima es de 25-27°C. En un esquema típico de producción de penicilina el inóculo se inicia utilizando esporas liofilizadas. Debido a la gran variabilidad de las cepas de alta producción, es necesario el mantenimiento cuidadoso de las cepas. La concentración de esporas (óptima 5x103/ ml) y la formación de agregados son cruciales para el rendimiento subsecuente. Si se quiere conseguir una velocidad óptima de formación de penicilina, los agregados (pellets) no deben crecer como bolas compactas sino de una forma suelta. Después de varias etapas de crecimiento está preparado el cultivo de producción. En la fermentación típica de penicilina existe una fase de crecimiento de unas 40h con un tiempo de duplicación de 6h, durante la cual se forma la mayor parte de la masa celular. El suministro de oxígeno es crítico en el cultivo en crecimiento ya que el aumento de la viscosidad dificulta la transferencia de oxígeno. Después de la fase de crecimiento, el cultivo llega a la fase real de producción de penicilina. Debido al aporte de distintos componentes al medio, la fase de producción puede extenderse hasta 120-160h.


4.- M茅todos de producci贸n


4.- Métodos de producción Actualmente la extracción con solventes es la base para la separación y purificación de la penicilina. El primer paso consiste en separar el micelio del medio de cultivo empleando un filtro rotatorio a vacío tipo cilíndrico. El filtrado rico en penicilina es luego enfriado en un intercambiador de calor a 0 - 4 °C con el objeto de disminuir la degradación enzimática y química durante las etapas de extracción posteriores. Las penicilinas G y V son ácidos fuertes (pKa entre 2.5 - 3.1). Las formas ácidas son solubles en muchos solventes orgánicos y se pueden extraer con un alto rendimiento en acetato de amilo o de butilo a pH 2.5 - 3.0. La extracción se puede realizar en operaciones continuas, a contracorriente en extractores centrífugos en etapas múltiples, a temperaturas de 0 - 3 °C. Otra posibilidad es el empleo de mezcladores estáticos o decantadores, los cuales tienen en menor costo de inversión. Se debe tener en cuenta que tanto la penicilina G como la V se degradan en medio ácido con una cinética de primer orden a una velocidad proporcional a la temperatura y recíproca con respecto al pH. Esto hace que la vida media en condiciones de eficiente extracción en medio ácido sea muy reducida. Sin embargo como la forma V en tales condiciones es más estable que la G, si el objetivo es obtener 6-amino penicilánico (6-APA) la producción de penicilina V es más aconsejable.


4.- Métodos de producción La extracción de penicilina se puede realizar en una o más etapas sucesivas, con una acidificación del caldo filtrado con H2SO4 o H3PO4 al 10% P/V y con el agregado de un agente surfactante (0,003 - 0,1% P/P, en el solvente), realizándose la extracción y concentración en extractores centrífugos. Dependiendo de las especificaciones de uso final, el solvente conteniendo penicilina se puede tratar con carbón para separar pigmentos y otras impurezas. Esta etapa actualmente no se realiza debido a las bajas impurezas de los caldos y a los altos rendimientos obtenidos. La cristalización se puede realizar desde la fase acuosa si se desea, siendo los valores críticos las concentraciones de sodio o potasio, la temperatura, la concentración de penicilina y el pH. En caso de hacerse la cristalización a partir de un solvente se requiere también un exceso de Na+ o K+ , siendo los cristales recuperados en un filtro rotatorio a vacío. Estos cristales son lavados y presecados con un solvente volátil que también separa impurezas coloreadas. El secado definitivo se puede realizar con aire caliente, vacío o calor radiante. La penicilina cristalina G o V así obtenida puede ser empleada como tal o como intermediario que es convertido a 6-APA para obtener nuevas penicilinas semisintéticas, cuidando en todos los casos que los productos deberán tener un grado farmacéutico. El ácido 6-APA puede ser obtenido por vía enzimática (penicilinacilasa) o química; sin embargo todas estas etapas escapan al alcance de esta monografía, por lo tanto se remite al lector interesado a la bibliografía.


4.- Métodos de producción El medio de un cultivo típico alimentado puede variar dependiendo de la cepa, y generalmente consiste en: · Líquido de maceración de maiz (4-5% peso seco). · Una fuente de Nitrógeno adicional, harina de soja, extracto de levadura o suero. · Una fuente de carbono, lactosa. · Varios tampones · El pH se mantiene constante a 6,5. · El ácido fenilacético o el fenoxiacético se alimentan continuamente como precursores (0,5-0,8% del total). Los procesos con alimentación de glucosa o melazas también tienen éxito. En estos casos las velocidades de alimentación son de 1.0-2.5 kg*m-3*h-1, con una concentración de glucosa de 500 kg*m-3. Aproximadamente el 65% de la fuente de carbono metabolizada se utiliza para el mantenimiento energético, el 25% para el crecimiento y sólo el 10% para la producción de penicilina.


4.- Métodos de producción

Producción de penicilina (x) en cultivos discontínuos. La variación en biomasa se representa con punto negros


4.- Métodos de producción

Producción de penicilina (x) en cultivos discontínuos. La variación en biomasa se representa con punto negros


4.- Métodos de producción

La principal fuente nitrogenada empleada hasta la década del 70 fue "corn steep liquor" debido a que aumentaba los rendimientos del antibiótico probablemente al suministrar compuestos como aminoácidos, factores de crecimiento, precursores de la cadena lateral, además de elementos trazas. Sin embargo, dada la variabilidad del producto entre distintas partidas, los problemas de suministro, y también debido a la introducción de precursores específicos de la cadena lateral, las industrias buscaron reemplazarlo. Los productos alternativos son la harina de semilla de algodón, extractos y peptonas, y la harina de soja. Sin embargo en algunos casos estos productos son igualmente variables y tanto o más caros.


4.- Métodos de producción En 1976 se demostró la importancia de un suministro continuo de amonio (por alimentación con (NH4)2SO4), que permitiese mantener niveles del mismo de aproximadamente 20 mM. Trabajando en cultivos alimentados y modificando la relación nitrógeno/carbono en la alimentación, se comprobó que cuando el cultivo estaba limitado en nitrógeno cesaba la producción de penicilina, la cual se restablecía al ser la fuente de carbono la limitante. El requerimiento de grandes cantidades de NH4+ podría reflejar su necesidad para la síntesis de glutamato, el cual es requerido para producir valina y cisteína. El azufre se incorpora como (NH4)2SO4 y con la fuente de nitrógeno orgánica (extractos, peptona). El fósforo en forma inorgánica se adiciona como sales de fosfato y se aconseja mantener su concentración entre 250 y 500 mg l-1 con alimen tación continua. Además se debe tener en cuenta que el "corn-steep liquor" es una fuente importante de fósforo. Si se desea obtener un determinado tipo de penicilina, se debe incluir inicialmente, o bien por alimentación en los medios, una cantidad relativamente grande de precursor. El requerimiento teórico de fenilacetato sódico, es 0.47 g g-1 de penicilina G ácida, y de fenoxiacetato de sodio, 0.50 g g-1 de penicilina V ácida.


4.- Métodos de producción Se ha intentado la producción de penicilina por fermentación continua, pero ha sido difícil debido a la inestabilidad de las cepas de producción. Como alternativa se ha sugerido un sistema de "tanque de llenar y sacar“ (feed batch). En este procedimiento el 20-40% del contenido de la fermentación se saca y se reemplaza con solución fresca de nutrientes; este proceso puede ser repetido hasta diez veces sin reducción del rendimiento.


4.- Métodos de producción

Se está llevando a cabo una intensa investigación para producir penicilina con células inmovilizadas. En un estudio a escala de laboratorio se demostró la ventaja de este enfoque sobre el uso de sistemas discontinuos alimentados, pero esta técnica no ha sido introducida todavía a nivel comercial. La penicilina es excretada al medio y menos del 1% permanece unida al micelio. Después de la separación del micelio, la recuperación del producto se lleva a cabo por medio de dos etapas de extracción continua en contracorriente del caldo de fermentación con acetato de amilo o de butilo a 0-3°C y pH: 2,5-3,0. El rendimiento es de alrededor del 90%.


Referencias http://nostoc.usal.es/sefin/MI/tema15MI.html http://www.biologia.edu.ar/microind/producci%C3%B3n_de_penicilina.htm http://www1.us.es/pautadatos/publico/asignaturas/40397/17564/BIOTEC_07-08_TEMA%2010.pdf


produccion penicilina