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ÍNDICE Resumo .............................................................................................................................................................................................. 03 1.

Conceitos Básicos da Ciência da Pele ...................................................................................................................................... 03

1.1 Camadas da Pele ................................................................................................................................................................ 04

2.

Tecnologia Transdérmica .......................................................................................................................................................... 05

2.1 Liberação Transdérmica ..................................................................................................................................................... 05

2.2 Nanotecnologia Aplicada à Liberação Transdérmica ............................................................................................................. 06

2.3 Nanotecnologia e Biotecnologia a serviço da sua VIDA ......................................................................................................... 08

3.

BIOLIPÍDEO B2® - Biotecnologia & Nanotecnologia

Aplicada na Biodisponibilidade de Hormônios Transdérmicos .................................................................................................. 09

3.1 Registro de Marca .............................................................................................................................................................. 10

3.2 Patente Nacional ................................................................................................................................................................ 10

3.3 PCT - Patente Internacional ................................................................................................................................................. 10

3.4 Exemplo de Uso Irregular de Propriedade Intelectual & Marcas Registradas........................................................................... 10

3.5 BIOLIPIDEO B2® - Processo de Aquisição da Matéria-Prima ................................................................................................ 10

3.6 BIOLIPIDEO B2® - Processo de Qualificação e Validação da

Nanoestruturação e da Estabilidade do Transdermal Drug Delivery .............................................................................................. 13

3.7 BIOLIPIDEO B2® - Processo de Identificação e Biodisponibilidade

do Fármaco através do Sistema Transdérmico BIOLIPÍDEO B2® .................................................................................................. 14

4.

Resultados – Laudo Gráfico de Permeação & Biodisponibilidade - Conclusão Sobre o BIOLIPÍDEO B2®

quando Aplicado na Reposição Hormonal em Seres Humanos - Estudo Clínico Monocêntrico .................................................. 17

4.1 LSE – a026 - TESTOSTERONA – [AMOSTRA 10.015] ........................................................................................................ 17

4.2 LSE – a027 – BIEST: Estriol & Estradiol – [AMOSTRA 10.016] ............................................................................................ 18

4.3 LSE – a028 – PROGESTERONA – [AMOSTRA 10.017] ....................................................................................................... 18

5.

Nanotechnology in hormone replacement therapy: safe and efficacy of transdermal estriol

and estradiol nanoparticles after 5 years follow-up study ........................................................................................................ 19

6.

Referências Bibliográficas Utilizadas para Realização dos Estudos Clínicos Monocêntricos

Desenvolvidos com BIOLIPÍDEO B2® em Seres Humanos ......................................................................................................... 27

7.

Expertize Científica do Grupo Evidence .................................................................................................................................... 28

6.1 Dra. Dinalva Brito de Queiroz ............................................................................................................................................... 28

6.2 Dr. Marco Botelho .............................................................................................................................................................. 29

8.

Protocolos de Cooperação & Parcerias Científicas ................................................................................................................... 30

9.

Produção Científica ................................................................................................................................................................... 32

10. Prêmios e Participações Científicas .......................................................................................................................................... 37 11. Anexos ...................................................................................................................................................................................... 41


RESUMO O presente trabalho objetivou certificar, a BIOCOMPATIBILIDADE, BIODISPONIBILIDADE, OTIMIZAÇÃO e a EFICÁCIA do Biolipídeo B2®, quando utilizado na reposição hormonal transdérmica em SERES HUMANOS. Determinado material irá esclarecer a tecnologia patenteada aplicada no Biolipídeo B2®, todo o processo de NANOTECNOLOGIA e BIOTECNOLOGIA e as metodologias que comprovam e atestam “IN VIVO” a sua capacidade de veicular e disponibilizar hormônio por via transdérmica com penetração e liberação prolongada certificada através de estudo realizado em seres humanos. Nesse dossiê, para a comprovação das características do Biolipídeo B2®, foram utilizados testes “IN VIVO” e “IN VITRO” reconhecidos internacionalmente pela comunidade científica e reconhecidos e validados nacionalmente pelo INMETRO através da Dimci - Diretoria de metrologia científica e industrial e da Dimat - Divisão de metrologia de materiais garantindo que o produto possui características que conferem reconhecimento nacional e internacional.

1. Conceitos Básicos da Ciência da Pele A PELE Segundo Holbrook (1983), pele é definida como um conjunto de tecidos, com organização estratificada, que reveste o corpo e apresenta componentes estruturais e metabólicos que trabalham em sintonia com o meio ambiente para manter o equilíbrio orgânico. A pele é o maior órgão do corpo humano, ocupando uma área de mais de 1,5m2 de superfície e corresponde, em média, a 10% a 12% do peso corporal (Breathnach, 1975). É um órgão de arquitetura complexa, estratificada horizontalmente em três compartimentos: a epiderme, a derme e a camada subcutânea, com penetrações verticais dos apêndices tais como folículo piloso, glândulas sudoríparas e sebáceas. Como uma fronteira entre o meio ambiente e o corpo, a pele exerce várias funções principalmente a de barreira.

Ao final, poderemos concluir que: 1- Reposição hormonal é um predicado terapêutico medicamentoso e não cosmético ou acessório à saúde e beleza humana, imprimindo e necessitando de muito profissionalismo, competência e experiência. 2- Metodologias científicas e processos comprovados são fundamentais para garantir BIODISPONIBILIDADE, EFICÁCIA TERAPÊUTICA e SEGURANÇA na reposição hormonal transdérmica. 3- A pele tem comprovada função de barreira estando configurada para proteger o nosso organismo de agentes externos. Transportar qualquer substância para dentro do nosso organismo e principalmente para esta tornar-se BIODISPONÍVEL, precisamos sim de tecnologia aplicada para este fim. 4- Biolipídeo B2® é capaz de introduzir hormônio na epiderme viável e derme permitindo e promovendo liberação do fármaco de forma prolongada durante 24hs. 5- Nanotecnonologia e Biotecnologia são fundamentais para desenvolver e ofertar uma proposta TERAPÊUTICA MEDICAMENTOSA segura, eficaz e otimizada. 6- Reposição Hormonal Transdérmica, feita de forma séria, científica e profissional é segura e garante saúde e qualidade de vida para os seus usuários. De outra forma poderá promover danos sérios a saúde ou no “melhor” dos cenários, não causar o efeito terapêutico e fisiológico desejado.

FUNÇÕES DA PELE Função

Atividade

Barreira funcional

Controle da homeostase

Controle de temperatura Controle da temperatura corporal a todo momento. Melanina e queratina

Protege o DNA contra agressão solar

Função sensorial

Múltiplos terminais nervosos que levam a informação do meio externo ao cérebro.

Metabolismo

Exemplo: síntese de vitamina D

Função imunológica

Células especiais para a resposta imunitária

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1.1 CAMADAS DA PELE

orgânica que o produto precisa adaptar-se para transpassar e ter acesso ao meio viável e sistêmico. A camada externa da pele, a epiderme, é completamente celular, tipicamente composta de um epitélio escamoso estratificado que contem cinco tipos de células histologicamente distintas. Essas células são organizadas em camadas que da superfície para profundidade são: estrato córneo, estrato lúcido, estrato granular, estrato espinhoso e a camada basal. Em especial pela presença do estrato córneo (EC), a epiderme serve como uma barreira que separa o meio externo da homeostase interna (Tzaphlidou, 2004).

A pele pode ser dividida em três componentes principais: a epiderme, a derme e os seus apêndices, e a camada subcutânea. A membrana basal é uma estrutura ondulada que se adere à epiderme, à derme papilar e ajuda a suportar a forma da membrana plasmática das células basais. A camada basal é a mistura heterogênea de células, das quais algumas se dividem e se diferenciam em queratinócitos, enquanto outras funcionam como âncoras. A camada granular é identificadas por densos grânulos de queratoialina. Nesta camada as células nucleadas e com poder de divisão se transformam em células achatadas, anucleadas e compostas quase exclusivamente de uma proteína plástica e resistente chamada queratina. A camada mais superficial, também com células achatadas e anucleadas, é conhecida como estrato córneo.

O EC compreende o estágio final de diferenciação celular epidérmica (Jackson e Elias, 1993). Histologicamente, o EC possui somente 10 a 15 camadas de células, e sua espessura média varia de acordo com a região a ser analisada chegando até 12µm. Esta fina membrana, representada especificamente por células queratinizadas mortas e anucleadas embebidas em uma matriz lipídica, permite a sobrevivência de grande parte dos mamíferos frente aos mais agressivos fatores ambientais (Jackson e Elias, 1993) além de ser uma formidável barreira CONTRA ADMINISTRAÇÃO TÓPICA DE MEDICAMENTOS E PERMEAÇÃO DE MOLÉCULAS DE ATIVOS (Paul et al, 2007). A espessura da epiderme varia de acordo com a área do corpo, por isso a importância de adaptar veículos transdérmicos a cada área sendo estes configurados para seu uso específico. A epiderme não contem vasos sanguíneos. A passagem de nutrientes e a remoção dos detritos são feitas por difusão da derme papilar, que é altamente vascularizada. Aqui fica bem claro que a epiderme exerce um papel fundamental na nossa pesquisa para reposição hormonal transdermica, pois o nosso alvo sistêmico para eficácia do tratamento fica logo abaixo dela, aonde teremos acesso a uma camada altamente vascularizada e com o real potencial de absorver as moléculas de hormônio tornando-as biodisponíveis.

a epiderme

A DERME

O conhecimento e o domínio das características da epiderme, observando cada camada histológica e as suas informações anatômicas e fisiológicas como a sua espessura e a sua composição é de fundamental importância para a reposição hormonal transdérmica, pois este é o primeiro desafio e a primeira barreira

A derme é a camada interna da pele que contem numerosas estruturas embutidas. A extensa vascularização da derme é essencial para regular a temperatura corporal e importante na cicatrização. O rico fluxo de sangue é eficiente na remoção de moléculas que atravessam as camadas externas da pele. Para a

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máxima administração transdérmica de medicamento, esta fonte de sangue mantém um gradiente de resultados otimizando a absorção do farmáco pelo meio sistêmico. É esse gradiente de concentração que fornece a força motriz para permeação da droga. Na área de administração transdérmica, a derme é vista como a água essencialmente gelificada, que fornece uma barreira mínima para a administração de drogas polares (Paul et al, 2007). Dessa forma podemos concluir que a utilização clínica de fármacos por esta via está limitada pela capacidade destes ultrapassarem a barreira da pele. Por exemplo, a baixa eficácia tópica do aciclovir (análogo do nucleosídico purínico sintético, 9-[(2-hidroxi-etoxil)metil]guanina) pode ser atribuída à inadequada permeação deste fármaco antiviral através do estrato córneo até à camada basal da epiderme, isto é, o local das lesões virais. Esta impermeabilidade da pele devido ao estrato córneo afeta também os sistemas transdérmicos desenvolvidos para uma ação sistêmica, podendo causar variações individuais e imprevisíveis da liberação do fármaco a partir de sistemas transdérmicos de, por exemplo, nitroglicerina e estrogênios, entre outros. Ao evoluir a nossa competência até este ponto, percebemos que além do conhecimento aprofundado das características de cada camada da pele temos que também dominar cientificamente a técnica de Liberação Transdérmica e todas as tecnologias envolvidas para otimizar esse processo.

nos tratamentos contra o tabagismo. No Brasil, essa tecnologia começou a ser estudada e aplicada mais amplamente na segunda metade da década de 90. Compreender, melhorar e validar a permeação de ativos farmacêuticos e cosméticos na pele a nível molecular é cada vez mais importante para aperfeiçoar o sistema de administração, liberação transdérmica e a biodisponibilidade dos ativos (Park, 2009). A eficácia clínica de um fármaco aplicado por via transdérmica depende, não só das suas propriedades farmacológicas, mas também da sua biodisponibilidade no local de ação (Loftsson, Olafsson,1998) e para que possamos compreender melhor o comportamento da molécula desses fármacos quando em contato com a pele, é fundamental conhecer integralmente este órgão tão especializado. Através de esforços voltados para pesquisa e desenvolvimento, o Grupo Evidence passou a estudar como romper a epiderme, com a menor perda percentual de ativo, e disponibilizar esse produto na derme, local viável para a absorção sistêmica do fármaco.

2.1 LIBERAÇÃO TRANSDÉRMICA

Conclusão Analisando as duas macro-camadas da pele, podemos concluir com simplicidade e exatidão que, romper a função natural da pele não trata-se de tarefa tão simplória e abstrata isentas de sustentabilidade científica comprovada. Para obter sucesso nessa via de administração, e em qualquer outra proposta terapêutica, é preciso investir em conhecimento, tecnologia, pessoas e processos capazes de, em conjunto, mesclar as suas forças e competências e desenvolver uma produto capaz de ser submetido à análise certificadas e reconhecidas para que comprovem as suas propriedades terapêutica, a sua estabilidade e a sua segurança. Os testes comprobatórios são a única forma de garantir que o veículo proposto está disponibilizando o ativo farmacêutico no seu sitio de ação – Nosso caso o meio sistêmico encontrado na derme.

2. Tecnologia Transdérmica O Transdermal Drug Delivery Technology surgiu nos EUA na década de 50 e em 1979 teve o seu primeiro fármaco autorizado pelo FDA para utilização em humanos. O grande avanço dessa magnífica via de administração de fármacos foi impulsionado pelo sucesso da nicotina transdérmica

O primeiro ponto a ser trabalhado no desenvolvimento de uma proposta adequada de sistema transdérmico de liberação de fármacos é a finalidade de ação do produto podendo esta ter objetivos de ação local ou ação sistêmica. Os objetivos desta última são: evitar administrações repetidas, ter liberação prolongada e manter as concentrações plasmáticas constantes. As vantagens da via transdérmica de administração de fármacos são: - diminuir as variações plasmáticas de fármaco; - diminuir a frequência de administração; - anular a variabilidade da absorção oral; - anular o metabolismo pré-sistémico; - possibilidade imediata de interromper a administração; - e constituir-se em boa alternativa à via intravenosa.

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A Via Transdérmica depende de alguns vetores de sucesso como os abaixo descritos: 1- A função barreira do estrato córneo, o intervalo de tempo entre a administração e o alcançar de concentração terapêutica (lag-time), a possibilidade de irritação local e a possibilidade de desencadear tolerância e/ou resistência constituem, no entanto, os desafios que devem ser superados na via de liberação transdérmica. 2- Os fármacos que são bons candidatos ao desenvolvimento por esta via de administração são muito potentes, não-irritantes, com extensa metabolização hepática, com tempos de meia-vida curtos, que não sofrem metabolismo na pele, que não induzem tolerância e que têm bons coeficientes de partição. 3- Os apêndices da pele apenas constituem 0,1% da superfície desta, que se estima ser a via transdérmica a principal via de permeação de fármacos (Suhonen et al., 1999). Assim, a absorção percutânea via transdérmica envolve a difusão através do estrato córneo, das células viáveis da epiderme e, finalmente, das camadas superiores da derme até à microcirculação. O passo determinante da absorção cutânea é a permeação através do estrato córneo. As proteínas desta camada se constituem de forma descontínua, enquanto que a fase lipídica é contínua. 4- Teoricamente, existem, então, duas vias potenciais de passagem: a transcelular e a intercelular. Contudo, em ambas as vias de permeação a estrutura do estrato córneo obriga o fármaco a se difundir através das bicamadas lipídicas intercelulares. 5- Estudos experimentais indicam que a permeação da maioria dos compostos através da camada córnea é dependente, QUER DA SUA LIPOFILICIDADE QUER DO SEU TAMANHO MOLECULAR (Guy e Hadgraft, 1992; Boddé et al., 1991). Analisando os tópicos acima, concluímos que a liberação transdérmica depende basicamente do domínio do conhecimento sobre a pele e suas camadas, de tecnologia aplicada a formulação e sistema de delivery proposto e da aplicação e emprego de promotores de permeação transdérmicos de fármacos aliados a mecanismos físicos de otimização a nível molecular. E é esse vetor que possibilita o necessário emprego da Nanotecnologia Transdérmica.

2.2 Nanotecnologia Aplicada à Liberação Transdérmica O desenvolvimento da nanotecnologia está impulsionando uma nova revolução tecnológica com significativos impactos nos mais diversos setores da atividade humana. Segundo os princípios da nanotecnologia, controlando-se a estrutura da matéria em escala nanométrica – a bilionésima parte do metro, aproximadamente 50 mil vezes menor que a espessura de um fio de cabelo – é possível conferir novas propriedades e aplicações aos materiais, ou então otimizá-los. 6

Tecidos resistentes a manchas e que não amassam, pinturas de automóveis resistentes a riscos, capeamento de vidro e aplicação anticorrosão em metais, filtros de proteção solar não cancerígenos, tratamentos e drogas transdérmicas, pós antibactérias, diversas aplicações na medicina como cateteres, válvulas cardíacas, marcapassos, implantes ortopédicos, produtos cosméticos, sistema de tratamento de água, microprocessadores e equipamentos eletrônicos em geral já são realidades de aplicações de nanotecnologias. Estima-se que em 2015 o mercado mundial de nanotecnologias movimentará mais de 1 trilhão de dólares. Ciente dessa evolução e participando ativamente desse movimento tecnológico, o Grupo Evidence investe e pesquisa Nanotecnologia desde o final de 2006 e em 2007 assumiu mais uma vez o seu pioneirismo e vanguarda tecnológica, lançando no Brasil o primeiro Sistema de Delivery Transdérmico Nanoestruturado adequado para veicular hormônios, bionutrientes e outros sais farmacêuticos compatíveis a sua estrutura bioquímica.

Entendendo o tamanho e a escala NANO Quando se fala em Nanotecnologia, a primeira coisa a fazer é mudar a escala com a qual se vê o mundo. Não se trata somente de mudar a forma como os olhos vêm às coisas. O que deve ser feito é mudar a maneira como o cérebro trabalha. Assim, essa é a melhor forma de entrar no pequeno grande mundo da nanotecnologia. Dentro do mundo cotidiano – o mundo da macro escala -, para se ter uma ideia crítica, um elefante, uma casa, uma pulga e um tijolo são algo que estão dentro de uma mesma escala de tamanho, ou seja, têm poucas ordens de magnitude de diferença. A ordem de magnitude é expressa em potenciais de 10. Isso significa que, se uma coisa é 10 vezes maior que outra, ela tem uma ordem de magnitude maior. Contundo, existem coisas muito maiores e muito menores que os exemplos apresentados acima.

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Assim, o objeto mais distante que podemos observar está a 1018 centímetros de distância, ou seja, o número 1 seguido de 18 zeros.

1 000 000 000 000 000 000 Por outro lado, a menor coisa existente no universo é conhecida como o comprimento de Planck, equivalente a 4 x 10-35 0, 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 04

Assim, lembrando que cada ordem de grandeza representa uma potência de 10, pode-se dizer que a diferença entre a maior e a menor coisa existente no universo é de 53 ordens de grandeza. De modo geral, o tamanho das coisas envolvidas no nosso diaa-dia está compreendido entre o tamanho de uma pulga e da linha do horizonte, ou seja, cerca de sete ordens de grandeza. Seguem alguns exemplos: • • • • • • •

Uma pulga tem cerca de 5 x 10-2 m. Um lápis tem cerca de 1,3 x 10-1 m. Um elefante tem cerca de 3 m. Um avião ERJ da embraer tem cerca de 23 m. Um campo de futebol tem cerca de 102 m. O prédio mais alto do Brasil, o Edifício Mirante do Vale em SP tem cerca de 170 metros de altura. A linha do horizonte tem cerca de 3 x 104 m.

Trabalhar em escala nano, requer tecnologia e investimento. Até os fenômenos físicos respeitam suas respectivas escalas de tamanho mostrando que existe uma dependência direta entre tamanho e o fenômeno a ser controlado / aplicado.

BOX DE ESCALA DE TAMANHO E FENÔMENOS FÍSICOS CENTÍMETRO

Gravidade, fricção, combustão.

MILÍMETRO

Gravidade, fricção, combustão, eletrostática.

MICRÔMETRO

Eletrostática, Van der Waals, browniano.

NANÔMETRO

Eletrostática, Van der Waals, browniano, quântico.

ANGSTRÖM

Mecânica quântica.

Como demonstrado na tabela acima, ao entrar na escala nanométrica, grande parte dos efeitos estão relacionados com aspectos quânticos, mudando completamente o conhecimento a ser dominado e aplicado, diferente de outras escalas como milímetro e centímetro. Na maioria dos casos, na escala nanométrica não é mais possível distinguir as propriedades químicas e físicas do nanossistemas, as quais dependem fortemente da maneira como os nanossistemas são sintetizados, arranjados e explorados.

Um aspecto que necessariamente deve ser destacado é que atualmente muitas coisas altamente significativas para o nosso mundo ocorrem fora dessa faixa de tamanho. Essas coisas pertencem ao mundo da micro ou da nanoescala. Essa é a escala tecnológica que empregamos e utilizamos no Grupo Evidence para a reposição hormonal transdérmica com o Biolipídeo B2®.

Para desenvolver sistemas nanoestruturados, como o Biolipídeo B2®, é fundamental a união do conhecimento de vários profissionais pesquisadores. Químicos, físicos, especialistas em materiais, engenheiros e biólogos devem trabalhar em conjunto a fim de não só compreender como também utilizar as propriedades dos nanossistemas.

Os prefixos nano, micro, mili, centi são usados para que se possa especificar o fator pelo qual é multiplicada uma determinada grandeza. Na escala Nano ( nm ), o fator de grandeza corresponde a 10-9 do metro, ou seja, um bilionésimo do metro.

Como é possível notar, ao avançar na leitura percebemos que a nanotecnologia não é somente promessa de futuro. Atualmente, existe nanotecnologia permeando quase todo o setor produtivo mundial e o Grupo Evidence oferece essa tecnologia na área de ciências aplicada a vida, saúde e bem estar.

0, 000 000 001m Esse tamanho é aproximadamente 100 mil vezes menor do que o diâmetro de um fio de cabelo, 30 mil vezes menor que um fio de uma teia de aranha ou 700 vezes menor que um glóbulo vermelho. É exatamente nessa escala de tamanho que a nanotecnologia é trabalhada e que os objetos nanotecnológicos, como o Biolipídeo B2® e todo o nosso sistema de reposição hormonal, são concebidos. Nessa mesma escala estão os átomos, as moléculas e o sequenciamento do nosso DNA.

O setor de ciências da vida merece um destaque especial, na medida em que não é só a área dos fármacos que se mostra em forte atividade. Já existem no mercado, aprovados ou em vias de aprovação, diversos produtos como: materiais implantáveis, materiais para reparação óssea, sensores implantáveis, sistemas de drug delivery (Biolipídeo B2®), sistemas de processamento e multianalise de DNA, implantes de retina e outros. O Grupo Evidence atualmente desenvolve pesquisa na área de fármacos e estuda o emprego da nanotecnologia em novas formas de administração de fármacos através de nanoemulsões e nanoparticulas associados para formar um sistema homogêneo, estável e nanoestruturado de Transdermal Drug Delivery capaz de entregar o fármaco no meio sistêmico.

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2.3 Nanotecnologia e Biotecnologia a serviço da sua VIDA. Desenvolver um sistema nanoestruturado de Transdermal Drug Delivery, requer considerável conhecimento nesta área da ciência, e desde 2001 o Grupo Evidence pesquisa e se qualifica no desenvolvimento de sistemas biotecnológicos transdérmicos utilizados para reposição hormonal e reposição de outros fármacos biocompatíveis e bionutrientes sendo pioneiro no Brasil na aplicação de reposição hormonal transdérmica nanoestruturada. O Grupo Evidence passou a observar que o emprego de tecnologias, como a nanotecnologia, seria de fundamental importância para desenvolver um sistema transdérmico único e realmente eficaz, podendo ser submetido a testes em seres humanos e ter o seu resultado comprovado através de métodos e estudos científicos válidos, pois acreditamos que uma empresa farmacêutica, que se propõe a tratar e manter a saúde e a vida de seres humanos devem obrigatoriamente ir além da superficial segurança contidas nas “comprovações” verbais.

ETAPA

Para desenvolver o Biolipídeo B2®, tivemos que estudar e entender as duas metodologias que constituem os modelos de estrutura NANO: metodologia “Top Down” e metodologia “Bottom Up”. Na metodologia “Top Down” (metodologia do Biolipídeo B2®) impõe-se uma estrutura no sistema por meio da definição de padrões e sua criação utilizando partes maiores e indo para partes menores nanoestruturadas. Nesse caso há necessidade do uso de maquinário capaz de reproduzir os padrões em tamanho de escala nano. Abaixo, segue comparativo sobre a tecnologia ofertada pelo mercado e a tecnologia contida no processo de obtenção do Biolipídeo B2®. Biolipídeo B2® é um processo sequenciado, científico e comprovado tendo a sua eficácia certificada “in vitro” e “in vivo” através de tecnologias de ponta e que promovem segurança para o uso em humanos.

MODELO EMPÍRICO - Mercado

MODELO EVIDENCE - Biolipídeo B2® (processo patenteado)

Identificação e classificação do fármaco (etapa 01)

Verifica, através de leitura, o laudo impresso e enviado Analise de amostra com HPLC e Espectroscopia de Absorbância pelo distribuidor. no UV visível para identificação do sal farmacêutico, por meio de institutos e universidades. Analise do tamanho da partícula através de Distribuição Granulométrica CILAS 920 Líquido com extensão de ultrassom.

Redução do fármaco para escala Nano (etapa 02)

Não aplicável. Utilização de centrífuga, moinho analítico e atomizador para nanoEm algumas empresas, quando se faz uso de alguma particularização do ativo farmacêutico. tecnologia, utiliza-se peneiras de inox na escala mesh sem utilizar padrão.

Comprovação da redução do fármaco (etapa 03)

Não aplicável.

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) com nebulização de elétrons de ouro com ampliação da resolução da superfície de uma amostra em até 300.000 vezes.

Formação do sistema de delivery (etapa 04)

Extrusão entre seringas plásticas ou agitação mecânica com o uso de tensoativos para formação de sistema água em óleo ( formação de creme ). Em alguns casos utilização de geís semi-prontos adicionados de álcool e algum fosfolipídeo, sendo estas formulações ofertadas por distribuidores de matéria-prima como bases prontas!

Formação de sistema coloidal nanoestruturado biocompatível com as camadas da pele e livre de conservantes e xenobióticos, através de homogeneizador e dispersor de ultra performance com até 30 mil rpm’s sem utilização de tensoativos, de derivados de petróleo, de carbomeros e de álcool. Formação de micelas biocompatíveis com as moléculas de hormônio e suas caracteríscas e com composição semelhante a da pele.

Diluição e difusão do fármaco no sistema. (etapa 05)

Utilização de trituração mecânica do fármaco e agitação com o uso de grau e pistilo. Nas mais evoluídas, atualmente utiliza-se o sistema de moinho de rolo com 2 rolos.

Diluição geométrica do ativo farmacêutico no sistema homogeneizado. Homogeneização de todo o sistema com a utilização de moinho de 3 rolos de composição quimicamente inerte e com velocidade controlada. Processo padronizado e patenteado pelo Grupo Evidence.

Comprovação da formação do sistema Não aplicável. de delivery transdérmico estável e nanoestruturado (etapa06)

Analise de distribuição do tamanho de partículas através de granulometria a laser para se obter o Potencial Zeta ( estabilidade do sistema e da formulação ) e o tamanho da partícula após incidência do feixe de laser medindo a intensidade de luz espalhada correlacionadas com o seu movimento aleatório ( Fenômeno Browniano ).

Identificação do fármaco no sistema Não aplicável. transdérmico (etapa 07)

Espectroscopia Raman baseado no espalhamento inelástico da luz

Comprovação de absorção e biodispo- Não aplicável. nibilidade do sistema e do farmáco em seres humanos (etapa 08)

Espectroscopia Raman 3510 da River Diagnostics, de acordo com a Legislação Brasileira, baseada na “Resolução Normativa 196/96, CNS/MS” através de estudo clínico monocêntrico de acordo com os procedimentos operacionais estabelecidos para realização de projeto de teste clínicos em humanos “IN VIVO”.

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ao interagir com as amostras do Biolipídeo B2® com o hormônio disperso, diluído e difundido na amostra.

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Atualmente essas são as etapas que formam o processo de obtenção de um sistema de Trandermal Drug Delivery como Biolipídeo B2®. Este, é um produto do Grupo Evidence com registro de marca e patente nacional e internacional depositados em nome da empresa e de domínio do grupo. Produtos semelhante ao Biolipídeo B2® + Testosterona são oferecidos no mercado internacional, a um custo médio de US$ 60,00. No Brasil, com conversão cambial e impostos, em média R$ 150,00. Não é possível comparar o custo de produção dos dois modelos. A finalidade é a mesma, porém os produtos são diferentes em sua composição, certificações de validade e segurança e tecnologia aplicada.

3. Biolipídeo B2® Biotecnologia & Nanotecnologia Aplicada na Biodisponibilidade de Hormônios Transdérmicos.

Após absorver parte da informação do dossiê científico, contida até aqui, podemos compreender e concluir que nem tudo que o mercado propõe para passarmos na nossa pele tem a capacidade de ser absorvido e aproveitado pelo nosso organismo, principalmente quando não são feitos testes que comprovem identificação, estabilidade e biodisponibilidade do fármaco em questão. Segundo Park, nos seus trabalhos publicados aprendemos que compreender, melhorar e validar a de ativos farmacêuticos na pele, à nível molecular, sistema de delivery transdérmico é cada vez mais para aperfeiçoar esse sistema de administração para biodisponibilidade dos ativos.

em 2009, permeação através de importante liberação e

Ao aplicar um fármaco na pele, principalmente hormônios, que necessitam de extrema segurança e controle da dosagem na sua liberação, não implica necessariamente no seu aproveitamento pelo organismo e tão pouco se a dose aplicada terá permeação transdérmica e estará disponível para ser absorvida na derme alcançando o meio sistêmico através dos vasos sanguíneos contidos nesta camada. Aprendemos que a única forma de garantir a segurança, ação e eficácia de fármacos, principalmente hormônios, é realizando a aplicação de tecnologias como biotecnologia e nanotecnologia, essas capazes de tornar o ativo farmacêutico estável e biodisponível para o nosso organismo. Porém, como cientistas, temos que assumir o ônus da contraprova pois sem esta metodologia não podemos assegurar que o sistema é confiável, eficaz e seguro. Este sistema e os seus processos, precisam passar por certificações e validações de metodologias reconhecidas capazes de assegurar: 1) Identificação do fármaco; 2) Tamanho de partícula do fármaco; 3) Diluíção, dispersão e difusão do farmáco em sistema unimodal nanoestruturado com tamanho de partículas homogêneas e estabilidade comprovada; 4) Nanodistribuição do sistema comprovando o seu alto poder de absorção transdérmica e celular; 5) Identificação do ativo farmacêutico (hormônio, antibiótico, analgésico, etc) no produto final; 6) Testes clínicos “In Vivo” de permeação transdérmica do produto; 7) Teste clínicos “In Vivo” de absorção do ativo farmacêutico (ex.: hormônio); 8) Teste clínicos “In Vivo” de BIODISPONIBILIDADE e LIBERAÇÃO PROLONGADA (24hs) do ativo farmacêutico (ex: hormônio) através do Transdermal Drug Delivery (Biolipídeo B2®); Após desenvolver o processo que entrega o hormônio devidamente diluído, disperso e difuso no Transdermal Drug Delivery o nosso maior desafio foi criar uma metodologia de testes comprobatórios que validassem toda a proposta terapêutica disponibilizada pelo Grupo Evidence. Várias são as dificuldades e imensos são os investimentos para realizar experimentos, principalmente quando concorremos num mercado que nada disso é exigido. Nossa proposta sempre foi balizada pela excelência, segurança, resultado e eficácia e para se atingir esses objetivos, investimos bastante em pesquisa e na comprovação desses resultados. Segue, abaixo o “Raio X” comprobatório do Biolipídeo B2®, desde o recebimento da matéria-prima até o produto final.

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Biolipídeo EVIDENCE B2® Processo de Autenticidade

3.2 PATENTE NACIONAL

No mercado farmacêutico, assim como em outros segmentos, infelizmente o Brasil vem no topo do ranking da pirataria mundial sendo um dos 5 maiores países a produzir e consumir produtos falsificados. O título reflete a insustentável situação de empresas sérias, que enfrentam graves dificuldades para sobreviver em um mercado cada vez mais competitivo, arcando com altas cargas tributárias e encargos trabalhistas elevados. Sujeitos à concorrência desleal dos produtos falsificados, alguns segmentos industriais são mais penalizados. A pirataria tem se destacado no mercado de cigarros, CDs, DVDs, brinquedos, roupas, programas de computador e até mesmo NA VENDA DE REMÉDIOS. (extraído do Jornal O Globo – Ana Tereza Basílio, Advogada) O pior efeito colateral de todo esse sistema paralelo que emerge a cada dia, principalmente quando nos reportamos ao mercado farmacêutico, é o perigo ao qual o consumidor final é submetido. Segundo a OMS, um medicamento falsificado é aquele etiquetado indevidamente, de forma deliberada ou fraudulenta, no que diz respeito à sua identidade ou fonte. Pode ser de marca ou genérico, e pode ter sua composição alterada ou até mesmo não conter nenhum princípio ativo.

3.3 PCT - PATENTE INTERNACIONAL

Infelizmente, essa prática aumenta a cada dia no Brasil e empresas vem se utilizando da propriedade intelectual e de marcas, patrimônios de terceiros, de forma equivocada. No final de todo esse processo ilegal, quem mais perde é o médico e o cliente, por na maioria das vezes essas empresas não saberem o que estão fazendo tecnicamente ou usando algo que não dominam ou não conhecem. Para a reflexão de todos os envolvidos no processo de prescrição e consumo do medicamento segue o relato abaixo da OMS: “O uso de medicamentos falsificados ou com desvios de qualidade pode resultar em pacientes que não recebem a quantidade necessária de princípio ativo, e conseqüentemente, suas enfermidades podem não estar sendo tratadas. E pior ainda, produtos que podem ter sido adulterados ou deliberadamente formulados utilizando substâncias industriais tóxicas, que não podem ser usadas na fabricação de medicamentos. ( appud, OMS, 2004)”

3.1 REGISTRO DE MARCA

3.4 EXEMPLO DE USO IRREGULAR DE PROPRIEDADE intelectual & Marcas registradas Empresas que utilizam a marca Biolipídeo em seus rótulos e formulações.

3.5 Biolipídeo B2® - Processo de Aquisição da MatériaPrima Quando o consumidor retira um medicamento na farmácia ou drogaria, dificilmente tem noção do longo caminho percorrido até se obter o produto final. A cadeia de fabricação / manipulação dos medicamentos quase sempre começa fora do País com a importação dos insumos farmacêuticos, ou seja, as matériasprimas. Até que sejam disponibilizados para os consumidores, os produtos passam por diversas e delicadas etapas. Qualquer erro é capaz de pôr em risco todo o trabalho de garantia da qualidade. O insumo farmacêutico, que chega ao País pode ser fracionado por uma empresa, distribuído por outra e processado em uma terceira 10

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e só então é transformado em medicamento. A complexidade do percurso percorrido até aqui pelo insumo farmacêutico não impede que a população se preocupe com a qualidade dos produtos e exija do setor público maior rigor para garantir a segurança de quem deles necessita. Por representarem o início da cadeia produtiva da indústria farmacêutica, os insumos farmacêuticos estão sujeitos a rigoroso controle, afinal, a qualidade das matérias-primas usadas para fabricar/manipular medicamentos pode ser a diferença entre um produto eficaz ou não. As matérias-primas utilizadas na fabricação de medicamentos constituem um ponto crítico para todo o processo industrial. “Muitos casos de desvio de qualidade estão ligados à falta de características ideais nos insumos” – afirma relator da ANVISA. O controle dos insumos importados é o que exige maior atenção. Mesmo representando cerca de 90% do volume utilizado pelo setor farmacêutico nacional, os fornecedores internacionais ainda não são vistoriados regularmente para a verificação de Boas Práticas de Fabricação. “Texto extraído e compilado da Rev. Saúde Pública vol.40 no.2 São Paulo -

entender como poderia criar um processo de análise e comprovação da sua matéria prima a ser utilizada na proposta terapêutica. Todo o processo de criação do Biolipídeo B2® como uma proposta segura, eficaz e biodisponível de Transdermal Drug Delivery só foi efetivo e possível após a qualificação e normatização do processo de aquisição do insumo farmacêutico, principalmente os hormônios, utilizados pelo sistema. E para isso foi necessário criar e investir em processos de identificação e qualificação desse insumo partindo da sua contra-prova de identificação e validação química através de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ( HPLC) e Espectrofotometria em Infravermelho até a análise e comprovação do tamanho da particula da amostra do insumo farmacêutico através do Granulômetro a Laser CILAS série 900, pois agora sabemos que o tamanho da partícula é um vetor de fundamental importância para a estabilidade do sistema, absorção transdérmica e biodisponibilidade do insumo farmacêutico. Esse processo de identificação e qualificação faz toda a diferença no produto final, pois temos o compromisso de trabalhar com a melhor e mais segura proposta terapêutica medicamentosa de reposição hormonal transdérmica.

INFORMES TÉCNICOS INSTITUCIONAIS - Pharmaceutical input”

Acima, fica bem claro que: 1) A qualidade da matéria prima bem como a sua comprovação através de laudos de controle de qualidade de empresas e laboratórios independentes como Universidades e institutos Federais é de fundamental importância para o resultado, segurança e eficácia do produto final;

Abaixo, segue laudos comprobatórios de validação do processo de aquisição, qualificação e liberação dos fármacos utilizados e dispensados pelas empresas do Grupo Evidence.

CONTRA-PROVA DE IDENTIFICAÇÃO DO FÁRMACO LAUDO DO FORNECEDOR / DISTRIBUIDOR

2) Ainda existem problemas de qualificação e especificação dos insumos pelo motivo da grande maioria, cerca de 90%, ainda serem importados. Esse é o grande problema relacionado aos produtos que dizem ser micronizados. Na sua grande maioria não apresentam padrão e contém falhas graves nas suas informações, necessitando sempre de contra-prova. Isso significa que a escolha, comprovação qualitativa e observação técnica das características dessas matérias primas devem ser rigorosamente realizadas e inspecionadas através de laudos comprobatórios que se contraponham ao resultado do laudo emitido pelo último distribuidor. Se para o mercado convencional isso ainda é um problema a ser monitorado de forma bem próxima, imaginemos então para um mercado tão específico e repleto de pré-requisitos técnicos como é o caso da proposta terapêutica de reposição hormonal transdérmica através de sistema nanoestruturado. Esse sempre foi um grande problema, que inicialmente a equipe técnica do Grupo Evidence teve que passar para

versão ampliada - anexo 1

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LAUDO CONTRA-PROVA DA AMOSTRA EM QUARENTENA

CONTRA-PROVA DO TAMANHO DA PARTÍCULA DO FÁRMACO

Metodologia de Identificação: • HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ( CLAE ) • Espectrofotometria de Absorção em Infravermelho.

Laudo do Fornecedor / Distribuidor Como podemos observar no laudo abaixo o fornecedor afirma que o hormônio é micronizado ( Estriol Micronizado ) e que 90% das partículas não são maiores que 10MU ( microns ). Ao fazer a contra prova percebemos que essa informação é altamente falha. Porém para a grande maioria das empresas farmacêuticas essa informação não é checada e sequer valorizada. Com a falta de comprovação da identificação e do tamanho de partícula todo o sistema pode colocar o usuário final em risco ou na melhor opção, o produto estará disponível apenas no estrato córneo servindo como esfoliante ou com ação tópica localizada e não com ação sistêmica como proposto pela terapêutica de reposição hormonal.

versão ampliada - anexo 2

Metodologia & Equipamentos Utilizados HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência versão ampliada - anexo 3

LAUDO CONTRA-PROVA DA AMOSTRA EM QUARENTENA Metodologia de Identificação: • Distribuição Granulométrica a Laser CILAS Líquido série 900

Espectrofotometria de Absorção em Infravermelho

A análise mostra que o estriol base micronizado tem 90% da sua amostra acima de 100MU (cem microns), 10 vezes superior do que informado pelo laudo do distribuidor. Diz também que o seu diâmetro médio, considerando toda a amostra, está na escala de 41,12 microns, 4,112 vezes acima do informado no laudo do distribuidor. Dessa forma podemos concluir a relevante falha tanto em valores absolutos como em valores médios relativos e a expressa necessidade de análise dos insumos adquiridos pela empresa.

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3.6 Biolipídeo B2®

Processo de Qualificação e Validação da Nanoestruturação e da Estabilidade do Transdermal Drug Delivery Através de estudos científicos, podemos concluir que a segurança, eficácia e o sucesso terapêutico por via transdérmica está intimamente relacionado a nanoestruturação e a estabilidade do sistema de Transdermal Drug Delivery, ou o produto final. Rothman apresentou a comunidade científica, um artigo de revisão no qual demonstrou que o veículo do ativo ( sistema de delivery transdérmico ), assim como o seu poder de organização dos lipídeos na pele, apresentam um singnificativo impacto nas taxas de absorção e permeação de fármacos. Tendo a ciência como espinha dorsal do Biolipídeo B2® e dos nossos processos, a comprovação de nanoestruturação e estabilidade do sistema através de metodologias reconhecidas se tornaram vitais. Abaixo segue laudos comprobatórios e tecnologia empregada para realização das análises. versão ampliada - anexo 4

Metodologia & Equipamentos Utilizados Granulômetro a Laser CILAS Líquido Série 900

LAUDO DO ESTRIOL BASE ATOMIZADO PELA EVIDENCE APÓS IDENTIFICAÇÃO DE FALHA NA GRANULOMETRIA E MICRONIZAÇÃO DO INSUMO

VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA E EQUIPAMENTOS UTILIZADOS MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (MEV) Metodologia validada pelo INMETRO, através da Divisão de Metrologia de Materiais – DIMAT, publicado na cartilha de apresentação da Diretoria de Metrologia Científica e Industrial - Dimci. A técnica possibilita investigar a superfície de amostra com magnificações da ordem de centenas de milhares de vezes. Além disso a técnica permite a realização de microanálises por espectroscopia de energia dispersiva ( EDS ), que possibilita a identificação e mapeamento dos elementos químicos presente no material. Fundamento da Técnica: Um feixe de elétrons varre a superfície da amostra e sua interação com o material analisado gera diversos tipos de sinal que são utilizados para a formação de imagens ou análise da composição da amostra. As imagens podem fornecer informações referentes à morfologia e topografia, e a composição química pode ser determinada por detecção de raios-X.

ANALISADOR DE POTÊNCIAL ZETA Metodologia validada pelo INMETRO, através da Divisão de Metrologia de Materiais – DIMAT, publicado na cartilha de apresentação da Diretoria de Metrologia Científica e Industrial Dimci. A técnica possibilita determinar a distribuição de partículas suspensas em meio líquido ( via úmida ) ou gás ( via seca ). Amostras prticuladas (pós) com dimensão variando entre 0,25µm a 2,0mm podem ser analisadas diretamente em via seca. Análises de dispersões em meio líquido ( BiolipídeoB2 e outras nanoemulsões e sistemas colóidais ) podem ser realizadas para materiais da ordem de 0,8nm a 2,0mm. Fundamento da Técnica: Quando um feixe de luz incide sobre uma dispersão coloidal, as partículas em suspensão espalham a radiação incidente. A intensidade da luz espalhada sofre flutuações que podem ser correlacionadas com o movimento aleatório ( Browniano ) dessas partículas, que por sua vez, depende de suas dimensões. Potencial ZETA: Partículas em suspensão apresentam acumulo de carga superficial que origina um potencial elétrico ( Potencial ZETA ). A medida desta propriedade permite obter informações SOBRE A ESTABILIDADE DO SISTEMA e de como as propriedades superficiais são modificadas nos processos e formulações.

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METODOLOGIA & EQUIPAMENTOS UTILIZADOS

INTERPRETAÇÃO DO LAUDO

Microscopia Eletrônica de Varredura ( Mev )

Esse laudo comprova e atesta a primeira linha para reposição hormonal transdérmica NANOESTRUTURADA, ESTÁVEL, HOMOGÊNEA E UNIMODAL. Isso garante que: 1) Sistema Homogêneo: O hormônio contido no sistema transdérmico está diluído, difuso e disperso de forma eficaz e segura. Garantindo que todas as doses utilizadas pelo cliente terão sempre a mesma composição/padrão, sem existir o risco de doses com altas concentrações de hormônio e outras doses com baixas concentrações ou sem nada do ativo. Isso reduz SIGNIFICATIVAMENTE O RISCO.

Analisador de Potêncial Zeta

2) Sistema Unimodal & Sistema Estável : O hormônio e todos os componentes da formulação do sistema transdérmico estão na mesma faixa de tamanho garantindo a otimização da permeação do sistema e a sua estabilidade. Isso garante estabilidade comprovada cientificamente, reduzindo e praticamente anulando os riscos de reações químicas e alteração na formulação. 3) Sistema Nanoestruturado: O hormônio e todos os componentes da formulação do sistema transdérmico estão na escala NANO com tamanhos homogêneos variando entre 560nm e 196nm de uma amostra para outra ( nossa maior amostra está quase 10 vezes menor que uma hemácia ) . Isso confere tecnologia na segurança, eficácia e resultado da terapêutica proposta, assegurando que o hormônio terá viabilidade para transpassar o estrato córneo e chegar ao meio sistêmico ( derme ) garantindo o resultado terapêutico e reduzindo de forma comprovada O RISCO.

LAUDO COMPROBATÓRIO - POTENCIAL ZETA BiolipídeoB2 é a primeira linha de hormônios com nanotecnologia garantida por laudo de análise de tamanho de partícula. Obtendo o potencial ZETA de -33mV até -72mV que comprova a alta estabilidade das partículas e de todo o sistema coloidal. Outra garantia e indicador de qualidade é o seu Índice de Polidispersão das Amostras, ficando todos abaixo de 1, variando entre 0,82 a 0,96 comprovando cientificamente que o BiolipídeoB2 além de estar em nanopartículas encontra-se com distribuição unimodal garantindo que todos os insumos do sistema estão com a mesma faixa de tamanho de partícula e todas estão estáveis.

3.7 Biolipídeo B2®

Processo de Identificação e Biodisponibilidade do Fármaco Através do Sistema Transdérmico Biolipídeo B2®.

versão ampliada - anexo 6

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Devido às dificuldades experimentais que comprovem a permeação cutânea de fármacos e consequentemente a biodisponibilidade destes, algumas empresas tem investido bastante em testes seguros que validem essa via. A grande maioria dos estudos utiliza-se de métodos invasivos, como tape stripping e biópsias (Park,2009). Buscando uma metodologia mais atual, segura e comprovada cientificamente validamos como modelo “Gold Standard” a Espectroscopia Confocal Raman que demonstrou, recentemente, ser um método de medição “in vivo” e

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“ex vivo”, não invasivo, que pode fornecer informações detalhadas, em tempo real, sobre a composição da pele (exemplo: fatores de hidratação natural - NMF, lipídios, nível de hidratação) e permeação cutânea, com base em padrões conhecidos e bem estabelecidos. Além disso, mantivemos como pré-requisito, o reconhecimento da técnica e buscamos para isso sua validação junto ao INMETRO através da Dimci e Dimat. Esta técnica está apta a fornecer novos dados sobre o processo de administração da molécula na pele (Paul et al, 2007).

formulação creme – produto farmacêutico, através da metodologia Espectroscopia Raman, modelo 3510 da River Diagnostic, o número de voluntários avaliados é suficiente. DESCRIÇÃO DOS PRODUTOS TESTE E PADRÃO O Produto Teste foi fabricado e fornecido pela Evidence Soluções Farmacêuticas, empresa do Grupo Evidence. Amostra 10.017, Lote 878122-1, fabricação 03.2011 e validade 06.2011. O padrão fornecido pelo patrocinador do estudo foi identificado como Progesterona Base veiculada em Biolipídeo B2®.

Em comparação com as metodologias disponíveis atualmente, como por exemplo, a avaliação em pele de porco utilizando Célula de Franz (Hanson), esta metodologia utilizada pelo Grupo Evidence na comprovação de biodisponibilidade e identificação do hormônio veiculado no Biolipídeo B2®, que emprega a Espectroscopia Confocal Raman torna-se robusta, precisa, fornecendo dados científicos palpáveis e confiáveis, baixo desvio padrão, e um ótimo intervalo de confiança.

Amostra 10.015, Lote 878122, fabricação 03.2011 e validade 06.2011. O padrão fornecido pelo patrocinador do estudo foi identificado como Testosterona Base veiculada em Biolipídeo B2®.

Vale ressaltar que os seres-humanos, voluntários para esse estudo clínico monocêntrico realizado pelo Grupo Evidence não colocam sua saúde nem sua vida em risco, pois utilizam o produto da mesma forma que o consumidor final, respeitando o gênero específico de cada voluntário e numa quantidade quase 33 vezes menor (usuário final = 1 grama / voluntário = 32mg).

PATROCINADOR DO ESTUDO Evidence Soluções Farmacêuticas Ltda.

TESTE REALIZADO AVALIAÇÃO “IN VIVO” DE PERMEAÇÃO CUTÂNEA EM SERES HUMANOS PELO MÉTODO DE ESPECTROSCOPIA RAMAN – Analisador de composição da pele River Diagnostics 3510. PRODUTOS TESTADOS 1- Biolipídeo B2® + Testosterona EviMicron Base ( Ref. Estudo: LSE-a026, 10.015 ) 2- Biolipídeo B2® + BiEst ( estriol + estradiol ) EviMicron Base ( Ref. Estudo: LSE-a027, 10.016 ) 3- Biolipídeo B2® + Progesterona EviMicron Base ( Ref. Estudo: LSE-a028, 10.017 )

Amostra 10.016, Lote 878122-3, fabricação 03.2011 e validade 06.2011. O padrão fornecido pelo patrocinador do estudo foi identificado como Estriol Base & Estradiol Base veiculada em Biolipídeo B2®.

CRONOGRAMA DO ESTUDO Início: 23/05/2011 Término: 08/06/2011 PROTOCOLO DO ESTUDO • Número de Voluntários para cada amostra: 02 (dois), faixa etária de 25 – 35 anos. • Área de aplicação: 01 (uma) área no antebraço direito. Figura 01. Delimitação da área de aplicação: 4 x 4 cm = 16 cm². Figura 01.

DEMONSTRAÇÃO DA METODOLOGIA APLICADA

OBJETIVO DO ESTUDO Neste estudo, foi avaliada a permeação cutânea das amostras, marcado e identificado o seu ativo farmacêutico (hormônio base) após aplicação da amostra em área do antebraço. Os parâmetros propostos foram com o intuito de conhecer, identificar e validar a possível permeação do produto e do seu ativo e assim seu comportamento no metabolismo cutâneo. RELAVANCIA DO ESTUDO As condições experimentais adotadas (área experimental, quantidade do produto aplicado, freqüência e duração das aplicações, etc.) reproduzem as condições de uso e o teste realizado em uma “pequena escala” refletiu a aplicação feita por futuros consumidores. 3.1. Ética Este estudo foi realizado de acordo com a Legislação Brasileira, baseada na “Resolução Normativa 196/96, CNS/MS(1)”. 3.2. Painel Por se tratar de uma confirmação da permeabilidade cutânea da

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• Quantidade de produto teste aplicado: 32 mg. • Formulação do produto teste: tabela – Formulação das Amostras. • Ambiente com controle de temperatura e umidade: tabela – Registros do Estudo • Parâmetros de leituras: tabela – Resultados Laudos Comprobatórios. Protocolo de estudo: Visita D1: Obtenção o consentimento dos voluntários; higienização do antebraço direito (água e sabão). Delimitação da área de aplicação/estudo. Condicionamento climático (15 minutos). Leitura basal (D1/T0). Aplicação do produto teste; 1h repouso; retirada do excesso de produto teste. Leituras após: 1 hora de aplicação (D1/T1h), 3 horas de aplicação (D1/T3h), 6 horas de aplicação (D1/T6h). Dispensa dos voluntários com devidas orientações do retorno ao Centro de Pesquisa. Visita D2: Limpeza da área de aplicação/estudo (soro fisiológico). Condicionamento climático (15 minutos). Leituras após 21 horas de aplicação (D2/ T21h), 24 horas de aplicação (D2/24h). Como podemos observar o teste realizado é considerado bem robusto e segue regras, abaixo listadas:

TABELA DE CARACTERÍSTICAS COMPROVADAS E CERTIFICADAS DE HORMONIO BASE VEÍCULADOS EM Biolipídeo B2®.

Formulação das Amostras AMOSTRA

ÁREA DE APLICAÇÃO

Janela retangular de apenas 4cm2. Espaço bastante pequeno buscando a máxima eficácia de permeação do produto, respeitando a sua área de aplicação posológica – O antebraço.

QUANTIDADE APLICADA

A quantidade aplicada nos voluntários foi 31,25 vezes menor que a quantidade posológica, respeitando um limite máximo de 32mg por amostra de produto. Isso mais uma vez certifica e comprova o altíssimo poder de permeação cutânea do Biolipídeo B2®, sendo esta sua exclusiva característica colocada a prova através de uma redução significativa da quantidade aplicada.

TIPO DE APLICAÇÃO

A amostra, quando aplicada no voluntário, é apenas colocada na superfície da pele (EC) após limpeza sem a realização de nenhum tipo de esfregaço, abrasão, fricção ou auxílio mecânico comprovando que além de mimetizar perfeitamente as características da pele, o

AMOSTRA 10.015 ESTUDO: LSE-a026

A metodologia aplicada no estudo, como descrita acima, certifica e comprova a exclusiva biodisponibilidade e liberação prolongada 24hrs do Biolipídeo B2®, sendo o único veículo transdérmico da América Latina capaz de entregar o ativo farmacêutico na derme e prolongar a sua liberação durante o período posológico sugerido de 24hrs, respeitando a fisiologia hormonal e dessa forma garantindo SEGURANÇA, EFICÁCIA E COMPATIBILIDADE FISIOLÓGICA DA DOSAGEM UTILIZADA

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• TESTOSTERONA BASE BIOIDENTICA EM Biolipídeo B2®

Testosterona Evimicrom Base -----------------------50mg / dose Oxyderme Release ------------ promotor de permeação cutânea. MNF Renew --- promotor e regulador da hidratação epidérmica. Biolipídeo B2® ------------------------------ veículo transdérmico. AMOSTRA 10.016 ESTUDO: LSE-a027

• BIEST BIOIDENTICO EM Biolipídeo B2® OH

HO

H H

OH H

H

H

H

HO

HO

Estriol Evimicrom Base ----------------------------- 2,5mg / dose Estradiol Evimicrom Base ----------------------------- 1mg / dose Oxyderme Release --- promotor de mobilidade transepidérmica. MNF Renew --- promotor e regulador da hidratação epidérmica. Biolipídeo B2 ®------------------------------ veículo transdérmico.

Biolipídeo B2® tem uma capacidade pioneira e exclusiva de transportar ativa e sinergicamente o componente ativo da fórmula para as camadas inferiores do estrato córneo (EC) sem a mínima necessidade de contato ou mesmo auxílio mecânico. PROTOCOLO DO ESTUDO

FORMULAÇÃO DA AMOSTRA EM Biolipídeo B2®

AMOSTRA 10.017 ESTUDO: LSE-a028

• PROGESTERONA BASE BIOIDENTICA EM Biolipídeo B2® O H H

H

O

Progesterona Evimicrom Base ---------------------- 50mg / dose Oxyderme Release ------------ promotor de permeação cutânea. MNF Renew ----- promotor e regulador da hidratação epidérmica. Biolipídeo B2® ------------------------------ veículo transdérmico.

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4. RESULTADOS - LAUDO GRÁFICO DE PERMEAÇÃO & BIODISPONIBILIDADE

CONCLUSÃO SOBRE O Biolipídeo B2® QUANDO APLICADO NA REPOSIÇÃO HORMONAL EM SERES HUMANOS – ESTUDO CLÍNICO MONOCÊNTRICO

Após as três (T3h) e seis (T6h) primeiras horas da aplicação, foi possível visualizar na profundidade correspondente a derme, a presença significativa de TESTOSTERONA, (53µm – T3h) e (57µm – T6h).

4.1 LSE – a026 - TESTOSTERONA – [ AMOSTRA 10.015 ]

Com intuito de avaliar o tempo de permanência de TESTOSTERONA BIODISPONÍVEL NA PELE, após uma única aplicação da amostra 10.015, foi realizado a avaliação dos níveis de TESTOSTERONA após 21 (T21h) e 24 (T24h) horas.

De acordo com os resultados obtidos no Laudo Gráfico de Permeação & Biodisponibilidade, foi possível observar que logo após a primeira 1 hora de uma única aplicação (T1h), a presença de TESTOSTERONA (marcador para a formulação denominada Amostra 10.015), é visualizada em diversas profundidades, entre 1µm e 60µm (Estrato Córneo até a Derme), o que demonstra uma rápida permeação de TESTOSTERONA, já nos primeiros minutos de aplicação. Este aumento inicial, dentro da profundidade considerada, identifica a presença do produto no estrato córneo (1µm -12µm), epiderme viável (13µm –40µm) e derme (41µm -60µm).

De acordo com os resultados obtidos, foi possível observar que após 24 horas de uma única aplicação (T24h), de TESTOSTERONA, esta permaneceu distribuída ao longo da profundidade correspondente a derme. Também é importante ressaltar que após uma hora de exposição ao produto (T1h) aproximadamente 39% de TESTOSTERONA foi visualizado distribuído entre a epiderme e derme.

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CONCLUSÃO DO ESTUDO

CONCLUSÃO DO ESTUDO

De acordo com os resultados apresentados, podemos concluir que:

De acordo com os resultados apresentados, podemos concluir que:

• A Amostra 10.015 promove permeação cutânea do ativo TESTOSTERONA já na primeira 1 hora de uma única aplicação;

• A Amostra 10.016 promove permeação cutânea dos ativos ESTRIOL e ESTRADIOL já na primeira 1 hora de uma única aplicação, permeando até a profundidade correspondente a derme.

• A Amostra 10.015 promove a permeação de TESTOSTERONA, após 1hora de aplicação na profundidade correspondente a derme (41µm -60µm) GARANTINDO QUE A TESTOSTERONA ATINGE A MICROCIRCULAÇÃO E ESTÁ BIODISPONÍVEL JÁ NA PRIMEIRA HORA DE APLICAÇÃO; • Após 24 horas de uma única aplicação da Amostra 10.015 ainda foram encontrados percentuais de TESTOSTERONA na pele, entre as profundidades de 41µm -60µm COMPROVANDO A BIODISPONIBILIDADE E A LIBERAÇÃO PROLONGADA DA TESTOSTERONA QUANDO VEÍCULADA EM Biolipídeo B2®. Notas: 1. Os resultados apresentados neste Relatório de Estudo têm significância restrita e se aplicam somente ao produto – teste denominado AMOSTRA 10.015 nas condições e concentrações avaliadas neste estudo. 2. Os resultados apresentados são exclusivamente oriundos de estudos in vivo.

• Na 21hr (T21) e 24hr (T24) após exposição ao produto – Amostra 10.016 - ainda foi detectado percentuais significativos dos hormônios na derme (41µm -60µm), GARANTINDO, COMPROVANDO E CERTIFICANDO A PERMEAÇÃO, BIODISPONIBILIDADE E LIBERAÇÃO PROLONGADA DOS MARCADORES ATIVOS (ESTRIOL E ESTRADIOL) QUANDO VEICULADOS NO SISTEMA Biolipídeo B2®. • Após 24 horas de uma única aplicação da Amostra 10.016, ainda foram encontrados percentuais de ESTRADIOL & ESTRIOL na pele, entre as profundidades de 13µm -60µm O QUE GARANTE BIODISPONIBILIDADE SISTÊMICA DOS MARCADORES ATIVOS, ATINGIDO A MICROCIRCULAÇÃO DÉRMICA DURANTE TODO O PRAZO POSOLÓGICO SUGERIDO ( 24HRS ). Notas: 1. Os resultados apresentados neste Relatório de Estudo têm significância restrita e se aplicam somente ao produto – teste denominado AMOSTRA 10.016 nas condições e concentrações avaliadas neste estudo.

CONCLUSÃO SOBRE O Biolipídeo B2® QUANDO APLICADO NA REPOSIÇÃO HORMONAL EM SERES HUMANOS – ESTUDO CLÍNICO MONOCÊNTRICO

2. Os resultados apresentados são exclusivamente oriundos de estudos in vivo.

4.2 LSE – a027 – BIEST: Estriol & Estradiol [ AMOSTRA 10.016 ]

CONCLUSÃO SOBRE O Biolipídeo B2® QUANDO APLICADO NA REPOSIÇÃO HORMONAL EM SERES HUMANOS – ESTUDO CLÍNICO MONOCÊNTRICO

De acordo com os resultados obtidos no Laudo Gráfico de Permeação & Biodisponibilidade, podemos observar que após a primeira 1 hora de exposição ao produto (T1h), a presença de ESTRADIOL & ESTRIOL (marcador para a formulação denominada Amostra 10.016), é visualizada em diversas profundidades, entre 1µm e 60µm, o que demonstra uma rápida permeação de ESTRADIOL & ESTRIOL, já nos primeiros minutos de aplicação. Após três horas de exposição (T3h), foram visualizados marcadores ativos da amostra ( Estriol + Estradiol ) na epiderme viável e na derme na profundidade de 59µm. Após 21 horas (T21h) foram identificados ESTRADIOL & ESTRIOL BIODISPONÍVEL NA DERME (53µm).Com intuito de avaliar o tempo de permanência de ESTRADIOL & ESTRIOL biodisponível na pele, após uma única aplicação da amostra 10.016, realizamos a avaliação dos seus níveis após 24 (T24h) horas. De acordo com os resultados obtidos, foi identificado Estriol & Estradiol distribuídos ao longo da profundidade correspondente a derme atingindo 60µm de profundidade, ISSO APÓS 24 HORAS DE UMA ÚNICA APLICAÇÃO. 18

4.3 LSE – a028 – PROGESTERONA – [ AMOSTRA 10.017 ] De acordo com os resultados obtidos no Laudo Gráfico de Permeação & Biodisponibilidade, foi possível observar que após a primeira 1 hora de uma única aplicação (T1h), a presença de PROGESTERONA (marcador para a formulação denominada Amostra 10.017), é visualizada em diversas profundidades, entre 1µm e 60µm chegando atingir 59µm de profundidade ainda na primeira hora, o que demonstra uma rápida permeação de PROGESTERONA (28µm), já nos primeiros minutos de aplicação. Este aumento inicial, dentro da profundidade considerada, identifica a presença do produto no estrato córneo (1µm -12µm), epiderme viável (13µm - 40µm) e derme (41µm - 60µm). Após as três (T3h) e seis (T6h) horas de exposição ao produto, foi possível visualizar a permeação significativa do marcador ativo, PROGESTERONA, aplicado sobre a pele, sendo este visualizado em significativas quantidades na epiderme viável e derme.

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Com intuito de avaliar o tempo de permanência de PROGESTERONA biodisponível na pele, após uma única aplicação da amostra 10.017, foi realizado a avaliação dos níveis de PROGETSERONA após 21 (T21h) e 24 (T24h) horas. De acordo com os resultados obtidos, foi possível observar que após 21 e 24 hora de exposição a Progesterona veiculada em BiolipídeoB2 ainda foi rastreado ativo biodisponível na derme (59µm). CONCLUSÃO DO ESTUDO De acordo com os resultados apresentados, podemos concluir que: • A Amostra 10.017 PROMOVE PERMEAÇÃO CUTÂNEA DO ATIVO PROGESTERONA JÁ NA PRIMEIRA 1 HORA DE EXPOSIÇÃO AO PRODUTO, QUANDO VEICULADA NO SISTEMA Biolipídeo B2®; • Após 24 horas de uma única aplicação da Amostra 10.017, ainda foram encontrados percentuais de PROGESTERONA BIODISPONÍVEL na derme, na profundidade de 60µm GARANTINDO, COMPROVANDO E CERTIFICANDO A PERMEAÇÃO, BIODISPONIBILIDADE SISTÊMICA E LIBERAÇÃO PROLONGADA DO MARCADOR ATIVO PROGESTERONA QUANDO VEICULADOS NO SISTEMA Biolipídeo B2®. GARANTE TAMBÉM A BIODISPONIBILIDADE SISTÊMICA DO MARCADOR ATIVO POR ATINGIR A MICROCIRCULAÇÃO DÉRMICA DURANTE TODO O PRAZO POSOLÓGICO SUGERIDO ( 24HRS ). Notas: 1. Os resultados apresentados neste Relatório de Estudo têm significância restrita e se aplicam somente ao produto – teste denominado AMOSTRA 10.017 nas condições e concentrações avaliadas neste estudo. 2. Os resultados apresentados são exclusivamente oriundos de estudos in vivo.

5. NANOTECHNOLOGY IN HORMONE REPLACEMENT THERAPY: SAFE AND EFFICACY OF TRANSDERMAL ESTRIOL AND ESTRADIOL NANOPARTICLES AFTER 5 YEARS FOLLOW-UP STUDY Luiz Wagner GONZAGA2, Marco Antonio BOTELHO 1,3*, Dinalva Brito QUEIROZ3, Pierre B. FECHINE3, Rafael FREIRE3, Angélica Morais3, Ronaldo RUELA2, Aarão Lyra4, Samela GOMES4, Lucindo QUINTANS JR 1 1. Department of Physiology, School of Medicine, Federal University of Sergipe, Av. Marechal Rondon S/N Rosa Elze, 49100001 - São Cristóvão-SE. 2. Group of Advanced Biomaterial in Chemistry (GQMAT) – Department of Analytical Chemistry, Federal University of Ceara UFC, Campus do Pici, CP 12100, 60451-970 Fortaleza - CE. 3. Department of Biomedical Research, Applied Biotechnology Institute, R. Padre Valdevino, 1905 - 60125-100, Fortaleza-CE.

4. Post graduation Program in Biotechnology, Laboratory of Nanotechnology, Potiguar University Avenida Salgado Filho, 1610 - 59060-000, Natal-RN. 5. National Scientific and Technological Development Council CNPq/Post-Doctoring Program, SHIS QI 01, 71605-170 - BrasiliaDF. Corresponding Author: Marco Antonio Botelho, MSc,PhD University Potiguar, School of Health, Av. Salgado Filho, 1610 Natal, Rio Grande do Norte, BRAZIL Phone: ++ 55 84 3215.1234 / Fax: ++ 55 84 3215.1275 Coordinator of the Post Graduation Program in Biotechnology Email: marcobotelho1@gmail.com Summary This study aimed to evaluate the safety and efficacy of a novel protocol of transdermal Hormone Replacement Therapy (HRT) based on a nanostructured formulation of Estriol (0.1%) + Estradiol (0.25%) restoring serum levels and relieving menopausal symptoms. We evaluated 122 women with mean age of 56.88 (±6.27) as part a longitudinal prospective study on post-menopausal women with natural menopause, received in the right forearm a transdermal formulation of (EE) daily for 60 months. Clinical parameters including the degree of satisfaction with symptomatic relief; serum concentrations of estradiol, Weight, blood pressure; bilateral mammography BI-RADS were compared between the baseline and five years after treatment. New evidence regarding this HRT protocol was assessed. The transdermal nanoformulation Estradiol improved clinical parameters. Satisfaction with treatment was 92%. Serum concentrations of Estradiol changed significantly after treatment (p<0.05). Weight and systolic and diastolic blood pressures had no significant differences (p>0.05) over the years. No vaginal bleeding was observed. Bilateral mammography assessment of the breasts following 60 months of HRT with Bioidentical Estradiol treatment found normal results in all women. This paper shows for the first time the effectiveness of a nanostructured transdermal formulation enhancer on the delivery of estradiol and estriol measured in vivo using Raman Confocal Spectroscopy. The Nanostructured formulation is safe and effective in reestablishing estradiol serum levels and relieving menopausal symptoms. The nanoformulation may serve as a good choice for hormone replacement therapy to protect against other post-menopausal symptoms. Keywords: Hormone replacement therapy; Nanoparticles; Raman Spectroscopy; Menopause; Transdermal delivery. INTRODUCTION The first-pass metabolism is related with a great number of side effects in many drugs, since the concentration of these bioactive compounds is reduced before it reaches the systemic circulation (1). The Nanotechnology comprises a new paradigm in science, in which new strategies with nanostructured drugs have been

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presenting interesting and unique properties such transdermal absorption (2). The technology of controlled release of drugs represents one of the frontiers on medical science; it involves multidisciplinary aspects and may provide an important contribution to improve human health (3, 4). Hormones play an important role on human health controlling and regulating different processes. Recent studies have been reported that regular and stable levels have beneficial effects for human physiology (5). During the menopausal transition, the ovarian production of estrogen and progesterone declines. This condition is related with physiologic changes such as loss of libido, vaginal dryness, insomnia, osteoporosis and cardiovascular disease (6). Hormonal replacement therapy (HRT) has been used for the treatment of menopause symptomatology; however, little is known concerning the use of Transdermal Bioidentical Hormone Replacement Therapy (THRT) as an alternative approach for those who have impeditive reasons for other ways of drugs administration (7-9). In this kind of treatment, side effects are highly dependent on dose and route of administration. Thus, strategies on hormonal replacement therapy are being developed in a perspective where benefits must always be advantageous when compared to the risks (10,11). Researchers have been using confocal Raman spectroscopy, as an interesting method of measuring bioactive compounds, providing detailed information in real time after a local application (10). This technique requires no sample preparation and is prepared to provide new data on the administration process of the molecule through the skin. Compared with the currently available methodologies, confocal Raman spectroscopy becomes robust, accurate, and provides reliable data (11). Recent studies have been conducted for a better understanding of some the active pharmaceutical permeation through the skin (12). The confocal Raman spectroscopy demonstrated to be an interesting method of measuring bioactive compounds providing detailed information in real time (13). The present study was designed to assess the long term efficacy and safety of a nanostructured formulation of Estriol+Estradiol for treating signs and symptoms related to the symptomatology in women with natural menopause and evaluate its effects on clinical laboratorial and radiographic parameters after 5 years follow-up. MATERIALS AND METHODS Ethics Iinitially, a written informed consent was provided for individuals willing to participate in a protocol approved by the Institutional Review Board of the Paulista University, Brazil. Eligible patients were then assigned were then enrolled to the study. 20

This was a long-term clinical trial study of female patients aged 45-72 years old treated for menopause-related hormone imbalances from January 1, 2003 to April 30, 2008. The Paulista University Health Science Center at Sao Paulo Institutional Review Board reviewed and approved this study; protocol #533/2009. Study Design One hundred and twenty-two patients (aged 45 to 72 years old) were enrolled into a pilot, single-center, prospective study. Inclusion criteria included patients with persistent amenorrhea (for ≥ 6 months), with typical climacteric complaints such as hot flushes, sweating, insomnia, depressive disturbance, genital itching and dyspareunia. Exclusion criteria included patients unwilling to complete the treatment protocol, subjects with any disease that would impede the use of the substances used in the study (e.g, mental diseases) as well as subjects that had used any type of HRT within six months prior to the study. Volunteers were recruited from a referenced Gynecology Medical Center in Fortaleza City, the Capital of Ceara state, located in Northeast Brazil where patient charts are maintained. Climacteric symptoms have a relevant prevalence in this part of the country. Clinical Evaluation At baseline, patients received a complete gynecological clinical exam where blood pressure, weight and others clinical parameters were evaluated. After the baseline visit, subjects were instructed to perform a blood exam including bilateral mammogram radiographic. The THRT consultation consists of an extensive clinical evaluation followed by an educational lecture about THRT. The patients were questioned regarding medical history and menopausal symptoms classified as “absent=0,” “mild=1,” “moderate=2” or “severe=3”. During initial evaluation and follow-up visits, it was used a standardized form to monitor symptom resolution and adverse effects. The patients also were educated on several components of this kind of therapy such as: hormonal changes in menopause, associated factors, symptoms, risks and benefits of THRT dosage forms and the importance of the follow-up visits. Blood samples were collected from the subjects early in the morning after an overnight fast. To minimize variation, each subject sample was analyzed at the same time of the day. Pre and post treatment data, such as age, weight, estradiol levels, Bi-rads classification and systolic and diastolic blood pressure are shown in Table I. After serum testing, the identification hormone deficiencies, was determined by the gynecologist, and then, additional bioidentical hormones such as estriol, estradiol, or a combination of both were recommended and the patients were evaluated each 6 months after THRT initiation. All the patients were instructed about how to use the pump for transdermal application (performed in the presence of an experienced gynecologist) who performed all clinical examinations to guarantee standardization and correct use of the THRT. Compliance was defined as completing seventy percent or

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more of the transdermal applications. Transdermal Hormone Replacement Therapy Patients received an transdermal dose on the right forearm a nanoparticulated formulation of Estriol (0.1%) + Estradiol (0.25%) (EE), (Estriol+Estradiol/ Biolipid B2®; Evidence, Fortaleza, Brazil) given daily for 60 months. The severity of the menopausal symptoms was evaluated according to the answers in the form full filled each six months of the study. Satisfaction with the hormone therapy was also evaluated at those times. Compliance with the regimen was checked by personal interviews. Furthermore, serum concentrations of estradiol and blood pressure were measured. During the 5 years of trial, Patients were instructed to complete evaluation forms each six months after the first consultation to monitor menopausal symptoms and side effects. The subjects continued to use their regular non-supervised, selfperformed transdermal bioidentical hormone measures. The clinical exam with the same parameters was repeated at 3 and after six months during five years.

evaluated. The mammograms were independently read by two certified radiologists who must reach consensus about referral for further diagnostic assessment. Assessment and diagnosis were repeated and completed with ultrasound and biopsies were performed when necessary. The American College of Radiology (ACR) guidelines (14) define a negative screening examination as one that is negative or has benign findings (BIRADS categories 1 and 2) and a positive screening examination as one for which referral is initiated (BI-RADS categories 0, 4 or 5). BI-RADS 3 was initially included in this study. Although this category is negative, it suggests short interval follow-up (14). Thus, this category was excluded and merged into BI-RADS 0. Scanning electron microscope (SEM) Assay The electron microscopy analyses of the size of nanoparticles, was obtained by an equipment TESCAN SEM (Model VEGA/XMU, Brno, Czech Republic) using accelerating voltage of the 30Kv. All samples analyzed for SEM were previously sputtered with a ~20nm gold layer in order to obtain the images of the hormone nanoparticles. Particle Size and distribution assay

Nanostructured Bioidentical Hormone Emulsion Preparation The Nanostructured Bioidentical Hormones formulation was prepared at the Department of Nanotechnology, Institute of Applied Biotechnology (Patent Pending PCT No. 2012/009778 A2). The Biolipid/B2 is a stable colloidal nanostructured system, biocompatible and developed to enhance the transdermal drug delivery of hormones. Two hormone+BIOLIPID/B2® formulations (Transdermal Penetration Enhancer Vehicle) were prepared. The emulsions were prepared, and the following mass ratios were obtained. • Nanoformulation 1: 0,1% Estriol + Biolipid®B2 • Nanoformulation 2: 0,25% Estradiol + Biolipid®B2 Estriol and Estradiol were obtained from Sigma Aldrich. The main composition of this emulsion is based on the nanoparticulated hormones (estriol/estradiol) and oleic acid, phospholipids, protein and bionutrients compatible with the dermal structure. Serum levels Assay Serum levels of estradiol were obtained by radio-immunoassay. The results of estradiol were expressed as picograms per milliliter (pg/ml). Blood was collected from each participant at the baseline visit and after 3 and each 6 months after baseline. The patients had their baseline blood test before initiating the bioidentical transdermal hormone replacement therapy (THRT). Samples were analyzed on the same reference laboratory of clinical analyses (Clementino Fraga, Fortaleza-CE/Brazil). Laboratory personnel were blinded to treatment status. BI-RADS Evaluation

The analyses of the size and distribution of nanoparticles, was performed by the equipment Zetasizer Nano ZS90 from Malvern Instruments Ltd. (Worcestershire,UK.England) using a method for the measurement of the nanoparticles. This technique is used to measure particle and molecule size. This technique measures the diffusion of particles moving under Brownian motion, and converts this to size and a size distribution using the Stokes-Einstein relationship, indicated for the types of nanoparticles commonly used in biological applications. The estriol and estradiol nanoparticles samples were analyzed in order to obtain the graphic distributions of the hormone particles. Raman spectrometer assay Raman Confocal spectroscopy measurements were performed using the model 3510 Skin Composition Analyzer (model 3510 SCA, River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands). To confirm the data, the experiments were performed twice on the volar forearms of volunteers (12). The arm of the volunteer was placed on a fused silica window mounted in the measurement stage. Laser light is focused into the skin with a microscope objective located under the window. An internal video camera allows for inspection of the skin surface and selection of the measurement spot (13). The spectral resolution is 4 cm-1 throughout the entire spectral range. A detailed Raman depth profiles could be acquired across the stratum corneum, viable epidermis and dermis. All Raman spectra were calibrated and corrected for instrument response using built-in instrument control software of the model 3510 SCA (River Diagnostics).

The data of 100 women who participated in the study were Grupo Evidence | Dossiê Científico BIOLIPÍDEO B2® 2011 | Profa. Dinalva Queiroz, Pharm.B., MSc, e Prof. Marco A. Botelho, DDS,MSc,PhD

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The test area was a marked in a 4 cm×4 cm in the arm of the volunteer and treated with 70 μL of the nanoformulation of both hormones and then was evaluated. The Nanostructured hormones were applied on the skin and gently spread using the tip of the micropipette, without rubbing (12, 13), 10 minutes after the application the measurements started. The volunteers place the volar forearm on a fused silica window for the measurement stage of the Raman spectrometer. Depth profiles were then collected in the period interval of 1, 3, 6, 21 and 24 hours after transdermal hormones (EE) administration. Six depth profiles were collected within each hour time period, thus, were acquired across the skin layers a detailed Raman depth and percent profiles from the nanoparticles formulation hormones. Statistical Analysis All statistical analyses were performed using SPSS statistical package for Windows version 10.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). The data are presented as the mean ± SEM or as the medians. The data are presented as the mean ± SEM or as the medians. Differences between baseline and after treatment were evaluated by Student’s T test to compare medians. Statistical differences were considered to be significant at p< 0.05. Categorical variables were compared using chi-square and Fisher’s exact tests. Continuous variables were tested for normality using the Shapiro Wilk-W Test. Normally distributed variables were reported as means (standard deviations). Paired data were compared using the Wilcoxon signed-rank test. All tests were two-sided. RESULTS Twenty two women were excluded from study with some of the events such as: absence to consultation through the study, urinary tract infection or viral infection. The mean age of the population at baseline was 56.88 ± 6.27 years. Baseline and post-treatment data, such as weight, blood pressure and estradiol serum levels are shown in Table I. The figure 1 shows the Estriol+Estradiol (EE) nanoparticles through skin layers performed using the model 3510 Skin Composition Analyzer (model 3510 SCA, River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands). Effect of Estradiol+Estriol Nanoparticles formulation the menopausal symptomatology The menopausal symptomatology analysis of the volunteers subjected to THRT that received a combination of Estradiol (0.25%) + Estriol (0.1%) emulsion revealed a relevant decreasing of menopausal symptoms (Table 2), receiving median score 1 (range, 0-1), whereas a significant symptomatology was found in the charts of patients on the baseline, receiving a median score 3 (range, 2-3). These values were statistically significant (P < 0.05), when THRT treatment was compared to the baseline. 22

Effect of Estradiol+ Estriol Nanoparticles formulation on the therapy satisfaction The comparison of the feeling of satisfaction with this hormone therapy between baseline and the end of treatment is shown in Figure 2. At the end of the first month, the extent of satisfaction with the hormone therapy was ~75%. The continuation of treatment seemed to induce further increases in the extent of satisfaction: 85.2 after one year of THRT and 92.5 ± 4.2% at the end of treatment (P < 0.05). Effect of Estradiol+ Estriol Nanoparticles formulation on the estradiol serum concentration The serum concentration of estradiol, over the 60-month study is shown in Figure 3. Statistical analysis of mean estradiol pretreatment values at baseline was 33.80 ±48.5 pg/mL and after 60 months of THRT showed a significant increase by 53.48 ±78.7 pg/mL. The data reached a statistical difference (p<0.05) in serum after the treatment with the Transdermal Bioidentical Hormone. Final serum values were compared prior to study entry (mean estradiol values prior to study entry and at the end of this study. Effect of Estradiol+ Estriol Nanoparticles formulation the BIRADS classification Concerning the BI-RADS classification, during the 60 months of hormone replacement treatment, no statistically significant changes were observed, however it was performed a comparison on B-0 index that establishes the “undefined” diagnosis. On the Baseline there was 9 patients with B-0 diagnosis and after 60 months of THRT this number was cut by half with only 4 patients with B-0 classification at the end of treatment showed a relevant decrease, however it was not statistically significant (P >0.05) as compared with pretreatment values respectively (Figure 4). Effect of Estradiol+ Estriol Nanoparticles formulation on the weight and blood pressure Changes in weight and blood pressure before and after treatment are shown in Figure 5 and 6. No statistical significant changes in these parameters were observed after 60 months of THRT treatment. Ultrasound assessment of the breasts following 60 months of treatment found no tumor in all women evaluated. No one patient reported vaginal bleeding and no adverse effects were reported by the patients during the study. The figure 7 shows the Estriol+Estradiol particles at Scan Electron Microscopy and the size and distribution of the nanoparticles through Zeta Sizer Nano ZS-90 (Malvern, WR, UK). DISCUSSION The transdermal estrogen therapy protocol is an effective treatment for relieving menopausal symptoms, particularly in those women for whom the adverse effects of the orally administered drugs are

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seen as an impeditive factor, since hormones are cleared in this stage when orally administered (15). The first-pass metabolism is a phenomenon of related with the drug metabolism where the concentration of the drug is greatly reduced before it reaches the systemic circulation. The nanoformulation of Estriol+Estradiol (EE) have shown an interesting controlled released system, delivering estriol and estradiol as early as one to 24 hours after its application on the volar arm of the subjects. The skin concentration analysis can be seen by Raman confocal spectroscopy data (table 3). This transdermal protocol configure the basis for the development of an innovative proposal that was able to validate safety and effectiveness of the nanostructured formulation used. Many studies relates the use of transdermal hormone therapy to relieve menopausal symptoms and also used for prevention of osteoporosis and cardiovascular diseases (16). Topical application of active substances offers an additional option in hormone therapy (17). The Estriol+Estradiol emulsion was studied in women showing expressive results on these patients (18). In the present study, we have shown the safe and efficacy of a transdermal nanoparticulated controlled system, this data was evaluated following 122 women for 60 months. As far as we concern, for first time Confocal Raman Spectroscopy was used to validate the transdermal absorption, thus, this methodology was able to explain the effect of penetration of hormones enhancer (BIOLIPID/B2®). This compound was able to show a very stable controlled released system delivering nanoparticles of estradiol and estriol, from one to 24 hours evaluation. Through this technique it was possible to measure in vivo the depth and percentage of tested nanoparticulated hormones. This data can be seen clearly on the figure 1 and 3. The transdermal effect of a nanoparticles formulation of Estriol+Estradiol emulsion plays a positive role on menopausal symptomatology; this effect was associated with reduction of the main complaints recorded at baseline (Table 2). Other interesting issue to be noticed over this 60 month study is that the transdermal therapy was not able to produce any kind of skin irritation or redness on the volunteers. The weight gain is an important matter to be discussed, which is characteristically seen in the patients subjected to the use of oral hormones or contraceptives (19). However after 60 month therapy, this phenomenon was not seen (Figure 5) over the 60 montns study follow-up. No statistical differences were observed between baseline and after THRT (P>0.05). The importance of this transdermal therapy, promotes a continuous stable systolic and diastolic blood pressure, in the present study,

the systolic blood pressure showed a slight decrease 60 months after starting treatment as compared with mean baseline values (figure 6). The reason for these results is not known, and further investigation in a larger number of patients is indicated. It is reasonable to speculate, the mechanism of action of transdermal hormone therapy. When applied to the stratum corneum (topical application) Estriol+Estradiol emulsion is absorbed into the underlying tissues, being able to deliver the hormones nanoparticles as a very stable drug released system, thus, it was possible to measure the increasing serum level of estradiol reducing menopausal complaints. A previous study showed that the use of percutaneous 17 estradiol emulsion was indicated for the treatment of vasomotor symptoms in postmenopausal women. This clinical approach has been shown as an actual tendency towards to choose this kind of therapy to treat menopausal disorders (20). From the findings of this experiment we can assume that this nanoparticles formulation, have proven to be safe and efficacy treating menopausal symptomatology. CONCLUSIONS Within the limitation of this trial, it was demonstrated that Estriol+Estradiol nanoemulsion is effective in reducing menopausal symptoms and the tested emulsion was able to restore the serum levels of estradiol in all patients and no statistical variations were seen on weight or blood pressure in post-menopausal women. These activities could support the continued investigation of nanoparticulated hormones as a potential therapeutic agent in hormone replacement therapy. The results may have an important impact in order to create in a close future an effective agent for use in the government women health programs, thus further studies are warranted to clarify its usefulness in a large sample. ACKNOWLEDGMENTS We gratefully acknowledge the financial support of Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq Brazilian Agencies for Scientific and Technological Development for the approval of a Post-Doctoring Scholarship Proc# 151080/20100. Special thanks to Rector Samela Gomes de Oliveira for the infrastructure support. Thanks also to Prof. Maria de Fatima Grossi (CAPES) and Prof. Claudio Ricardo Gomes de Lima (IFCE Dean). References 1. Simon, J.A., ESTRASORB® Study Group (2006) Menopause. 13: 222-231. 2. Botelho, M.A., Martins, J.G., Ruela, R.S., Queiroz, D.B., Ruela, W.S (2010) J Appl Oral Sci. 18: 335-80. 3. Botelho, M.A., dos Santos, R.A., Martins, J.G., Carvalho, C.O., Paz, M.C., Azenha, C., Ruela, R.S., Queiroz, D.B., Ruela, W.S., Marinho G & Ruela, F.I (2009) Phytother Res. 23: 1214-9.

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4. Kumar, R., Philip, A (2007) Trop J Pharm Res. 6: 633-44. 5. Ruoslahti, E., Bhatia, S.N., Sailor, M.J (2010) J Cell Biol. 188: 759-68 6. Berecki-Gisolf, J., Begum, N., Dobson, A.J., (2009) Menopause. 16:1021-1029. 7. Nabulsi, A.A., Folsom, A.R., White, A., Patsch, W., Heiss, G., Wu, K.K., Szklo, M (1993) N Engl J Med. 328: 1069-1075. 8. Gadducci, A., Guerrieri, M.E., Genazzani, A.R (2012) Minerva Ginecol. 64:67-74. 9. Burbos, N., Musonda, P., Duncan, T.J., Crocker, S.G., Nieto, J.J., Morris, E.P (2012) Menopause Int. 18: 5-9. 10. Lin, E., McCabe, E., Newton-Cheh, C., Bloch, K., Buys, E., Wang, T., Miller, K.K (2012) Fertil Steril. 97: 489-493. 11. Margarido, P.F., Bagnoli, V.R., Maggio da Fonseca, A., Maciel, G.A., Soares, J.M.Jr., D’Amico, E.A., Baracat, E.C (2011) Clin Exp Obstet Gynecol. 38: 232-235. 12. Caspers, P.J., Lucassen, G.W., Carter, E.A., Bruining, H.A., Puppels, G.J (2001) J Invest Dermatol. 116: 434-442. 13. Boncheva, M., de Sterke, J., Caspers, P.J., Puppels, G.J (2009) Exp Dermatol. 18:870-876. 14. American College of Radiology (2003) ACR BI-RADS®Mammography: Breast Imaging Reporting and Data System, Breast Imaging Atlas, vol 4. ACR, Preston 15. A.C. Williams, W.B. Barry (2004) Adv Drug Deliv Rev. 56: 603618. 16. Boothby, A., Doering, P.L., Kiperstok, S (2004) Menopause. 11: 356-368 17. Mélot, M., Pudney, P.D., Williamson, A.M., Caspers, P.J., Van Der Pol, A., Puppels, G.J (2009) J Control Release, 138: 32-39. 18. Archer, D.F., Pickar, J.H., Macallister, D.C., Warren, M.P (2012) Menopause Jan 26. [ahead of print] 19. Bonny, A.E., Secic, M., Cromer, B.A (2011) J Pediatr Adolesc Gynecol. 24: 35-38. 20. Archer, D.F., EstroEmulsion Study Group (2003) Menopause. 10:516-521.

Table 2: Symptomatology analysis of the effect of the nanoparticles formulation of Estriol+Estradiol emulsion on menopausal complaints.

* P<0.05 compared to baseline values (Kruskal-Wallis)

Table 3: Raman Confocal spectroscopy analysis on skin layers of estradiol nanoparticles concentration.

FIGURES AND LEGENDS

Figure 1.

TABLES Table 1. Characteristics of women on the Baseline and women treated with THRT after 60 month follow-up.

Figure 1: Skin Layer Analysis - Nanoparticles concentration of Estriol+Estradiol on the dermis. The skin depth concentration of the hormones was measured at 1,3,6,21 and 24 hours after transdermal application. (Model 3510 SCA, River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands). a

Fisher’s exact test; b t-test; c Chi Square test. 24

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Figure 4

Figure 2

Figure 2: The satisfaction of the treatment in 100 women submitted to the transdermal hormone replacement therapy (THRT) during 60 months. Estriol+Estradiol emulsion was administered topically in women with menopause. The continuation of treatment seemed to induce further increases in the extent of satisfaction: 85.2 after one year of THRT and 92.5 ± 4.2% at the end of treatment (P < 0.05).

Figure 3

Figure 4: Effect of Nanoparticles formulation emulsion on Birads undefined classification in 100 women submitted to the transdermal hormone replacement therapy (THRT) during 60 months. Estriol+Estradiol emulsion was administered topically in women with menopause. *P<0.05 was considered significantly different compared to baseline values (Student’s T test).

Figure 5

Figure 3: Effect of Nanoparticles formulation emulsion on Estradiol serum concentration (ESC) in 100 women submitted to the transdermal hormone replacement therapy (THRT) during 60 months. The emulsion was administered topically in women with menopause. Mean values are shown, SE is indicated by error bars. *P<0.05 was considered significantly different compared to baseline values (Student’s T test).

Figure 5: Effect of Nanoparticles formulation emulsion on weight in 100 women submitted to the transdermal hormone replacement therapy (THRT) during 60 months. Estriol+Estradiol emulsion was administered topically in women with menopause. Mean values are shown, SE is indicated by error bars. *P<0.05 was considered significantly different compared to baseline values (Student’s T test).

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Figure 6

Figure 6: Effect of Nanoparticles formulation emulsion on Systolic and Diastolic Blood pressure in 100 women submitted to the transdermal hormone replacement therapy (THRT) during 60

Estriol+Estradiol emulsion was administered topically in women with menopause. Mean values are shown, SE is indicated by error bars. *P<0.05 was considered significantly different compared to

months.

baseline values (Student’s T test).

Figure 7A

Figure 7: (A) Microscopic analyses of Estriol+Estradiol particles at Scanning electron microscope (SEM). (B) Size and distribution particles analysis (Estriol+Estradiol Nanoformulation). Zetasizer Nano ZS90 from Malvern Instruments Ltd. (Worcestershire,UK.England) 26

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6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS UTILIZADAS PARA REALIZAÇÃO DOS ESTUDOS CLÍNICOS MONOCÊNTRICOS DESENVOLVIDOS COM BIOLIPÍDEO B2® EM SERES HUMANOS. Paul D. A. Pudney, Michael Mélot, Peter J. Caspers, Andre Van Der Pol, and Gerwin J. Puppels. Na In Vivo Confocal Raman Study of the Delivery of Trans-Retinol to the Skin. Applied Spectroscopy, 61 edition, 2007. 2. Park K.. Confocal Raman Spectroscopy to Study In Vivo Skin Penetration of Retinol, Journal of Controlled Release, 2009. 3. MINISTÉRIO DA SAÚDE/CONSELHO NACIONAL DE SAÚDE; Resolução No 196, de 10 de Outubro de 1996 – Diretrizes e Normas Reguladoras de pesquisas envolvendo seres humanos. 4. Slobodan Sasic. Pharmaceutical Applications of Raman Spectroscopy. 5. Ewen Smith, Geoffrey Dent. Modern Raman Spectroscopy – A Practical Approach. 6. Holbrook KA. The biology of human fetal skin at ages related to prenatal diagnosis. Pediatr Dermatol 1: 97-111, 1983. 7. Breathnach AS. Aspects of epidermal ultrastructure. J Invest Dermatol 65: 2-15, 1975.

11. P. J. Caspers, G.W. Lucassen, R. Wolthuis, H.A. Bruining, G. J. Puppels. In Vitro and In Vivo Raman Spectroscopy of Human Skin. 12. Paul D.A. Pudney, Michael Mélot, Peter J. Caspers, Andre Van Der Pol and Gerwin J. Puppels. Na In Vivo Confocal Raman Study of the Delivery of Thans-Retinol to the Skin. 13. Wilkes GL, Brown IA, Wildnauer RH. The biomechanical properties of skin. CRC Crit Rev Bioeng 453–495, 1973. 14. Kalinin A, Marekov LN, Steinert PM. Assembly of the epidermal cornified cell envelope. Journal of Cell Science 114: 3069-3070, 2001. 15. Lampe MA, Williams ML, Elias PM. Human epidermal lipids: characterization and modulations during differentiation. J Lipid Res 24: 131–140, 1983. 16. Harding CR, Watkinson A, Rawlings AV. Dry skin, moisturization and corneodesmolysis. Int J Cosm Sci 22: 21-52, 2000.

8. Tzaphlidou, M. The role of collagen and elastin in aged skin: an image processing approach. Micron 35: 173-177, 2004.

17. Zhang G, Moore DJ, Mendelsohn R, Flach CR. Vibrational Microspectroscopy and Imaging of Molecular Composition and Structure During Human Corneocyte Maturation. J Invest Dermatol 126: 1088-1094, 2006.

9. Jackson SM, Elias PM. Epidermis as an organ of protection. In: Fitzpatrick TB, Eisen AZ, Wolff K, Freedberg IM, Austen KF, eds: Dermatology in General Medicine, 4th edition. New York, NY, McGraw- Hill, 1993.

18. Morganti P. Skin hydration. Cosmet Sci Technol 19: 71-97, 1999.

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7. EXPERTIZE CIENTÍFICA DO GRUPO EVIDENCE 6.1 DRA. DINALVA BRITO DE QUEIROZ

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7. EXPERTIZE CIENTÍFICA DO GRUPO EVIDENCE 6.2 DR. MARCO BOTELHO

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8. PROTOCOLOS DE COOPERAÇÃO & PARCERIAS CIENTÍFICAS

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8. PROTOCOLOS DE COOPERAÇÃO & PARCERIAS CIENTÍFICAS

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9. PRODUÇÃO CIENTÍFICA Produção em C,T & A Produção bibliográfica Citações Web of Science Total de trabalhos: 6 Total de citações: 77 Fator H5 BOTELHO MA Data: 04/09/2011 SciELO Total de trabalhos: 2 Total de citações: 13 Botelho, MA Data: 26/06/2011 SCOPUS Total de trabalhos: 8 Total de citações: 85 Botelho, MA Data: 04/09/2011

Produção bibliográfica Citações Web of Science Total de trabalhos: 5 Total de citações: 3 Queiroz DB Data: 28/02/2011 SCOPUS Total de trabalhos: 5 Queiroz DB

Total de citações: 6 Data: 28/02/2011

Artigos completos publicados em periódicos 1. Quintans-Júnior, Lucindo J. ; Guimarães, Adriana G. ; Santana, Marilia T. de ; Araújo, Bruno E.S. ; Moreira, Flávia V. ; Bonjardim, Leonardo R. ; Araújo, Adriano A. S. ; Siqueira, Jullyana S. ; Antoniolli, Ângelo R. ; Botelho, Marco A. ; Almeida, Jackson R. G. S. ; Santos, Márcio R. V. . Citral reduces nociceptive and inflammatory response in rodents. Revista Brasileira de Farmacognosia (Impresso), v. 21, p. 497502, 2011. 2. Franco, Clóvis R. P. ; Antoniolli, Ângelo R. ; Guimarães, Adriana G. ; Andrade, Daniela M. ; Jesus, Hugo C. R. ; Alves, Péricles B. ; Bannet, Leonard Edward ; Patrus, Ana Helena ; Azevedo, Eduardo G. ; Queiroz, Dinalva B. ; Quintans-Júnior, Lucindo J. ; BOTELHO, Marco Antonio . Bioassay-guided Evaluation of Antinociceptive Properties and Chemical Variability of the Essential Oil of Hyptis fruticosa. PTR. Phytotherapy Research, v. 28, p. n/a-n/a, 2011. 3. Bonjardim, L. R. ; Silva, A. M. ; Oliveira, M. G. B. ; Guimarães, A. G. ; Antoniolli, A. R. ; Santana, M. F. ; Serafini, M. R. ; Santos, R. C. ; Araújo, A. A. S. ; Estevam, C. S. ; Santos, M. R. V. ; Lyra, A. ; Carvalho, R. ; Quintans-Júnior, L. J. ; Azevedo, E. G. ; Botelho, M. A. . Sida cordifolia Leaf Extract Reduces the Orofacial Nociceptive Response in Mice. PTR. Phytotherapy Research, v. 25, p. 1236-1241, 2011. 4. Costa, Jose ; Brito, Samara ; Nascimento, Eidla ; Botelho, Marco ; Rodrigues, Fabiola ; Coutinho, Henrique . ANTIBACTERIAL PROPERTIES OF PEQUI PULP OIL (Caryocar coriaceum - Wittm.). International Journal of Food Properties, v. 99999, p. 1-1, 2010. 5. Botelho, M. A. ; Silva FT ; Martins E . Circunferência Abdominal como Preditor de Risco de Doenças Cardiovasculares na Terceira Idade. The FIEP Bulletin, v. 80, p. 660-664, 2010. 6. BOTELHO, Marco Antonio ; QUINTANS JR, L. ; PAIXAO M.S . ANTIINFLAMMATORY EFFECT OF DICLOFENAC DIETHYLAMMONIUM GEL ON ACUTE PHASE OF LIGATURE INDUCED PERIODONTITIS IN RATS. Acta Farmaceutica

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Capítulos de livros publicados 1. Park, HS ; AZENHA, C. R. ; BOTELHO, Marco Antonio ; Macluf E ; VILLELA, LGS ; Araújo, RFA . Chapter 5/6 Protraction of a molar or molars / Forced Eruption (tradução). Pequenos movimentos dentários com mini-implantes: Auxílio no tratamento ortodôntico, na reabilitação protética e no preparo para implantes. 01 ed. Nova Odessa / SP: Editora Napoleão Ltda - ME, 2009, v. , p. 01-187. 2. AZENHA, C. R. ; Macluf E ; BOTELHO, Marco Antonio . Sequencia da Mecânica. In: Claudio Azenha, Eduardo Macluf. (Org.). Protocolos de Ortodontia. 1 ed. Campinas: Napoleão, 2008, v. 1, p. 358-386. 3. BOTELHO, Marco Antonio . Alecrim-pimenta. In: Rozeli Coelho Silva. (Org.). Plantas Medicinais na Saúde Bucal. Vitória: , 2001, v. , p. 26-26.

Textos em jornais de notícias/revistas 1. BOTELHO, Marco Antonio . PROJETO DO PROGRAMA RHAE DESENVOLVE FITOFÁRMACOS COM NANOTECNOLOGIA NO NORDESTE. Portal Ministério da Ciência e Tecnologia, Brasila, 08 abr. 2010. 2. BOTELHO, Marco Antonio . ALECRIM PIMENTA COMBATE A CÁRIE. Jornal da UFC, Fortaleza, v. 8, p. 10 - 10, 20 abr. 2006.

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3. BOTELHO, Marco Antonio ; PINHEIRO, Frederico Augusto Gurgel . Questoes do Concurso do PSF podem ser Anuladas. Jornal Diario do Nordeste, Fortaleza, v. 2, p. 12 - 12, 22 dez. 2005. 4. BOTELHO, Marco Antonio . Gosto de alecrim Pesquisas brasileiras mostram a eficácia da planta na prevenção de cáries. ISTOÉ, São Paulo, v. 1883, p. 56 - 57, 16 nov. 2005. 5. BOTELHO, Marco Antonio . Projeto Cuida da Saude Oral de Moradores de Mundaú. Diario do Nordeste, Fortaleza, v. 5, p. 11 - 11, 07 nov. 2005. 6. BOTELHO, Marco Antonio . Ceará já exporta óleo da planta. Diario do Nordeste, fortaleza, v. 5, p. 12 - 12, 07 nov. 2005. 7. BOTELHO, Marco Antonio . Planta Usada na Prevenção das Cáries . Diario do Nordeste, Fortaleza, v. 1, p. 1 - 1, 06 nov. 2005. 8. BOTELHO, Marco Antonio . Alecrim-pimenta previne cárie. Diário do Nordeste, Brasil, p. 14 - 14, 06 nov. 2005. 9. BOTELHO, Marco Antonio . Cearense integra Operação Sorriso nas Filipinas. Diário doi Nordeste, Fortaleza, p. 08 - 08, 18 fev. 2000. 10. BOTELHO, Marco Antonio . Pessoas com podem ser curadas. Jornal da Rua, Fortaleza, p. 03 - 03, 28 fev. 1999. 11.BOTELHO, Marco Antonio . Viva a Saúde. Jornal DN. Infantil, Fortaleza / Ce, v. 604, 10 dez. 1995. 12. BOTELHO, Marco Antonio . Fluoretação da Água em Debate. Jornal Diário do Nordeste, Fortaleza / Ce, 08 abr. 1994. 13. BOTELHO, Marco Antonio . Odontologia Descobre Novo Anti-Séptico. Jornal Tribuna do Ceará, Fortaleza / Ce, 22 nov. 1993. 14. BOTELHO, Marco Antonio . A Eficácia do Álcool na limpeza das mãos. Jornal da Associação Brasileira de Odontologia, p. 9 - 9, 08 set. 1993. 15. BOTELHO, Marco Antonio . Alecrim da Prêmio. Jornal Diário do Nordeste, Fortaleza / Ce, p. 25 - 25, 16 maio 1993. 16. BOTELHO, Marco Antonio . O Sorriso da Vitória. Jornal O Povo, Fortaleza / Ce, p. 4 - 4, 22 ago. 1992. 17. BOTELHO, Marco Antonio . O Flúor na Água de Fortaleza. Jornal da Associação Brasileira de Odontologia, v. 5, p. 5 - 5, 08 ago. 1992. 18. BOTELHO, Marco Antonio . Estudante Conquista Prêmio Kolynos. Jornal da ABO, Fortaleza / Ce, v. 6, p. 4 - 4, 01 ago. 1992. 19. BOTELHO, Marco Antonio . Jovem Ganha Prêmio em Odontologia. Jornal O Povo, Fortaleza / Ce, p. 14 - 14, 22 jun. 1992. 20. BOTELHO, Marco Antonio . Derrubando um Mito. Jornal Diário do Nordeste, Fortaleza / Ce, p. 11 - 11, 30 maio 1992. 21. BOTELHO, Marco Antonio . Aluno da Odontologia Vencedor de Concurso Recebe o Concultório. Jornal Diário do Nordeste, Fortaleza / Ce, p. 11 - 11, 30 maio 1992. 22. BOTELHO, Marco Antonio . Aluno da Odontologia Recebe Prêmio e Faz Crítica a Universidade. Jornal Diário do Nordeste, Fortaleza / Ce, p. 12 - 12, 29 maio 1992. 23. BOTELHO, Marco Antonio . Bomba Relógio sem Efeito. Jornal Diário do Nordeste, Fortaleza / Ce, p. 11 - 11, 01 abr. 1992. 24. BOTELHO, Marco Antonio . Aluno de Odontologia é Premiado com Consultório. Jornal Diário do Nordeste, Fortaleza / Ce, p. 11 - 11, 01 abr. 1992. 25. BOTELHO, Marco Antonio . Cearense Ganha Prêmio Kolynos. Jornal da Associação Brasileira de Odontologia (SESSÃO CE), Fortaleza / Ce, v. 5, p. 9 - 9, 01 abr. 1992. 26. BOTELHO, Marco Antonio . Anti-Sépticos. Jornal da Associação Brasileira de Odontologia (SESSÃO CE), Fortaleza / Ce, v. 5, p. 9 - 9, 01 abr. 1992. 27. BOTELHO, Marco Antonio ; SOARES, Juarez Braga . Limpeza das Mãos - A eficácia do etanol e álcool. Jornal da Associação Brasileira de Odontologia (SESSÃO CE), p. 9 - 10.

Trabalhos completos publicados em anais de congressos 1. ARAÚJO, A B ; Botelho, M. A. . Degradação eletroquímica de fenol e nitrofenóis em solução aquosa.. In: 15º Congresso Brasileiro de Catálise / 5º Congresso Brasileiro de Catálise do Mercosul CBCAT 2009, 2009, Armação de Búzios. Anais 15º Congresso Brasileiro de Catálise/ 5º Congresso Brasileiro de Catálise do Mercosul CBCAT 2009,, 2009. 2. ARAÚJO, A B ; BOTELHO, Marco Antonio . Descoloração foto-assistida de corante azo e índigo em solução aquosa. In: 15º Congresso Brasileiro de Catálise/ 5º Congresso Brasileiro de Catálise do Mercosul CBCAT, 2009, Armação de Búzios. Anais 15º Congresso Brasileiro de Catálise/ 5º Congresso Brasileiro de Catálise do Mercosul CBCAT, 2009. 3. BOTELHO, Marco Antonio ; SILVA, A M ; BEZERRA, A C S . Determinações Quantitativas de Cálcio e Fosfato no Esmalte e na Raiz de Dentes Extraídos de Pessoas Adultas. In: I Encontro Universitário de Iniciação à Docência, 1992. Anais do I Encontro Universitário de Iniciação à Docência. p. 45-45. Resumos expandidos publicados em anais de congressos 1. BOTELHO, Marco Antonio ; Araujo, RS . O GEL DENTAL DE ALECRIM

PIMENTA (LIPPIA SIDOIDES) COM NANOPARTÍCULAS NA DOENÇA PERIODONTAL EXPERIMENTAL (DPE): AVALIAÇÃO MICROBIOLÓGICA. In: III Congresso de Pesquisa e Inovação da Rede Norte Nordeste de, 2008, Fortaleza. CONEPI 2008, 2008. 2. Oliveira M.S ; BOTELHO, Marco Antonio . ADSORÇÃO DE CORANTES ÁCIDOS E BÁSICOS, EM FASE AQUOSA, UTILIZANDO MATERIAL MCM-41 CONTENDO ALUMÍNIO. In: III Congresso de Pesquisa e Inovação da Rede Norte Nordeste de, 2008, Fortaleza. CONEPI 2008, 2008. 3. BOTELHO, Marco Antonio . Análise do Nível de Satisfação dos Usuários do CS Irmã Ecília Aragão.. In: 1ª Mostra do Sistema Municipal de Saúde Escola, 2007, Fortaleza. 1ª Mostra do Sistema Municipal de Saúde Escola, 2007. 4. BOTELHO, Marco Antonio . A correlação entre Periodontite e Doença Cardio-Vascular: Um estudo Caso-Controle. In: XIII CONGRESSO DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE CARDIOLOGIA - CE, 2007, FORTALEZA. Revista da Sociedade Cearense de Cardiologia. Fortaleza : Sociedade Cearense de Cardiologia, 2007. v. 8. p. 58-58. 5. SOUZA, A. J. S. ; Sousa, E.S. ; Carvalho, P.H.R. ; CARVALHO, Cibele Barreto Mano ; MONTENEGRO, Danusa ; SANTOS FILHO, Emídio A ; SOUZA, Julia Aparecida Lourenço de ; HEUKELBACH, Jorg ; FONSECA, Said Gonçalves da Cruz ; BOTELHO, Marco Antonio . Effect of a novel essential oil mouthwash on salivary Streptococcus mutans levels: a double blind randomized study. In: 1ST NATIONAL SYMPOSIUM ON CLINICAL PHARMACY, 2006, Fortaleza. 1ST NATIONAL SYMPOSIUM ON CLINICAL PHARMACY. 6. M NETO, Renato ; CARVALHO, Cibele B Mano de ; SILVA, Sônia L da ; MORAIS, Maria Elizabete ; BOTELHO, Marco Antonio ; MATOS, Francisco José de A ; LEMOS, Telma Leda G ; PESSOA, Otília Deusdênia L . Atividade antibacteriana in vivo do óleo essencial de Lippia aff. Gracilis. In: 28ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2005, Poços de Caldas. Anais da 28ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2005. 7. BOTELHO, Marco Antonio ; PASSEGI, M ; LINHARES, A ; GAPSKI, R . Popular Eduction: Syncretism and Representations in Brazilians’Public Health. In: European Congress of Epidemiology 2004, 2005, Porto. Journal of Epidemiology and Community Health, 2005. v. 58. 8. BOTELHO, Marco Antonio ; LINHARES, Ângela Maria Bessa ; PASSEGGI, M . Water Treatment Station: fluoridation poison or holy water?. In: 2nd Internation Conference on Local and Regional Health Programmes, 2004, Quebéc. Annals of the 2nd Internation Conference on Local and Regional Health Programmes, 2004. v. 1. p. 196-197. 9. Botelho, M. A. . A new method for caries prevention in public health: efficacy of an antiseptc mouthrinse prepared with alecrim-pimenta essential oil (Lippia Sidoides Cham). In: EpiEURO, 2004, Lisboa. Epieuro2004, 2004. v. 58. p. 64-64. 10. BOTELHO, Marco Antonio . A new method for caries prevention in public health: efficacy of an antiseptc mouthrinse prepared with alecrim-pimenta essential oil (Lippia Sidoides Cham).. In: EpiEURO, 2004, Lisboa. Epieuro2004. v. 58. p. 6464.

Resumos publicados em anais de congressos 1. Araujo, RS ; BOTELHO, Marco Antonio ; Ruela RS . CHEMICAL COMPOSITION OF THE ESSENTIAL OIL BY GC/MS TECHNIQUE IN MICROSPHERES GEL FOR GINGIVITIS CONTROL IN PATIENTS WITH ORTHODONTIC APPLIANCES. In: COLACRO XII - Congresso Latino-Americano de Cromatografia e Técnicas Relacionadas, 2008, Florianópolis. Anaias do COLACRO XII - Congresso LatinoAmericano de Cromatografia e Técnicas Relacionadas, 2008. 2. Araujo, RS ; BOTELHO, Marco Antonio . Al-MCM-41 MESOPOROUS MATERIAL AS STACIONARY PHASE FOR SEPARATION AND QUANTIFICATION OF THE PYRENE: A SIMPLIFIED STUDY BY LIQUID CHROMATOGRAPHY. In: COLACRO XII - Congresso Latino-Americano de Cromatografia e Técnicas Relacionadas, 2008, Florianópolis. Anais COLACRO XII - Congresso Latino-Americano de Cromatografia e Técnicas Relacionadas, 2008. 3. BOTELHO, Marco Antonio ; ARAÚJO, A B ; COSTA, José Galberto Martins da . EFICÁCIA DO NANOGEL DE ALECRIM PIMENTA NA REDUÇÃO DA PLACA BACTERIANA E GENGIVITE: ENSAIO CLÍNICO CONTROLADO RANDOMIZADO. In: INOVA 2008, 2008. INOVA 2008, 2008. 4. BOTELHO, Marco Antonio ; VASCONCELOS, R . FITOTERAPIA X GINECOLOGIA: O ÓLEO ESSENCIAL DO ALECRIM-PIMENTA NO CONTROLE DAS INFECÇÕES POR CANDIDA ALBICANS. In: 52 Congresso Brasileiro de Ginecologia e Obstetrícia - CBGO., 2007, FORTALEZA. 52 Congresso Brasileiro de Ginecologia e Obstetrícia - CBGO.. FORTALEZA, 2007. 5. BOTELHO, Marco Antonio ; MONTENEGRO, Danusa ; BEZERRA FILHO, JOSE GOMES . O Antisséptico Bucal de Alecrim Pimenta (Lippia Sidoides) no Programa de Saúde da Família: um ensaio clínico duplo cego controlado e randomizado.. In: 1ª Mostra do Sistema Municipal de Saúd e Escola e 1ª Seminário Municipal de Saúde do Trabalhador da Saúde SUS, 2007, 2007, Fortaleza. 1ª Mostra do Sistema Municipal de Saúde Escola 2007. Fortaleza, 2007.

Grupo Evidence | Dossiê Científico BIOLIPÍDEO B2® 2011 | Profa. Dinalva Queiroz, Pharm.B., MSc, e Prof. Marco A. Botelho, DDS,MSc,PhD

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6. BOTELHO, Marco Antonio . Análise da Distância do domicílio ao CS Hercília Aragão no Controle e Tratamento do Diabettes Mellitus e Hipertensão no Programa de Saúde da Família.. In: 1ª MOSTRA DO SISTEMA MUNICIPAL DE SAÚDE ESCOLA, 2007, Fortaleza. 1ª MOSTRA DO SISTEMA MUNICIPAL DE SAÚDE ESCOLA, 2007. 7. BOTELHO, Marco Antonio . O Programa de Odontologia Integral (POI) no Programa de Saúde da Família: uma conquista do usuário no CS Irmã Hercília Aragão.. In: 1ª Mostra do Sistema Municipal de Saúde Escola, 2007, Fortaleza. 1ª Mostra do Sistema Municipal de Saúde Escola, 2007. 8. BOTELHO, Marco Antonio ; Pessoa JP . Acurácia do uso de indices antropométricos na prevalências da Hipertensão Arterial. In: XIII Congresso Cearense de Cardiologia, 2007, Fortaleza. Revista da sociedade cearense de Cardiologia. Fortaleza : Sociedade Cearense de cardiologia, 2007. v. 8. p. 60-60. 9. BOTELHO, Marco Antonio ; Pitombeira M . Epidemiologia da Hipertensão Arterial Sistêmica em Fortaleza utilizando o Sistema de Informações Geográficas: Uma análise espacial. In: XIII CONGRESSO CEARENSE DE CARDIOLOGIA, 2007, Fortaleza. Revista da Sociedade Cearense de Cardiologia. Fortaleza : Sociedade Cearense de Cardiologia, 2007. v. 8. p. 58-58. 10. BOTELHO, Marco Antonio ; Silva C.G . Baixo peso ao nascer: Uma analise em Fortaleza de 2004 a 2006. In: Enfermaio, 2007, Fortaleza. XI ENFERMAIO, 2007. 11. BOTELHO, Marco Antonio ; HEUKELBACH, Jörg ; MONTENEGRO, Danusa ; FONSECA, Said Gonçalves da Cruz . The antimicrobial activity of a novel chlorhexidine mouthrinse sweetened with stevioside.. In: 1. Simpósio Brasileiro de Farmácia Clínica, 2006, Fortaleza. Simpósio Brasileiro de Farmácia Clínica, 2006. 12. BOTELHO, Marco Antonio . Clinical, laboratorial and bioethical aspects of a clinical trial assessing the efficacy of new compounds for the control of bacterial plaque and gingivitis. 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Resumos do XXIV Encontro Universitário de Iniciação à Pesquisa, 2005. 15. SOUZA, Júlia Aparecida Lourenço de ; FONSECA, Said Gonçalves da Cruz ; HEUKELBACH, Jorg ; BOTELHO, Marco Antonio ; CARVALHO, Cibele Barreto Mano ; LEMOS, Telma Leda G . Ação Antimicrobiana Comparativa de Antisépticos Bucais à Base de Clorhexidina Edulcorados com Sacarina e Steviosídeo. In: XXIV Encontro Universitário de Iniciação à Pesquisa, 2005, Fortaleza. Resumo do XXIV Encontro Universitário de Iniciação à Pesquisa, 2005. 16. BOTELHO, Marco Antonio ; PASSEGGI, M . A NEW METHOD FOR CARIES PREVENTION IN PUBLIC HEALTH: EFFICACY OF AN ANTISEPTIC MOUTHRINSE PREPARED WITH ALECRIM-PIMENTA ESSENTIAL OIL (LIPPIA SIDOIDES CHAM). In: Epropean Epidemiology Congress, 2004, Porto. Journal of Epidemiology and Community Health. Portugal, 2004. v. 58:. p. 12-12. 17. BOTELHO, Marco Antonio ; PASSEGGI, M ; LINHARES, Ângela Maria Bessa ; FÉRRER, Kátia Novelo ; MATOS, Francisco José de Abreu . POPULAR EDUCATION: SYNCRETISM AND REPRESENTATIONS IN BRAZILIANS PUBLIC HEALTH. In: European Epidemiology Congress, 2004, Porto. Journal Epidemiology And Community Health. Portugal, 2004. v. 58. p. 64-65. 18. BOTELHO, Marco Antonio . Biossegurança - Desinfecção das Mãos . In: XXX Congresso Brasileiro de Odontologia, 1999, Fortaleza. Anais do XXX Congresso Brasileiro de Odontologia, 1999. p. 05-05. 19. BOTELHO, Marco Antonio . Biossegurança -Desinfecção das Mãos . In: XIII Congresso Cearense de Odontologia, 1999, Fortaleza. Anais do XIII Congresso Cearense de Odontologia, 1999. p. 05-05. 20. BOTELHO, Marco Antonio ; DUARTE, Flávia Neves ; TÁVORA, Flora Freitas Fernandes . O uso de plantas medicinais na prevenção da cárie dental. In: XXX Congresso Brasileiro de Odontologia, 1999, Fortaleza. Anais do XXX Congresso Brasileiro de Odontologia, 1999. p. 10-10. 21. BOTELHO, Marco Antonio ; DUARTE, Flávia Neves ; TÁVORA, Flora Freitas Fernandes . O uso de plantas medicinais na prevenção da cárie dental . In: XIII Congresso Cearense de Odontologia, 1999, Fortaleza. Anais do XIII Congresso Cearense de Odontologia, 1999. p. 10-10. 22. BOTELHO, Marco Antonio ; SOARES, Juarez B . O Óleo essencial do Alecrim-Pimenta (Lippia sidoides cham) na Prevenção da Cárie Dental. In: XIII Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil, 1994, Fortaleza. Resumo de Temas Livres do XIII Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil, 1994. p. 6-6. 23. BOTELHO, Marco Antonio ; SOARES, J B . Método Prático para Determinação do Risco de Cáries Através do Isolamento de S. mutans. In: XII

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Encontro Universitário de Iniciação à Pesquisa, 1993, Fortaleza. Anais do XII Encontro Universitário de Iniciação à Pesquisa, 1993. p. 246-246. 24. BOTELHO, Marco Antonio ; SOARES, J B . Estudo da Capacidade Tamponante da Saliva no Tratamento Odontológico Preventivo. In: XII Encontro Universitário de Iniciação à Pesquisa, 1993, Fortaleza. Anais do XII Encontro Universitário de Iniciação à Pesquisa, 1993. p. 246-246. 25. BOTELHO, Marco Antonio ; SOARES, J B . Estudo Comparativo dos Níveis de S. mutans e Lactobacilos Durante o Tratamento Odontológico Preventivo. In: XII Encontro Universitário de Iniciação à Pesquisa, 1993, Fortaleza. Anais do XII Encontro Universitário de Iniciação à Pesquisa, 1993. p. 245-245. 26. BOTELHO, Marco Antonio . O Uso dos Parafusos Recuperadores de Espaço na Correção das Más Oclusões. In: XII Encontro Universitário de Iniciação à Pesquisa, 1993, Fortaleza. Anais do XII Encontro Universitário de Iniciação à Pesquisa, 1993. p. 244-244. 27. BOTELHO, Marco Antonio ; FIUZA, I M ; LEITÃO, Neto D . Avaliação Comparativa dos Antissepticos Frente aos Estreptococos Sanguis e Salivarius (in vitro). In: 10º Encontro Universitário de Iniciação à Pesquisa, 1992, Fortaleza. Anais do 10º Encontro Universitário de Iniciação à Pesquisa, 1992. v. único. p. 203-204. 28. BOTELHO, Marco Antonio ; LEITÃO, Neto D . Análise Comparativa dos PH’s dos Cremes Dentais na Incorporação do Flúor no Esmalte Dental. In: 10º Encontro Universitário de Iniciação à Pesquisa, 1992, Fortaleza. Anais do 10º Encontro Universitário de Iniciação à Pesquisa, 1992. v. único. p. 301-302. 29. BOTELHO, Marco Antonio ; LEITÃO, Neto D . A Vaidade Clínica do Uso do Plástico na Limpeza das Faces Interproximais em Relação ao Fio Dental. In: 10º Encontro Universitário de Iniciação à Pesquisa, 1992, Fortaleza. Anais do 10º Encontro Universitário de Iniciação à Pesquisa, 1992. v. único. p. 300-301. 30. BOTELHO, Marco Antonio ; LEITÃO, Neto D . O Efeito dos Extratos e Óleos Essenciais de Plantas Frente a Placa Bacteriana (in vitro). In: 10º Encontro Universitário de Iniciação à Pesquisa, 1992, Fortaleza. Anais do 10º Encontro Universitário de Iniciação à Pesquisa, 1992. v. único. p. 302-303. 31. BOTELHO, Marco Antonio ; SOARES, J B . O Óleo Essencial do Alecrim (Lippia Sidoides Cham) na Prevenção da Cárie Dental. In: XI Encontro Universitário de Iniciação as Pesquisas, 1992, Fortaleza. Anais do XI Encontro Universitário de Iniciação as Pesquisas, 1992. 32. BOTELHO, Marco Antonio ; SOARES, J B . Estudo Comparativo da Atividade Antimicrobiana da Vancomicina e Cefalozina Frente aos S.mutans (ss 980) in vitro. In: XI Encontro Universitário de Iniciação as Pesquisas, 1992, Fortaleza. Anais do XI Encontro Universitário de Iniciação as Pesquisas, 1992. 33. BOTELHO, Marco Antonio ; SILVA, A M ; BEZERRA, A C S . Estudo Preliminar da Concentração de Cálcio e Fosfato no Esmalte Cemento Dental. In: XI Encontro Universitário de Iniciação as Pesquisas, 1992, Fortaleza. Anais do XI Encontro Universitário de Iniciação as Pesquisas, 1992. 34. BOTELHO, Marco Antonio ; SILVA, A M . Análise da Concentração de Fluoreto na Água de Abastecimento de Fortaleza. In: XI Encontro Universitário de Iniciação as Pesquisas, 1992, Fortaleza. Anais do XI Encontro Universitário de Iniciação as Pesquisas, 1992. 35. BOTELHO, Marco Antonio ; SOARES, J B . Avaliação Comparativa do Crescimento de S. mutans em Meios de Cultura. In: XI Encontro Universitário de Iniciação as Pesquisas, 1992, Fortaleza. Anais do XI Encontro Universitário de Iniciação as Pesquisas, 1992. 36. BOTELHO, Marco Antonio ; SANTOS, P C F . Os Aparelhos Ortodonticos Removíveis na Correção da Mordida Cruzada Anterior. In: XI Encontro Universitário de Iniciação as Pesquisas, 1992, Fortaleza. Anais do XI Encontro Universitário de Iniciação as Pesquisas, 1992.

Resumos publicados em anais de congresso s(artigos) 1. BOTELHO, Marco Antonio ; SILVA, A M . Estudo Preliminar da Concentração de Fluoreto em Águas de Abastecimento de Fortaleza (uma análise após 12 anos). Jornal da Associação Brasileira de Odontologia, Fortaleza / Ce, n. 6, 1992. Artigos aceitos para publicação 1. Botelho, M. A. ; QUINTANS JR, L. . Phythochemical screening and antimicrobial activity of leaves essential oil from Lippia gracillis Schauer, Verbenaceae. Revista Brasileira de Farmacognosia (Impresso), 2011. 2. BOTELHO, Marco Antonio ; COSTA, José Galberto M da . Enhancement of the antibiotic activity of erythromycin by volatile compounds of Lippia alba (Mill.) N.E. Brown against Staphylococcus aureus. Pharmacognosy Magazine, 2011. 3. Veras H ; Coutinho, Henrique ; COSTA, José Galberto M da ; BOTELHO, Marco Antonio . Lippia alba (Mill.) NE essential oil interferes with aminoglycosides effect Against Staphylococcus aureus. Journal of Essential Oil-Bearing Plants, 2011. Apresentações de Trabalho 1. BOTELHO, Marco Antonio ; QUINTANS JR, L. ; PAIXAO M.S . PHYTOCHEMISTRY AND ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF HYPTIS PECTINATA L. POIT (LAMIACEA) AQUEOUS EXTRACT. 2011. (Apresentação de Trabalho/Comunicação).

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2. Veras H ; BOTELHO, Marco Antonio ; Martins, Jose Galberto . AVALIACAO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E TOXICIDADE DO OLEO ESSENCIAL DE LIPPIA ALBA. 2010. (Apresentação de Trabalho/Simpósio). 3. Araujo, RS ; BOTELHO, Marco Antonio . Al-MCM-41 MESOPOROUS MATERIAL AS STACIONARY PHASE FOR SEPARATION AND QUANTIFICATION OF THE PYRENE: A SIMPLIFIED STUDY BY LIQUID CHROMATOGRAPHY. 2008. (Apresentação de Trabalho/Comunicação). 4. BOTELHO, Marco Antonio ; Araujo, RS . CHEMICAL COMPOSITION OF THE ESSENTIAL OIL BY GC/MS TECHNIQUE IN MICROSPHERES GEL FOR GINGIVITIS CONTROL IN PATIENTS WITH ORTHODONTIC APPLIANCES. 2008. (Apresentação de Trabalho/Comunicação). 5. BOTELHO, Marco Antonio ; Ruela RS . EFICÁCIA DO NANOGEL DE ALECRIM PIMENTA NA REDUÇÃO DA PLACA BACTERIANA E GENGIVITE: ENSAIO CLÍNICO CONTROLADO RANDOMIZADO. 2008. (Apresentação de Trabalho/ Seminário). 6. Araujo, RS ; BOTELHO, Marco Antonio ; Oliveira M.S . ADSORÇÃO DE CORANTES ÁCIDOS E BÁSICOS, EM FASE AQUOSA, UTILIZANDO MATERIAL MCM41 CONTENDO ALUMÍNIO. 2008. (Apresentação de Trabalho/Congresso). 7. BOTELHO, Marco Antonio ; Araujo, RS . O GEL DENTAL DE ALECRIM PIMENTA (LIPPIA SIDOIDES) COM NANOPARTÍCULAS NA DOENÇA PERIODONTAL EXPERIMENTAL (DPE): AVALIAÇÃO MICROBIOLÓGICA. 2008. (Apresentação de Trabalho/Congresso). 8. BOTELHO, Marco Antonio ; Correa LL . A correlação entre Periodontite e Doenca Cardiovascular: Um estudo Caso-Controle. 2007. (Apresentação de Trabalho/Congresso). 9. BOTELHO, Marco Antonio ; Pitombeira M . Epidemiologia da Hipertensão Arterial Sistêmica em Fortaleza utilizando o SIG: Uma Análise Espacial. 2007. (Apresentação de Trabalho/Congresso). 10. BOTELHO, Marco Antonio ; Sampaio I. . Acurácia do uso de indicadores antropométricos na prevalência de Hipertensão arterial: Um estudo transversal. 2007. (Apresentação de Trabalho/Congresso). 11. BOTELHO, Marco Antonio ; FONSECA, Said Gonçalves da Cruz ; HEUKELBACH, Jörg ; OLIVEIRA, Cleide Correa ; COSTA, José Galberto Martins da . Os Produtos Naturais No Controle da Cárie Dental . 2006. (Apresentação de Trabalho/Congresso). 12. BOTELHO, Marco Antonio ; ARRUDA, Lia Pontes ; CODES, Beatriz Nogueira ; MONTENEGRO, Danusa . O anti-séptico bucal de alecrim-pimenta: Um ensaio clínico controlado e randomizado. 2006. (Apresentação de Trabalho/Congresso). 13. BOTELHO, Marco Antonio . Aspectos clínicos, laboratoriais e bioéticos de um ensaio c’’inico avaliando eficácia de novos medicamentos no controle da placa e gengivite. 2006. (Apresentação de Trabalho/Congresso). 14. BOTELHO, Marco Antonio ; Damasceno T.G . Avaliação comparativa da concentração de fluoreto na agua de abastecimento de Fortaleza: Um estudo Longitudinal. 2006. (Apresentação de Trabalho/Congresso). 15. BOTELHO, Marco Antonio . O uso do antisséptico bucal do alecrim pimenta no PSF. 2006. (Apresentação de Trabalho/Congresso). 16. BOTELHO, Marco Antonio ; M NETO, R ; CARVALHO, C B M ; SILVA, S L ; MORAES, M E . Atividade antimicrobiana in vivo do óleo essencialde Lippia aff. gracillis. 2005. (Apresentação de Trabalho/Outra). 17. BOTELHO, Marco Antonio ; CARVALHO, Cibele B M ; SANTOS FILHO, Emídio A ; CHAVES, Hellíada V ; SANTOS, Danusa Montene ; CODES, Beatriz Nogueira ; ARRUDA, Lia Pontes ; HEUKELBACH, Jörg . Eficácia do Alecrim Pimenta ( Lippia sidoides) e do Neem(Azadirachta) na redução da plava bacteriana e gengivite: um ensaio clínico controlado randomizado. 2005. (Apresentação de Trabalho/ Outra). 18. BOTELHO, Marco Antonio ; CARVALHO, Cibele B M ; SANTOS FILHO, Emídio A ; CHAVES, Hellíada V ; SANTOS, Danusa Montene ; CODES, Beatriz Nogueira ; ARRUDA, Lia Pontes ; HEUKELBACH, Jörg . Estudo Comparativo da Ação Antimicrobiana in vitro de Antisépticos Bucais á Base de Clorhexidina Edulcorados com Sacarina ou Steviosídeo. 2005. (Apresentação de Trabalho/Outra). 19. BOTELHO, Marco Antonio ; CARVALHO, Cibeleb M ; SANTOS FILHO, Emíido A ; CHAVES, Hellíada V ; SANTOS, Danusa Montene ; CODES, Beatriz Nogueira ; ARRUDA, Lia Pontes ; HEUKELBACH, Jörg . Estudo do Efeito do AlecrimPimenta (Lippia sidoides) e Aroeira do Sertão (Myracrodruon urundeuva) na Doença Periodontal Experimental (DPE): avaliação microbiológica. 2005. (Apresentação de Trabalho/Outra). 20. FÉLIX, Francisca Helvira Cavalcante ; SOUZA, Júlia Aparecida Lourenço de ; FONSECA, Said Gonçalves da Cruz ; BOTELHO, Marco Antonio ; HEUKELBACH, Jorg ; MONTENEGRO, Danuza ; CARVALHO, Cibele Barreto Mano . Estudo do Efeito do alecrim-pimenta (Lippia sidoides) e a aroeira do sertão (Myracrodruon urundeuva) na doença periodontal experimental (DPE): avaliação microbiológica preliminar. 2005. (Apresentação de Trabalho/Outra). 21. NÓBREGA, Renate Ferreira ; FONSECA, Said Gonçalves da Cruz ; S FILHO, Emídio A ; GOMES, Antoniella Souza ; MONTENEGRO, Danusa ; CARVALHO, Cibele Barreto Mano ; HEUKELBACH, Jorg ; BOTELHO, Marco Antonio . Alecrim-Pimenta Lippia sidoides é eficaz na redução da placa bacteriana, gengivite e halitose. 2005.

(Apresentação de Trabalho/Outra). 22. SOUZA, Júlia Aparecida Lourenço de ; FONSECA, Said Gonçalves da Cruz ; HEUKELBACH, Jorg ; BOTELHO, Marco Antonio ; CARVALHO, Cibele Barreto Mano ; LEMOS, Telma Leda G . Ação Antimicrobiana Comparativa de Antisépticos Bucais à Base de Clorhexidina Edulcorados com Sacarina e Steviosídeo. 2005. (Apresentação de Trabalho/Outra). 23. BOTELHO, Marco Antonio ; ARRUDA, Lia Pontes ; CODES, Beatriz Nogueira ; MONTENEGRO, Danusa . O alecrim pimenta e o Neem como anti- sépticos bucais eficazes na redução do número de S. mutans na saliva. 2005. (Apresentação de Trabalho/Outra). 24. BOTELHO, Marco Antonio . “O uso da Ortopedia Funcional dos Maxilares no tratamento de pacientes fissurados”. 2001. (Apresentação de Trabalho/ Conferência ou palestra). 25. BOTELHO, Marco Antonio . Biossegurança - Desinfecção das Mãos . 1999. (Apresentação de Trabalho/Congresso). 26. BOTELHO, Marco Antonio . Biossegurança-Desinfecção das Mãos . 1999. (Apresentação de Trabalho/Congresso). 27. BOTELHO, Marco Antonio . O Óleo Essencial do Alecrim-Pimenta (Lippia Sidoides Cham) na Prevenção da Cárie Dental. 1994. (Apresentação de Trabalho/ Simpósio). 28. BOTELHO, Marco Antonio . Ortodontia Preventiva e Interceptiva na Correção das Más Oclusões. 1993. (Apresentação de Trabalho/Congresso). 29. BOTELHO, Marco Antonio . Ortodontia Preventiva e Interceptiva na Correção das Más Oclusões. 1993. (Apresentação de Trabalho/Congresso). 30. BOTELHO, Marco Antonio . Ortodontia Preventiva e Interceptiva na Correção das Más Oclusões. 1993. (Apresentação de Trabalho/Seminário). 31. BOTELHO, Marco Antonio ; LEITÃO, Neto D . Avaliação Comparativa dos Anti-Sépticos Frente aos Estreptococos Sanguis e Salivarius (in vitro). 1992. (Apresentação de Trabalho/Outra). 32. BOTELHO, Marco Antonio . Analise Comparativa do Ph de Cremes dentais na incorporação do Flúor no Esmalte. 1992. (Apresentação de Trabalho/ Comunicação). 33. BOTELHO, Marco Antonio . O efeitos de extratos e oleos essenciais de plantas frente a placa bacteriana in vitro. 1992. (Apresentação de Trabalho/ Comunicação). 34. BOTELHO, Marco Antonio . A validade clinica do uso do plástico na lipeza das faces interproximais em relacao ao fio dental. 1992. (Apresentação de Trabalho/ Comunicação). 35. BOTELHO, Marco Antonio ; LEITÃO, Neto D . Estudo Comparativo dos Anti-Sépticos Bucais Frente a Placa Bacteriana. 1991. (Apresentação de Trabalho/ Congresso). 36. BOTELHO, Marco Antonio ; LEITÃO, Neto D . Estudo Comparativo dos Anti-Sépticos Bucais Frente a Placa Bacteriana. 1991. (Apresentação de Trabalho/ Congresso). 37. BOTELHO, Marco Antonio ; LEITÃO, Neto D . Estudo Comparativo dos Anti-Sépticos Bucais Frente a Placa Bacteriana. 1991. (Apresentação de Trabalho/ Seminário). 38. BOTELHO, Marco Antonio . Avaliação comparativa do pó de juazeiro em relação aos dentiftícios comerciais. 1991. (Apresentação de Trabalho/ Comunicação).

Demais tipos de produção bibliográfica 1. BOTELHO, Marco Antonio . Docente de Canindé aprova pesquisa no MCT 2010 (Comunicação Científica e Social).

Produção técnica Produtos tecnológicos 1. BOTELHO, Marco Antonio ; Queiroz. D.B ; Grupo Evidence Farmacêutica ; Universidade Potiguar . SABONETE GINECOLOGICO COM NANOPARTÍCULAS. 2010. 2. BOTELHO, Marco Antonio ; Queiroz. D.B ; Correia JM ; QUINTANS JR, L. . GEL NANOESTRUTURADO PARA ACNE ROSÁCEA. 2010. 3. BOTELHO, Marco Antonio ; Wexner S ; REGADAS, F. S. . Novel nanogel for gingivitis dental caries and oral cankers. 2010. 4. BOTELHO, Marco Antonio ; Queiroz. D.B ; Grupo Evidence Farmacêutica ; Universidade Potiguar . Gel Nanoestruturado para mucosite oral. 2009. 5. BOTELHO, Marco Antonio ; Queiroz. D.B ; Universidade Potiguar ; Grupo Evidence Farmacêutica . Gel Nanoestruturado para tratamento da Candidíase. 2009. 6. BOTELHO, Marco Antonio ; Queiroz. D.B . NANO DENTALGEL. 2008. 7. BOTELHO, Marco Antonio ; Queiroz. D.B . DENTAL GEL PARA O TRATAMENTO DA GENGIVITE. 2007.

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Processos ou técnicas 1. BOTELHO, Marco Antonio ; Araujo, RS ; COSTA, José Galberto Martins da . INOVAÇÃO BIOTECNOLÓGICA: ELABORAÇÃO DE FITOFÁRMACOS COM NANOTECNOLOGIA. 2008. 2. BOTELHO, Marco Antonio . OS BIOPRODUTOS DO ALECRIM PIMENTA (Lippia sidoides Cham.) NO TRATAMENTO DE PATOLOGIAS BUCAIS: UM ENSAIO CLÍNICO DUPLO-CEGO CONTROLADO E RANDOMIZADO.. 2006.

Trabalhos técnicos 1. BOTELHO, Marco Antonio ; Ruela RS ; MONTENEGRO, Danusa . INOVAÇÃO BIOTECNOLÓGICA:ELABORAÇÃO DE FITOFÁRMACOS COM NANOTECNOLOGIA. 2008. 2. BOTELHO, Marco Antonio ; Soares JB ; MONTENEGRO, Danusa ; Ruela RS . I Workshop Internacional sobre Telemedicina & Biotecnologia. 2008. 3. BOTELHO, Marco Antonio . GEL DENTAL COM NANOPARTÍCULAS A BASE DE FLAVONÓIDES E ÓLEO ESSENCIAL NA PREVENÇÃO DO PERIODONTOPATIAS. 2008. 4. BOTELHO, Marco Antonio ; de Paula. H ; Queiroz. D.B . OS BIOPRODUTOS DO ALECRIM PIMENTA (Lippia sidoides Cham.) NO TRATAMENTO DE PATOLOGIAS BUCAIS: UM ENSAIO CLÍNICO DUPLO-CEGO CONTROLADO E RANDOMIZADO.. 2007. 5. BOTELHO, Marco Antonio ; OLIVEIRA, Cleide Correa ; COSTA, José Galberto M da ; ROLIM, Adriana . Curso de Aperfeiçoamento no Atendimento de Pacientes Especiais. 2006. 6. BOTELHO, Marco Antonio . Projeto de Ação Social Oficina do Sorriso . 2001. 7. BOTELHO, Marco Antonio . O tratamento Ortodontico de pacientes labio fissurados. 2001. 8. BOTELHO, Marco Antonio . Operation Smile. 2001. 9. BOTELHO, Marco Antonio . OPERATION SMILE. 2000. 10. BOTELHO, Marco Antonio . OPERATION SMILE FOUNDATION. 1999.

Ortodônticos Removíveis na Correção das Más-Oclusões . 1992. (Palestras Ministradas em Congresso). 17. BOTELHO, Marco Antonio . Atividade Antimicrobiana do Óleo Essencial do Alecrim Frente ao S.Mutans . 1992. (Palestras Ministradas em Congresso). 18. BOTELHO, Marco Antonio . BHI Ágar: Um Meio de Cultura Alternativo para o Cultivo de S.Mutans . 1992. (Palestras Ministradas em Congresso). 19. BOTELHO, Marco Antonio . Estudo Preliminar da Concentração de Fluoreto em Águas de Abastecimento de Fortaleza (uma análise após 12 anos). 1992. (Palestras Ministradas em Anais). 20. BOTELHO, Marco Antonio . Estudo Comparativo Entre a Saponina e o Pó de Juazeiro Frente a Placa Bacteriana . 1992. (Palestras Ministradas em Congresso). 21. BOTELHO, Marco Antonio . Estudo Comparativo da Atividade Antimicrobiana da Vancomicina e Cefalozina Frente aos S. Mutans . 1992. (Palestras Ministradas em Congresso). 22. BOTELHO, Marco Antonio . Avaliação Comparativa dos Anti-Sépticos Comerciais Frante aos S. Mutans. 1992. (Palestras Ministradas em Congresso). 23. BOTELHO, Marco Antonio . O Óleo Essencial do Alecrim (Lippia Sidoides Cham) na Prevenção da Cárie Dental . 1992. (Palestras Ministradas em Anais). 24. BOTELHO, Marco Antonio . Estudo Comparativo da Atividade Antimicrobiana da Vancomicina e Cefalozina Frente aos S. Mutans (ss 980) in vitro. 1992. (Palestras Ministradas em Anais). 25. BOTELHO, Marco Antonio . Estudo Preliminar da Concentração de Cálcio e Fosfato no Esmalte e Cemento Dental. 1992. (Palestras Ministradas em Congresso). 26. BOTELHO, Marco Antonio . Análise da Concentração de Fluoreto na Água de Abastecimento de Fortaleza. 1992. (Palestras Ministradas em Anais). 27. BOTELHO, Marco Antonio . Avaliação Comparativa do Crescimento de S. Mutans em Meios de Cultura. 1992. (Palestras Ministradas em Anais). 28. BOTELHO, Marco Antonio . Os Aparelhos Ortodônticos Removíveis na Correção da Mordida Cruzada Anterior. 1992. (Palestras Ministradas em Anais). 29. BOTELHO, Marco Antonio . Determinações quantitativas de cálcio e fosfato no esmalte e na raiz de dentres extraídos de pessoas adultas. 1992. (Palestras Ministradas em Anais). 30. BOTELHO, Marco Antonio . Avaliação Comparativa do Pó de Juazeiro em Relação aos Dentifricios Comerciais na Higiene Oral. 1991. (Palestras Ministradas em Congresso).

Demais tipos de produção técnica 1. BOTELHO, Marco Antonio . Testes Paramétricos e Não Paramétricos. 2006. (Curso de curta duração ministrado/Outra). 2. BOTELHO, Marco Antonio . Ortopedia Funcional dos Maxilares. 2003. (Aula ministrada). 3. BOTELHO, Marco Antonio . O Tratamento Ortodôntico nos Pacientes Fissurados. 2001. (Palestras Ministradas). 4. BOTELHO, Marco Antonio . Lábios Fissurados. 2001. (Palestras Ministradas). 5. BOTELHO, Marco Antonio . AS PLANTAS MEDICINAIS NA PREVENCAO DA CARIE DENTAL. 2001. (Programa de rádio ou TV/Entrevista). 6. BOTELHO, Marco Antonio . Room Monitor 100th AAO Annual Session, 5th Internacional Ortodontic Congress, II Meeting of the World Federation of Orthodontists. 2000. (Monitor). 7. BOTELHO, Marco Antonio . Biossegurança - Desinfecção das Mãos . 1999. (Palestras Ministradas em Congresso). 8. BOTELHO, Marco Antonio ; TÁVORA, Flora Maria Freitas Fernandes . O Uso de Plantas Medicinais na Prevenção da Cárie Dental. 1999. (Palestras Ministradas em Congresso). 9. BOTELHO, Marco Antonio . Ortodontia Preventiva e Interceptiva na Correção das Más Oclusões. 1993. (Palestras Ministradas em Congresso). 10. BOTELHO, Marco Antonio . Método Prático para a Determinação dos Níveis de Estreptococos Mutans na Saliva. 1992. (Curso de curta duração ministrado/ Outra). 11. BOTELHO, Marco Antonio . Método Prático para a Determinação dos Níveis de Estreptococos mutans na Saliva. 1992. (Palestras Ministradas). 12. BOTELHO, Marco Antonio . O Efeito dos Extratos e Óleos Essenciais de Plantas Frente a Placa Bacteriana (in vitro). 1992. (Palestras Ministradas em Anais). 13. BOTELHO, Marco Antonio . Avaliação Comparativa dos Anti-Sépticos Comerciais Frente aos S. Salivarius . 1992. (Palestras Ministradas em Anais). 14. BOTELHO, Marco Antonio . A Validade Clínica do Uso do Plástico na Limpeza das Faces Interproximais em Relação ao Fio Dental. . 1992. (Palestras Ministradas em Anais). 15. BOTELHO, Marco Antonio . Análises Comparativas do PH dos Cremes Dentais na Incorporação do Flúor no Esmalte Dental . 1992. (Palestras Ministradas em Anais). 16. BOTELHO, Marco Antonio . Potencial Terapéutico dos Aparelhos

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Demais trabalhos 1. BOTELHO, Marco Antonio . Eficácia do óleo essencial do alecrim pimenta (Lippia sidoides) e do Neem (azadirachta indica) no controle da placa bacteriana e gengivite: Um ensaio Clínico controlado e randomizado. 2005 (Trabalho de Pesquisa). 2. BOTELHO, Marco Antonio ; MATOS, Francisco José de Abreu . Men in White: Sincretism and Representations in the Popular Education. 2004 (Trabalhos Aceitos para Apresentação em Eventos). 3. BOTELHO, Marco Antonio ; BESSALINHARES, Ângela Maria ; FÉRRER, Cátia Novelo ; PASSEGGI, Maria da Conceição . Sincretism and Representation in the Popular Education. 2004 (Trabalhos Aceitos para Apresentação em Eventos). 4. BOTELHO, Marco Antonio . Water Treatment Station: fluoridation poison or holy water?. 2004 (Trabalhos Aceitos para Apresentação em Eventos). 5. BOTELHO, Marco Antonio . Biossegurança - Desinfecção das Mãos. 1999 (Demais trabalhos relevantes). 6. BOTELHO, Marco Antonio ; TÁVORA, Flora Freitas Fernandes . O uso de Plantas Medicinais na Prevenção da Cárie Dental. 1999 (Demais trabalhos relevantes). 7. BOTELHO, Marco Antonio ; FRACALANZZA, Sérgio ; TEIXEIRA, Lúcia Martins . A atividade antimicrobiana do óleo essencial do alecrim (Lippia Sidoides) frente aos Estreptococos Mutans.. 1992 (Trabalho de Pesquisa). 8. BOTELHO, Marco Antonio . Estudo preliminar da concentração de fluoreto nas águas de abastecimento de Fortaleza (uma análise de 12 anos). 1992 (Trabalho de Pesquisa). 9. BOTELHO, Marco Antonio ; SILVA, A M ; BEZERRA, A C S . Determinações Quantitativas de Cálcio e Fosfato no Esmalte e na Raiz de Dentes Extraidos de Pessoas Adultas. 1992 (Trabalho de Pesquisa). 10. BOTELHO, Marco Antonio ; LEITÃO NETO, Domingos . Estudo comparativo da ação do pó de Juazeiro em relação aos anti-sépticos comerciais frente a placa bacteriana (In Vitro). 1991 (Trabalho de Pesquisa). 11. BOTELHO, Marco Antonio ; LEITÃO NETO, Domingos . Avaliação comparativa do uso do pó de Juazeiro em relação aos dentrificios comerciais na higiene bucal. 1991 (Trabalho de Pesquisa). 12. BOTELHO, Marco Antonio ; LEITÃO NETO, Domingos . Os produtos naturais como anti-sépticos e dentifrícios alternativos. 1991 (Trabalho de Pesquisa).

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10. PRÊMIOS E PARTICIPAÇÕES CIENTÍFICAS desenvolvimento

1ª colocação geral na renorbio

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eventos internacionais

reconhecimento nacional

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prêmios

projetos e pesquisas

parcerias

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artigos e citações

visitas técnicas

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11. ANEXOS

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ANEXO 1

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ANEXO 2

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ANEXO 3

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ANEXO 4

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ANEXO 5

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ANEXO 6

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