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合成生物学导论 第五章、合成生物学的应用研究 ksong@tju.edu.cn


5.1 合成生物学应用于维护人类健康 在解释疾病机理方面  人工重构B细胞抗原受体信号处理过程  V.Rolli等人在果蝇Schneider-2细胞中人工重构了B细胞抗原受体 (B cell antigen receptor,BCR)信号处理过程,证实了别构的 酪氨酸激酶Syk具有酪氨酸活化模体ITAM(immunoreceptor tyrosine-based activation motif),能够与BCR免疫受体结合并被 磷酸化而激活。使邻近的ITAM磷酸化导致更多的Syk的结合和激 活,形成正反馈,并最终引起BCR信号的快速放大。随后,又证 明了罕见的血液丙球蛋白缺乏症与IgB的一种无义突变有关。

 人工改造蝙蝠冠状病毒  M. M. Becker等人使蝙蝠病毒刺突蛋白的针结构域与感染人类的 SARS病毒相应蛋白的外结构域互换,能够在鼠科和灵长类动物细 胞中复制,为SARS病毒的研究开发通用平台。


5.1 合成生物学应用于维护人类健康  在发现新药方面 W. Weber等人在人类的胚肾细胞中植入了一个基于EthR 的合成基因线路,筛选了能够关闭结核分枝杆菌对抗生素 乙硫异烟胺(ETH)抗性的小分子酯类2-丁酸苯乙酯能激 活结核分枝杆菌中EthA的表达,使病原体对抗生素ETH更 加敏感。为抗结核病的新药发现开辟了崭新思路。 PIP是一种源于始旋链霉菌的链阳菌素响应的阻遏蛋白。 D. Aubel等人把PIP工程化入哺乳动物细胞中,筛选链霉菌 代谢物库,识别其代谢化合物能够抵抗临床上病原体、渗 透入哺乳动物细胞且没有毒性的链霉菌菌株。


5.1 合成生物学应用于维护人类健康  在发现新药方面 抗癌药物的关键特性之一是必须能够选择性的杀死分裂细胞 而不影响无有丝分裂活性的细胞。V. Gonzalez-Nicolini等在 中国仓鼠卵巢细胞内构建了一个由四环素激活的工程化基因 网络来控制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27Kip1的表达。 G. Stephanopoulos课题组将其氨基酸序列作为具有规律性语 法的正式语言,用以设计新的非天然抗菌肽。这些人工设计 的新型抗菌肽遵循天然抗菌肽的语法准则但位于不同的序列 区域。与常规抗菌素相比,这些抗菌肽具有受细菌抗性影响 小的优势,能够抑制包括金黄色葡萄球菌和炭疽杆菌在内的 多种致病菌。


大肠杆菌呈像系统 PCB

PCB

P pcyA PCB 转化

lacZ ompC

hol

血红素

LacZ s-gal

催化 黑色物


大肠杆菌呈像系统 1)光感应器的构建 将取自Synechocystis的藻胆青素合成基因 (ho1和pcyA)构建在质粒上引入大肠杆菌, 将血红素转化为藻胆青素(PCB)使E coli. 能够产生光敏色素感光。


大肠杆菌呈像系统 2)应答调节子 将PCB双组份系统的胞外部分与E coli. EnvZ-OmpR双组份系统的胞内部分进行交 联,将光反应传递给EnvZ-OmpR。


大肠杆菌呈像系统 呈像部分 将lacZ基因与大肠杆菌染色体上的ompC基 因做成融合基因,由OmpR蛋白控制这个融 合基因的表达。 lacZ基因编码的LacZ蛋白能够催化S-Gal (一种稳定的可溶于水的DNA染色剂)产生黑 色化合物。


大肠杆菌呈像系统 PCB

PCB

P pcyA PCB 转化

lacZ ompC

hol

血红素

LacZ s-gal

催化 黑色物

有光照的部分为黑色,无光照部分为菌苔自身颜色


微生物计算系统 翻烧饼问题the Burnt Pancake Problem,BPP (-4,-2,-1,3)

(-2,4,-1,3) 1

a

b

(2,1,3,4) (2 1 3 4)

(-3,-1,-2,4) 3

d

c

4

(-1,-2,3,4)

(1,-2,3,4) 5

e

(1,2,3,4)

 g

f 6

2


微生物计算系统

hixC A

hixC

-2 -1

-2 1

RBS 模块2

12

-1 2

Hin二聚体

1 -2

-1 -2

模块1 Hin二聚体 hixC B

hixC

hixC

hixC

2 -1

RBS 模块1

模块2

C

21


微生物计算系统 (-1,-2)

(2,1)

RBS

tetA

tetA

hixC

hixC Plac hixC

hixC

(1,2)

(-1,2) (1,-2)

3 RBS hixC

hixC

hixC

烧饼1

烧饼2

hixC

RBS

tetA

RBS hixC

hixC

hixC

tetA hixC


微生物计算系统 汉弥尔顿路径问题(Hamiltonian path problem) 在有向图中找到一条遍历图中所有节点一次且仅一 次的最短路径 1 4

3 2 5


微生物计算系统 RFP1 RFP2 A

RBS

GFP1 GFP2 RBS

hixC 节点1 RFP1 GFP1 B

RBS

hixC 路径1

hixC

节点2 RFP2 GFP2

RBS hixC

hixC

hixC


J Keasling 与能够合成青蒿酸的“微生物”


合成青蒿酸的微生物工厂 乙 酰 辅 酶 A

atoB HMGS tHMGR

甲 羟 戊 酸

ERG12 ERG8 MVD1

idi

ADS

IPP ERG12 ERG8 MVD1

idi

FPP

ispA

Amorphadiene

DMAPP

ispC G3P Pyrunate

DXP

MEP

1)将大肠杆菌中常见的化学物质乙酰辅酶A转变成甲羟戊酸; 2)将甲羟戊酸转化成异戊烯焦磷酸酯(IPP) 或者二甲(基)丙烯 焦磷酸酯(DMAPP); 3)将IPP或者DMAPP转化成法尼基环焦磷酸酯(FPP); 4)利用ADS基因,将FPP转化成Amorphadiene。 IPP和DMAPP是所有类异戊二烯的通用前体物


合成青蒿酸的微生物工厂 1、净化大肠杆菌中的代谢内环境 引入ispC基因,利用其产物将大肠杆菌原有的 DXP途径切断

2、合成和优化编码Amorphadiene 合成酶的 基因ADS,克服植物基因在大肠杆菌中表 达的困难。 3、将酿酒酵母中的甲羟戊酸途径转入大肠杆 菌。 4、协调IPP有关的基因以平衡其合成与消耗, 确保在其能够杀伤大肠杆菌以前及时转化 为Amorphadiene。


合成青蒿酸的微生物工厂 乙 甲 酰 ERG10 ERG13 tHMGR 羟 ERG12 ERG8 ERG19 idi 辅 IPP 戊 酶 酸 A ADS DMAPP

CYP71AV1/CPR 青蒿酸

Amorphadiene

DPP ERG20

FPP

1)优化FPP生物合成途径提高FPP的产量; 2)从黄花蒿中引入紫穗槐二烯合成酶(ADS)基因,其表达的 产物将FPP转化为Amorphadiene; 3)通过比较基因组学分析得到来自于A.annua 的细胞色素 P450氧化还原酶- CYP71AV1/CPR,克隆表达后实现 Amorphadiene到青蒿酸的三步氧化还原反应而得到青蒿酸。


合成青蒿酸的微生物工厂 优化青蒿酸产量: 1)过量表达tHMGR,有效限制FPP向固醇的转化。 2)通过甲硫氨酸可抑制启动子(PMET3)下调ERG9编码角鲨 烯(squalene)合成酶,阻断FPP 向下合成固醇的支路,避 免FPP在其他方面的不必要消耗; 3)过表达upc2-1并结合ERG9的下调时; 4)所有被修饰基因都整合到染色体上确保稳定性; 5)降低细胞密度,避免不必要的互相干扰和确保养分充足。

153mg/l,提高了近500倍


Not your father’s biofuels Nature,451,880-883, Feb.21,2008


合成生物学研究举例  2005年MIT“技术评论”将“细菌工厂” (Bacterial Factories)作为将影响世界的新出 现的10大技术之一,  Keasling教授被美国“发现”杂志评选为2006年 度最有影响的科学家。  Keasling等人专门建立了新的公司—Amyris Biotechnologies, 用合成生物学技术进行抗疟疾 药及生物能源的生产。  该项目已经获得比尔-梅林达盖茨基金会4300 万美元的资助,进行进一步的实验室研究、中 试、临床实验等后续工作。


Christina D Smolke 研究组最新论文  Production of benzylisoquinoline alkaloids in Saccharomyces cerevisiae Nature Chemical Biology, 2008, 4(9):564-573  Higher-Order Cellular Information Processing with Synthetic RNA Devices Science,2008,322,456-460  Model-guided design of ligand-regulated RNAi for programmable control of gene expression Molecular Systems Biology , 2008, 4; No.224;


Foundational advances in RNA engineering applied to control of biosynthesis Christina D. Smolke Division of Chemistry and Chemical Engineering California Institute of Technology


A Synthetic Gene-Metabolic Oscillator Fung, E., Wong, W.W., Suen, J.K., Bulter, T., Lee, S.G. and Liao, J.C. (2005) Nature, 435, 118-122. we designed and constructed a synthetic circuit in Escherichia coli K12, using glycolytic flux to generate oscillation through the signalling metabolite acetyl phosphate. If two metabolite pools are interconverted by two enzymes that are placed under the transcriptional control of acetyl phosphate, the system oscillates when the glycolytic rate exceeds a critical value. We used bifurcation analysis to identify the boundaries of oscillation, and verified these experimentally. This work demonstrates the possibility of using metabolic flux as a control factor in system-wide oscillation, as well as the predictability of a de novo gene–metabolic circuit designed using nonlinear dynamic analysis.


利用工程化的大肠杆菌非发酵代谢途径生物 合成高级醇 Professor James C. Liao, UCLA

葡萄糖 苯丙氨酸 生物合成 1-丙醇

KDC ADH

丙酮酸 ilviA

正缬氨酸生物合成 2-酮丁酸 2-酮戊酸 KDC ADH 1-丁醇

苯丙酮酸

L-苏氨酸

异亮氨酸 ilviHCD 生物合成 2-酮-3-甲基-戊酸 KDC ADH 2-甲基-1-丁醇

KDC ADH 2-苯乙醇

缬氨酸生物合成 ilviHCD 2-酮异戊酸 KDC ADH 异丁醇

亮氨酸生物合成 2-酮-4-甲基-戊酸 KDC ADH 3-甲基-1-丁醇


Resistance to Diet-Induced Obesity in Mice with Synthetic Glyoxylate Shunt Cell Metabolism, 9:525-536, 2009 UCLA的化学与生物分子工程学 教授廖俊智(James Liao)借鉴 了合成生物学的的研究策略,发 现了一项新的、具有煽动效应的 研究结果。


A Tale of Two Energy Problems: Fuel Shortage and Obesity (Award lecture, 1 h) ďƒ˜ AIChE's Society for Biological Engineering (SBE) has awarded its fifth annual James E. Bailey Award to Dr. James C. Liao for advances in metabolic research. Liao is the Chancellor's Professor at the University of California, Los Angeles. He has made major contributions to biochemical engineering with his theoretical and his experimental work, and has an James E. Bailey Award international reputation that extends well beyond the chemical to Professor James C. LIAO Nov. 10, 2009 engineering community.


Bioengineers Succeed in Producing Plastic Without the use of Fossil Fuels  A team of pioneering South Biotechnology Korean scientists have & Bioengineering succeeded in producing the 2010,105: polymers used for everyday plastics through bioengineering, rather than Metabolic Engineering of E. coli for through the use of fossil fuel the Production of Polylactic Acid based chemicals. and Its Copolymers, 105:161-171  This groundbreaking research, is published in two papers in Biosynthesis of Polylactic Acid and the journal Biotechnology and Its Copolymers Using Evolved Bioengineering to mark the Propionate CoA Transferase journal’s 50th anniversary. and PHA Synthase, 105:150-160


发表合成生物学较多的刊物及新创刊的刊物 PNAS Nature Science MSB


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Chapter v