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GÊNESE DO POTENCIAL DE MEMBRANA

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O experimentador pode ajustar manualmente a corrente aplicada (Iinj.) até que a voltagem através da membrana atinja o valor desejado. No VC automático, a fixação de voltagem é feita por um circuito eletrônico muito rápido e sensível. Neste caso, a fixação pode ser também feita durante os transientes.

A TÉCNICA DO PATCH-CLAMP

Fig. 5.10 Voltage-clamp manual, de 4 eletrodos.

ao longo da resistência Rm da membrana. Assim, de modo geral, temos que: Vm  Em  VRm

(5.19)

onde VRm é a queda ôhmica através da resistência da membrana e é dada por: VRm  Rm  Iinj.

(5.20A)

Nota: Na condição estacionária não é necessário considerar a capacitância da membrana. Desta maneira, podemos expressar o potencial de membrana, em steady-state, como: Vm  Em  VRm  Em  Rm  Iinj.

(5.20B)

Quando não há corrente passando através da membrana (ou seja, Iinj.  0), VRm é igual a zero, e tem-se que Vm  Em. Mas, se uma corrente constante é injetada pela pipeta e sai através da membrana, então a queda VRm é diferente de zero e Vm é dado pela Equação 5.19 ou 5.20B. O processo de ajuste ou fixação da voltagem de membrana num valor predeterminado é conhecido como fixação de voltagem ou voltage-clamp. Como mostra a Equação 5.20B, ajustando-se a corrente Iinj., o potencial Vm pode ser fixado ou mantido no valor desejado pelo experimentador. Voltage-clamp manual O voltage-clamp de 4 eletrodos, manual, é o mais didático. Consiste em 2 eletrodos que monitoram a voltagem e 2 eletrodos que aplicam a corrente (Figura 5.10). Neste circuito, a corrente aplicada através da resistência Rm gera uma DP através de Rm que soma-se à FEM da bateria Em. A relação entre a corrente aplicada e a voltagem de clampeamento é dada por: Vclamp  Em  Iinj.  RCuri-Procopio (5.21)| m

A técnica de patch-clamp (PC), idealizada entre as décadas de 1970 e 1980, permitiu grande avanço no entendimento da função dos canais iônicos. A técnica de PC é conceitualmente simples: consiste em isolar eletricamente uma pequena área da membrana celular (o patch), aplicar voltagens através da região definida pelo patch e medir as correntes associadas. Portanto, temos, na técnica de PC, quatro ingredientes ou vantagens fundamentais: o selo elétrico, o patch com área pequena, a sensibilidade da medida e a rapidez de resposta. Estas vantagens tornam o PC uma ferramenta poderosa para a medida de pequeníssimas correntes, da ordem de fração de pA. O selo elétrico é obtido pela aposição da ponta da pipeta com a superfície da membrana com auxílio de uma pressão negativa, obtida por sucção na pipeta. Como a ponta é polida por aquecimento e ajusta-se com grande intimidade à superfície externa da membrana, a resistência elétrica do selo é muito alta (na faixa dos vários gigaohms) e, portanto, é conhecido também como gigaseal. A pequeníssima área do patch é obtida graças ao uso de uma ponta muito fina na micropipeta, tipicamente 0,1-3 micrômetros. As vantagens da área pequena são duas: monitora um pequeno número de canais, idealmente 1 único canal, e resulta numa grande resistência elétrica e baixa capacitância intrínsecas da membrana. Finalmente, a sensibilidade de detecção é conseguida por meio da combinação de dois fatores: um nível muito baixo de ruído intrínseco da preparação e uma grande sensibilidade do instrumento de medida, o amplificador de patch-clamp (APC). Desta maneira, o índice sinal/ ruído é muito favorável. Além disso, a pequena área tem uma capacitância elétrica pequena que (associada a alta resistência) funciona como um filtro elétrico cortando altas freqüências. Uma característica adicional do método de PC é a rapidez de resposta, o que permite detectar eventos como abertura e fechamento de canais rápidos, por exemplo, flickering. No modo cell-attached ou no modo excised-patch, os mais convencionais na análise de canais unitários, o sistema de PC pode detectar e medir correntes unitárias de menos de 1 picoAmpère. Patch-clamp usando VC de 2 eletrodos: conversor corrente-voltagem No voltage-clamp de 2 eletrodos usa-se o mesmo par de eletrodos para medir a voltagem e para passar a corrente. Uma montagem bastante usual com 2 eletrodos é o conversor corrente-voltagem, cujo esquema básico está representado na Figura 5.11. Este circuito é a base do amplificador de patch-clamp. O VC de 2 eletrodos é usado quando as correntes são de Fisiologia Básicae não geram quedas ôhmicas imporpequena magnitude

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Curi-Procopio | Fisiologia Básica  

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