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GENÉTICA MOLECULAR DOS GENES AOS GENOMAS

Carlos F. M. Menck Biólogo. Doutor em Bioquímica pela Universidade de São Paulo (USP). Pós-Doutorado pelo Institut des Recherches Scientifiques sur le Cancer (IRSC, França). Livre-docência em Genética pela USP. Professor das disciplinas Microbiologia Básica, Biologia Molecular e Biologia Molecular e Celular do Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da USP (ICB-USP).

Marie-Anne Van Sluys Bióloga. Especialista em Biologia Celular pela Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ). Doutora em Genética e Microbiologia pela Université Paris XI. Professora Titular das disciplinas Diversidade Biológica e Filogenia, Biologia e Evolução em Procariotos do Departamento de Botânica do Instituto de Biociências da Universidade São Paulo (IB-USP).

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Colaboradores

Adriana Silva Hemerly

Cristina Elisa Alvarez Martinez

Bióloga genética. Doutora em Biotecnologia pela Rijksuniversiteit Gent (Bélgica). Professora-asociada IV da disciplina Bioquímica I, da Faculdade de Farmácia do Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis da Universidade Federal do Rio de Janeiro (IBqM-UFRJ).

Bióloga. Mestre em Biologia Molecular pelo Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro (IBCCF-UFRJ). Doutora em Bioquímica pelo Instituto de Química da Universidade de São Paulo (IQ-USP). Professora Doutora das disciplinas Microbiologia e Microbiologia Molecular, do Departamento de Genética, Evolução e Bioagentes do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp).

Alessandra Splendore Bióloga. Mestre e Doutora em Genética pela Universidade de São Paulo (USP).

Alysson Renato Muotri Biólogo. Especialista em Biologia Molecular pela Universidade Estadual de Campinas (Unicamp). Doutor em Genética pela Universidade de São Paulo (USP). Professor-associado da disciplina Medicina, do Departamento de Pediatria e Medicina Celular e Molecular da Universidade da Califórnia de San Diego.

Andrea Laurato Sertié

Danielle Maluf Quintanilha Bióloga. Especialista em Biologia Molecular pelo Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo (IB-USP). Doutora em Ciências pela Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” da Universidade de São Paulo (ESALQ-USP).

Débora Braga Vieira Química. Doutora em Bioquímica pelo Instituto de Química da Universidade de São Paulo (IQ-USP).

Bióloga. Especialista em Biologia Molecular e Genética pelo Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo (IB-USP). Mestre e Doutora em Genética pelo IB-USP. Pesquisadora do Centro de Pesquisa Experimental do Instituto Israelita de Ensino e Pesquisa Albert Einstein (IIEPAE).

Débora Romeo Bertola

Bruno Karolski

Biólogo. Mestre e Doutor em Biologia Celular e Molecular pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Professor adjunto IV da disciplina Biologia Molecular Básica do Departamento de Biologia Molecular e Biotecnologia da UFRGS.

Biólogo. Mestre em Botânica e Doutor em Biotecnologia pela Universidade de São Paulo (USP). Pesquisador em Microbiologia Ambiental pela USP.

Carolina Quayle Bióloga. Doutora em Microbiologia pela Universidade de São Paulo (USP). Colaboradora no Laboratório de Genética do Salk Institute for Biological Studies (Califórnia, EUA).

Claudia Barros Monteiro Vitorello Bióloga. Mestre e Doutora em Genética e Melhoramento de Plantas pela Universidade de São Paulo (USP). Professora-associada de Genética Molecular do Departamento de Genética da Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” da USP.

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Médica. Especialista em Genética Clínica pela Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP). Mestre e Doutora em Pediatria pela FMUSP.

Diego Bonatto

Diogo Meyer Biólogo. Mestre em Biociências pela Universidade de São Paulo (USP). Doutor em Biologia pela University of California. Professor-associado da disciplina Processos Evolutivos, do Departamento de Genética e Biologia Evolutiva da USP.

Edgar Andrés Ochoa Cruz​ Microbiologista. Doutor em Biotecnologia pela Universidade de São Paulo (USP​).

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viii  Genética Molecular Básica | Dos Genes aos Genomas

Eduardo Cremonese Filippi Chiela

Guido Lenz

Biomédico. Mestre e Doutor em Biologia Celular e Molecular pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Pós-Doutorado pela Faculdade de Medicina da UFRGS. Professor orientador do Programa de Pós-Graduação em Hepatologia e Gastroenterologia da UFRGS.

Químico. Mestre e Doutor em Bioquímica pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Professor-associado das disciplinas Sinalização Celular, Biologia Celular e Biologia Celular e Molecular do Câncer, do Departamento de Biofísica e do Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular da UFRGS.

Eduardo Gorab Biólogo. Doutor em Ciências pela Universidad Autónoma de Madrid. Professor-assistente da disciplina Biologia Molecular, do Departamento de Genética e Biologia Evolutiva do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo (IBUSP).

Emy Tiyo Mano Bióloga. Especialista em Análises Clínicas pela Universidade de Mogi das Cruzes (UMC). Mestre e Doutora em Biotecnologia pela Universidade de São Paulo (USP). Pesquisadora da Fundação Coordenação de Projetos, Pesquisas e Estudos Tecnológicos (COPPETEC).

Erika Cristina Jorge Bióloga. Mestre e Doutora em Ciência Animal e Pastagens pela Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” da Universidade de São Paulo (ESALQ-USP). Pós-Doutorado em Biologia do Desenvolvimento e Biotecnologia pela USP e em Citologia e Biologia Celular pela Harvard University. Professora adjunta da disciplina Embriologia, do Departamento de Morfologia da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG).

Érika Maria de Jesus Bióloga. Doutora em Botânica pelo Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo (IB-USP). Pós-Doutorado em Botânica pelo IB-USP. 

Flávio Vieira Meirelles Médico veterinário. Mestre em Reprodução Animal pela Universidade de Montreal. Doutor em Genética pela Universidade de São Paulo (USP). Livre-docência pela USP. Professor Titular da disciplina Biologia Celular e do Desenvolvimento, do Departamento de Medicina Veterinária da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da Universidade de São Paulo (FZEA-USP).

Franceli Rodrigues Kulcheski Bióloga. Mestre em Fitotecnia e Doutora em Biologia Celular e Molecular pela Universidade do Rio Grande do Sul (UFRGS). Professora adjunta da disciplina Biologia Celular, do Departamento de Biologia Celular, Embriologia e Genética da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC).

Francisco G. Nóbrega Médico. Doutor em Bioquímica pelo Instituto de Química da Universidade de São Paulo (IQ-USP). Professor Titular aposentado de Microbiologia no Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da USP (ICB-USP).

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Guilherme Loss de Morais Biólogo. Mestre e Doutor em Biologia Celular e Molecular pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Pós-Doutorado em Bioinformática pelo Laboratório Nacional de Computação Científica (LNCC).

Hana Paula Masuda Bióloga. Mestre e Doutora em Química Biológica pelo Instituto de Bioquímica Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro (IBqM-UFRJ). Professora adjunta do Centro de Ciências Naturais e Humanas da Universidade Federal do ABC (UFABC).

Helaine Carrer Engenheira agrônoma. Mestre em Agronomia pela Universidade de São Paulo (USP). PhD em Biologia de Plantas pela Rutgers University (New Jersey, EUA). Professora Titular da disciplina Bioquímica e Biologia Molecular de Plantas, do Departamento de Ciências Biológicas da USP.

Januario Bispo Cabral Neto Biólogo. Mestre em Biologia pela Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ). Doutor em Microbiologia pela Université Pierre et Marie Curie – Paris VI. Professor-associado da disciplina Biofísica – Radio e Fotobiologia, do Departamento de Biologia Molecular do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ).

Jeferson Gross Farmacêutico. Mestre em Biologia Celular e Molecular pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Doutor em Genética Molecular de Plantas pela Ludwig-MaximiliansUniversität München (Universidade de Munique). Professor Pesquisador IV do Instituto de Pesquisas em Bioenergia da Universidade Estadual Paulista (Unesp – campus Rio Claro).

Júlio César de Lima Biólogo. Mestre em Biologia Celular e Molecular e Doutor em Genética e Biologia Molecular pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Pesquisador colaborador do Laboratório de Fisiologia Vegetal do Centro de Biotecnologia da UFRGS. Professor PEBII de Ciências do Ensino Fundamental de Canoas (RS).

Leandro Marcio Moreira Biólogo. Especialista em Biologia Molecular Aplicada pela Universidade São Judas Tadeu. Mestre e Doutor em Bioquímica pelo Instituto de Química da Universidade de São Paulo (IQ-USP). Professor-associado das disciplinas Bioquímica e Biologia Molecular, do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP).

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Genética Molecular Básica | Dos Genes aos Genomas  ix

Lucymara Fassarella Agnez Lima

Marilis do Valle Marques

Bióloga. Mestre e Doutora em Biologia Genética pela Universidade de São Paulo (USP). Pós-Doutorado em Genética pela Universitat de Barcelona. Professora Titular da disciplina Genética do Departamento de Biologia Celular e Genética da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).

Bióloga. Doutora em Bioquímica pela Universidade de São Paulo (USP). Professora-associada do Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo (ICB-USP).

Luis Eduardo Aranha Camargo

Biólogo. Mestre e Doutor em Genética pelo Instituto de Bio­ ciências da Universidade de São Paulo (IB-USP). Professorassociado de Microbiologia do Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da USP (ICB-USP).

Engenheiro florestal. Mestre em Fitopatologia pela Universidade de São Paulo (USP). PhD em Genética e Melhoramento de Plantas pela University of Wisconsin (EUA). Professor-associado de Fitopatologia no Departamento de Fitopatologia e Nematologia da USP.

Luis Eduardo Soares Netto Biólogo. Doutor em Bioquímica pela Universidade de São Paulo (USP). Professor Titular da disciplina Proteínas: Estrutura, Função e Biologia Celular, do Departamento de Genética e Biologia Evolutiva do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo (IB-USP).

Luiz Mors Cabral Biomédico. Mestre e Doutor em Bioquímica pelo Instituto de Bioquímica Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Professor adjunto da disciplina Bioquímica e Biologia Celular, do Departamento de Biologia Celular e Molecular da Universidade Federal Fluminense (UFF).

Marcelo Boareto do Amaral Físico biológico. Doutor em Física pela Universidade de São Paulo (USP). Pós-Doutorado pelo Departamento de Biosistemas, Ciência e Engenharia (BSSE) do Instituto Federal de Tecnologia de Zurique (ETH Zürich).

Marcos Antonio de Oliveira Biólogo. Mestre em Genética e Evolução pela Universidade Federal de São Carlos (UFSCar). Doutor em Genética e Biologia Molecular pela Universidade Estadual de Campinas (Unicamp). Professor Doutor de Genética e Biologia Molecular do Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista (Unesp).

Marcos Roberto Chiaratti Zootecnista. Especialista em Genética Mitocondrial pela Universidade de São Paulo (USP). Doutor em Fisiopatologia Médica pela Universidade Estadual de Campinas (Unicamp). Professor adjunto III da disciplina Biotecnologia Animal e Biologia Molecular, do Departamento de Genética e Evolução da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar).

Maria Carolina Marchetto Bióloga. Mestre e Doutora em Microbiologia pela Universidade de São Paulo (USP). Cientista (staff scientist) do Laboratory of Genetics do Salk Institute for Biological Sciences (La Jolla, CA, EUA).

Maria Rita Passos-Bueno Bióloga. Mestre e Doutora em Genética Humana pelo Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo (IB-USP). Professora Titular da disciplina Genética Humana, do Departamento de Genética e Biologia Evolutiva do IB-USP.

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Mário H. Barros

Napoleão Fonseca Valadares Farmacêutico e bioquímico. Doutor em Física Biomolecular pela Universidade de São Paulo (USP). Pós-Doutorado pela USP. Professor adjunto da disciplina Bioquímica e Biofísica, do Departamento de Biologia Celular da Universidade de Brasília (UnB).

Nathalia de Setta Costa Bióloga. Mestre e Doutora em Genética pela Universidade Estadual Paulista (Unesp). Professora adjunta da disciplina Genética do Centro de Ciências Naturais e Humanas da Universidade Federal do ABC (CCNH-UFABC).

Patricia Ashton-Prolla Médica. Residência em Genética Médica no Hospital das Clínicas de Porto Alegre. Doutora em Ciências Biológicas pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Membro Titular da Sociedade Brasileira de Genética Médica (SBGM). Professora adjunta do Departamento de Genética da UFRGS.

Patricia Izetti Médica. Residência no Serviço de Radio-oncologia do Instituto Nacional de Câncer (INCA). Doutora em Genética e Biologia Molecular pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRS).

Pedro A. F. Galante Cientista molecular. Doutor em Bioquímica e Biologia Molecular pelo Instituto de Química da Universidade de São Paulo (IQ-USP). Pesquisador sênior do Hospital Sírio-Libanês.

Regina Lúcia Baldini Bióloga. Mestre em Genética pela Universidade Estadual de Campinas (Unicamp) e Doutora em Bioquímica pela Universidade de São Paulo (USP). Professora-associada do Departamento de Bioquímica do Instituto de Química da Universidade de São Paulo (IQ-USP).

Ricardo De Marco Químico. Doutor em Bioquímica pelo Instituto de Química da Universidade de São Paulo (IQ-USP). Livre-docência pelo Instituto de Física de São Carlos da Universidade de São Paulo (IFSC-USP). Professor-associado do Departamento de Física e Ciência Interdisciplinar do IFSC-USP.

Richard Charles Garratt Bioquímico. Mestre e Doutor em Cristalografia pela University of London. Pós-Doutorado e Livre-docência pela

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x  Genética Molecular Básica | Dos Genes aos Genomas Universidade de São Paulo (USP – campus São Carlos). Professor Titular do Departamento de Física e Ciência Interdisciplinar do Instituto de Física de São Carlos da Universidade de São Paulo (IFSC-USP).

Roberto Dalto Fanganiello Biólogo. Doutor em Genética Humana pelo Departamento de Genética da Universidade de São Paulo (USP) e pelo Department of Orthopaedics and Rehabilitation da Yale University (EUA). Pós-Doutorado em Medicina Regenerativa e Bioengenharia de Tecidos pela USP.

Robson Francisco de Souza Cientista molecular. Mestre em Biotecnologia e Doutor em Bioquímica pela Universidade de São Paulo (USP). Professor Doutor de Microbiologia Básica e Bioinformática no Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da USP (ICB-USP).

Rodrigo da Silva Galhardo Biólogo. Mestre em Biofísica pela Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Doutor em Microbiologia pela Universidade de São Paulo (USP). Professor Doutor do Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da USP (ICB-USP).

Rogerio Margis Biólogo. Mestre em Bioquímica pelo Instituto de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Doutor em Biologia Molecular e Virologia Vegetal pela Université Louis Pasteur de Strasbourg. Professor-associado do Departamento

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de Biofísica e do Centro de Biotecnologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS).

Sandro José de Souza Biólogo. Doutor em Bioquímica pela Universidade de São Paulo (USP). Pós-Doutorado pela Universidade de Harvard. Professor Titular da disciplina Bioinformática no Instituto do Cérebro e no Bioinformatics Multidisciplinary Environment da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).

Tatiana Teixeira Torres Bióloga. Doutora em Genética e Biologia Molecular pelo Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp). Professora-assistente da disciplina Genética do Departamento de Genética e Biologia Evolutiva do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo (IB-USP).

Veridiana Munford Bióloga. Mestre e Doutora em Microbiologia pelo Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo (ICB-USP). Especialista em Laboratório no Departamento de Microbiologia do ICB-USP.

Welington Luiz de Araújo Biólogo. Mestre e Doutor em Agronomia (área: Genética e Melhoramento de Plantas) pela Universidade de São Paulo (USP). Professor-associado das disciplinas Biologia Molecular (Biomedicina) e Microbiologia (Química Ambiental, Engenharia Ambiental e Nutrição) no Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da USP (ICB-USP).

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Apresentação Este projeto nasceu da falta de livros em português na área de Biologia concebidos por pesquisadores brasileiros. Existem excelentes exemplos de obras traduzidas, principalmente de autores norte-americanos e europeus, mas a contribuição de nossos professores e cientistas é sempre marginal nessas edições. Enfrentamos o desafio por cerca de 5 anos, na expectativa de obter um livro que, além de conversar com o leitor sobre a genética molecular, pudesse conter mensagens que importassem diretamente para o nosso país. O objetivo era abranger os temas básicos em Genética, sem deixar de apresentar a história das descobertas e o desenvolvimento dessa ciência. A partir daí buscamos entre os melhores pesquisadores especialistas aqueles que pudessem contribuir, abraçando o desafio. Cada um desses autores empenhou-se ao máximo, e o resultado permite que o leitor, estudante ou profissional qualificado, aprenda os conceitos básicos sobre Genética ou se aprofunde em temas mais específicos. É importante ressaltar que nestes últimos anos testemunhamos mudanças profundas na Ciência que demandaram dos autores atualização permanente para que o livro resultasse em uma fonte precisa na área da Genética e Biologia Molecular. Esta obra é destinada principalmente a alunos de graduação que desenvolvem seus estudos nas diferentes áreas de Ciências da Vida (Biológicas, Médicas, Farmácia, Veterinária e Agronomia), mas pode ser útil também aos curiosos – jornalistas, historiadores, comunicadores, entre outros – que simplesmente buscam entender como a Genética tem avançado ou como vem mudando a sociedade desde os primeiros estudos de Mendel em meados do século 19. Nos 25 capítulos que compõem esta obra, a Genética é apresentada da maneira mais completa possível, alcançando os avanços atuais de profunda influência na sociedade. O livro mostra como em apenas 60 anos, a partir da descoberta da estrutura da molécula de DNA na década de 1950, a engenharia genética se desenvolveu, fazendo surgir a clonagem, a identificação do funcionamento dos primeiros genes e a era dos genomas e da biologia sintética. A leitura da sequência nucleotídica do genoma humano, em grande parte graças ao desenvolvimento da Bioinformática, possibilitou a compreensão de diversas doenças humanas diretamente relacionadas a problemas genéticos, hereditários ou não. A obra apresenta ainda de que maneira é possível usar esse conhecimento para interferir diretamente no genoma humano, com benefício para a saúde, por meio das terapias genética e celular. O que fica evidente é que as perspectivas de aplicação da genética em questões da sociedade são extremamente promissoras, graças, principalmente, a conhecimentos básicos envolvendo o funcionamento do gene, sua distribuição nos cromossomos, a regulação da expressão gênica, de moléculas de RNA não codificantes e até mesmo a evolução dos genes humanos. Ressalta-se também a descoberta de que partes do genoma consideradas “lixo” são geradoras de diversidade e adaptação em condições de adversidade. Sem dúvida, é por causa desse conhecimento básico que hoje temos à disposição uma série de ferramentas e estratégias que nos permitem sonhar longe em termos de terapias: entregas gênicas nas células humanas, reprogramação de células diferenciadas em células pluripotentes e edição do genoma de qualquer organismo para benefício da sociedade. Todas essas estratégias são abordadas neste livro, assim como a organização da vida celular na Terra e sua evolução. Nesse sentido, compreender a Genética é fundamental para sermos capazes de conservar e restaurar a diversidade biológica que nos rodeia. Esperamos que este livro possibilite ao leitor não apenas aprender conceitos importantes, como também despertar sua curiosidade sobre como ocorre a apreensão do conhecimento na área. Que se abram novas questões nas mentes, principalmente dos jovens, de modo que seu espírito criativo estimule sua vontade de fazer ciência. Que o espírito crítico seja aguçado pela leitura deste livro e que o leitor identifique o valor do conhecimento básico e das pesquisas para o progresso e a justiça social. Carlos F. M. Menck e Marie-Anne Van Sluys

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Prefácio

É com entusiasmo que saúdo o livro Genética Molecular Básica | Dos Genes aos Genomas. Este novo empreendimento da Editora Guanabara Koogan destina-se a estudantes e profissionais da área de saúde que desejam imergir nos conceitos e nas aplicações da Biologia Molecular. Esta obra é relevante por dois aspectos principais. Primeiro, temos de destacar a qualidade do trabalho e o envolvimento de conceituados pesquisadores brasileiros na elaboração dos capítulos. Segundo porque o mercado editorial investiu na produção de material nacional de qualidade, não limitando-se à tradução de obras de outros países. Carlos Menck e Marie-Anne Van Sluys, dois respeitáveis pesquisadores brasileiros, organizaram este compêndio de maneira encadeada, sem deixar de lado o aspecto autônomo dos capítulos para aqueles que buscam o conhecimento de algum tópico específico. As quatro primeiras partes fornecem os conceitos fundamentais de biologia e genética molecular. Escritos por pesquisadores atuantes nas respectivas áreas, os capítulos oferecem uma visão clara, objetiva e atualizada do que é relevante em cada tópico. A leitura é agradável, tornando estimulante o aprendizado dos temas. A quinta parte do livro apresenta a genômica em toda sua extensão, desde as técnicas de manipulação dos genes, passando pelas metodologias de alta performance (high throughput) para a análise de genomas e pelo tratamento de dados usando bioinformática, até os genomas de organelas e os RNA não codificantes. O conjunto deixa claro a complexidade do genoma e quais ferramentas estão disponíveis para sua elucidação. A sexta parte do compêndio indica aplicações da biologia molecular moderna na área da saúde, com foco na abordagem de doenças genéticas e câncer, apresentando dois capítulos sobre células-tronco e terapia gênica, que são perspectivas terapêuticas concretas para um futuro próximo. Por fim, o último capítulo do livro apresenta a grande perspectiva que se abre com a biologia sintética e aborda a evolução de genes e genomas. Com certeza este trabalho será um instrumento importante para estudantes de Medicina, Farmácia, Biologia, Biomedicina, Veterinária e Agronomia, mas também para alunos de outras áreas do saber e profissionais que almejam um conhecimento atualizado e qualificado em genética molecular e suas aplicações. Samuel Goldenberg Biólogo. Doutor em Biologia Molecular pela Université Paris Diderot. Pós-Doutorado pelo Institut Pasteur. Pesquisador Titular do Laboratório de Regulação da Expressão Gênica do Instituto Carlos Chagas da Fundação Oswaldo Cruz do Paraná (ICC-Fiocruz).

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Sumário

Parte 1 | Introdução�����������������������������������������������������������������������1

Parte 5 | Era da Genômica������������������������������������������������������� 195

1 Histórico das Descobertas | De Mendel às Análises dos Genomas���������������������������������������������������������������������3

1 Manipulando o Gene | Técnicas de Biologia Molecular���197 1 12 Genômica | A Revolução na Análise dos Genes�����������������223 13 Transcriptômica e Proteômica��������������������������������������������������243 14 Como Desvendar Dados Biológicos com a Bioinformática�����������������������������������������������������������������������������261 15 Genoma de Organelas | Cloroplastos e Mitocôndrias�����291 16 Mundo dos RNA Não Codificantes������������������������������������������321 17 Genoma Móvel | Mecanismos de Transposição e Impacto Evolutivo�������������������������������������������������������������������������335

Parte 2 | Estrutura, Transmissão e Manutenção da Informação Hereditária.........................................................17 2 Dupla-hélice do DNA e Variedade de Estruturas do RNA������������������������������������������������������������������������������������������������ 19 3 Perpetuando a Informação Genética | Processos de Replicação do DNA���������������������������������������������� 39 4 Reparo e Recombinação de DNA | Instabilidade do Genoma������������������������������������������������������������� 65 5 Nucleotídeos Traduzidos em Aminoácidos | Polipeptídeos, Motivos Estruturais, Domínios e Suas Funções��������������������������������������������������������������������������������� 89 Parte 3 | Expressão do Gene��������������������������������������������������� 115 6 Transcrição e Regulação Gênica����������������������������������������������117 7 Tradução do Código Genético | Processo de Síntese Proteica�����������������������������������������������������133 Parte 4 | Conceito do Gene����������������������������������������������������� 151 8 Uso de Organismos-modelo na Genética����������������������������153 9 Anatomia do Genoma de Eucariotos�������������������������������������167 10 Organizando os Genes em Cromossomos���������������������������179

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Parte 6 | Genética Médica������������������������������������������������������� 355 8 Mecanismos de Doenças Genéticas���������������������������������������357 1 19 Identificação de Mecanismos Causadores de Doenças Genéticas Humanas���������������������������������������������������375 20 Ciclo Celular������������������������������������������������������������������������������������387 21 Genética do Câncer����������������������������������������������������������������������407 22 Células-tronco e Terapia Celular����������������������������������������������433 23 Terapia Gênica | Interferência no Genoma��������������������������443 24 Biologia sintética | Encontro da Engenharia com a Biologia Molecular�����������������������������������������������������������471 Parte 7 | Evolução do Gene����������������������������������������������������� 487 25 Evolução de Genes e Genomas������������������������������������������������489 Índice Alfabético����������������������������������������������������������������������� 505

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Histórico das Descobertas | De Mendel às Análises dos Genomas Carlos F. M. Menck e Marie-Anne Van Sluys

Este capítulo oferece um relato histórico das grandes descobertas científicas que se iniciaram no s­ éculo 19 com os experimentos com ervilhas de Mendel, e que tiveram avanços fantásticos no ­século 20. A construção do conhecimento que resultou na identificação do ácido desoxirribonucleico (DNA) como material genético e na proposição da sua estrutura de dupla-hélice é a base para a atual explicação do processo de herança genética. A determinação do modo como o fluxo gênico ocorre na célula e a capacidade de manipulação genética têm tido grandes impactos na ciên­cia moderna, o que, por si só, explica o grande número de descobertas, que foram reconhecidas com vários prêmios Nobel.

Genética e sociedade O papel da herança genética sempre despertou fascínio no ser humano, e as descobertas relacionadas com os genes e genomas de organismos sempre tiveram grande impacto na sociedade em geral. A herança genética e o papel dos genes não explicam somente a determinação das características dos indivíduos, mas também questões abstratas, como a origem da vida e o parentesco entre macacos e seres humanos. A capacidade de manipulação genética realizada nas últimas décadas possibilitaram desenvolvimentos tecnológicos fantásticos que nos influenciam diretamente, em par­ticular na alimentação e na saú­de. Alguns desses avanços são considerados polêmicos, como o desenvolvimento de organismos transgênicos, a clonagem de animais e de seres humanos, as células-tronco de embriões, o que amplia ainda mais as discussões que permeiam a sociedade. Entretanto, é evidente para a sociedade em geral que os benefícios proporcionados por essas descobertas e pelos avanços tecnológicos são mais amplos que as polêmicas levantadas. Diferentes nomes têm sido utilizados para identificar a ciên­cia que estuda o gene: tecnologia do DNA recombinante, genética molecular, biologia molecular, biotecnologia, genômica etc. Essas diferentes denominações de certo modo mostram o alcance multidisciplinar dessa ciência, que apesar de mostrar enorme potencial aplicado, é fruto de esforços acadêmicos com pesquisas científicas com objetivos, em geral, apenas básicos. Grande parte das descobertas relatadas neste livro foi possível pela simples curiosidade do ser humano em compreender o mundo que o cerca, e, par­ticularmente, o fenômeno da vida. Mesmo que aparentemente recentes, estas constituem, de fato, a evolução passo a passo do conhecimento produzido nos últimos 150 anos. Para citar apenas um dos ramos em que a genética afeta de modo vital a sociedade, podemos afirmar que os avanços nessa ciên­cia estão nos aproximando de mais uma revolu-

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ção na ­área da saú­de. O desenvolvimento da Medicina nos últimos ­séculos resultou no aumento da expectativa de vida e na redução da perda de vidas humanas em escala sem precedentes na História. A expectativa atual é que a capacidade de interferir no genoma celular possa se tornar realidade em processos de terapia na Medicina. Sem dúvida, o simples avanço nas fronteiras do conhecimento da fisiologia celular tem resultado em soluções para a melhoria da saú­de em termos gerais. Entretanto, novas e promissoras abordagens de terapias gênica e celular surgem para ampliar o espectro de ferramentas que possam ter grandes implicações na saú de humana. Neste capítulo serão descritos os principais fatos históricos da ciên­cia que possibilitaram a evolução do conhecimento de como os organismos transmitem suas características hereditárias e as bases que definiram o conceito do gene e do genoma.

A herança segundo Mendel e a descoberta do ácido nucleico por Miescher Duas descobertas fundamentais e concomitantes ocorreram no fim do ­século 19 em locais muito próximos: a menos de 1.000 km de distância. Os pesquisadores responsáveis por esses trabalhos não tinham nenhum contato, e certamente não havia condições de saber que rea­li­zavam trabalhos muito relacionados e que formaram a base do que conhecemos hoje como genética. Em 1864, o monge austría­co Gregor Mendel identificou que a herança de caracteres de ervilhas seguiam padrões bastante definidos, ao que chamou de “fatores”, e também definiu alelos. Mendel trabalhou principalmente na horta da Abadia de São Tomé, em Brno, na atual República Checa. Com seus resultados, determinou as leis da hereditariedade (Figura 1.1) que, porém, foram ignoradas até início do ­século 20, depois de sua morte, quando seu trabalho foi redescoberto e os fatores batizados “genes”. Próximo dali, na Basileia, Suí­ ça, em 1869, o bioquí­mico suí­ço Johann Friedrich Miescher

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4  Parte 1  ❖ Introdução

A

Ervilhas lisas e rugosas

Ervilhas verdes e amarelas

Posição das flores axiais ou terminais

B Parental AA

Vagens verdes e amarelas

aa

Geração F1 Aa Autofecundação

Geração F2 Flores violeta e branca

AA

Aa

Aa

aa

Figura 1.1 A. Principais caracteres estudados em cruzamentos de ervilhas por Mendel. B. Exemplo de um padrão de herança observado por ele.

interessava-se em estudar o núcleo de células com o emprego inicialmente de linfócitos e, posteriormente, de esperma de salmão (no qual 90% da célula é constituído pelo núcleo). Nesses núcleos ele encontrou uma substância branca, ácida, rica em fósforo, que chamou de “nucleí­na” (Figura 1.2). Vinte anos depois (1889), seu aluno Richard Altmann denominou essa substância de ácido nucleico, que constitui as moléculas de DNA e RNA.

Moscas ajudam a revelar o padrão de herança Logo após a redescoberta dos trabalhos de Mendel, o zoó­logo americano Thomas Hunt Morgan se interessou em demonstrar que os padrões de herança também ocorrem em animais. Como modelo de estudo, trabalhou com as pequenas moscas de fruta, conhecidas como drosófilas. Em 1910, Morgan encontrou um mutante em suas drosófilas, com os olhos brancos, considerando que as moscas selvagens têm olhos vermelhos. Por meio de cruzamentos, pôde determinar que se tratava de um alelo recessivo, mas que era encontrado apenas em machos, ou seja, era um traço de herança ligado ao sexo. Isso fez com que propusesse que o gene responsável pelos olhos brancos (que ele denominou gene white) encontravase em um dos cromossomos sexuais (cromossomos X e Y) da drosófila (Figura 1.3). Vários outros mutantes espontâneos foram encontrados por Morgan e seus alunos, e o estudo da herança dessas mutações fez com que seu grupo identificasse pro-

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Detergentes Esperma de salmão Extrato celular +HCl

Proteínas

Nucleína

Figura 1.2 Miescher isolou o material nuclear a partir de células de timo (linfócitos T) e, posteriormente, de esperma de salmão. À substância branca, ácida, rica em fosfato, obtida do núcleo dessas células, deu o nome de nucleína.

cessos de recombinação cromossômica e mapeasse os genes nos cromossomos das drosófilas. Esse trabalho que demonstrou que os cromossomos são portadores dos genes levou Morgan a receber o Prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina em 1933. O impacto do trabalho de Morgan foi enorme, e vários de seus alunos rea­li­zaram pesquisas científicas de destaque, que,

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Capítulo 1  ❖  Histórico das Descobertas | De Mendel às Análises dos Genomas  5

DNA eram relativamente bruscas, de modo que essa molécula parecia ser muito pequena, o que também não correspondia ao que se esperava dos genes. As proteí­nas, ao contrário, eram sabidamente moléculas grandes e suficientemente complexas (compostas de 20 aminoácidos diferentes) e, portanto, as principais candidatas a guardar a informação genética. Em 1928, o médico e microbiologista inglês Frederick Griffith começou a virar essa página ao estudar a atividade patogênica de duas linhagens (uma lisa, virulenta; e outra rugosa, não virulenta) de uma mesma bactéria causadora de pneumonia: a Streptococcus pneumoniae. Na busca de uma vacina para essa doen­ça, seu trabalho consistia em testar a capacidade de essas linhagens causarem doen­ças em camundongos (Figura 1.5). Ele observou que bactérias lisas com uma cápsula polissacarídea não causariam a doen­ça se fossem previamente fervidas (porque isso ocasionava a lise das bactérias ao criar um extrato bacteriano). Contudo, quando esse extrato era misturado com bactérias rugosas, que normalmente não causavam a doen­ça, originava bactérias virulentas, ou seja, que causavam a doen­ça, resultando na morte dos camundongos. Uma observação interessante é que bactérias lisas eram recupe­radas dos camundongos mortos, o que indicava que as bactérias rugosas eram transformadas em bactérias lisas. Por esse motivo, Griffith interpretou seus dados como resultado da incorporação de um “princípio transformante”, de um modo desconhecido, para as bactérias inicialmente não virulentas. De fato, estudos poste-

posteriormente, também receberam o Prêmio Nobel. Um desses alunos foi o americano Hermann Joseph Muller, que estudou o efeito de raios X na indução de mutações em drosófila. Em 1926, Muller conseguiu demonstrar que havia correlação entre as doses de radiação e a indução de mutações nessas moscas, o que o levou a manifestar sua preocupação sobre os perigos desses raios para o ser humano. Afinal, o que ocorre em moscas pode servir de exemplo para seres humanos! Pelo trabalho de provar que raios X podem induzir mutações genéticas, Muller recebeu o Prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina em 1946.

Genes de bactérias e bacterió­fagos são compostos por DNA No início do s­éculo 20, os cromossomos foram definidos como portadores dos fatores de herança, os chamados genes, e iniciou-se uma busca para se identificar quimicamente o gene. Em 1929, a composição quí­mica dos ácidos nucleicos foi identificada como constituída por nucleo­tídeos, com fosfato, ribose e bases nitrogenadas, pelo americano Phoebus Aaron Levene. Esse pesquisador chegou a propor a estrutura definida de tetranucleo­tí­deos para o DNA considerando as quatro bases que compõem essa molécula (Figura 1.4). No entanto, essa estrutura parecia muito regular e simples e, por isso, incapaz de codificar algo tão complexo como o que deveria ser o gene. Além disso, as tecnologias da época para purificação do

A

Fêmea com olhos vermelhos

Macho com olhos brancos (mutante)

F1 todos com os olhos vermelhos

B

Fêmea com olhos brancos (mutante)

Macho com olhos vermelhos

F1 fêmeas com os olhos vermelhos e machos com os olhos brancos

Fêmea

Macho

XX

XY 2n = 8

Figura 1.3 Ao encontrar moscas com olhos brancos (e, mais tarde, outros mutantes) em sua população de moscas drosófila, Morgan identificou o padrão de herança desse caráter, que, no entanto, estaria ligada aos cromossomos sexuais (A). Os oito cromossomos de drosófila estão demonstrados em XX e XY representam os cromossomos sexuais (B).

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6  Parte 1  ❖ Introdução

NH2

riores revelaram que a virulência resulta da síntese da cápsula de polissacarídeos que protegem as bactérias do sistema imunológico do camundongo. Sem essa cápsula, as bactérias não causam a doen­ça, como na linhagem não virulenta. A substância responsável pelo “princípio transformante” ficou desconhecida por mais de uma década, porém havia expectativa (que se mostrou correta posteriormente) de que essa substância fosse o material genético em si, o que, se acreditava na época, deveria ser composto de proteí­na. O bió­logo Oswald T. Avery (nascido no Canadá, porém com parte da sua trajetória científica vivida nos EUA) se interessou dCMP NH2 N

NH

dGMP

N O

O

O

O

O O

dTMP

O

H 2N

HN

O

N

N

O

O

N

O

O P

P

O

N

P

O

O O

O

O

O

O O

N

O P O

N

N

N

O

dAMP

Figura 1.4 Estrutura proposta por Levene para o tetranucleotídeo, que seria o principal componente do DNA. Ele havia desvendado a estrutura da ribose, desoxirribose e da ligação fosfodiéster, que são os componentes do que Levene chamou de nucleotídeo. A simplificação de tetranucleotídeos repetida na molécula de DNA, no entanto, estava errada, mas ajudou na compreensão da estrutura do DNA.

por esse princípio transformante e o mistério da herança. Após mais de uma década de trabalho, ele e seus colegas Colin M. MacLeod e MacLyn McCarthy conseguiram purificar, com base no extrato de bactérias lisas (virulentas), um material que mantinha a capacidade transformante. Para obter essa fração, eles conseguiram hidrolisar a cápsula de polissacarídeos com uma enzima e, por meio de um fracionamento com clorofórmio e posterior precipitação com álcool, obtiveram uma substância branca fibrosa que mantinha o princípio transformante. Essa substância era resistente a proteases ou a ribonucleases, enzimas que clivam proteí­nas e moléculas de RNA. Por outro lado, a substância e a atividade transformante eram destruí­das pela enzima desoxirribonucleotidase (DNAse), que degrada especificamente a molécula de DNA. Esse resultado foi publicado em 1944 e surpreendeu a comunidade científica da época, porém foi seguido de ceticismo do verdadeiro impacto desse trabalho em termos de genética. Havia ainda a ideia de que proteí­nas deveriam constituir os genes, ao passo que o DNA (apenas um “tetranucleo­tídeo”) deveria ter função apenas estrutural nos cromossomos. Vários pesquisadores ainda cogitavam que a preparação purificada por Avery e seus colegas teria proteí­nas contaminantes. Outros pesquisadores, como Joshua Ledeberg e Edward Tatum (que demonstraram o processo de conjugação entre bactérias em 1946), valorizaram o experimento de Avery e seus colegas ao provarem que o princípio transformante como início da genética molecular é o DNA. Avery foi também negligenciado pela Fundação Nobel, apesar de ter sido indicado algumas vezes para receber o Prêmio Nobel, sem sucesso. Em 1952, os americanos Alfred D. Hershey e Martha C. Chase estudaram vírus que infectam bactérias (bacterió­fagos T2) muito simples, contendo somente proteí­nas e DNA como componentes, porém capazes de se reproduzir e lisar as bactérias infectadas. Com experimentos elegantes, Hershey e Chase demonstraram que apenas a molécula de DNA viral era necessária e suficiente para a reprodução dos bacterió­fagos ao produzir novas partículas virais (Figura 1.6). O capsídeo proteico era totalmente dispensável para o processo de reprodução e, portanto, de herança viral. Na época desse trabalho, a restrição da comunidade científica

Tipo R não virulenta

Tipo S virulenta

Tipo S após fervura

Tipo R + Tipo S após fervura

Animal vive Não se recupera bactéria

Animal morre Recupera-se bactéria Tipo S

Animal vive Não se recupera bactéria

Animal morre Recupera-se bactéria Tipo S

Figura 1.5 De cepas virulentas e não virulentas de Streptococcus pneumoniae, Griffith identificou que existiria um princípio transformante que promoveria mudanças nas características herdadas das bactérias. Em 1944, Avery et al. identificaram essa substância como o DNA.

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2

Dupla-hélice do DNA e Variedade de Estruturas do RNA Luis Eduardo Soares Netto e Marcos Antonio de Oliveira

O ácido desoxirribonucleico (DNA) é composto de dois polímeros (duas cadeias) de nucleo­tídeos arranjados de maneira oposta (antiparalela). Os nucleo­tídeos são as unidades básicas do DNA, constituí­dos por fosfato, 2’-desoxirribose e quatro tipos de bases nitrogenadas. A se­quência das bases nitrogenadas ao longo das duas cadeias de DNA contém a informação genética. A estrutura das duas cadeias é helicoidal, com as bases nitrogenadas orientadas para o interior da molécula, de acordo com modelo elaborado por Watson e Crick. As bases das duas cadeias interagem entre si por pontes de hidrogênio, e a adenina emparelha com a timina, a guanina com a citosina. O ácido ribonucleico (RNA) é de cadeia simples e, como o DNA, é um polímero de nucleotídeos no qual o açúcar é substituído pela ribose e a base nitrogenada timina é substituída por uracila. As estruturas de DNA com muitas ligações não covalentes estabilizadoras são compatíveis com uma molécula armazenadora da informação genética. Em contraste, as estruturas das moléculas de RNA mais variáveis entre si e menos estáveis são compatíveis com funções múltiplas, como transportador da informação genética, estrutural, catalítica e regulador da expressão gênica.

Introdução Com a revelação de que o DNA é a matéria-prima dos genes, como descrito no capítulo anterior, despertou-se um grande interesse na identificação da estrutura desse ácido nucleico, culminando no modelo da dupla-hélice do DNA de Watson e Crick, como descrito a seguir. Mais de 60 anos após a elaboração do modelo da dupla-hélice, ele con­ti­nua válido e fornece pistas sobre processos como replicação e transcrição do DNA. Desse modo, todos os genes têm praticamente a mesma estrutura tridimensional; as diferenças estão relacionadas principalmente com a se­quência das quatro bases nitrogenadas, com propriedades relativas à informação genética. Por outro lado, o RNA, apesar de ser quimicamente muito semelhante ao DNA, apresenta grandes diferenças em sua estrutura e propriedades físico-quí­micas, as quais, por sua vez, estão relacionadas à grande versatilidade de funções celulares que esse ácido nucleico desempenha (desde o transporte de informação genética e a catálise de reações, conhecidas há bastante tempo, até o controle da expressão gênica). Em razão dessa versatilidade, o RNA tem sido proposto como a macromolécula primordial no processo de origem da vida.

Composição química do DNA Para compreendermos a estrutura do DNA, é necessário inicialmente conhecer sua composição química. De fato, James Watson e Francis Crick propuseram o modelo da dupla-hélice, em 1953, tomando como base uma série de informações que incluíam a composição química do DNA. Na verdade, os ácidos nucleicos foram primeiramente identificados em células de sangue e depois, em 1871, em esperma de salmão pelo suíço Friedrich Miescher. À substância ácida que ele encontrou

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como predominante no núcleo dessas células denominou “nucleína” e, mais tarde, “ácido nucleico”. Posteriormente (1929), o lituano Phoebus Aaron Levene caracterizou quimicamente essa substância e identificou quatro nucleotídeos distintos, com as bases adenina, guanina, citosina e timina. De fato, a molécula de DNA é um polímero desses quatro nucleotídeos formados por três componentes químicos: (1) fosfato; (2) um açúcar de cinco carbonos, denominado desoxirribose; e (3) uma base nitrogenada. Os quatro tipos de nucleotídeos variam de acordo com a base nitrogenada, que pode ser adenina, guanina, citosina ou timina. Com relação ao fosfato e à desoxirribose, os quatro nucleotídeos são idênticos entre si (Figura 2.1). Para melhor compreender como se dão as reações entre os componentes dos nucleotídeos, é importante numerar os átomos de carbono que fazem parte da desoxirribose e das bases nitrogenadas (as numerações das quatro bases nitrogenadas estão apresentadas na Figura 2.1). Para diferenciar a numeração das bases nitrogenadas, os átomos de carbono da desoxirribose são apresentados com algarismos seguidos de primo (1’, 2’ e assim por diante). O prefixo “desoxi” referente ao açúcar do DNA decorre do fato de seu carbono 2’ não apresentar um grupo hidroxila e, portanto, estar desprovido de um átomo de oxigênio. Como se verá, esse fato que parece ser um pequeno detalhe químico tem grande reflexo nas propriedades e estabilidades desses dois ácidos nucleicos. Duas das quatro bases nitrogenadas apresentam dois anéi­s aromáticos e são derivadas quimicamente de uma substância denominada purina. São estas: a adenina (6-amino purina) e a guanina (2-amino-6-hidroxipurina) (Figura 2.1 A e B). As outras duas bases são compostas de um único anel aromático e são derivadas da pirimidina: a citosina com modificações nas posições 2 e 4 (2-ona-4-amino-pirimidina) e a timina com

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20  Parte 2  ❖  Estrutura, Transmissão e Manutenção da Informação Hereditária

Base nitrogenada Adenina (A)

Bases púricas

NH2

N 7

6

5 4

8 9 N

N

1 2

A 3 N

Guanina (G)

O

5’ CH2 O

O

4’

O

A

O

1’

H 3’

Fosfato

OH

5 6

Citosina (C)

4’

O

3 N

N

H

NH

1’

H 3’

Desoxirribose

OH B

4

3 2

C 1 N

H 2’ H

Desoxiguanosina

Bases pirimídicas

O CH3

N

Timina (T)

5 6

4

T 1 N

O

O

3 2

H

N O

O

P –

G

1 2

5’ CH2 O

O

H

Desoxiadenosina

O

P –

H 2’

NH2

8

6

O

P –

5 4

9 N

O –

O

N 7

5’ CH2 O

O

4’

O

1’

OH

P –

H 2’

H 3’

C

O

5’ CH2 O

O

4’

O

1’

OH

H D

Desoxicitosina

H 2’

H 3’

H

Desoxitimidina

O CH3

H N 3 T 2 Base nitrogenada 1 O N 4

5 6

OH

O –

O

P –

5’ HO CH2 O

OH

4’

O

1’ H 2’

H 3’

Ácido fosfórico

OH

2H2O

2’-desoxirribose

H

O CH3 5 6

4

T 1 N

3 2

N

H Base nitrogenada O

O –

O

P –

O

O

5’ CH2 O 4’

1’

H 3’ OH

E

Ligação glicosídica

H 2’ H

Nucleotídeo (dTMP)

Figura 2.1 Estrutura quí­mica dos quatro nucleotídeos, unidades básicas do DNA: (A) adenilato; (B) guanilato; (C) citidinilato e (D) timidinilato. O açúcar é chamado de desoxirribose porque o carbono 2’ não apresenta uma hidroxila como açúcar mais comum, a ribose. E. Ligação glicosídica entre base nitrogenada (timina) e 2’-desoxirribose; e ligação éster entre fosfato e 2’-desoxirribose envolvidas na manutenção do desoxirribonucleotídeo, unidade básica do DNA.

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22  Parte 2  ❖  Estrutura, Transmissão e Manutenção da Informação Hereditária H

OH

2’ H

3’ H

1’

O–

4’ O CH2 5’

N

O

P –

O

O CH2 5’ H

1’

HN

N

1’

H

H 3’

O CH 2 5’

O

H CH3 2’

o

H fat ibo

P

r xir

O

N

O

N

o let

N

H 2’

1’

H

e qu Es

N

O O

P –

O

O

N

O

N

P

O

O

C

N NH

O–

4’ O CH 2 5’

HN H

G

H

3’ H

O

1’

H 3’

O 2’ H

O

4’

O

O

P

H

5’ CH2 O

de

so

H

N

O –

NH

O

N

A

N

T

O–

4’

O

1’

3’ H

o

H

2’ H

N

fat

O

s

H

N

4’

os ef

O

G

N

O

P

N

5’ CH2 O

O

P –

H

N

O O

N

C

H

N

O

fos

H 2’

H 3’

O–

4’

N O

5’ CH2 O 4’

O

1’

se bo irri ox es od

O

O

3’ H

t ele qu Es

N

H 2’ H

CH3

N

A

O

T

HN

O

P

N

O HN H

O

H

N

H

O

5’ CH2 O 4’

1’ H 2’

H 3’ OH

H

Figura 2.2 Estrutura do polímero de nucleotídeos. Ligações fosfodiéster unem os diferentes nucleotídeos da mesma cadeia. Pontes de hidrogênio entre uma purina (adenina ou guanina) e uma pirimidina (timina ou citosina) estabilizam a união dos polímeros de nucleotídeos em uma dupla-hélice. Tabela 2.2 Composição de bases nitrogenadas de vários organismos. Origem

Mol % de bases Adenina

Razões Guanina

Citosina

Timina

Adenina/Timina

% Guanina/Citosina

Guanina/Citosina

Vírus ΦX174

24,0

23,3

21,5

31,2

0,77

1,08

44,8

Milho

26,8

22,8

23,2

27,2

0,99

0,98

46,1

Polvo

33,2

17,6

17,6

31,6

1,05

1,00

35,2

Galo

28,0

22,0

21,6

28,4

0,99

1,02

43,7

Rato

28,6

21,4

20,5

28,4

1,01

1,00

42,9

Humano

29,3

20,7

20,0

30,0

0,98

1,04

40,7

Dados obtidos de Chargaff (1952), e tabela adaptada de Bansal (2003). Uma característica interessante desses dados é que a quantidade de adenina é semelhante à de timina, e a de guanina à da citosina. Essa característica, conhecida como uma das regras de Chargaff, foi crucial para Watson e Crick chegarem a seu modelo de dupla-hélice do DNA encontrado como quase verdade na maioria dos casos. Qualquer desvio significativo a essa regra (como em ΦX174) sugere que o DNA em questão é simples fita.

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26  Parte 2  ❖  Estrutura, Transmissão e Manutenção da Informação Hereditária mesmo modo, timina e citosina são derivadas de pirimidinas, que também apresentam grupos ceto e amino. Esses grupos quí­micos estão sob equilíbrio tautomérico amino-imino ou ceto-enólico, o que altera a capacidade de as respectivas bases nitrogenadas interagirem com outras bases nitrogenadas por meio de pontes de hidrogênio (ver Figura 2.7). Os equilíbrios tautoméricos estão bastante deslocados para os tipos amino e ceto, e correspondem às estruturas descritas na Figura  2.1 e comumente apresentadas em artigos científicos e livros-texto. A formação de grupos imino e enol durante a replicação é uma das causas de erro na produção de novas moléculas de DNA. É interessante notar que, antes de 1953, quando Watson e Crick publicaram o modelo da dupla-hélice, não era amplamente conhecido que as bases nitrogenadas se encontram predominantemente como ceto e amino. Assim, a descoberta sobre as formas tautoméricas predominantes foi pré-requisito para elaboração do modelo da dupla-hélice criado por Jerry Donohue, um colaborador de Watson e Crick e especialista em estruturas de pequenas moléculas orgânicas como bases nitrogenadas.

Características globais da dupla-hélice do DNA Vamos agora analisar características globais da dupla-hélice do DNA, tomando como base o modelo descrito por WatsonCrick e denominado “forma B”. Fibras de DNA assumem essa conformação quando estão na presença de um contraíon com um metal alcalino, como sódio (Na+), e com umidade relativa Amino H

Imino H

H

N 5 6

A

4

N

C 1 N

3 2

N

5 6

O

Esqueleto ribose fosfato

8

9 N

B

6

G 3 N

1 2

3 2

C 1 N

H

O 5 4

H

4

N O

Esqueleto ribose fosfato

Ceto

N 7

N 7

H

N N

H H

Esqueleto ribose fosfato Doador de H

8

9 N

Enol O

5 4

6

G 3 N

1 2

N N

H H

Esqueleto ribose fosfato Aceptor de H

Figura 2.7 O equilíbrio de tautômeros das bases nitrogenadas e pontes de hidrogênio. Os pares de bases nitrogenadas estão em equilíbrio, o que altera o emparelhamento entre elas. A. Tautomerismo aminoimino. B. Tautomerismo ceto-enólico. As setas vermelhas representam os sítios doadores de hidrogênio, ao passo que as setas azuis representam os sítios receptores de átomos de hidrogênio. Como pode ser observado, os tautômeros apresentam diferentes grupos doadores e receptores de átomos de hidrogênio.

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superior a 92%. Embora seja difícil fazer considerações sobre a variedade biológica do DNA, muita atenção tem sido dada ao tipo B, já que seu padrão de difração de raios X é muito semelhante ao obtido de DNA em espermatozoides. No tipo B, a dupla-hélice é voltada para a direita, de acordo com a regra do polegar. Isso se aplica quando se aponta os polegares das mãos esquerda e direita para cima com os demais dedos dobrados, conforme descrito na Figura 2.8. Considere inicialmente a mão direita. Encaixe o polegar no eixo principal da dupla-hélice e observe que é possível percorrer a espiral de qualquer uma das duas fitas com os outros quatro dedos. Esse procedimento não funcionará se você utilizar a mão esquerda, o que indica que o tipo B do DNA é voltado para a direita. Ainda no tipo B, cada par de bases que representa um degrau da escada está torcido sobre o par inferior por aproximadamente 36°. Assim, considera-se que uma estrutura com o empilhamento de dez pares de bases corresponde a uma torção de 360°, e, portanto, a uma volta completa da dupla-hélice (ver Figura 2.4). Como conse­quência dessa geometria, a molécula de DNA tem dois sulcos assimétricos (ver Figura 2.4 B), sendo um é menor que o outro. Essa assimetria é resultado da configuração geométrica das ligações entre o esqueleto de fosfato – açúcar e as bases nitrogenadas por meio das ligações glicosídicas que forçam as bases nitrogenadas a assumirem ângulos de aproximadamente 120°. Ou

A

B

Figura 2.8 Determinação da direção da volta de hélices. A direção da volta do DNA é dada pelo teste do polegar. Imagine o polegar no centro da dupla-hélice. A direção se dá pela mão que possibilita executar o caminho da hélice: direita (A) e esquerda (B).

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Capítulo 2  ❖  Dupla-hélice do DNA e Variedade de Estruturas do RNA  27

DNA A

DNA B

Sulco menor

Sulco menor

B

Sulco maior

A

até aqui. Por exemplo, sob umidade mais baixa, as fibras do DNA podem apresentar o tipo A, que tem maior número de pares de bases (11 pares no tipo A contra 10,5 pares no tipo B) a cada volta de 360°. Como consequência, o tipo A tem um diâmetro maior que o tipo B. Como o B, o A também está voltado para a direita. De maneira geral, o tipo A parece mais compacto que o B (Figura 2.9). O sulco maior do tipo A é mais profundo e mais estreito que a estrutura correspondente no B, o que deve dificultar a sua interação com proteínas. Por outro lado, o sulco menor do tipo A é mais largo e raso que o sulco menor do tipo B. É muito difícil imaginar o significado biológico desses tipos do DNA, já que essa molécula está altamente compactada nas células, interagindo com múltiplas proteínas. De qualquer modo, especula-se que o

Sulco maior

Sulco maior

Sulco menor

seja, se as bases nitrogenadas se projetassem do esqueleto em ângulos de 180° não seria esperada a formação de sulcos com tamanhos distintos. Um aspecto funcional relacionado aos sulcos maior e menor é que nessas regiões as bases nitrogenadas podem estar mais expostas, o que possibilita interações com proteínas que reconhecem sequências específicas e que podem, por exemplo, regular a transcrição de genes. Nesse sentido, é esperado que, no sulco maior, as bases nitrogenadas estejam mais expostas que no sulco menor, tornando possível que as proteí­nas interajam seletivamente de acordo com sequências específicas presentes nessas regiões. Em diferentes condições físico-químicas, o DNA pode assumir outras configurações distintas do tipo B descrito

C

DNA Z

Figura 2.9 Características de diferentes tipos de duplas-hélices de DNA. São apresentados os tipos de DNA no tipo A (A), no B (B) e no Z (C). Os três apresentam características topológicas distintas, mas o A é mais compacto e o Z mais alongado (em relação ao tipo B), o que resulta em notáveis diferenças nos sulcos menor e maior. Os tipos A e B são duplas-hélices de giro direito (destrógiro), ao passo que o tipo Z apresenta giro de mão esquerda (levógiro). Os átomos estão representados em CPK (C = cinza, O = vermelho, N= azul e P= laranja). Os códigos de acesso do pdb para o DNA A, DNA B e DNA Z são 28DN, 2BNA e 2IE1, respectivamente.

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28  Parte 2  ❖  Estrutura, Transmissão e Manutenção da Informação Hereditária tipo A do DNA pode ser importante em determinados complexos de DNA-proteína e de DNA-RNA. Eventualmente, algumas sequências de DNA no tipo B podem transitar para o tipo Z, que é uma alteração mais radical que a descrita anteriormente. A diferença mais evidente é a mudança de orientação da volta à direita para a volta à esquerda. Regiões do DNA que apresentam resíduos de purinas alternados com resí­duos de pirimidinas são mais suscetíveis a sofrer essas transições entre o tipo B e o tipo Z. Essa transição é possível por causa da rotação do resíduo de purina da conformação anti da ligação glicosídica para a posição syn (Figura 2.10). No DNA tipo B, a ligação glicosídica está sempre na conformação anti e voltada para a direita. Já no DNA tipo Z, a unidade repetitiva fundamental é um dinucleotídeo purina-pirimidina, com a ligação glicosídica na conformação anti para as pirimidinas e syn para as purinas. Essa alteração na conformação das ligações glicosídicas confere uma aparência de zig-zag ao tipo Z do DNA, daí o uso da letra Z. Além disso, o DNA em Z aparece mais alongado, com 12 pares de bases por volta (ver Figura 2.9). Um resumo das características das três conformações de DNA descritas aqui está apresentado na Tabela 2.3. O significado biológico do tipo Z, assim como de A e B, é de difícil interpretação, dada a complexidade da cromatina nas células. De qualquer modo, tem sido sugerido que o Z ocorre durante a transcrição de genes, e a função desse tipo seria absorver parte do superenrolamento do DNA, como descrito a seguir. N 7 8 O –

O

P –

O

Em termos estruturais, devem ser considerados níveis de organização hierárquicos superiores à dupla-hélice descrita. Com frequência, ela é caracterizada como uma estrutura secundária do DNA em analogia à alfa-hélice e às estruturasbeta de proteí­nas. Do mesmo modo, essa estrutura secundária (dupla-hélice) pode se organizar espacialmente em topologias mais ou menos compactadas (o termo topologia aqui equivale à estrutura terciária em proteínas). Assim como alfa-hélices e estruturas-beta se organizam espacialmente em diferentes estruturas terciárias, a dupla-hélice do DNA pode se organizar especialmente em diferentes topologias. Inicialmente considera-se o caso de uma molécula de DNA cujas extremidades não estão livres, mas covalentemente ligadas entre si, formando uma estrutura circular que é comumente encontrada em bactérias. De fato, os genomas da maioria das bactérias estão organizados em um único cromossomo, que é uma molécula única e circular de DNA, além de pequenos plasmídeos, que também são moléculas circulares. Nesses casos, a dupla-hélice pode dobrar-se sobre si própria para formar topologias denominadas superenroladas (supercoiling), que podem adotar conformações mais compactas (Figura 2.11A e B). Isso é muito similar ao que ocorre quando se tem um fio de telefone enrolado sobre si próprio (Figura 2.11 C). Para estudar essas topologias, vamos inicialmente definir alguns parâmetros topológicos derivados da geometria. O pri-

NH2 5 4

6

A 3 N

1 2

NH2 N

5’ CH2 O

N

O –

4’

O

O

1’

H 3’ OH

A

9 N

A dupla-hélice do DNA pode apresentar topologias diferentes

P –

H 2’

O

H

O

6

1 2

5

A4 3 N

B

9 N

8

5’ CH2 O 4’

1’

H 3’ OH

Desoxiadenosina anti

N 7

H 2’ H

Desoxiadenosina syn

Figura 2.10 Possíveis conformações da base nitrogenada em relação à desoxirribose. A. Conformação anti da base nitrogenada em relação a 2’-desoxirribose. Essa conformação é a mais frequente no DNA em B, e é importante para que o emparelhamento das bases ocorra. B. Conformação syn encontrada muitas vezes no DNA no tipo Z. Tabela 2.3 Comparação das propriedades estruturais dos tipos A, B e Z do DNA. Propriedades

Tipos de dupla-hélice Tipo A

Tipo B

Sentido de rotação da dupla-hélice

Direito

Direito

Esquerdo

Tipo Z

Número de pares de bases por volta de 360º

11

10,5

12

Comprimento de um par de bases

2,6Å

3,4 Å

3,7 Å

Diâmetro da hélice

25,5 Å

23,7 Å

18,4 Å

Conformação glicosídica

anti

anti

Alternando anti e syn

Grau de inclinação por volta da hélice

25,3 Å

35,4 Å

45,6 Å

Inclinação do par de bases com relação ao eixo principal 19° da dupla-hélice

Sulco maior

Largo com profundidade intermediária

Achatado

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Estreito e muito profundo

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3

Perpetuando a Informação Genética | Processos de Replicação do DNA Luiz Mors Cabral, Adriana Silva Hemerly e Hana Paula Masuda

A replicação do ácido desoxirribonucleico (DNA) é um evento crucial para que as células se multipliquem e se perpetuem. A cada divisão celular, todo o genoma da célula precisa ser duplicado. Isso implica na existência de controles que garantam que o DNA da célula seja replicado correta e completamente, no momento certo, e apenas uma vez a cada divisão ou ciclo celular. Neste capítulo, são descritos os processos gerais que culminam na duplicação do DNA, as proteí­nas e os mecanismos moleculares q ­ ue atuam nesse processo e como ele é regulado tanto em bactérias quanto em eucariotos. Modificações e alternativas do modelo básico de replicação do DNA, bem como a replicação do DNA organelar, também são brevemente abordados.

Introdução A regulação da replicação do DNA é um evento essencial para que as células dos organismos vivos se multipliquem e se perpetuem. Toda vez que células se dividem e dão origem a novas células, o genoma precisa ser duplicado correta e completamente, de modo que as células-filhas tenham o mesmo material genético das células que as originaram e passem a informação contida sem erros. Além disso, a cada ciclo celular, todo o DNA de uma célula deve ser duplicado apenas uma vez e, posteriormente, o DNA duplicado deve ser dividido igualmente em duas células-filhas.

Esses dois eventos ocorrem em momentos diferentes do ciclo celular: em bactérias, a replicação do DNA ocorre no perío­do conhecido como replicação (Perío­do C; Figura 3.1 A), com a posterior segregação das moléculas de DNA e formação de duas células-filhas (Perío­do D; Figura 3.1 A). Em eucariotos, a replicação do DNA ocorre ao longo da fase S (fase de síntese do DNA), e a segregação das fitas do DNA replicado durante a fase M (mitose) (Figura 3.1 B). As fases S e M são antecedidas de intervalos denominados G1 e G2 (do inglês Gap1 e Gap2), respectivamente, que são fases preparatórias necessárias para que o DNA seja corretamente duplicado Segregação do nucleoide

Período B Nascimento

Período C (replicação) Início

Alongamento

Período D Terminação

Divisão

A

G1 B

S

G2

M G1

Figura 3.1 Divisão celular em células procarió­ticas e eucarió­ticas. Todo o genoma nu­clear é replicado apenas uma vez a cada ciclo celular. A. Ciclo celular de uma bactéria de crescimento lento com três perío­dos bem definidos: perío­dos B, C e D. Adaptada de Haeusser e Levin, 2008. B. Ciclo celular de uma célula eucarió­tica dividido em quatro fases: G1, S, G2 e M.

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40  Parte 2  ❖  Estrutura, Transmissão e Manutenção da Informação Hereditária (fase G1) ou para que a segregação do DNA duplicado ocorra sem problemas (fase G2). A operação perfeita desse ciclo (G1  S  G2  M  G1...) é importante não apenas para a manutenção da viabilidade dessas células, mas também para prevenir ou evitar instabilidade genética, que pode levar, por exemplo, à formação de tumores.

Replicação semiconservativa do DNA Quando James D. Watson e Francis Crick desvendaram a estrutura de dupla-hélice com fitas antiparalelas do DNA, em 1953, a pergunta seguinte foi: “Como o DNA é duplicado?” A replicação do DNA poderia ocorrer de três maneiras possíveis: semiconservativa, conservativa ou dispersiva (Figura 3.2). No modelo de replicação semiconservativa, cada nova molécula de DNA seria composta por uma fita de DNA original (ou parental) e uma fita recém-sintetizada (fita nova), de modo que cada DNA duplicado teria uma fita nova e uma fita parental. No modelo de replicação conservativa, a molécula de DNA parental seria formada por duas fitas parentais e a nova molécula de DNA formada seria composta por duas fitas completamente novas, recém-sintetizadas. Finalmente, no modelo de replicação dispersiva, parte da molécula de dupla fita de DNA seria composta por fitas parentais e parte por fitas

Conservativo

novas. Assim, as moléculas-filhas seriam compostas parte por fitas parentais e parte por fitas novas recém-sintetizadas. Em 1958, apenas 5 anos após a estrutura do DNA ser desvendada, os pesquisadores Matthew Meselson e Franklin W. Stahl determinaram qual das três hipóteses descritas seria o modelo correto da replicação do DNA. Para isso, eles precisavam encontrar uma maneira de saber qual era a fita parental e qual era a fita recém-sintetizada. Para resolver esse problema, eles cresceram culturas da bactéria Escherichia coli em um meio contendo 15N, um isótopo do nitrogênio mais pesado (Figura 3.3). Após crescer as bactérias por várias gerações em meio rico em 15 N, seu DNA ficou mais denso porque as bases nitrogenadas haviam incorporado o isótopo de nitrogênio mais pesado. A densidade do nitrogênio pôde ser determinada utilizando-se a técnica denominada Centrifugação por Gradiente de Densidade. Nesse experimento, eles usaram uma solução de cloreto de césio (CsCl) contendo DNA bacteriano. Essa solução foi ultracentrifugada por várias horas até chegar o momento em que o equilíbrio entre a força centrífuga e a difusão do CsCl foi atingido. Como resultado, a solução de CsCl fica mais concentrada no fundo do tubo e menos concentrada no topo. O DNA dissolvido nessa solução forma uma banda à determinada altura do tubo onde sua densidade é igual à densidade da solução de

Semiconservativo

Dispersivo

Figura 3.2 Modelos propostos para explicar a replicação do DNA: modelo conservativo, semiconservativo e modelo dispersivo.

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Capítulo 3  ❖  Perpetuando a Informação Genética | Processos de Replicação do DNA  41 E. coli crescendo em meio contendo 15N

15

N

Transferência para meio contendo 14N

14

15

14

N

14

14

N

N 14

N

N

Crescimento de E. coli em meio contendo 14N

N

DNA isolado de células é misturado a um tubo com solução de CsCl (densidade 1,7) e levado à ˜ centrifugação DNA leve (14N-14N) DNA híbrido (14N-15N) DNA pesado (15N-15N)

CsCl mais concentrado no fundo do tubo devido à sua “sedimentação” durante a centrifugação A 14

Antes da transferência DNA 15N

N-14N

15

N-14N

15

N-15N Gerações 0 0,3 0,7

Uma geração depois da transferência DNA híbrido 15N-14N

1,0 1,1 1,5

Duas gerações depois da transferência DNA 14N e híbrido 15N-14N

1,9 2,5

Quatro gerações depois da transferência DNA 14N

B

3,0 4,1 0 e 1,9 misturados 0 e 4,1 misturados

Figura 3.3 Experimento de Meselson e Stahl para determinar o modo de replicação do DNA. A. Meselson e Stahl cresceram bactérias por várias gerações em um meio contendo 14N e depois transferiram para um meio contendo 15N. O DNA das bactérias foi submetido a uma ultracentrifugação em solução de CsCl. Os resultados obtidos por eles estão representados em B, que mostra fotografias dos tubos iluminados com luz ultravioleta. As bandas escuras correspondem ao DNA marcado com 15N (bandas à direita), DNA marcado com 14N (bandas à esquerda) e bandas in­ter­me­diá­ rias mostrando a replicação semiconservativa do DNA (Meselson e Stahl, 1958). Adaptado de Allison, 2007.

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Capítulo 3  ❖  Perpetuando a Informação Genética | Processos de Replicação do DNA  43 E. coli (OriC) 5’

3’

3’

13 mer

A

13 mer

13 mer

9 mer

9 mer

9 mer

9 mer

5’

9 mer 3’

ATTTATPuTTTT 5’ 3’

B3

B2

B1

A TAAATAPyAAAA

B

Helicase

3’

Forquilha de replicação

5’

A Pol α:Primase

5’

3’ 5’ Topoisomerase

Pol α:Primase

Figura 3.4 Origem e forquilha de replicação em E. coli (A) e leveduras (B). A. Esquema da origem de replicação OriC do cromossomo circular da bactéria E. coli. B. Esquema da origem de replicação da levedura S. cerevisiae. As origens de replicação de leveduras são compostas pelo elemento A, essencial para o recrutamento de proteí­nas que irão iniciar a replicação, e elemento B.

origens e que já, possivelmente, estão mais relacionadas com a estrutura do DNA do que com se­quências específicas. A existência de muitas origens de replicação no genoma de eucariotos torna possível uma flexibilização na escolha das origens e em qual momento elas serão ativadas. Como cromossomos de eucariotos têm muitas origens de replicação, nem sempre essas mesmas origens são utilizadas pela célula em um mesmo ciclo celular. Isso possibilita que ciclos celulares distintos possam usar somente algumas origens de replicação para controlar a replicação de determinada região do DNA. Por exemplo, na mosca D. melanogaster, foi mostrado que as origens de replicação usadas durante as fases iniciais do desenvolvimento embrionário não são usadas por células maduras.

Proteí­nas iniciadoras e licenciamento das origens de replicação A primeira etapa da replicação do DNA requer proteí­nas iniciadoras que reconheçam e se liguem a se­quências específicas do DNA. Essa interação determina a localização das origens de replicação, ou seja, onde a replicação do DNA deve se iniciar. Essas proteí­nas iniciadoras (ou proteí­nas que reconhecem a origem) têm duas funções importantes: (1) reconhecer e se associar à origem; e (2) guiar outras proteí­nas replicativas até essas origens para que a atividade de helicase inicie a separação das fitas de DNA. As origens de replicação nos diversos grupos de organismos são reconhecidas por um complexo de várias proteí­nas iniciadoras específicas e distintas. Apesar dessa fase da replicação do DNA apresentar par­ticularidades na forma de regulação em cada organismo, a dinâmica do processo é semelhante. Normalmente, o reconhecimento e a ativação de uma origem de replicação ocorrem de maneira sequencial: inicialmente uma ou mais proteí­nas iniciadoras reconhecem e se ligam a se­ quências de DNA na origem de replicação, atraindo, sequencialmente para o local, as outras proteí­nas do complexo.

Em procariotos | OriC de E. coli Em E. coli, pelo menos nove proteí­nas diferentes participam da etapa de início da síntese de DNA, formando um complexo pré-replicativo (Figura 3.5). O reconhecimento da OriC é rea­

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li­zado por um grupo de proteí­nas iniciadoras denominadas DnaA, que se associam aos cinco sítios de 9 pb. Esse complexo com aproximadamente 20 proteí­nas de DnaA é envolvido pelo DNA e, na presença de ATP, a DnaA se liga às repetições de 13 bp, estimulando a separação das fitas do DNA nessa região. Quando essas repetições estão abertas, o processo segue para a etapa seguinte, atraindo as proteí­nas de replicação: a DNA helicase DnaB e seu cofator DnaC. São formados dois complexos DnaB-DnaC, cada um contendo um monômero de DnaC associado a um hexâmero de DnaB. Ao se ligar, DnaB-DnaC desloca a DnaA das repetições de 13 pb. DnaC hidrolisa ATP, liberando cada hexâmero DnaB associado a uma forquilha de replicação, para se mover e atuar como helicase, separando as fitas de DNA bidirecionalmente. Duas outras proteí­nas participam dessa etapa de abertura do DNA: a DNA girase (topoisomerase II), que alivia a torção das fitas de DNA causadas pelo desenrolamento, e as SSB (do inglês, Single-Stranded DNA Binding protein), que se ligam às fitas simples de DNA, estabilizando as fitas separadas. A proteí­na HU, que tem a atividade topoisomerase, altera a topologia do DNA e estimula a formação da forquilha de replicação. Cada DnaB também ativa uma DnaG primase, que sintetiza os RNA iniciadores para a etapa de síntese do DNA. Há evidências que indicam que a RNA polimerase também está envolvida na etapa de início da síntese de DNA. Uma possibilidade seria que RNA transcritos que terminassem em uma origem funcionariam como RNA iniciadores, fornecendo o 3’-OH para a DNA polimerase III atuar. Outra possibilidade é que o processo de transcrição, que também requer separação das fitas de DNA, auxiliaria no início da replicação mudando localmente a estrutura do DNA. Mas como uma origem é usada para iniciar a replicação somente uma vez a cada ciclo celular? No caso da OriC, esse controle se dá pela metilação da adenina na posição N6  de seus sítios GATC presentes nas repetições de 13 pb, nas duas fitas do DNA, pela enzima Dam metilase (Figura 3.6). Após a replicação do DNA, a nova fita sintetizada não é metilada, ao passo que a fita antiga está metilada, o que resulta em um DNA hemimetilado. A origem OriC hemimetilada é detectada pela proteí­na SeqA que se liga aos sítios GATC, reduzindo a taxa de metilação desse sítio pela Dam metilase. Além disso, quan-

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44  Parte 2  ❖  Estrutura, Transmissão e Manutenção da Informação Hereditária 5’

3’ Monômeros de DnaA se 5’ ligam às repetições de 9 pb

3’ 13 mer

13 mer

13 mer

9 mer

9 mer

9 mer

9 mer

9 mer

5’ 3’ DnaA se liga às repetições de 13 pb 5’ 3’ 5’ 3’ As fitas de DNA se separam nas repetições de 13 pb 5’ 3’ 5’ 3’ DnaB/DnaC se juntam ao complexo formando a forquilha de replicação 5’ 3’

DnaA

DnaB

DnaC

Figura 3.5 Associação sequencial de proteí­nas na origem de replicação levando à abertura da dupla fita de DNA em E. coli. A ligação de proteí­nas DnaA às repetições de 9 pb e 13 pb aproxima essas duas re­giões e promove a abertura da dupla fita de DNA nas repetições de 13 pb. DnaB/DnaC se juntam ao complexo, formando a forquilha de replicação. Adaptada de Watson et al., 2008.

do associada à OriC, a SeqA previne a associação da DnaA, evitando o reinício de um novo ciclo de replicação. Dessa forma, uma origem de replicação hemimetilada não pode ser usada para iniciar a síntese do DNA, garantindo, assim, que o processo ocorra apenas uma vez a cada ciclo celular. Outros fatores podem também controlar o reinício da síntese do DNA. A remetilação do DNA das origens não ocorre imediatamente após a replicação do DNA. Como as origens hemimetiladas se ligam à membrana celular, é possível que fiquem inacessíveis à ação das metilases. Além disso, o promotor da DnaA hemimetilado está em uma forma reprimida, reduzindo os níveis dessa proteí­na que é essencial para o reconhecimento e ativação das origens.

Em eucariotos Nos eucariotos, as origens de replicação são reconhecidas por um grupo de seis proteí­nas chamadas de complexo de reconhecimento da origem (do inglês, origin recognition complex – ORC). As proteí­nas que formam o ORC são denominadas Orc1 a Orc6, segundo ordem decrescente de tamanho, sendo Orc1 a maior delas. Após se ligarem à origem de replicação, o complexo ORC serve como âncora para a associação sequencial de proteí­nas de replicação. As proteí­nas Cdc6 (do inglês, cell division cycle 6) e Cdt1 são as próximas a se ligarem, possibilitando a associação subsequente de um complexo de seis

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proteí­nas que formam um anel ao redor do DNA, chamadas de MCM (MCM2-7), do inglês, minichromosome maintenance proteins (Figura 3.7). Além de participarem da ativação das origens, as MCM con­ti­nuam a atuar na forquilha de replicação, possivelmente contribuindo para a atividade  de helicase que separa as fitas de DNA, com papel análogo ao da helicase DnaB de E. coli. As proteí­nas iniciadoras Cdc6 e Cdt1 funcionam de modo semelhante à proteí­na de E. coli DnaC, auxiliando na associação das helicases MCM próximas às origens de replicação. Esse conjunto de proteí­nas, associado às origens de replicação, forma o complexo pré-replicativo (pré-RC) em eucariotos. Apesar da dinâmica da formação do pré-RC ser muito semelhante entre os organismos eucariotos, a regulação de sua ativação visando garantir que cada origem se replique apenas uma vez por ciclo celular é distinta entre diversos organismos. Em leveduras, a origem ARS é reconhecida pelo complexo ORC, que se liga aos sítios A e B1 em um processo que requer ATP (Figura 3.7 A). O fator de transcrição ABF1 se liga ao sítio B3 e auxilia o início da replicação. As proteí­nas ORC são cruciais para o reconhecimento das origens e ficam associadas a elas durante todo o ciclo celular. Tanto Cdc6 quanto Cdt1 são necessários para a associação subsequente de MCM às origens. Em leveduras, Cdt1 e MCM2-7 formam um complexo estável e são recrutados concomitantemente às origens. A hidrólise de ATP por Cdc6 estimula a associação de forma estável de MCM à cromatina e é seguida da dissociação de Cdc6 e Cdt1. Dessa

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5’ 3’ 5’

3’

5’

3’

H

H

H

H

N

NH N

3’ 5’

5’ 3’

5’

3’ Adenina metilada no N6 nas duas fitas do DNA

Adenina metilada no N6

OH

H

OH O

N

N

3’

5’

Figura 3.6 Metilação em OriC garante a replicação do DNA apenas uma vez por ciclo celular em procariotos. As adeninas das origens de replicação encontram-se metiladas (asteriscos vermelhos) nas duas fitas do DNA, o que torna possível o início da replicação do DNA. Após a replicação, a fita nova sintetizada não apresenta metilação, evitando uma nova rodada de replicação. A enzima Dam metilase metila a fita nova, dando início a um novo ciclo celular.

Adenina metilada no N6 somente em uma das fitas do DNA

N

Dam metilase

N

NH2

5’

3’

Período C (replicação)

Período B

H

3’

Período D

H

OH Adenina

H

H

H

OH O

5’

Adenina metilada no N6 nas duas fitas do DNA novamente

3’

5’

Divisão

N

N

CH3

Capítulo 3  ❖  Perpetuando a Informação Genética | Processos de Replicação do DNA  45

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Capítulo 3  ❖  Perpetuando a Informação Genética | Processos de Replicação do DNA  47 Origem de replicação

5’

3’

3’

5’ ORC2 ORC6

5’

ORC3 ORC5

ORC1 ORC4 3’

ORC1-6

3’

Origem de replicação sem proteínas replicativas

5’

ORC1-6

Complexo ORC reconhece as origens de replicação

Cdt1 Cdc6 Cdc6 ORC1-6

5’

Cdt1

3’ Cdc6

ORC1-6 Cdt1

3’

Cdc6 e Cdt1 se ligam a ORC nas origens de replicação

5’

MCM2-7 Pré-RC 5’ 3’

Cdc6 ORC1-6 MCM2-7 Cdt1 Cdc6 ORC1-6 MCM2-7 Cdt1

3’ 5’

Cdc6 é fosforilada e é exportada para fora do núcleo

Pi Cdc6 5’ 3’

3’

ORC1-6 MCM2-7 Cdt1

Cdc45 Pré-IC

MCM2-7 ORC1-6 Cdt1

GINS

Cdt1

MCM2-7 3’

Pi

RPA

3’ MCM2-7

ORC1-6

DNA pol

3’

Cdc45 GINS

DNA MCM2-7 pol

5’

GINS Cdc45

ORC2 ORC6

5’

5’

Cdc45 ORC1-6 GINS

5’

Ligação de Cdc6 e Cdt1 à ORC recruta proteínas MCM formando o complexo pré-replicativo

ORC3 ORC5

Pi ORC1

GINS Cdc45

Cdc45 e GINS e outras proteínas acessórias do início da replicação são recrutados e Cdc45 e GINS se ligam a MCM

ORC1 é fosforilada e é direcionada para degradação ou é exportada para os centrossomos

ORC4

DNA pol MCM2-7

Cdt1 é fosforilada e é direcionada para degradação ou é inativada pela interação com geminina

3’ 5’

As RPA se ligam às fitas simples de DNA, estabilizando-as As DNA polimerases são recrutadas e começa a replicação do DNA

B

Figura 3.7 (Continuação) Iniciação da replicação do DNA nas origens de replicação de leveduras (A) e mamíferos (B). Após o início da síntese do DNA, ORC se dissocia da origem. A proteína ORC é fosforilada e direcionada para a degradação ou exportada para os centrossomos. Cdc6 também é fosforilada durante a fase S e conduzida para fora do núcleo. Cdt1 é regulada principalmente por degradação e pela interação com a proteína geminina, que a impossibilita de se associar ao pré-RC novamente. Esses mecanismos inviabilizam a formação de novos pré-RC após o início da síntese de DNA, garantindo que o processo ocorra apenas uma vez por ciclo celular.

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